專(zhuān)利名稱(chēng)：中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因的新突變及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中國(guó)北方Lynch syndrome大腸癌患者的hMSH2基因的一種新的突變類(lèi)型。屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
hMSH2基因是大腸癌患者的致病基因之一。自Fishel等人1993年在Lynchsyndrome大腸癌患者中發(fā)現(xiàn)了 hMSH2基因突變后，國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)報(bào)道了 hMSH2基因在Lynch syndrome大腸癌中的突變位點(diǎn)。但hMSH2基因在中國(guó)北方Lynch syndrome大腸癌患者中的突變無(wú)人報(bào)道，尤其是在一例Lynch syndrome大腸癌患者中新發(fā)現(xiàn)的突變(在 c. 1127后插入7個(gè)堿基(AACAACA)并在c. 1129后缺失三個(gè)堿基(AAG))在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在已報(bào)道hMSH2基因突變基礎(chǔ)上更豐富了 hMSH2基因在大腸癌患者中的突變譜。為大腸癌患者的分子診斷和治療提供了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的發(fā)明人在14例Lynch syndrome大腸癌患者中開(kāi)展hMLHl基因外顯子l-19、hMSH2基因外顯子l-16、k-ras基因12和13密碼子、Braf基因11、15外顯子和PI3K基因9、20外顯子的突變篩檢，在I例Lynch syndrome大腸癌患者中發(fā)現(xiàn)了 hMSH2基因外顯子7的一種新的突變類(lèi)型。而該病例未攜帶其它與Lynch syndrome大腸癌有關(guān)的基因突變。在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號(hào)為NM_0002511所示的序列基礎(chǔ)上發(fā)生以下突變?cè)赾. 1127后插入7個(gè)堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個(gè)堿基AAG。(cDNA堿基位置的命名是從ATG開(kāi)始)。所述的突變hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的引物。優(yōu)選的，所述的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)所述的突變hMSH2基因或其片段的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括以上所述的引物。優(yōu)選的，所述的試劑盒中包括的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。更進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了所述的引物在制備診斷或檢測(cè)中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因試劑中的應(yīng)用。及所述的試劑盒在制備診斷或檢測(cè)中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(I)采用經(jīng)典的飽和酚氯仿的方法提取組織樣本DNA。(2)設(shè)計(jì)需要擴(kuò)增的hMSH2基因外顯子7的引物。
(3)配制25 μ I PCR擴(kuò)增體系，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4)瓊脂糖凝膠電泳配制I %瓊脂糖凝膠稱(chēng)取Ig瓊脂糖粉，加入到I. O X TBE電泳液中。PCR產(chǎn)物在100V的條件下電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后于紫外燈下觀察結(jié)果。若在目的片段大小的位置出現(xiàn)條帶則PCR成功，可以進(jìn)行下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳。(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳①制備玻璃板架將兩塊玻璃板平放，玻璃板之間的三邊插入膠條，三周用夾子夾緊，斜放在架子上。②配制濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠用500ml量筒量取243. 8ml雙蒸水至IOOOml大燒杯中；用IOOml和500ml量筒分別稱(chēng)取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入雙蒸水的大燒杯中，分別用移液管和移液器吸取4ml 10%過(guò)硫酸胺、200 μ ITEMED至大燒杯中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?。③加樣將上述配好的混合液用玻璃棒引流至已?jīng)夾好的玻璃板之間，插入梳子。將制好的聚丙烯酰胺膠連帶玻璃板夾固定在電泳槽上，倒入約400mLl X TBE0將準(zhǔn)備好的電泳槽連接到電泳儀上，300伏預(yù)電泳30分鐘。將變性buffer與PCR產(chǎn)物按照5 : I的比例至10 μ I體積混勻離心。98°C變性10分鐘，將變性后的PCR產(chǎn)物迅速冰浴。將PCR產(chǎn)物用微量加樣器加入上樣孔。④電泳將電泳槽放入4°C冰箱。300伏電泳5分鐘，150伏電泳過(guò)夜。⑤染色第二天停止電泳。取下玻璃板，棄掉電泳液，將兩玻璃板分離，將聚丙烯酰胺膠剝離出來(lái)。將剝離出來(lái)的凝膠放在盛有固定液的托盤(pán)里，放在搖床上固定10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。再將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有染色液的托盤(pán)里，染色10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。然后將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有顯色液的托盤(pán)里，直至條帶清晰可見(jiàn)。最后將凝膠裝入10#封口袋中，在凝膠成像系統(tǒng)的白光下照相，保存圖片并記錄結(jié)果。(7)將聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶出現(xiàn)異常者的PCR產(chǎn)物送至華大基因公司用ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果序列和NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的原始序列用Chromas2. 22 軟件(Technelysium Pty. Ltd.，QLD, Australia)進(jìn)行比對(duì)分析。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明是首次在1/14例Lynch syndrome大腸癌患者中檢測(cè)到hMSH2基因外顯子7的移碼突變。該突變位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。


圖I為一例Lynch syndrome大腸癌患者的外顯子7的SSCP結(jié)果圖；圖2為該病例外顯子7的測(cè)序結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例I(I)飽和酚氯仿法提取組織樣本DNA ①將Lynch syndrome大腸癌患者的術(shù)后切除的直腸癌組織組織樣本用液氮研磨，在研磨好的組織粉末中加入4ml TES緩沖液，10% SDS溶液250 μ l,20mg/ml蛋白酶K溶液50μ 1，充分混勻，使聚集的白細(xì)胞分散開(kāi)；56°C恒溫水浴2小時(shí)。 ②加入等體積的飽和酚，反復(fù)緩慢地顛倒離心管，混合兩相成乳狀液。③5000rpm，4°C, 15 分鐘離心。④用大口徑吸管吸取粘稠的水相(上層)，移至另一潔凈離心管中。⑤重復(fù)步驟②，③，④。 ⑥加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24 I)溶液，反復(fù)緩慢地顛倒離心管，混合兩相成乳狀液。重復(fù)步驟③，④。⑦重復(fù)步驟⑥兩次，第二次的水相(上層)轉(zhuǎn)移至IOOml小燒杯中。⑧加入2. 5倍體積的在_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，邊加邊輕搖，有DNA纖維狀沉淀析出，置于冰上15 30分鐘；用吸頭(最好將口熔封)撈出DNA，移到裝有l(wèi)ml70%乙醇的
I.5ml離心管中，漂洗。⑨12000rpm，4°C, 10分鐘離心，小心移去乙醇液；再用70%乙醇漂洗一次，棄乙
醇，置室溫，使乙醇揮發(fā)。⑩用適量TE溶液(400-800ul)溶解DNA，4°C冰箱保存。(短期保存可用水溶解DNA)。(2)設(shè)計(jì)hMSH2基因各外顯子的引物，該突變位點(diǎn)在外顯子7中，其引物序列如下上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。(3)配制25 μ I PCR擴(kuò)增體系如下HG buffer 12. 5 μ I, dNTP2 μ 1，上下游引物各
O.8 μ I, Supper Taq 酶 O. 5 μ I, DNAO. 8 μ I,雙蒸水 7· 6 μ I。(4)在型號(hào)為ΑΒΙ9700的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下95°C 5分鐘，以以下程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，72 °C延伸7分鐘，4°C保存。(5)瓊脂糖凝膠電泳配制I %瓊脂糖凝膠稱(chēng)取Ig瓊脂糖粉，加入到I. O X TBE電泳液中。用10 μ I微量移液器吸取2μ I 6X loading buffer于0.5ml EP管中，再吸取4μ I PCR產(chǎn)物于O. 5mlEP管中，離心后加到瓊脂糖膠孔中，IOOV電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后于紫外燈下觀察結(jié)果。若在目的片段大小的位置出現(xiàn)條帶則PCR成功，可以進(jìn)行下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳。(6)聚丙烯酰胺凝膠電泳①制備玻璃板架將兩塊玻璃板平放，玻璃板之間的三邊插入膠條，三周用夾子夾緊，斜放在架子上。
②配制濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)試劑40%聚丙烯酰胺取116g丙烯酰胺、4g雙丙烯酰胺、加超純水至1000ml，攪拌溶解。10 X T BE 緩沖液取 121. 15gTris Base,55. 65g硼酸，加 20ml 500mMEDTA (PH8. O)，加超純水至1L，混勻。10 %過(guò)硫酸胺取IOg過(guò)硫酸胺加超純水至IOOml，混勻。12%聚丙烯酰胺膠的配制用500ml量筒量取243. 8ml雙蒸水至IOOOml大燒杯中；用IOOml和500ml量筒分別稱(chēng)取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入雙蒸水的大燒杯中，分別用移液管和移液器吸取4ml 10%過(guò)硫酸胺、200 μ ITEMED至大燒杯中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹?。③加樣將上述配好的混合液用玻璃棒引流至已?jīng)夾好的玻璃板之間，插入梳子。這期間要不斷觀察，出現(xiàn)漏液立即補(bǔ)充。一到兩個(gè)小時(shí)后，拔掉上方的梳子及下方的玻璃條，將玻璃板周?chē)膴A子去掉，電泳槽底部倒入約300mL I X TBE，把玻璃板夾在電泳槽上，將玻璃板底部的氣泡趕出，在電泳槽上端兩塊玻璃板之間倒入約400mLl X TBE。將準(zhǔn)備好的電泳槽連接到電泳儀上，同時(shí)用IOml注射器沖洗梳子孔，將電泳槽放在4°C冰箱中，300伏預(yù)電泳30分鐘。準(zhǔn)備樣品。在0.5ml離心管中加入變性buffer 6 μ 1，然后加入PCR產(chǎn)物
I.8μ 1，離心。當(dāng)預(yù)電泳至30分鐘后，將離心好的樣品放入PCR儀中，98°C變性10分鐘。將變性后的PCR產(chǎn)物從PCR儀中迅速移至冰浴。將PCR產(chǎn)物用微量加樣器加入上樣孔。④電泳將電泳槽放入4°C冰箱。300伏電泳5分鐘，150伏電泳過(guò)夜。⑤染色第二天停止電泳。取下玻璃板，棄掉電泳液，將兩玻璃板分離，將聚丙烯酰胺膠剝離出來(lái)。配制固定液，染色液和顯色液，配方如下固定液無(wú)水乙醇100ml、冰乙酸4ml,加一蒸水至800ml,混勻。染色液硝酸銀I. 6g，加入甲醛4 μ 1，加一蒸水至800ml，混勻。顯色液氫氧化鈉128，加入甲醛4 4 I，加超純水至800ml，混勻。將剝離出來(lái)的凝膠放在盛有固定液的托盤(pán)里，放在搖床上固定10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。再將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有染色液的托盤(pán)里，染色10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。然后將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有顯色液的托盤(pán)里，直至條帶清晰可見(jiàn)。最后將凝膠裝入10#封口袋中，在凝膠成像系統(tǒng)的白光下照相，保存圖片并記錄結(jié)果。本發(fā)明的攜帶新突變的大腸癌病例外顯子7的SSCP結(jié)果圖，如圖I所示。(7)將聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶出現(xiàn)異常者的PCR產(chǎn)物送至華大基因公司用ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果序列和NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的原始序列用Chromas2. 22 軟件(Technelysium Pty. Ltd. ,QLD,Australia)進(jìn)行比對(duì)分析。該病例外顯子7測(cè)序結(jié)果如圖2所示，突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號(hào)為NM_0002511所示的序列的c. 1127后插入7個(gè)堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個(gè)堿基AAG。
權(quán)利要求
1.一種分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號(hào)為NM_0002511所示的序列基礎(chǔ)上發(fā)生以下突變?cè)赾. 1127后插入7個(gè)堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個(gè)堿基AAG。
2.如權(quán)利要求I所述的分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于所述的突變hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。
3.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的引物。
4.如權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
5.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括權(quán)利要求3或4所述的引物。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括權(quán)利要求4所述的引物，所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
7.權(quán)利要求3或4所述的引物在制備診斷或檢測(cè)中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5或6所述的試劑盒在制備診斷或檢測(cè)中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了中國(guó)北方大腸癌患者h(yuǎn)MSH2基因的新突變及其用途，它涉及中國(guó)北方Lynch syndrome大腸癌患者的hMSH2基因的一種新的突變類(lèi)型。本發(fā)明在1/14例Lynch syndrome大腸癌患者中發(fā)現(xiàn)一種新的突變，即在GeneBank登錄號(hào)為NM_0002511所示的序列基礎(chǔ)上發(fā)生以下突變?cè)赾.1127后插入7個(gè)堿基AACAACA并在c.1129后缺失三個(gè)堿基AAG。本發(fā)明在已報(bào)道hMSH2基因突變基礎(chǔ)上更豐富了hMSH2基因在大腸癌患者中的突變譜。為大腸癌患者的分子診斷和治療提供了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102634521SQ20121005768
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者朱琳, 梁靜, 王帆, 胡付蘭, 趙亞雙 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)