可用于檢測與大腸癌相關(guān)的mdfi基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用
【專利說明】可用于檢測與大腸癌相關(guān)的MDFI基因啟動子區(qū)甲基化程 度的試劑盒及其應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明涉及一種輔助診斷大腸癌的檢測試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測與大 腸癌相關(guān)的/基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌（Colorectal Cancer，CRC)又稱結(jié)直腸癌，是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤。 目前研宄表明大腸癌是大腸黏膜上皮細(xì)胞在遺傳和環(huán)境等多種復(fù)雜的因素共同作用下，發(fā) 生遺傳和表觀遺傳的改變而獲得無限增殖，躲避凋亡程序等能力，從而在局部形成腫塊。近 年來，隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣與結(jié)構(gòu)的改變，加之人口老齡化趨勢的影響，我 國大腸癌的發(fā)病率和死亡率增長迅速，而且發(fā)病年齡明顯提前。盡管目前手術(shù)方式和輔助 治療手段不斷改進(jìn)，大腸癌的患者的術(shù)后生存情況有了較大的改善，但是CRC患者的五年 總體生存率仍舊不高，其中最重要的一個(gè)因素就是，許多患者在疾病發(fā)生的早期沒有得到 及時(shí)的診斷和治療。因此，有必要探索其他分子指標(biāo)獨(dú)立或者聯(lián)合CEA等檢測，對大腸癌患 者做到早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療，提高大腸癌患者總體生存率。
[0003] 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就是各類信號包括分子信號或外源刺激信號等通過細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)信 使分子介導(dǎo)，最終引起核內(nèi)靶基因表達(dá)改變的過程。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程發(fā)生障礙或異常， 必然會導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖、分化和代謝等一系列生物學(xué)異常，從而引起各種疾病甚至腫瘤 的發(fā)生。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生物發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作 用，其異常活化與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩種作用機(jī)制： 經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：當(dāng)細(xì)胞分泌的Wnt家族分泌蛋白（Wnt) 同時(shí)與細(xì)胞跨膜特異受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)rz)和輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān) 蛋白 5/6(low density lipoprotein receptor related protein5/6)結(jié)合后，角蟲發(fā)細(xì)胞 內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化的細(xì)胞內(nèi)散亂蛋白（Dishevelled，Dsh)，活化的Dsh能抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 0-連環(huán)蛋白（0-catenin)、軸蛋白或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（Axin or Conductin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉 (adenomatouspolyposis coli, APC)基因產(chǎn)物、糖原合成酶激酶 3 0 (glycogen synthase kinase-3 |3，GSK-3 |3 )復(fù)合物的形成（該復(fù)合物能夠降解細(xì)胞內(nèi)|3 -catenin)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) 0-catenin的積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（T cell factor，TCF)/淋巴樣增 強(qiáng)因子（lymphoid enchancing factor，LEF)結(jié)合，刺激 Wnt 信號革巴基因 遞P-蹲的轉(zhuǎn)錄。
[0004] 生肌決定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor,層/7/ or the inhibitor of the myogenic family,I~mfa)位于 6 號 染色體 (hr6:41，606, 198-61，621，982)，其編碼產(chǎn)物生肌決定因子基因家族抑制蛋白（MyoD family inhibitor,MDFIorthe inhibitor of the myogenic family,I-tufa),^一種 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能通過與肌源蛋白家族其他成員結(jié)合并且掩蓋生肌決定因子轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi) 的信號，從而抑制肌細(xì)胞形成過程。除此之外，有研宄表明，生肌決定因子基因家族抑制蛋 白（MyoD family inhibitor,MDFIorthe inhibitor of the myogenic family,I~mfa) 能夠通過與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（T cell factor, TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子（lymphoid enchancing factor，LEF)結(jié)合而抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。有研宄發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，生 肌決定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor,層Z7/ or the inhibitor of the myogenic family, 因啟動子區(qū)高甲基化而失活。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān) 于用于檢測大腸癌中生肌決定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor，MFJ or the inhibitor of the myogenic family，啟動子區(qū)甲基化程度的檢測試劑盒相關(guān) 研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測方便、針對性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確率高的可 用于檢測與大腸癌相關(guān)的/基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，其中基因 甲基化水平與大腸癌的患病率呈正相關(guān)，可通過對樣品DNA甲基化水平測定輔助診斷 大腸癌。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種可用于檢測與大腸癌相關(guān)的 基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒，包括/基因啟動子區(qū)的甲基化特異性擴(kuò)增上 游引物、下游引物及其甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' -Biotin -GTGTTAGGTTTTTGGTTGGGTTAAG-3' ； 所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -CCCCTTCCTTCTTCCTTCTCT-3' ； 所述的甲基化特異性測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -CTTCCCTAACCCACC-3'。
[0007] -種可用于檢測與大腸癌相關(guān)的/基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒的應(yīng) 用，該試劑盒可用于大腸癌輔助檢測、診斷或藥物治療中。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了可用于檢測與大腸癌 相關(guān)的/基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，所述的檢測試劑盒包含生肌 決定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor，層/Y or the inhibitor of the myogenic family, 啟動子區(qū)的甲基化特異性上游引物、甲基化特異性下游引物及 其甲基化特異性測序引物。生肌決定因子基因家族抑制基因啟動子區(qū)域的高甲基化，影響 轉(zhuǎn)錄因子與DNA間的相互作用，或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致生肌決定因子基因家族抑制基 因的低表達(dá)，從而影響大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，生肌決定因子基因家族抑制基因啟動子 區(qū)甲基化水平與大腸癌的患病率呈正相關(guān)，通過檢測生肌決定因子基因家族抑制基因啟動 子區(qū)甲基化程度輔助診斷大腸癌，簡單、方便，檢測效率高，針對性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確可靠、靈活 快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
[0009] 綜上所述，以基因啟動子區(qū)域甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒可以方便快 捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對大腸癌的檢測，同時(shí)，以/基因啟動子區(qū)域DNA甲基化為靶點(diǎn) 的藥物有望成為大腸癌輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
【附圖說明】
[0010] 圖1為被檢測序列所在區(qū)域(具體位置為chr6:41，606, 076-41，606, 130)，以及所 檢測的7個(gè)CpG點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0. 943, CpG2與 CpG3的相關(guān)系數(shù)為0.962); 圖2為DNA甲基化水平檢測結(jié)果示意圖（如圖示CpGl到CpG7的甲基化程度分別為69%， 67%，65%，64%，60%，56%，67%);圖中陰影部分