專(zhuān)利名稱：基因檢測(cè)芯片、檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)基因的芯片，檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法，所述檢測(cè)芯片，檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)并分析基因堿基序列，除此之外，還有基因異常情況如DNA中的一個(gè)堿基置換SNP(人類(lèi)遺傳密碼的變種)、多個(gè)堿基置換，占突變，基因缺失等。
背景技術(shù)：
所謂一個(gè)堿基置換SNP一般認(rèn)為是在人的DNA堿基序列中1000bp到2000bp中有一個(gè)堿基的變化。不管是正常人還是病人，認(rèn)為有從十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)的SNP，人們正期待著SNP成為分析病因及預(yù)防疾病的有效標(biāo)記。
所謂多個(gè)堿基置換是在基因堿基序列中有多個(gè)堿基變化。
所謂點(diǎn)突變是在已知基因中堿基序列中的一個(gè)堿基變化，由此可以發(fā)現(xiàn)翻譯出的蛋白質(zhì)的機(jī)能異常，有時(shí)成為疾病的原因。
所謂基因的易位是指堿基序列的順序有一部分逆轉(zhuǎn)，有時(shí)成為疾病的原因。
所謂基因的缺失是指一部分堿基序列欠缺。有時(shí)成為疾病的原因。
所謂基因的擴(kuò)增是指一部分堿基序列重復(fù)。有時(shí)成為疾病的原因。
所謂三聯(lián)體重復(fù)是三個(gè)堿基對(duì)重復(fù)延長(zhǎng)。有時(shí)成為疾病的原因。
作為檢測(cè)、分析基因DNA的堿基序列差異的手段，采用DNA測(cè)序法(堿基序列測(cè)定法)、PCR-SSCP(聚合酶鏈反應(yīng)—單股鏈構(gòu)象多態(tài)性(雙脫氧鏈終止法)、等位基因特異雜交法、DNA芯片法等方法。
DNA測(cè)序法有Maxam-Gilbert(化學(xué)降解法)和Sanger-coulson法?，F(xiàn)在主要使用Maxam-Gilbert(化學(xué)降解法)。在用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法擴(kuò)增分析人的DNA區(qū)域之后，使用在PCR法中使用的引物或在擴(kuò)增DNA內(nèi)已設(shè)定的引物進(jìn)行測(cè)序，決定該區(qū)域內(nèi)DNA的序列。
PCR-SSCP法是用PCR法擴(kuò)增分析的人的基因的區(qū)域后，由于熱變性形成單鏈，將其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，由此使PCR法擴(kuò)增的雙鏈DNA的每個(gè)鏈形成二次結(jié)構(gòu)(分子內(nèi)氫鍵)。由于一個(gè)堿基序列的不同，所形成的二次結(jié)構(gòu)(分子內(nèi)氫鍵)不同，使得電泳距離不同，從而檢測(cè)出基因的一個(gè)堿基置換SNP和點(diǎn)突變等。
等位基因特異雜交法是用PCR法擴(kuò)增想要分析的區(qū)域后，在膜(尼龍過(guò)濾膜)區(qū)域內(nèi)作成20個(gè)堿基程度的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸探針，在此，將用放射性同位素32P等標(biāo)記的DNA樣品(被檢DNA)雜交。調(diào)節(jié)其溫度等雜交條件，用放射性同位素的強(qiáng)度差檢測(cè)基因中的一個(gè)堿基SNP和點(diǎn)突變。
DNA芯片法在原理方面與等位基因特異雜交法幾乎相同。它是將20個(gè)堿基程度的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸探針排列在固定相(基盤(pán)上)，使其與熒光標(biāo)記的DNA樣品(被檢DNA)雜交。通過(guò)調(diào)節(jié)溫度等雜交條件，根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別檢測(cè)人基因中的一個(gè)堿基置換SNP等。
在等位基因特異雜交法中的雜交場(chǎng)合，由于使用放射性同位素標(biāo)記DNA，所以放射性同位素的處理和管理需要較多的費(fèi)用是一個(gè)問(wèn)題。另外，在DNA芯片法的場(chǎng)合，使用熒光素標(biāo)記，由于熒光素是大分子結(jié)構(gòu)，在足夠的頻率下，熒光不能捕捉到DNA。熒光標(biāo)記探針的熒光強(qiáng)度不高，更使得熒光褪色及玻璃等基盤(pán)有熒光(背景部分的熒光)成為問(wèn)題。
為了解決這些問(wèn)題，作為檢測(cè)DNA雜交的形成、檢測(cè)雙鏈DNA的簡(jiǎn)單、高敏感度的好方法，將DNA探針固定在電極上，讓該DNA探針在有嵌入化合物的情況下與DNA樣品反應(yīng)，用電化學(xué)方式檢測(cè)雙鏈DNA和雜交形成體，該方法已被公開(kāi)。(參照特開(kāi)平9-288080號(hào)公報(bào)及1996年第57屆分析化學(xué)研討會(huì)論文集P137-138)但是，基因中的一個(gè)堿基置換SNP和基因突變等的數(shù)量非常大，例如為了制作一個(gè)人的15KB密度(分辨率)的一個(gè)堿基置換SNP圖，必須至少鑒定二百萬(wàn)的一個(gè)堿基置換SNP。另外，與已知疾病有關(guān)的基因點(diǎn)突變的數(shù)量也極多。采用現(xiàn)有的方法籠統(tǒng)地分析一個(gè)堿基置換和點(diǎn)突變?cè)诂F(xiàn)實(shí)中幾乎是不可能的。
本發(fā)明的目的就是解決上述現(xiàn)有的問(wèn)題，以多個(gè)DNA樣品為檢測(cè)對(duì)象可以進(jìn)行檢測(cè)、分析大量的基因，即可以進(jìn)行高處理的能力(高速、大量)的處理，而且可以提供高敏感度地檢測(cè)和分析基因的鑒定裝置。總之，本發(fā)明是特開(kāi)平9-288080號(hào)公報(bào)記載的、根據(jù)電化學(xué)進(jìn)行雙鏈DNA的檢測(cè)和雜交形成體的檢測(cè)的原理，力圖實(shí)現(xiàn)大量、高敏感度地檢測(cè)、分析基因的裝置。
而且本發(fā)明是力圖實(shí)現(xiàn)在實(shí)際檢測(cè)等操作中操作簡(jiǎn)單、容易作業(yè)的基因檢測(cè)的方法、檢測(cè)裝置及檢測(cè)芯片的發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題，本發(fā)明提供用于基因檢測(cè)的芯片。其特征為有多個(gè)作為測(cè)定極的柱電極，并在所述柱電極和所述柱電極的配極的通用電極之間加電壓，能夠檢測(cè)出電流。
本發(fā)明由于使用矩陣狀排列的柱電極，可以同時(shí)分析大量的基因。
另外，具有可以在柱的前端和側(cè)面固定基因、可以大量獲得固定面積的優(yōu)點(diǎn)。
另外，具有如下優(yōu)點(diǎn)即，在平面電極上分注基因的場(chǎng)合，平面電極的表面有凹凸，不能均一固定，與此相比，將柱電極插入含有基因的液體中固定，即使柱電極的表面有凹凸，也能均一地固定一定量的基因。由于能固定一定量的基因，在定量分析方面精度、靈敏度高。
而且，本發(fā)明不必將含基因的液體分注，具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
由于本發(fā)明可以在用雜交法檢測(cè)固定在柱電極上的基因探針和DNA樣品后除去DNA樣品，再次使另外的DNA樣品雜交，所以能反復(fù)使用芯片?；蛘哌M(jìn)行除去基因探針的處理，再次將另外的基因探針固定在柱電極上，因而可以反復(fù)將芯片用于不同的檢測(cè)目的。
本發(fā)明的檢測(cè)芯片也可以有所述柱電極的配極的與所述柱電極不接觸的通用電極。
本發(fā)明中的檢測(cè)芯片也可以容納所述柱電極，同時(shí)具有能填充DNA樣品的凹部。
在所述柱電極上也可以分別固定具有不同基因序列的基因。
在所述柱電極上也可以固定有不同基因序列的多個(gè)PCR產(chǎn)物，寡聚核苷酸、信使RNA、互補(bǔ)DNA，PNA(peptidic nucleic acid)，或LNA(lockednucleic acid)。
與本發(fā)明有關(guān)的其它的檢測(cè)芯片也可以在所述柱電極上分別固定具有相同基因序列的基因。
在所述柱電極上也可以固定具有相同基因序列的PCR產(chǎn)物，寡聚核苷酸、信使RNA、互補(bǔ)DNA、PNA，或LNA。(locked nucleic acid LLC商標(biāo))該檢測(cè)芯片在能夠分別容納所述柱電極的同時(shí)，還有可以填充DNA樣品的多個(gè)凹部，也可以在這些凹部中分別填充不同的DNA樣品。
所述檢測(cè)基因的芯片對(duì)檢測(cè)諸如基因的堿基序列、一個(gè)堿基置換SNP、多個(gè)堿基置換、點(diǎn)突變、易位、缺失、擴(kuò)增或三聯(lián)核糖醇是有用的。
所述電極也可以在其表面鍍金。
所述電極也可以在其部分表面用樹(shù)脂涂覆。
所述樹(shù)脂也可以是PEEK(聚醚醚酮)或PTFE(聚四氟乙烯)。
所述用于檢測(cè)基因的芯片有支撐柱電極的支撐部件構(gòu)成，所述柱電極也可以突出設(shè)置在該支撐部件上。
此處所謂“突出設(shè)置”是指柱電極從以支撐部件為基座的支撐部件上突出設(shè)置。
所述柱電極也可以通過(guò)點(diǎn)電極突出設(shè)置在所述支撐部件上。
所謂“點(diǎn)電極”是指在支撐部件上的點(diǎn)上配置的電極。
所述用于檢測(cè)基因的芯片有支撐柱電極的支撐部件而形成，所述柱電極的一端也可以鑲嵌在該支撐部件上。
此處所謂“鑲嵌”是指使柱電極的一端與設(shè)在支撐部件上的凹部嵌合，柱電極從支撐部件突出來(lái)。
所述支撐部件也可以是電路基板。
所述柱電極也可以使接觸或鑲嵌在所述支撐部件上的端部用環(huán)氧樹(shù)脂或聚四氟乙烯包覆固定于支撐部件上。
在所述柱電極上只使不是接觸或鑲嵌在所述支撐部件上的端部的一端部固定基因，也可以在整個(gè)柱電極固定基因。
由于在柱電極表面所定的范圍作了樹(shù)脂涂層，也可以僅在沒(méi)有涂覆的露出部分固定基因。
在所述用于檢測(cè)基因芯片的內(nèi)部存在空隙，所述柱電極也可以向該空隙內(nèi)突出地設(shè)置在所述支撐部件上，所述通用電極的一部分或全部在該空隙內(nèi)露出。
在芯片上也可以設(shè)置通向該空隙內(nèi)的注入口，使得能夠向該空隙內(nèi)注入、排出基因樣品和電解質(zhì)等。
所述用于檢測(cè)基因芯片具有主體部和可以與主體部結(jié)合的框架部。所述主體部在其內(nèi)側(cè)面有所述柱電極，所述框架部在與該主體部結(jié)合后其內(nèi)側(cè)面可以容納柱電極，同時(shí)也可以有能夠填充DNA樣品的凹部。
所述主體部和所述框架部也可以自由拆裝。
作為使主體部和框架部拆裝自由地結(jié)合的結(jié)構(gòu)，可以適當(dāng)采用諸如在主體部或框架部中的任何一方設(shè)置凸部，在另一方設(shè)置凹部，該凸部和凹部可以形成扣合結(jié)構(gòu)；用夾子、夾板等將兩者夾住的結(jié)構(gòu)；使一方相對(duì)另一方滑動(dòng)、同時(shí)嵌合的結(jié)構(gòu)；用磁鐵使兩部分相互吸著的結(jié)構(gòu)等眾所周知的方法。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)基因的一堿基置換SNP和點(diǎn)突變的芯片，該芯片具有相互拆裝自由的主體部和框架部，其特征在于，所述主體部在其內(nèi)側(cè)面有多個(gè)柱電極測(cè)定極呈矩陣狀排列、并突出；所述框架部在其內(nèi)側(cè)面上安裝有所述主體部時(shí)可以收納所述多個(gè)柱電極，同時(shí)有能夠填充DNA樣品的凹部，在所述凹部?jī)?nèi)配有不與所述柱電極相接觸的配極作為通用電極，所述柱電極固定有不同基因序列而生成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸；在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，能夠檢測(cè)出電流。
另外，在本發(fā)明中所謂矩陣狀是指多個(gè)柱電極相互平行地從規(guī)定的面上突出排列的狀態(tài)。
所述柱電極以各種矩陣狀排列，分別被插入由不同基因序列而成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸的收容部，這樣也可以作為固定由不同基因序列而成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸的部件。
所述用于檢測(cè)的芯片也可以用于基因診斷。使用本發(fā)明的檢測(cè)用芯片進(jìn)行的基因診斷，有時(shí)可以診斷是否具有涉及肌營(yíng)養(yǎng)不良、血友病、苯丙酮酸尿癥等單一基因病和糖尿病、癌、高血壓、心肌梗塞、肥胖癥等多因素基因病的基因；有時(shí)可以診斷發(fā)病前的基因，從而成為選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ê退幬锏呐袛嘁罁?jù)。
另外，本發(fā)明為了解決上述問(wèn)題，提供所述基因檢測(cè)用芯片和有能裝入及取出該檢測(cè)用芯片的測(cè)定裝置的檢測(cè)基因的裝置。
所述檢測(cè)用芯片也可以采用輝銻鐵元素作為控制溫度的手段控制溫度。
而且本發(fā)明為了解決所述問(wèn)題，提供了一種檢測(cè)方法，使用所述基因檢測(cè)芯片進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于，在所述凹部?jī)?nèi)填充DNA樣品或由DNA樣品擴(kuò)增形成的DNA，進(jìn)行雜交形成雙鏈，之后從所述凹部中除去所述DNA樣品或由DNA樣品擴(kuò)增形成的DNA，經(jīng)洗凈后在所述凹部?jī)?nèi)填充含有電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)，使所述雙鏈與所述電化學(xué)活性分子結(jié)合，之后在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，檢測(cè)流經(jīng)的電流值。
或者說(shuō)提供一種檢測(cè)方法，使用所述基因檢測(cè)芯片進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于，在所述凹部?jī)?nèi)填充DNA樣品或由DNA樣品擴(kuò)增形成的DNA和含有電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)，進(jìn)行雜交形成雙鏈，使所述雙鏈與所述電化學(xué)活性分子鍵合，之后在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，檢測(cè)流經(jīng)的電流值。
這樣，用所述芯片進(jìn)行雜交后使其與電化學(xué)活性分子鍵合或在電化學(xué)活性分子存在的情況下進(jìn)行雜交，由此可以利用極簡(jiǎn)便的操作、以高精度和高靈敏度同時(shí)分析大量的基因。
在所述檢測(cè)方法中也可以在控制溫度的同時(shí)，進(jìn)行所述雙鏈與所述電化學(xué)活性分子的鍵合。
所述包含電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)也可以是二茂鐵、鄰苯二酚胺、金屬聯(lián)吡啶絡(luò)合物、金屬菲絡(luò)合物、生物睪丸酮(ピオロ-ゲン)或把引入這些化合物的窩邊型嵌入化合物作為有效成份。
特別優(yōu)選二茂鐵窩邊型嵌入化合物。
所述包含電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)除上述外，也可將乙啡啶、溴化乙錠、吖啶、氨基吖啶、吖啶橙、二氨基吖啶、多諾霉素、D放線菌素、給體霉菌體(ド-ノマィシン)、絲裂霉素C、三(菲繞啉)鋅絡(luò)合物、三(菲繞啉)釕絡(luò)合物、三(菲繞啉)鈷絡(luò)合物、二(菲繞啉)鋅絡(luò)合物、二(菲繞啉)釕絡(luò)合物、二(菲繞啉)鈷絡(luò)合物、二吡啶粗鉑絡(luò)合物、粗鉑絡(luò)合物、菲繞啉粗鉑絡(luò)合物、三(二吡啶)鋅絡(luò)合物、三(二吡啶)釕絡(luò)合物、三(二吡啶)鈷絡(luò)合物、二(聯(lián)吡啶)鋅絡(luò)合物、二(聯(lián)吡啶)釕絡(luò)合物、二(聯(lián)吡啶)鈷絡(luò)合物作為有效成份。


圖1為說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)基因裝置的整體結(jié)構(gòu)的立體圖。
圖2為說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)基因芯片的整體結(jié)構(gòu)的立體圖。
圖3(a)是圖2(c)的A-A剖面圖、圖3(b)是圖3(a)主要部分的放大圖，圖3(c)～圖3(e)表示在電路基板上設(shè)置柱電極的各種結(jié)構(gòu)。
圖4是本發(fā)明相關(guān)的檢測(cè)基因裝置及檢測(cè)用芯片的電極、配線等結(jié)構(gòu)的說(shuō)明圖。
圖5是圖2的檢測(cè)芯片的剖面圖及主要部分的放大圖。
圖6是說(shuō)明本發(fā)明相關(guān)的檢測(cè)基因芯片使用狀態(tài)的立體圖。
圖7是實(shí)驗(yàn)例3的測(cè)定結(jié)果。
圖8是實(shí)驗(yàn)例4的測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下參照附圖，對(duì)與本發(fā)明相關(guān)的基因檢測(cè)方法、檢測(cè)裝置和檢測(cè)用芯片的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。附圖只不過(guò)是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，不僅限于此。
在圖1中涉及本發(fā)明的基因檢測(cè)裝置1由檢測(cè)芯片2、有能插入檢測(cè)芯片2的入口29的、能夠檢測(cè)分析雜交形成的雙鏈DNA的測(cè)定裝置3和微機(jī)35組成。
圖2是檢測(cè)用芯片2的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2(a)是表示檢測(cè)用芯片2整體的立體圖，該芯片呈卡狀或盒狀。在圖2(b)中如分解的立體圖所示，檢測(cè)芯片2是由陶瓷和合成樹(shù)脂等形成的框架4和裝在該框架上的、能拆裝的主體部5構(gòu)成。
使主體部5對(duì)于框架4能開(kāi)合自由地結(jié)合的結(jié)構(gòu)，可以依靠例如在框架4和主體部5的觸接面上各自形成能相互彈性地嵌合的凹凸。在本實(shí)施例中如圖2(b)、(c)、圖3(a)、圖5(a)中所示，在主體部5和框架4上在避開(kāi)柱電極排列的位置上，分別設(shè)置凸部6和凹部7，使之可以拆裝。
使框架4和主體部5互相開(kāi)合自由地結(jié)合的這種結(jié)構(gòu)適宜采用諸如將兩者或用夾子、夾板等固定，或用磁鐵使它們互相吸引等公認(rèn)的方法。
在框架4的中央處形成矩形的凹部8。在這個(gè)凹部8的周?chē)皆O(shè)封條9。這個(gè)凹部8如后所述能填充溶液(DNA樣品、窩邊式嵌合化合物、清洗液等)，通過(guò)將主體部5安裝在框架4上進(jìn)行封裝。另外，將主體部5從框架4上拆卸，能迅速地進(jìn)行凹部8內(nèi)溶液的交換、混合及清洗等。
另一方面，在主體部5上，如圖2(c)所示，在與框架4的凹部8相對(duì)應(yīng)的區(qū)域均勻地突出設(shè)置有多個(gè)柱電極10。將主體部裝在框架4上時(shí)，柱電極10突出的長(zhǎng)度是插入凹部8內(nèi)的長(zhǎng)度。
圖3(a)是圖2(c)的A-A剖面圖，表示主體部5的結(jié)構(gòu)和柱電極10的突出設(shè)置狀態(tài)。主體部5由在內(nèi)側(cè)壁11和外側(cè)壁12之間設(shè)有電路基板13構(gòu)成。電路基板13的端部露出，在該露出部分設(shè)置有柱電極用的接線端子20和通用電極用的接線端子(在圖4中表示的27)。另外在電路基板13上形成包含配線(在圖4中表示的21、22、23)等的電路。
如圖3(a)，圖3(b)所示，柱電極10構(gòu)成從電路基板13貫通內(nèi)側(cè)壁11并突出出來(lái)。
柱電極10如圖3(c)所示，也可以構(gòu)成從外側(cè)壁12貫通電路基板13和內(nèi)側(cè)壁11并突出出來(lái)。
柱電極10如圖3(d)所示，也可以作成如下結(jié)構(gòu)，主體部5插在基座14上設(shè)置電路基板13，在其上突出設(shè)置柱電極10。
或者如圖3(e)所示，預(yù)先在電路基板13上真空鍍敷多個(gè)點(diǎn)電極15，形成多個(gè)點(diǎn)電極15，在點(diǎn)電極15上也可以以電接觸狀態(tài)突出設(shè)置柱電極10。
如圖6(b)放大圖所示，在柱電極10的表面固定在PCR產(chǎn)物和寡聚核苷酸5’末端巰基化地導(dǎo)入SH基的SH化寡聚核苷酸16。PCR產(chǎn)物是雙鏈DNA，在鏈的5’末端使其巰基化。導(dǎo)入SH基的這一寡聚核苷酸具有含20～50堿基的長(zhǎng)度，通過(guò)導(dǎo)入其基端的巰基固定在柱電極10上。
該寡聚核苷酸的固定如圖6(a)所示，可以靠把柱電極10插入有與柱電極10相同的間隔排列的DNA凹坑18的微量反應(yīng)板17的各凹坑18內(nèi)，同時(shí)對(duì)種類(lèi)不同的DNA進(jìn)行修飾。柱電極10的表面鍍金，在鍍金層上通過(guò)SH基固定SH化的寡聚核苷酸16的固定方法是眾所周知的。
有關(guān)在柱電極的表面鍍金前的預(yù)處理方法和SH-金結(jié)合的問(wèn)題記載如(C.D.Bain)J.Am.Chem.Soc.111，P321，(1989)，和(JJ.Gooding)Anal.Chem.70，P2396，(1998)，而且用(C.D.Bain)J.Am.Chem.Soc，111，P321，(1989)上記載的方法等進(jìn)行基因探針的清除。
多數(shù)柱電極10設(shè)置在電路基板13上，電也成為電路基板的一部分。并且如圖2(c)所示，在主體部5的前端并列設(shè)置有接線端子20、27。
如圖4(a)、圖3(a)、圖3(b)所示，柱電極10分別連接在電路基板上的配線21上。該配線21的另一端與接線端子20各自獨(dú)立連接。
圖4表示基因的電檢測(cè)電路。如圖4(a)所示，對(duì)于柱電極10的配線21也可以分別對(duì)應(yīng)柱電極10一根根地連接，分別接在接線端子20上。如圖4(b)所示，如設(shè)置有由薄膜晶體管組成的開(kāi)關(guān)元件的有源矩陣型的薄膜晶體管液晶顯示裝置等的矩陣電極那樣，在由大量的縱橫導(dǎo)線22、23組成的矩陣配線的交叉部，各自矩陣配線的導(dǎo)線22、23和柱電極10也可以通過(guò)FET場(chǎng)效應(yīng)晶體管24連接。當(dāng)作成這樣結(jié)構(gòu)，縱橫導(dǎo)線22、23掃描、選擇的薄膜晶體管接通，特定的柱電極就可以電連接在接線端子上。
在本實(shí)施例中進(jìn)一步具有圖4所示的通用電極25。圖4所示的通用電極是用于徹底說(shuō)明電路結(jié)構(gòu)，模式化記載的。實(shí)際上優(yōu)選通用電極配置在凹部8。例如如圖5(a)所示，通用電極25作為柱電極10的配極配置在凹部8的底面的一部分(例如周邊等處)或底面的全部靠近凹部8的底面的四周等處。而且通用電極25設(shè)置在不與柱電極10接觸的位置上。當(dāng)在框架4上安裝主體部5時(shí)，通用電極20如圖5(b)中放大圖所示，作成與主體部5的通用電極用的端子26接觸的結(jié)構(gòu)。而且這個(gè)通用電極用的端子26通過(guò)配線28接在通用電極用的接線端子27上。
另外，每個(gè)柱電極10和通用電極25即配極之間的電流值，在凹部8內(nèi)的空間中填充后述的電解質(zhì)溶液的情況下，以配線連接電解質(zhì)溶液形成的參照電極(圖中未顯示)的值作為基準(zhǔn)測(cè)定，從而在測(cè)定中得到正確的電流值，也可以作成如上的結(jié)構(gòu)。
在測(cè)定裝置的檢測(cè)芯片入口(圖1中的29)的內(nèi)部，如圖4(c)所示，連接通用電極的接線端子27和各柱電極的接線端子20，在通用電極的接線端子27和各柱電極的接線端子20之間配置有加電壓電路30。
而且在通用電極的接線端子27和各柱電極的接線端子20之間加電壓E時(shí)，使其結(jié)構(gòu)能用設(shè)置在電路30上的檢測(cè)器31檢測(cè)、測(cè)定流經(jīng)通用電極25和各柱電極10之間的電流。
另外，為了有選擇地連接柱電極10的接線端子20，從入口29插入檢測(cè)芯片2時(shí)，在測(cè)定裝置3上設(shè)置有與各柱電極的接線端子20連接的接收端子32和在電路30上有選擇地與接收端子32連接的掃描端子33。
根據(jù)這個(gè)檢測(cè)出的電流測(cè)定的數(shù)據(jù)，用接在檢測(cè)器31上的A-D變換器34等數(shù)字化，用微機(jī)35進(jìn)行分析、鑒定DNA樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
另外，在測(cè)定裝置3上裝備有由輝銻鐵元素組成的溫度控制裝置(圖中未顯示)。用這個(gè)溫度控制裝置可以控制后述的雜交的溫度條件。
對(duì)于由以上結(jié)構(gòu)組成的本發(fā)明相關(guān)的檢測(cè)裝置1的作用進(jìn)行說(shuō)明。圖6(a)為微量反應(yīng)板17，其上的收容部18呈矩陣狀排列，并與柱電極10保持相等距離。在該微量反應(yīng)板17上的各收容部18內(nèi)容納種類(lèi)相同或不同的DNA。
而且如圖6(a)中所示，將檢測(cè)用芯片2的主體部5的多個(gè)柱電極10分別插入收容部18。由此，如圖6(b)表示的部分放大圖，在各自的柱電極10上能夠修飾種類(lèi)相同或不同的DNA。
另一方面，在框架4的凹部8內(nèi)注入DNA樣品溶液進(jìn)行填充，之后在這個(gè)凹部8內(nèi)插入已修飾所述DNA的大量的柱電極10，將主體部5在框架4上凸部與凹部扣合安裝。這樣在凹部8內(nèi)用封條9密封，通用電極25與主體部5的通用電極端子26接觸。
另外DNA樣品是用DNA分解酶或超聲波處理分解從生物材料中提取的DNA得到的，或者由特定的基因利用PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)法)擴(kuò)增的DNA。這些DNA樣品在雜交之前先進(jìn)行熱處理使之變性。
在固定于柱電極上面的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸的DNA(單鏈形態(tài))上添加DNA樣品(單鏈形態(tài))，互補(bǔ)堿基序列的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸的DNA和DNA樣品可以雜交。
在雜交時(shí)，將檢測(cè)用芯片2裝入測(cè)定裝置3內(nèi)的入口29，用裝在測(cè)定裝置3內(nèi)的由輝銻鐵元素組成的溫度控制裝置控制雜交的溫度條件。
進(jìn)行雜交后，將檢測(cè)用芯片2從測(cè)定裝置3中取出，再將主體部5從框架4卸下，之后除去凹部8內(nèi)的DNA樣品溶液，在凹部8內(nèi)注入清洗液，將沒(méi)有進(jìn)行雜交的DNA樣品沖洗干凈。
進(jìn)行這樣的清洗后，在凹部8內(nèi)填充含有電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)溶液，把主體部5安裝在框架4上。電化學(xué)活性分子具有改變雜交形成的雙鏈DNA的電阻值等電性的機(jī)能。對(duì)此在特開(kāi)平9-288080號(hào)公報(bào)中有詳細(xì)說(shuō)明。
在測(cè)定裝置3上再次插入進(jìn)行了這樣處理的檢測(cè)用芯片2，將檢測(cè)芯片的通用電極用接線端子27和各柱電極用的接線端子20接在測(cè)定裝置的接收端子32上，通過(guò)選擇開(kāi)關(guān)接在電壓回路30上。在通用電極25和各柱電極10之間加上弱電壓，在雜交形成的雙鏈DNA和被連接的柱電極10上有微弱電流流過(guò)電壓回路30和通用電極25。通過(guò)測(cè)定裝置3內(nèi)的輝銻鐵元素控制溫度，測(cè)定不同溫度下的電流值。
在測(cè)定裝置3中如圖4(c)所示，能夠?qū)τ诟髦姌O用的接線端子20及接收端子32轉(zhuǎn)換掃描端子33(轉(zhuǎn)換可以自動(dòng)或手動(dòng)，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)不是本發(fā)明的要點(diǎn)，故省略說(shuō)明。)，由此，電流順次流過(guò)雜交后的雙鏈DNA，用檢測(cè)器31檢測(cè)。
該檢測(cè)結(jié)果用A-D變換器34變換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，作為測(cè)定數(shù)據(jù)用微機(jī)35存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器等中。用該測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行DNA樣品的鑒定和分析。例如根據(jù)與預(yù)先儲(chǔ)備的各類(lèi)DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，能夠分析和鑒定DNA樣品。
下面將說(shuō)明本發(fā)明相關(guān)的基因的電化學(xué)檢測(cè)裝置的實(shí)驗(yàn)例。
(實(shí)驗(yàn)例1)在基因P53的第72密碼子中表示的，一個(gè)堿基置換SNP檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)例。將具有以下兩種相當(dāng)于多型現(xiàn)象(遺傳的多型性)的堿基序列的寡聚核苷酸分別對(duì)準(zhǔn)柱電極10，使之固定。
P53Pro(第72密碼子為Pro)P53Arg(第72密碼子為Arg)對(duì)此，將DNA以及用該DNA擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)生物熱變性后進(jìn)行雜交反應(yīng)，其中所述DNA是從正常人末梢血中提取的，P53第72密碼子為pro，而其中所述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為包含密碼子72的片斷，該密碼子存在于P53外顯示4中。
從末稍血提取的DNAP53Pro的電流變化(％)52％P53Arg的電流變化(％)15％PCR產(chǎn)物P53Pro的電流變化(％)65％P53Arg的電流變化(％)13％進(jìn)一步將DNA以及用該DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同樣熱變性后進(jìn)行雜交，其中所述DNA是從正常人末梢血中提取的，P53第72密碼子為Arg，而其中所述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為包含密碼子72的片斷，該密碼子存在于P53外顯示4中。
從末稍血提取的DNAP53Pro的電流變化(％)46％P53Arg的電流變化(％)17％PCR產(chǎn)物
P53Pro的電流變化(％)53％P53Arg的電流變化(％)11％可以認(rèn)為在完全配對(duì)的堿基序列和錯(cuò)配的堿基序列中這些電流變化有顯著的差別。
(實(shí)驗(yàn)例2)說(shuō)明表示根據(jù)堿基置換的數(shù)量測(cè)定的電流值不同，能測(cè)定錯(cuò)配的量的實(shí)驗(yàn)例。將dT20，dT10dAdT9，dT8dA4dT8，dAdT19，dA3dT17，dT19dA，dT17dA3等七種寡聚核苷酸分別對(duì)準(zhǔn)柱電極10使之固定，在此對(duì)dT20進(jìn)行雜交反應(yīng)。
在用于測(cè)定這些的電解質(zhì)溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1MKCI，0.05mM NFc)中，在20度時(shí)測(cè)定了470mV(Ag/AgCI參照電極基準(zhǔn))的雜交前后的電流值變化。
表1表示這一測(cè)定結(jié)果。
表1

在表1中電流變化大致隨著錯(cuò)配堿基量而變化。特別是在末端部存在錯(cuò)配的情況下，可以看到比Tm值大的變化。在現(xiàn)有的SSCP中用這樣的系列是檢測(cè)不出的，而本方法初步明確。
(實(shí)驗(yàn)例3)表示對(duì)于mRNA表達(dá)量的定量的實(shí)驗(yàn)例。將在大腸菌乳來(lái)于操縱子上的Lacz基因上存在的唯一序列40個(gè)大小(設(shè)計(jì)為非高級(jí)結(jié)構(gòu))的寡聚核苷酸5’末端導(dǎo)入巰基的物質(zhì)各自固定在柱電極10上(HS-ml60fmol)。
另外，將來(lái)自含有不同mRNA表達(dá)量的大腸菌的mRNA提取液放入不同的孔內(nèi)。這個(gè)微量滴定板上的孔里浸著事先調(diào)制過(guò)的柱電極10，在2×SSC、室溫、一小時(shí)的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。在用于測(cè)定這些的電解質(zhì)溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1M KCI，0.05mM NFc)中，在20度時(shí)測(cè)定了470mV(Ag/AgCI參照電極基準(zhǔn))的雜交前后的電流值變化。
得到的測(cè)定結(jié)果如圖7所示。由圖7可知直到mRNA量達(dá)到60fmol，隨著mRNA量的增加，電流變化△i(％)呈直線增加。
這樣，本實(shí)施例說(shuō)明了可以用fmol對(duì)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行定量。
實(shí)驗(yàn)例4表示檢測(cè)基因的實(shí)驗(yàn)例。將來(lái)自爪蟾屬的卵細(xì)胞細(xì)胞色素C的用于基因檢測(cè)DNA探針(5’-HS-AAGGTTGATTACTGGAATGGGGACCTGTTA-3’)分別固定在柱電極10上，將包含不同DNA量的目的基因(與DNA探針互補(bǔ)的DNA)溶液放入微量滴定板上的不同孔內(nèi)。這個(gè)微量滴定板的孔中浸沒(méi)著事先調(diào)制過(guò)的柱電極10，在2×SSC、室溫、一小時(shí)的條件下進(jìn)行原位雜交反應(yīng)。在用于測(cè)定這些的電解質(zhì)溶液(0.1M AcOH-AcOK(pH5.6)，0.1MKCI，0.05mM NFc)中，在20度時(shí)測(cè)定了470mV(Ag/AgCI參照電極基準(zhǔn))的雜交前后的電流值變化。
得到的結(jié)果如圖8所示。由圖8可知能夠檢測(cè)數(shù)十～數(shù)百fmol的目的基因。另一方面，不含細(xì)胞色素C的DNA樣品的電流變化幾乎觀察不到。
以上是本發(fā)明相關(guān)的基因的檢測(cè)方法、檢測(cè)裝置及檢測(cè)用芯片的實(shí)施例。但本發(fā)明并不特別限于這些實(shí)施例，在權(quán)利要求書(shū)中的技術(shù)事項(xiàng)的范圍內(nèi)有各種各樣的實(shí)施方式。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明相關(guān)的基因的檢測(cè)方法、檢測(cè)裝置及檢測(cè)芯片具有如上所述的結(jié)構(gòu)，因此能夠以高靈敏度、高速大量、簡(jiǎn)便地進(jìn)行檢測(cè)和基因。
這樣一種高靈敏度、高速大量處理本發(fā)明的檢測(cè)裝置在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有助于分析基因與性狀的關(guān)系。通過(guò)本發(fā)明基因的堿基序列、一個(gè)堿基置換SNP、多個(gè)堿基置換、點(diǎn)突變、易位、缺失、擴(kuò)增或三聯(lián)核糖醇的檢測(cè)分析裝置分析藥物代謝酶、抗癌基因等特定的基因，也可用于基因診斷。
例如本發(fā)明相關(guān)的檢測(cè)裝置能高靈敏度、高速大量地處理，所以能用于收集有關(guān)日本人基因的數(shù)據(jù)，鑒定與發(fā)病有關(guān)的基因，對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)防未來(lái)的疾病可以起到重要的作用。
另外，根據(jù)診斷基因也可以對(duì)選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ɑ蚋弊饔眯〉乃幬锲鹱饔谩?br> 利用疾病的基因分析結(jié)果也可以不必反復(fù)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)就能開(kāi)發(fā)新藥。
本發(fā)明由能使檢測(cè)用芯片相互拆裝自由的主體部和框架部構(gòu)成，在框架部上形成了能填充DNA樣品溶液等的凹部，通過(guò)極簡(jiǎn)單的操作就能將DNA樣品、窩邊式夾層等的溶液填充或取出，同時(shí)能用清洗液簡(jiǎn)單地沖洗凹的內(nèi)部。
在本發(fā)明中作為檢測(cè)用芯片的測(cè)定極，在主體部?jī)?nèi)側(cè)突出設(shè)置有排列成矩陣狀的柱電極，所以將柱電極插入裝有不同DNA的微量反應(yīng)板上的收容部?jī)?nèi)，由此可以同時(shí)一次修飾(固定)種類(lèi)不同的DNA。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)基因的芯片，具有多個(gè)柱電極作為測(cè)定極，其特征在于，在所述柱電極和所述柱電極的對(duì)極的通用電極之間加電壓，能檢測(cè)出電流。
2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于還具有所述柱電極的對(duì)極，即通用電極，該電極不與所述柱電極接觸。
3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，還具有能夠容納所述柱電極的同時(shí)有可以填充DNA樣品的凹部。
4.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，在所述柱電極上分別固定有具有不同基因序列的基因。
5.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，在所述柱電極上固定有具有不同DNA序列的多個(gè)PCR產(chǎn)物、寡聚核苷酸、mRNA、cDNA、PNA(肽核酸(peptidic nucleic acid))或LNA(locked nucleic acid；ProligoLLC商標(biāo))。
6.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，在所述柱電極上分別固定有具有相同基因序列的基因。
7.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，在所述柱電極上固定有具有相同基因序列的PCR產(chǎn)物、寡聚核苷酸、mRNA、cDNA、PNA(肽核酸(peptidic nucleic acid))或LNA(locked nucleic acid；Proligo LLC商標(biāo))。
8.如權(quán)利要求6所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，還具有能夠各自容納所述柱電極同時(shí)可以填充DNA樣品的多個(gè)凹部，在該多個(gè)凹部中可以分別填充不同的DNA樣品。
9.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，用于檢測(cè)基因的堿基序列、一個(gè)堿基置換SNP，多個(gè)堿基置換、點(diǎn)突變、易位、缺失、擴(kuò)增或三聯(lián)核糖醇。
10.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，所述柱電極在其表面鍍金而形成。
11.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于所述柱電極其部分表面用樹(shù)脂涂覆而形成。
12.如權(quán)利要求11所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于所述樹(shù)脂是PEEK或PTFE。
13.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，還具有支撐柱電極的支撐部件，所述柱電極突出設(shè)置于該支撐部件上。
14.如權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，所述柱電極通過(guò)點(diǎn)電極突出設(shè)置于所述支撐部件上。
15.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，還具有支撐柱電極的支撐部件，所述柱電極的一端鑲嵌在該支撐部件上。
16.如權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)基因的芯片，所述支撐部件為電路基板。
17.如權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，所述柱電極接觸或鑲嵌在所述支撐部件的端部，由環(huán)氧樹(shù)脂或PTFE包覆并固定在支撐部件上。
18.如權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于在所述柱電極中，只在不與所述支撐部件接觸或嵌合的端部固定基因而形成。
19.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于在所述柱電極中，在整個(gè)柱電極上固定有基因。
20.如權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于其內(nèi)部有空隙，所述柱電極設(shè)于所述支撐部件上向該空隙內(nèi)突出，所述通用電極的一部分或全部露出在該空隙內(nèi)。
21.如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于具有主體部和能與該主體部結(jié)合的框架部，所述主體部在其內(nèi)側(cè)面具有所述柱電極，所述框架部在其內(nèi)側(cè)面具有當(dāng)與該主體部結(jié)合時(shí)，能容納所述柱電極同時(shí)可以填充DNA樣品的凹部。
22.如權(quán)利要求21所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，所述主體部和所述框架部是裝拆自由的。
23.一種用于檢測(cè)基因的一個(gè)堿基置換SNP和點(diǎn)突變的芯片，具有裝拆自由的主體部和框架部，其特征在于所述主體部具有在其內(nèi)側(cè)面矩陣狀排列突出的作為測(cè)定極的多個(gè)柱電極，所述框架部在其內(nèi)側(cè)面具有當(dāng)安裝入所述主體部時(shí)可以接收所述多個(gè)柱電極同時(shí)可以填充DNA樣品的凹部，在所述凹部中設(shè)置有不與所述柱電極接觸而配置的對(duì)極，即，通用電極，所述柱電極固定有由不同的基因序列組成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸，在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，能檢測(cè)出電流。
24.如權(quán)利要求23所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于所述柱電極各自呈矩陣狀排列有多個(gè)，通過(guò)插入收容不同基因序列組成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸的各收容部，所述不同基因序列形成的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷被固定。
25.如權(quán)利要求1～24中的任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其用于基因診斷。
26.一種用于檢測(cè)基因的裝置，具有權(quán)利要求1～24中的任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)基因的芯片及能夠插入和取出該檢測(cè)芯片的測(cè)定裝置。
27.如權(quán)利要求26所述的用于檢測(cè)基因的裝置，其特征在于能用輝銻鐵元素控制所述基因檢測(cè)芯片的溫度。
28.一種檢測(cè)方法，使用權(quán)利要求1～24中的任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于在所述凹部?jī)?nèi)填充DNA樣品或由DNA樣品擴(kuò)增而成的DNA，使其進(jìn)行雜交，形成雙鏈，然后，從所述凹部中清除、洗凈所述DNA樣品或由DNA樣品擴(kuò)增而成的DNA，之后在所述凹部?jī)?nèi)填充含有電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)，使所述雙鏈鍵合所述電化學(xué)活性分子，然后在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，檢測(cè)流過(guò)的電流值。
29.一種檢測(cè)方法，使用權(quán)利要求1～24中的任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)基因的芯片，其特征在于，在所述凹部?jī)?nèi)填充DNA樣品或由DNA樣品基因擴(kuò)增而成的DNA和含有電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)，使之進(jìn)行雜交，形成雙鏈，同時(shí)使所述雙鏈與所述電化學(xué)活性分子鍵合，然后在所述通用電極和所述柱電極之間加電壓，檢測(cè)流過(guò)的電流值。
30.如權(quán)利要求28所述的檢測(cè)方法，其特征在于控制溫度的同時(shí)，使所述雙鏈與所述電化學(xué)活性分子鍵合。
31.如權(quán)利要求28所述的檢測(cè)方法，其特征在于，含有所述電化學(xué)活性分子的電解質(zhì)以二茂鐵、鄰苯二酚胺、金屬聯(lián)吡啶絡(luò)合物、金屬絡(luò)合物、生物睪丸酮或?qū)脒@些化合物的窩邊型嵌入化合物作為有效成份。
32.一種基因診斷的方法，其特征在于，使用了權(quán)利要求1～24中的任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)基因的芯片。
全文摘要
檢測(cè)芯片2由能夠互相拆裝的主體部5和框架4構(gòu)成。在主體部5的內(nèi)側(cè)突出多個(gè)矩陣狀的柱電極10。在這個(gè)柱電極10上固定著由不同基因序列組成的寡聚核苷酸。框架4的凹部8內(nèi)配置有共同電極,不與此柱電極10接觸。在凹部8處加入DNA樣品,在通用電極和柱電極10之間加電壓,通過(guò)檢測(cè)電流檢測(cè)雜交的雙鏈DNA,從而可以完成分析工作。
文檔編號(hào)G01N27/403GK1341211SQ00803998
公開(kāi)日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月20日
發(fā)明者竹中繁織, 內(nèi)田和彥, 宮原孝俊 申請(qǐng)人:竹中繁織, 內(nèi)田和彥, 宮原孝俊