館藏陳舊蟹類標(biāo)本dna提取及其pcr擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物信息處理領(lǐng)域，特別涉及一種陳舊蟹類標(biāo)本的DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，蟹類分類系統(tǒng)中的各總科、科及屬間關(guān)系仍存在很大爭(zhēng)議，分子生物學(xué)手段已廣泛應(yīng)用到物種起源、系統(tǒng)進(jìn)化的研究中，館藏標(biāo)本因時(shí)間久遠(yuǎn)給DNA提取和PCR擴(kuò)增帶來極大困難，常規(guī)的DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法不能滿足館藏陳舊蟹類標(biāo)本DNA的提取問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種館藏陳舊蟹類標(biāo)本DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法，所述的方法能夠解決館藏標(biāo)本因時(shí)間久遠(yuǎn)給DNA提取和PCR擴(kuò)增帶來的困難問題，以便為采用館藏陳舊模式標(biāo)本來解決蟹類的分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種館藏陳舊蟹類標(biāo)本DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法，其特征在于:所述的方法的流程包括以下步驟:
[0005](1)標(biāo)本準(zhǔn)備:從自然博物館取得館藏陳舊蟹類標(biāo)本，所述的標(biāo)本為1976年采集于西沙群島的角眼沙蟹和裸掌盾牌蟹；1976年采集于大連的譚氏泥蟹；1981年采集于廣西的六齒猴面蟹和中華巴隆蟹，標(biāo)本轉(zhuǎn)存于純度為75%的乙醇中；
[0006](2)標(biāo)本預(yù)處理:取乙醇浸泡的館藏陳舊蟹類標(biāo)本附肢約20?50mg，放于L 5mLEppendorf管中并剪碎，加入lmL ddH20室溫下洗脫酒精48h，其間更換ddH20六次，然后吸干管中溶液，經(jīng)預(yù)處理過的標(biāo)本經(jīng)68°C烘干備用；
[0007](3)基因組提取:經(jīng)預(yù)處理過的館藏陳舊蟹類標(biāo)本再經(jīng)液氮研磨或充分剪碎，放Λ 1.5mL Eppendorf 管中，加入 380 μ L EST (lOOmmol/LEDTA，pH 8.0，10mmol/LTris-HCl)，10 4 1^03，10 4 1^蛋白酶1(，用ddH20調(diào)至700 μ L于55°C水浴中消化完全，然后按下述步驟抽提:
[0008](a)經(jīng)700 μ L的pH值為8.0的飽和酚抽提；
[0009](b)經(jīng)飽和酚:氯仿:異戊醇，比例為25: 24: 1的混合液抽提；
[0010](c)經(jīng)氯仿:異戊醇，比例為24: 1的混合液抽提；
[0011](d)取上清液以柱式華舜PCR純化試劑盒替代傳統(tǒng)的乙醇沉淀法回收高質(zhì)量的館藏陳舊蟹類標(biāo)本基因組；
[0012](4)獲得序列:以巢式PCR擴(kuò)增替代常規(guī)一次PCR反應(yīng)，所需兩對(duì)引物分別為
[0013]18S-F1:TGCTTGTCTCAAAGATTAAGC、18S-F2:ATTAAAGTTGTTGCGGTT 和
[0014]18S-F1:TGCTTGTCTCAAAGATTAAGC^18S-RC:TGCTTTGAGCACTCTAA ；
[0015]PCR反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀上完成，反應(yīng)體積為30yL，含Taq DNA聚合酶1.0U (Promega)，dNTP 0.2mM，MgC122.0mM，10 X Buffer 3.0 μ L，上游和下游引物各 0.5 μΜ，DNA模板約5?10ng。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性4min ；以下過程重復(fù)30個(gè)循環(huán):94°C變性 30s，50 °C (—次 PCR)和 52°C (二次 PCR)退火 45s，72 °C 延伸 100s ;最后，72 °C 補(bǔ)齊lOmin ;巢式反應(yīng)產(chǎn)物先后經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和切膠純化，純化產(chǎn)物在ABI3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀上測(cè)序，得到館藏陳舊蟹類標(biāo)本基因組的序列；
[0016](5)序列分析:從DNA測(cè)序儀上測(cè)得館藏陳舊蟹類標(biāo)本基因組的序列后，按以下步驟進(jìn)行分析:
[0017](a)序列比對(duì)采用ClustalX 1.8軟件，比對(duì)參數(shù)選用默認(rèn)值，比對(duì)后的序列若存在大片段插入、缺失及模糊位點(diǎn)則完全刪除；
[0018](b)DNA序列堿基組成、變異位點(diǎn)、序列差異及遺傳距離等采用MEGA 3.0軟件完成；
[0019](c)序列的轉(zhuǎn)換、顛換飽和度用DAMBE軟件完成；
[0020](e)序列分析結(jié)果為:5條館藏陳舊蟹類標(biāo)本的18S rDNA部分序列存在明顯的長(zhǎng)度差異，角眼沙蟹、譚氏泥蟹和中華巴隆蟹均為683bp，裸掌盾牌蟹為655bp，六齒猴面蟹為632bp，其A、T、G、C平均堿基百分組成基本相同，其中A占25.5%，T占24.5%，G占25.8%，C占24.2% ;序列中共683位點(diǎn)存在明顯的插入缺失，其中變異位點(diǎn)187個(gè)，包括簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)95個(gè)，單變異位點(diǎn)92個(gè)，轉(zhuǎn)換/替代為1.2，轉(zhuǎn)換明顯高于顛換，且均未達(dá)到飽和；陳舊蟹類5條18S rDNA部分序列兩兩之間的平均遺傳距離為0.184。
[0021]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本方法能夠改進(jìn)DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法，優(yōu)化反應(yīng)條件，順利地從館藏陳舊蟹類標(biāo)本中獲得靶向目的序列、模式標(biāo)本目的DNA序列、地模標(biāo)本的目的DNA序列，通過柱式回收法除了能從陳舊標(biāo)本中提取到模板DNA外，有效去除DNA提取過程中殘余的苯酚、氯仿、異戊醇等，減少了影響PCR反應(yīng)的主觀因素，由于其間省略了 -20°C冰無水乙醇過夜沉淀以及離心后自然風(fēng)干的步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，提取模板的質(zhì)量和純度大大提高，還能防止其它同源基因即假基因的擴(kuò)增，提高產(chǎn)物的純度，為解決蟹類各階元的的分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系提供了較好的DNA樣本和理想的PCR結(jié)果，從而使得該問題的解決變得更加容易和更具說服力。
【附圖說明】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，本發(fā)明有如下5幅附圖:
[0023]圖1為本發(fā)明館藏陳舊蟹類標(biāo)本DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法的流程圖；
[0024]圖2為本發(fā)明中巢式PCR產(chǎn)物和柱式回收法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0025]圖3為本發(fā)明獲得的陳舊蟹類5條18S rDNA部分序列變異位點(diǎn)序列圖；
[0026]圖4為本發(fā)明獲得的基于5條18S rDNA序列變異的轉(zhuǎn)換、顛換飽和度的關(guān)系圖；
[0027]圖5為本發(fā)明獲得的陳舊蟹類5條18S rDNA部分序列兩兩之間遺傳距離示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]1.參見圖1，本發(fā)明館藏陳舊蟹類標(biāo)本DNA提取及其PCR擴(kuò)增方法的流程為:
[0029](1)標(biāo)本準(zhǔn)備:從自然博物館取得館藏陳舊蟹類標(biāo)本，所述的標(biāo)本為1976年采集于西沙群島的角眼沙蟹和裸掌盾牌蟹；1976年采集于大連的譚氏泥蟹；1981年采集于廣西的六齒猴面蟹和中華巴隆蟹，標(biāo)本轉(zhuǎn)存于純度為75%的乙醇中；
[0030](2)標(biāo)本預(yù)處理:取乙醇浸泡的館藏陳舊蟹類標(biāo)本附肢約20?50mg，放于L 5mLEppendorf管中并剪碎，加入lmL ddH20室溫下洗脫酒精48h，其間更換ddH20六次，然后吸干管中溶液，經(jīng)預(yù)處理過的標(biāo)本經(jīng)68°C烘干備用；
[0031](3)基因組提取:經(jīng)預(yù)處理過的館藏陳舊蟹類標(biāo)本再經(jīng)液氮研磨或充分剪碎，放Λ 1.5mL Eppendorf 管中，加入 380 μ L EST (lOOmmol/LEDTA，pH 8.0，10mmol/LTris-HCl)，
104 1^03，10 4 1^蛋白酶1(，用ddH20調(diào)至700 μ L于55°C水浴中消化完全，然后按下述步驟抽提:
[0032](a)經(jīng)700 μ L的pH值為8.0的飽和酚抽提；
[0033](b)經(jīng)飽和酚:氯仿:異戊醇，比例為25: 24: 1的混合液抽提；
[0034](c)經(jīng)氯仿:異戊醇，比例為24: 1的混合液抽提；
[0035](d)取上清液以柱式華舜PCR純化試劑盒替代傳統(tǒng)的乙醇沉淀法回收高質(zhì)量的館藏陳舊蟹類標(biāo)本基因組；
[0036](4)獲得序列:以巢式PCR擴(kuò)增替代常規(guī)一次PCR反應(yīng)，所需兩對(duì)引物分別為
[0037]18S-F1 -TGCTTGTCTCAAAGATTAAGC、18S-F2:ATTAAAGTTGTTGCGGTT 和
[0038]18S-F1:TGCTTGTCTCAAAGATTAAGC、18S-RC:TGCTTTGAGCACTCTAA ；
[0039]PCR反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀上完成，反應(yīng)體積為30yL，含Taq DNA聚合酶1.0U(Promega)，dNTP 0.2mM，MgC122.0mM, 10XBuffer 3.0 μ L，上游和下游引物各 0.5 μΜ,DNA模板約5?10ng。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性4min ；以下過程重復(fù)30個(gè)循環(huán):94°C變性 30s，50 °C (—次 PCR)和 52°C (二次 PCR