專利名稱：犬瘟熱弱毒疫苗株f和h基因重組新城疫病毒活載體疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H或HA)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa_⑶VR-F或rLa_⑶VR-H。本發(fā)明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗/試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
犬痕熱(⑶)是由犬痕熱病毒(Canine Distemper Virus, Q)V)感染引起的急性、高度接觸性傳染病。該病不但可以感染犬科動(dòng)物，還能感染鼬科、浣熊科和貓科等多種動(dòng)物，發(fā)病率高，幾乎可以達(dá)到100%，且臨床癥狀多樣，容易發(fā)生細(xì)菌、病毒的混合感染和繼發(fā)二次感染，死亡率更是可高達(dá)80%，素有“毀滅性傳染病”之稱[1]。近年來，Mee等從患 Pagets疾病的病人組織中檢測(cè)出犬瘟熱病毒核酸M，使得犬瘟熱成為繼狂犬病之后人畜共患的第二種疫病，引起了動(dòng)物病毒學(xué)界及醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注。犬痕熱病毒(caninedistemp virus,CDV)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亞科(Paramyxovirinae),麻疫病毒屬(Morbillivirus),為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)15690bp，編碼N、P、M、F、H、L和C蛋白。融合蛋白(fusion protein,F)，是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白，介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞間的融合，使病毒具有在宿主體內(nèi)擴(kuò)散的能力。研究發(fā)現(xiàn)雖然針對(duì)F蛋白的單抗不能完全中和CDV，但其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生ο附著或血凝素蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein, H 或 HA),是CDV囊膜表面上典型的II型糖蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是抗犬瘟熱病毒免疫的主要抗原?？谷翢岵《綡蛋白單克隆抗體具有病毒中和活性，對(duì)試驗(yàn)鼠的保護(hù)力強(qiáng)于抗F蛋白的單克隆抗體[4]。病毒通過H蛋白吸附到細(xì)胞表面的受體上，因此，H蛋白決定了犬瘟熱病毒宿主的特異性，并協(xié)助F蛋白使犬瘟熱病毒以囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞[5]。F、H是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位。CD是可以預(yù)防的，主要通過給幼犬接種犬瘟熱弱毒苗進(jìn)行免疫，但由于母源抗體的存在會(huì)直接干擾免疫效果，常常導(dǎo)致免疫失敗。因此研制不受犬只已有抗體干擾的疫苗廣品迫在眉睦。負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過程，其基本過程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動(dòng)子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板；②以基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板與啟動(dòng)病毒復(fù)制必須的轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能結(jié)構(gòu)蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達(dá)質(zhì)粒(T7啟動(dòng)子)一起，共轉(zhuǎn)染整合表達(dá)T7聚合酶的病毒復(fù)制許可細(xì)胞24-72小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。對(duì)基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system,RGS系統(tǒng))可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒。申請(qǐng)人:之前獲得授權(quán)的中國(guó)專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?00510097997. 8，申請(qǐng)日2005年9月2日)已經(jīng)建立了一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，并且成功拯救了野生型病毒株，并且為進(jìn)一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV病毒相關(guān)基礎(chǔ)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明人為研制更安全有效、生產(chǎn)成本低廉的犬瘟熱活載體疫苗，在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出表達(dá)犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8F或H蛋白的重組病毒rLa_CDVR_F或rLa_CDVR_H，通過Western-blot和免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證犬瘟熱融合蛋白和血凝素蛋白的正確表達(dá)，進(jìn)行兩株重組病毒的毒力檢測(cè)，并通過對(duì)小鼠和犬的免疫試驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中優(yōu)選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優(yōu)選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ IDNo. 2所示,和/或編碼所述犬痕熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過反向遺傳操作技術(shù)在新城疫LaSota弱毒疫苗中表達(dá)所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)，優(yōu)選用于表達(dá)所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗為rLa_⑶VR-F或rLa-CDVR-H。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供根據(jù)本發(fā)明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預(yù)防犬瘟熱和/或新城疫的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)本發(fā)明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括(I)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列，優(yōu)選所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615 ；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；
(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；和(4)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株，
其中優(yōu)選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優(yōu)選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；更優(yōu)選其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所不。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是PBRN-FL-F或pBRN-FL_H，和/或所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是質(zhì)粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供根據(jù)本發(fā)明的方法制備的重組新城疫LaSota弱毒疫苗。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供根據(jù)本發(fā)明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于受試者針對(duì)犬瘟熱的加強(qiáng)免疫，優(yōu)選所述受試者已經(jīng)用犬瘟熱 病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫,更優(yōu)選所述受試者選自由犬科動(dòng)物、鼬科動(dòng)物、綜熊科動(dòng)物和貓科動(dòng)物組成的組，最優(yōu)選犬科動(dòng)物，特別是犬。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防犬瘟熱和/或新城疫的試劑盒，其在相同或不同包裝或容器中包括(a)犬瘟熱病毒(CDV)弱毒疫苗；(b)根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優(yōu)選為rLa_⑶VR-F、rLa_⑶VR-H或它們的混合物；和任選地(C)使用說明書，優(yōu)選(a)和(b)是在試劑盒中的不同包裝或容器中，其中所述使用說明書指示(a)用于首次免疫，(b)用于加強(qiáng)免疫。非復(fù)制性活載體疫苗-新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)只在禽源組織中復(fù)制，具有宿主限制性，被其表達(dá)的外源蛋白與其它哺乳動(dòng)物病毒表達(dá)載體相比，具有較高的表達(dá)效率，而且生產(chǎn)成本低廉。NDV活載體疫苗不需佐劑即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生比較廣泛的免疫，包括體液免疫和較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，甚至粘膜免疫，是當(dāng)今與未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一。本研究選用單股負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作系統(tǒng)-新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株為載體，構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8) F或H基因的重組 NDV疫苗株，為研制和應(yīng)用安全、有效、生產(chǎn)成本低廉的新型犬瘟熱活載體疫苗及犬瘟熱的防制奠定基礎(chǔ)。更具體地，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)已知的新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)(參見ZL200510097997.8)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H。兩重組株均與親本株一致，具有高雞胚生長(zhǎng)滴度的特性和低致病性。重組株rLa-⑶VR-F免疫犬在初免和加強(qiáng)免疫后其體內(nèi)⑶V中和抗體均彡2 ;接種rLa-⑶VR-H或接種rLa-CDVR-F/Η混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗體效價(jià)平均值為2，而二次免疫后，中和抗體效價(jià)在一周后平均值分別達(dá)到37. 64和26. 24 ;CDV弱毒疫苗Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)接種組初次免疫一周中和抗體效價(jià)為19. 69，經(jīng)rLa-⑶VR-F/H混合病毒液加強(qiáng)免疫后中和抗體平均值高達(dá)204. 06。這一結(jié)果表明，重組疫苗株rLa-⑶VR-H表達(dá)的H蛋白的免疫原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于重組株rLa-⑶VR-F表達(dá)的F蛋白，但F蛋白在抗體滴度的維持方面呈現(xiàn)一定作用。rLa-⑶VR-F/H可不受⑶V抗體干擾，免疫增強(qiáng)效果顯著。這也為探尋新型犬瘟熱重組活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。


圖I.表達(dá)⑶VR F或H的重組型NDV基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建；圖2.激光共聚焦觀察⑶VR-F或⑶VR-H蛋白在重組病毒感染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；
圖3. ffestern-blot檢測(cè)⑶V F或H抗原在重組新城疫病毒感染細(xì)胞的表達(dá)；圖4.重組疫苗滴鼻及肌肉注射免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度；圖5.重組疫苗肌肉免疫犬誘導(dǎo)產(chǎn)生的病毒中和抗體滴度；圖6. pBRN-FL-Pmel 的質(zhì)粒圖譜；圖7.質(zhì)粒pBS-NP的序列，帶下劃線的斜體部分是NP基因的編碼序列；圖8.質(zhì)粒pBS-P的序列，帶下劃線的斜體部分是P基因的編碼序列；圖9.質(zhì)粒pBS-L的序列，帶下劃線的斜體部分是L基因的編碼序列；圖10.質(zhì)粒pBRN-FL-F的全序列；圖11.質(zhì)粒pBRN-FL-H的全序列。
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例I表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的構(gòu)建和生物學(xué)活性I材料和方法I. I 材料I. I. I細(xì)胞、病毒、重組質(zhì)粒、雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HEp_2細(xì)胞(ATCC CCL-23)和BHK-21細(xì)胞(ATCC CCL-10)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清DMEM ;Vero_E6細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3 (ATCC，VR-2153)購(gòu)于ATCC ；NDV感染性克隆質(zhì)粒pBRN-FL-Pmel以及輔助核蛋白(pBS_NP)、磷蛋白(pBS_P)和大聚合酶蛋白(pBS_L)重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[6’7]，它們也可以根據(jù)ZL200510097997. 8的說明書實(shí)施例I進(jìn)行構(gòu)建；重組新城疫弱毒疫苗株rLaSotate’7](其也可以根據(jù)ZL200510097997. 8的說明書實(shí)施例I進(jìn)行構(gòu)建)和表達(dá)綠色熒光蛋白的重組犬瘟熱病毒rCDVR-EGFP[6’7]均由本實(shí)驗(yàn)室克隆，拯救并保存；犬瘟熱弱毒疫苗株CDV/R-20/8購(gòu)自軍事獸醫(yī)研究所；雞抗NDV、鼠抗CDV和犬抗CDV高免血清均由本研究室制備；新城疫血凝抑制試驗(yàn)(HI)診斷抗原由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)并提供；9 11日齡SPF雞胚由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；3周齡BALB/c小鼠(均為雌性)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；12周齡比格犬購(gòu)自廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院。I. I. 2 主要試劑和儀器rTaq 酶,Primer Star HS DNA Polymerase 均購(gòu)自 TaKaRa公司；T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)處理的胰酶、FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的兔抗雞IgG和山羊抗鼠IgG熒光抗體、TIRTC(羅丹明衍生物)標(biāo)記山羊抗鼠IgG熒光抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體和兔抗雞IgG抗體均購(gòu)自Sigma公司；優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基opti_MEM、RNA提取試劑Trizol、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)試劑盒以及磷酸I丐轉(zhuǎn)染試劑盒(Calcium phosphateTransfection Kit)均購(gòu)自Invitrogen公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)及質(zhì)粒小量提取試劑盒(Plasmid Mini Kit)均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica DMIRB，購(gòu)自Leica公司。I. 2CDV/R-20/8融合蛋白(F)和血凝蛋白(H或HA)基因的獲取和序列分析從GenBank獲得⑶V弱毒疫苗株Rockborn基因組F和H基因的開放閱讀框(ORF)序列(F 基因 GenBank Accession No. AF026244. I ;H 基因 GenBank AccessionNo. GU266280. I)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(見表I)，在上述兩種上游引物起始密碼子ATG前分別加入了基因起始、基因間隔、基因終止和利于真核表達(dá)的Kozak序列，并在上下游引物中引入Pme I限制酶識(shí)別序列，同時(shí)要保證重組病毒基因組cDNA全長(zhǎng)總堿基數(shù)仍保持6的倍數(shù)。
將犬瘟熱弱毒疫苗株CDV/R-20/8按MOI約為I. O的病毒量接種于Vero-E6細(xì)胞中，72h后收獲病毒液。Trizol法提取病毒液中的基因組RNA，利用上述兩對(duì)成對(duì)的引物經(jīng)RT-PCR方法分別獲得F和H基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳回收后平端克隆到pBlueScr ip 11KS (+)載體的EcoR V位點(diǎn)，克隆產(chǎn)物分別命名為pBS-⑶VR-F和pBS-⑶VR-H，通過測(cè)序確?？寺〉幕蚱闻c病毒基因組DNA序列完全一致。表I.表達(dá)F或HA基因的全長(zhǎng)基因組克隆質(zhì)粒構(gòu)建所用引物
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引物名稱引物序列
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CDVR-H-PF 5 ^-GACTGTTTAAAClTTAGAAAAAAlllACGGGTAGAAlGrGCCGCCA CCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGT-3，
CDVR-H-PR 5，-GACTGTTTAAACTCAGGGATTTGAACGGTTACATG-3 ’
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Z注帶下劃線序列是F或H-特異性序列，限制性位點(diǎn)用粗體表示，Kozak序列用斜體表示，轉(zhuǎn)錄終止序列GE和轉(zhuǎn)錄起始序列Gs用加框表示。I. 3表達(dá)F或HA基因的重組病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建質(zhì)粒pBS-CDVR-F 和 pBS_CDVR_H 分別經(jīng) Pme I 酶切處理后，回收 CDVR-F 或 CDVR-H片段，并與同樣經(jīng)Pme I酶切去磷酸化的NDV感染性克隆質(zhì)粒pBRN-FL-Pmelm連接，分別構(gòu)建成表達(dá)⑶V/R-20/8F或H基因的重組基因組全長(zhǎng)cDNA克隆，分別命名為pBRN_FL_F和pBRN-FL-HοI. 4重組病毒的拯救BHK-21細(xì)胞接種于35mM六孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80% 90%單層時(shí)，按MOI約為
O.01的病毒量接種表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3。vTF7_3預(yù)感染細(xì)胞Ih后，利用磷酸隹丐轉(zhuǎn)染試劑盒(Calcium Phosphate Transfection System),將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 pBRN-FL-F 或pBRN-FL-H 及輔助質(zhì)粒 pBS-NP、pBS-P 和 pBS_L 分別以每孔 5 μ g、2. 5 μ g、I. 25μ g、l. 25 μ g共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，具體拯救方法見參考文獻(xiàn)m。收獲HA及HI實(shí)驗(yàn)m結(jié)果均為陽(yáng)性的尿囊液，-70°C凍存，并按常規(guī)方法分別接種于9 11日齡雞胚滴定每毫升病毒液EIDki含量。拯救出的重組病毒分別命名為rLa-⑶VR-F和rLa-⑶VR_H(在本文中有時(shí)也稱為rLa-CDVR-HA)。I. 5重組病毒的RT-PCR鑒定各取250 μ L重組病毒雞胚接種尿囊液，用Trizol經(jīng)常規(guī)方法提取病毒基因組RNA。分別以 CDVR-F-PF 和 pBRN-8306-PR (5' -GACTGCATTCACTGATGAG-3')或 CDVR-H-PF和pBRN-8306-PR為引物，參照文獻(xiàn)Μ中所述進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析。I. 6激光共聚焦檢測(cè)F或HA蛋白的表達(dá)將rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H 和 rCDV/R-20/8 病毒液按 MOI 約為 I. O 感染BHK-21細(xì)胞，24h后3%多聚甲醛固定20min。IxPBST洗3x5min后，依次以I : 50稀釋的鼠抗⑶V高免血清和雞抗NDV高免血清為一抗孵育lh，再依次以I : 200稀釋TIRTC標(biāo)記 山羊抗鼠IgG和FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG熒光抗體為二抗孵育lh。PBST洗滌完畢后，加入DAPI (2- (4-Amidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrochloride,購(gòu)自 sigma)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染核處理。使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)處理完畢的樣品進(jìn)行觀察并拍照。I. 7ffestern-Blot 檢測(cè) F 或 H 抗原表達(dá)將rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H 和 rCDV/R-20/8 病毒液按 MOI 為 5. O 感染單層BHK-21細(xì)胞，24h后將5% DMEM換成優(yōu)化培養(yǎng)基opti-MEM，同時(shí)每孔加入8yL的TPCK(O. 25μ g/μ L)。待80% 90%細(xì)胞脫落后離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)印，5%脫脂乳封閉過夜。一抗為I : 100稀釋的犬抗⑶V高免血清檢測(cè)F蛋白和H蛋白。二抗為I : 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗犬IgG。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色3 5min后去離子水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)空白BHK-21細(xì)胞為陰性對(duì)照。2 結(jié)果2. I表達(dá)F或H基因的重組病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建和重組病毒的拯救在新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，利用PCR手段在CDV/R-20/8株F或H基因兩端引入轉(zhuǎn)錄調(diào)控GE、GS序列和Pme I酶切位點(diǎn)后，插入同樣經(jīng)Pme I酶切處理的NDV感染性克隆pBRN-FL-Pmel，分別構(gòu)建成表達(dá)犬瘟熱弱毒疫苗株⑶V/R-20/8F或H基因的重組NDVcDNA克隆pBRN_FL_F，pBRN-FL-H (如圖I所示)。以CDVR-F-PF或CDVR-H-PF 分別和 pBRN-8306-PR(5' -GACTGCATTCACTGATGAG-3')為引物，利用 PCR 方法擴(kuò)增出2495bp和2333bp的產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果相符，經(jīng)測(cè)序鑒定已證實(shí)插入NDV全長(zhǎng)cNDA克隆的片段大小和方向均正確。為了從克隆的cDNA中拯救出感染性重組病毒，分別以pBRN-FL-F或pBRN-FL-H與表達(dá)NDV NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。休克、換液72h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)接于9 11日齡的SPF雞胚，繼續(xù)培養(yǎng)5天后收獲血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的尿囊液作為拯救病毒的Fl代。病毒樣品經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳代3次后，提取病毒液RNA，進(jìn)一步的RT-PCR及序列分析結(jié)果顯示，F(xiàn)3代重組病毒基因組的預(yù)期位點(diǎn)正確插入了 CDV/R-20/8株F或H基因及其引入的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。以上結(jié)果表明，通過反向遺傳操作技術(shù)，利用NDV LaSota疫苗株基因組cDNA克隆成功救獲了具有感染性的重組子代病毒rLa-CDVR-F 株和 rLa-CDVR-H 株。
2. 2共聚焦檢測(cè)檢測(cè)F或H蛋白表達(dá)為能更直觀地觀察重組病毒在細(xì)胞內(nèi)F或H蛋白表達(dá)量和錨定的位置，將親本株rLaSota(即通過反向遺傳操作技術(shù)由AV1615獲得的疫苗株)和重組株rLa-⑶VR-F，rLa-CDVR-H，rCDV/R-20/8分別感染BHK-21細(xì)胞24h后固定，以雞抗NDV高免血清和鼠抗⑶V高免血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG和TIRTC標(biāo)記山羊抗鼠IgG熒光抗體為二抗，DAPI染核處理制備共聚焦樣品。通過激光共聚焦觀察到親本株rLaSota感染的細(xì)胞內(nèi)只有NDV蛋白表達(dá)(圖2，B，C);在重組株rLa-⑶VR-F和rLa-⑶VR-H感染的BHK-21細(xì)胞中有NDV和⑶V兩類蛋白，且犬瘟熱病毒的兩種糖蛋白F和H均位于宿主細(xì)胞膜上(圖2，G，K)，而重組病毒r⑶V/R-20/8感染的細(xì)胞內(nèi)只有⑶V蛋白表達(dá)(圖2，N，0)。結(jié)果顯示重組病毒表達(dá)了 F或H蛋白。2. 3ffestern-Blot 檢測(cè) F 或 H 蛋白表達(dá)將重組病毒株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H和親本株rLaSota分別感染的BHK-21細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至尼龍膜后，以重組疫苗株r⑶V/R-20/8免疫制備的犬高免血清為一抗、HRP-標(biāo)記的兔抗犬IgG為二抗，進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。圖3d中顯示 分子量為60kDa的多肽與重組毒rLa-⑶VR-F感染細(xì)胞所表達(dá)的H)前體蛋白大小相一致。重組病毒rLa-⑶VR-H感染的BHK-21細(xì)胞中檢測(cè)到一種85kDa的多肽(圖3e)，這與完全糖基化的犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的大小相一致。在親本株rLaSota感染組(圖3b)和空白(圖3c)BHK-21細(xì)胞中均未檢測(cè)到⑶VR-F和H的特異性產(chǎn)物。這些結(jié)果顯示犬瘟熱病毒F和H抗原分別在重組新城疫病毒感染細(xì)胞中獲得了正確表達(dá)。實(shí)施例2重組病毒的致病性試驗(yàn)、對(duì)小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)和對(duì)犬的免疫試驗(yàn)I.材料與方法I. I重組病毒的致病性試驗(yàn)按O. I. E標(biāo)準(zhǔn)方法[9]對(duì)重組病毒rLa-⑶VR-F和rLa_⑶VR-H F3代進(jìn)行平均雞胚致死時(shí)間(MDT)、腦內(nèi)致死指數(shù)(ICPI)及靜脈內(nèi)致病指數(shù)(IVPI)等致病性指標(biāo)測(cè)定。I. 2重組病毒對(duì)小鼠的免疫試驗(yàn)將4周齡雌性BALB/c小鼠分為四組，每組15只，重組株rLa_⑶VR-F，重組株rLa-CDVR-H，rLa-CDVR-F/Η 混合病毒液(I I)以約 108_ 5EID5(I/100 μ L 劑量(半數(shù)雞胚感染量(EID5tl))經(jīng)滴鼻和肌注兩種途徑分別免疫，每只130yL，第四組為正常對(duì)照組，采用相同方式免疫親本株rLaSota。免疫28天后重組病毒均以相同劑量和相同途徑加強(qiáng)免疫小鼠。初次和加強(qiáng)免疫14天后小鼠眼眶后靜脈叢取血。由于分離的血清量較少不足以進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，因此采用間接ELISA試驗(yàn)進(jìn)行抗體滴定。通過間接ELISA方陣試驗(yàn)確定純化的r⑶V/R-20/8最適抗原包被濃度為5 μ g/mL后，以此濃度包被96孔ELISA板，4°C過夜放置。次日取出用I % BSA室溫封閉Ih后，加入待檢血清和陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋，于25°C放置lh，隨后以I : 4000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。I. 3重組病毒對(duì)犬的免疫試驗(yàn)分別將重組疫苗株rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H及rLa-CDVR-F/Η混合病毒液以2xl09·5EID50的劑量經(jīng)肌肉注射接種于12周齡比格犬各5只，同時(shí)取犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)免疫同齡比格犬5只作為對(duì)照。免疫后第四周以rLa-CDVR-F/H混合病毒液對(duì)所有免疫組進(jìn)行加強(qiáng)免疫。采集免疫后一周的犬前臂靜脈血，分離血清進(jìn)行熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)檢測(cè)。血清樣品首先經(jīng)56°C水浴滅活補(bǔ)體，隨后將連續(xù)4倍至128倍倍比稀釋好的血清與含100個(gè)TCID5tl (半數(shù)組織感染量)的r⑶VR-EGFP病毒等體積混合，37°C孵育Ih后每孔加入100 μ L Vero-E6細(xì)胞懸液。每個(gè)樣品作4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性血清對(duì)照。感染72h后用突光顯微鏡觀察結(jié)果。被檢血清的病毒中和抗體(virus neutralize antibody,VNA)滴度為能保護(hù)50%細(xì)胞孔不出現(xiàn)病變的血清最高倍數(shù)。2 結(jié)果 2. I重組病毒的致病性分析重組病毒株rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H F3代的半數(shù)雞胚感染量(EID5tl)分別為IO8.5/0· ImL和IO8-6Vo. ImL ;雞胚平均致死時(shí)間分別為130. 8h和135. 2h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90h，屬于溫和或緩發(fā)型毒株。該結(jié)果表明重組株保持了 LaSota弱毒疫苗親本毒株對(duì)雞胚良好的高滴度生長(zhǎng)適應(yīng)和低致病特性。2. 2重組病毒對(duì)小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)分別將親本毒 rLaSota，重組病毒 rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H (即 rLa-CDVR-HA)和混合病毒液rLa-⑶VR-F/H(即rLa-⑶VR-F+HA)經(jīng)滴鼻和肌注兩種途徑免疫4周齡的BALB/c小鼠，免疫四周后以相同方式進(jìn)行加強(qiáng)。對(duì)采集的血清樣品利用間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)抗體滴度。結(jié)果顯示，初免和加強(qiáng)免疫后重組株rLa-⑶VR-F與親本株rLaSota所免疫血清OD值均為陰性值，未檢測(cè)到抗體；而重組株rLa-⑶VR-H和混合免疫組rLa-⑶VR-F/H初免兩周后抗體濃度分別為2. 05 μ g/mL和I. 91 μ g/mL ;加強(qiáng)免疫兩周后抗體滴度顯著增加,分別達(dá)到58. 87 μ g/mL和44. 76 μ g/mL (如圖4所示)。2. 3重組病毒對(duì)犬的免疫試驗(yàn)將重組弱毒疫苗株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H、rLa-CDVR-F/Η混合病毒液以及Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)分別接種12周齡比格犬。并于初次免疫后4周用rLa-⑶VR-F/H混合病毒液進(jìn)行加強(qiáng)免疫。通過中和試驗(yàn)對(duì)所采集血樣的中和抗體滴度(virus neutralize antibody, VNA)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組株rLa-CDVR-F免疫犬在初免和加強(qiáng)免疫后其體內(nèi)⑶V中和抗體均< 2 ;接種rLa-⑶VR-H或接種rLa-⑶VR-F/H混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗體效價(jià)平均值為2,而進(jìn)行二次免疫后，抗體滴度顯著升高，產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)在一周后平均值分別達(dá)到37. 64和26. 24 ；Rockborn-20/8 (CDV/R-20/8)接種組初次免疫一周中和抗體效價(jià)為19. 69，經(jīng)rLa-CDVR-F/H混合病毒液加強(qiáng)免疫后中和抗體平均值高達(dá)204. 06 (圖5)。3.討論犬瘟熱呈世界性分布，敏感宿主范圍廣，而且可在大量不相關(guān)的動(dòng)物種類中進(jìn)行種間傳播，因此免疫接種預(yù)防犬瘟熱病毒感染具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，國(guó)內(nèi)外常用疫苗主要分為滅活苗和弱毒疫苗兩種，CDV滅活苗因免疫原性差，生產(chǎn)成本高而逐漸被弱毒疫苗、尤其聯(lián)苗取代。國(guó)內(nèi)常用的犬瘟熱弱毒疫苗為雞胚成纖維細(xì)胞源弱毒株(Ondersteppot)和犬細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株(Rockborn),犬痕熱弱毒疫苗雖然非常有效,但其本身易受母源抗體干擾，而且⑶V弱毒疫苗對(duì)溫度敏感、熱穩(wěn)定性差，對(duì)于疫苗的運(yùn)輸和保存條件要求很高。此外CDV弱毒疫苗對(duì)部分免疫缺陷犬和野生食肉動(dòng)物不安全，易出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)等問題。因此，尋求更安全有效、生產(chǎn)成本低廉的新型疫苗已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Norrby等用單抗親和層析方法純化⑶V的H、F蛋白抗原接種犬[1°]，這種基因工程亞單位疫苗雖然呈現(xiàn)較好的免疫原性，但其生產(chǎn)成本高。Cherpillod P et al (2000)將⑶V強(qiáng)毒株A75/17的F、H、N基因克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pCI，構(gòu)建了 pCI_N、pCI_F、pCI-H三種質(zhì)粒，混合肌注免疫犬，三次免疫后四周攻強(qiáng)毒發(fā)現(xiàn)，該DNA疫苗對(duì)免疫犬提供了保護(hù)力。但由于其存在安全隱患而未得到推廣。以活病毒作為載體表達(dá)外源基因能夠最大程度接近編碼蛋白的天然狀態(tài)，保持蛋白的抗原性，并可激發(fā)細(xì)胞免疫、體液免疫和局部粘膜免疫，是所有疫苗形式中最為理想的免疫方式。本研究中，我們以負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system,RGS)成功建立的新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株作為活病毒表達(dá)載體。由于新城疫病毒活載體疫苗在哺乳動(dòng)物中不能進(jìn)行有效復(fù)制，便不會(huì)造成病毒在免疫個(gè)體中或未免疫群體及整個(gè)環(huán)境的交叉?zhèn)鞑ィ@一特性表明其具有很高的安全性。而且其作為活載體疫苗 的有效性和安全性也已在靈長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得證實(shí)，被國(guó)際學(xué)術(shù)界認(rèn)為是防治重大烈性緊急傳染病極有希望的安全、有效活病毒疫苗載體。Ge JY[12]等已采用此NDV載體表達(dá)了狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因，免疫鼠和犬后，不僅表現(xiàn)出安全性，而且能夠有效持久地保護(hù)動(dòng)物抵抗狂犬病毒的攻擊。我們采用同樣的策略，分別構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱弱毒疫苗株Rockborn (CDVR)-20/8的融合蛋白(F)或血凝素蛋白(H)的重組新城疫病毒rLa-CDVR-F和rLa-⑶VR-H，經(jīng)Western-blot和免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證插入的外源蛋白能正確表達(dá)并發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能。很多研究證實(shí)，麻疹病毒屬的融合蛋白具有很低的免疫原性。雖然Malvoisin和ffild(1990)[13]已經(jīng)證明了具有中和活性的抗F單抗能被分離到，但是一直以來都認(rèn)為在體外試驗(yàn)中融合抗體只具有很低的中和活性。1992年，Taylor等[14’15]采用CPV和VV載體分別重組了 MV的H、F基因，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了不論是接種CP-MVF重組疫苗還是接種VV-MVF重組疫苗的犬體內(nèi)均未誘導(dǎo)產(chǎn)生MV中和抗體。這與本研究中免疫了重組株rLa-CDVR-F的小鼠和犬體內(nèi)均未產(chǎn)生中和抗體的試驗(yàn)結(jié)果相一致。免疫試驗(yàn)中通過對(duì)犬體內(nèi)中和抗體的持續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共同免疫了 rLa-CDVR-F/Η比單獨(dú)免疫rLa-CDVR-H的犬體內(nèi)中和抗體下降緩慢。這也表明犬瘟熱的融合蛋白在維持抗體滴度方面呈現(xiàn)一定的作用。犬瘟熱的血凝素蛋白具有較高的免疫原性，我們研究發(fā)現(xiàn)，免疫了重組株rLa-⑶VR-H或共同免疫了 rLa-⑶VR-F/H的小鼠一次免疫就能誘導(dǎo)產(chǎn)生與對(duì)照組有顯著差異的IgG抗體；而免疫犬在初免后雖然中和抗體滴度很低，但進(jìn)行二次免疫后，抗體滴度大幅提高。這也與Taylor等學(xué)者的研究結(jié)果相一致。但是免疫犬只在再次接種后一周抗體滴度顯著升高，但二周后迅速下降，抗體持續(xù)周期較短(數(shù)據(jù)未顯示)，這一特點(diǎn)與CDV弱毒疫苗免疫極其相似；因此，二次或多次加強(qiáng)免疫，對(duì)誘導(dǎo)高水平的免疫反應(yīng)并維持長(zhǎng)時(shí)間的有效保護(hù)反應(yīng)具有極為重要意義。但考慮到CDV抗體對(duì)CDV弱毒疫苗的干擾作用，CDV弱毒疫苗多次加強(qiáng)免疫可能導(dǎo)致免疫失敗，因此，在CDV弱毒疫苗首次免疫的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用rLa-⑶VR-F/H對(duì)Rockborn (⑶VR) -20/8免疫組進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)后一周的中和抗體滴度高達(dá)204，加強(qiáng)效果非常顯著。重組活載體疫苗rLa-⑶VR-F和rLa_⑶VR-H平均每毫升雞胚接種尿囊液病毒滴度可達(dá)109_5EID5(l/mL，對(duì)溫度不敏感，凍干疫苗產(chǎn)品可常溫運(yùn)輸不會(huì)導(dǎo)致疫苗滴度下降；雞胚接種的生產(chǎn)成本低遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CDV弱毒疫苗，操作簡(jiǎn)單便于大規(guī)模生產(chǎn)；NDV活載體疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)哺乳動(dòng)物呈一過性感染，不會(huì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，相比較于CDV弱毒疫苗具有更高的安全性，尤其對(duì)于水貂等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物安全性尤為重要。此項(xiàng)研究為進(jìn)一步探索犬瘟熱重組活病毒疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，重組活載體疫苗有望部分取代傳統(tǒng)CDV弱毒疫苗成為防制犬瘟熱更廉價(jià)、安全的新型重組基因工程活載體疫苗。參考文獻(xiàn)[I]周慶國(guó)，張更利.犬瘟熱與常見相似疾病臨診特征的比較[J].畜牧與獸醫(yī)，2000，32 (3) 32 33.[2]Mee AP,Dixon JA,Hoyland JA,Davies M,Selby PL,Mawer EB.Detection ofcanine distemper virus in 100% of Paget’ s disease samples by in situ-reversetransciptase polymerase chain reaction. 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權(quán)利要求
1.一種表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中優(yōu)選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優(yōu)選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如 SEQ ID No. 4 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中通過反向遺傳操作技術(shù)在新城疫LaSota弱毒疫苗中表達(dá)所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)，優(yōu)選用于表達(dá)所述犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何ー項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其為rLa_⑶VR-F或rLa-CDVR-H。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何ー項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預(yù)防犬瘟熱和/或新城疫的疫苗中的應(yīng)用。
6.ー種生產(chǎn)權(quán)利要求1-4中任何ー項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括 (1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入編碼犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列，優(yōu)選所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615 ； (2)構(gòu)建ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白⑵的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列； (3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；和 (4)收獲上清液，過濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株， 其中優(yōu)選所述犬瘟熱病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，優(yōu)選所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；更優(yōu)選其中編碼所述犬瘟熱病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示，和/或編碼所述犬瘟熱病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No. 4所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-F或pBRN-FL_H，和/或所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別是質(zhì)粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7中任何ー項(xiàng)的方法制備的重組新城疫LaSota弱毒疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何ー項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于受試者針對(duì)犬瘟熱的加強(qiáng)免疫，優(yōu)選所述受試者已經(jīng)用犬瘟熱病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫，更優(yōu)選所述受試者選自由犬科動(dòng)物、鼬科動(dòng)物、綜熊科動(dòng)物和貓科動(dòng)物組成的組，最優(yōu)選犬科動(dòng)物，特別是犬；還優(yōu)選所述疫苗是通過滴鼻或肌肉注射對(duì)所述受試者進(jìn)行免疫。
10.用于預(yù)防犬瘟熱和/或新城疫的試劑盒，其在相同或不同包裝或容器中包括(a)犬瘟熱病毒(⑶V)弱毒疫苗；(b)根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何ー項(xiàng)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優(yōu)選為rLa-⑶VR-F、rLa-⑶VR-H或它們的混合物；和任選地(c)使用說明書，優(yōu)選 (a)和(b)是在試劑盒中的不同包裝或容器中，其中所述使用說明書指示(a)用于首次免疫，(b)用于加強(qiáng)免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白(F)或犬瘟熱病毒血凝素蛋白(H)的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。本發(fā)明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備疫苗/試劑盒中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102816741SQ201210056899
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者步志高, 陳化蘭, 葛金英, 夏咸柱, 王喜軍, 高玉偉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司, 長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司