專利名稱：HBx和人IL-12雙基因重組載體及抗肝癌疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疾病基因免疫治療領(lǐng)域。涉及乙肝病毒X蛋白(HBx)和人白介素-12(hIL-12)雙基因重組載體及以其為主要活性成分制備的抗肝癌疫苗。
背景技術(shù)：
肝癌是人類常見的惡性腫瘤之一，世界每年新增肝癌患者62. 6萬，它的死亡率排在惡性腫瘤死亡率的第三位。肝癌是一種極具侵襲性的惡性腫瘤，其患者自確診后的平均6個(gè)月存活率不到50%，I年存活率為24%，5年存活率僅5%。我國屬肝癌高發(fā)區(qū)域，國內(nèi)肝癌發(fā)病率逐年上升。我國肝癌發(fā)病率占全球的45%,居我國癌癥發(fā)病率的第二位。現(xiàn)今肝癌治療仍以手術(shù)切除為主，然從臨床實(shí)踐來看，包括進(jìn)行術(shù)前化、放療后能 夠施行完全肝癌切除手術(shù)患者比例不到肝癌總例數(shù)的10%。其余90%肝癌患者雖可接受放療、包括射頻或酒精消融及給予阿霉素、氟尿嘧啶、順鉬、a -干擾素等進(jìn)行系統(tǒng)或肝動(dòng)脈輸注或栓塞化學(xué)療法，然而這些療法不僅毒性嚴(yán)重，且通常也無明顯疾病緩解或延長生存期效果。正由于肝癌缺乏有效控制方法，肝癌患者的預(yù)后極差。除可切除小型肝癌患者的5年存活率達(dá)到80 90%外，不能手術(shù)肝癌患者自癥狀發(fā)作后的平均存活時(shí)間只有3 4個(gè)月，而發(fā)展中國家全部肝癌病例的平均5年存活率僅為5%左右。肝癌迄今尚還處于一種嚴(yán)重缺乏有效治療藥物的尷尬境地，因此，肝癌治療是目前醫(yī)藥領(lǐng)域需予面對(duì)的強(qiáng)力挑戰(zhàn)之一。近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，以腫瘤免疫治療、基因治療為代表的腫瘤生物治療有望成為繼手術(shù)治療、化療和放療后肝癌治療的新手段。流行病學(xué)研究表明慢性HBV感染與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV屬嗜肝DNA病毒科正類嗜肝DNA病毒屬，基因組全長約3. 2kb，為部分單鏈的雙股環(huán)狀DNA。HBV基因組有4個(gè)開放讀碼框(ORF)，分別編碼包膜蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)及X蛋白。HBV基因組有4個(gè)開放讀碼框(open reading frame, ORF),分別編碼包膜蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)及X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)。乙肝病毒X抗原(HBx)上存在能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的抗原表位，這些抗原表位對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和急性肝炎患者表現(xiàn)出了良好的治療作用。臨床研究表明90%的HBV相關(guān)性肝癌患者的肝癌組織中表達(dá)HBx。因此，當(dāng)HBx特異性的CTL被激活時(shí)，HBx可以成為肝癌免疫治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。由于腫瘤抗原免疫原性弱、MHC分子表達(dá)下調(diào)和共刺激分子缺失等特點(diǎn)，機(jī)體對(duì)腫瘤存在免疫耐受，現(xiàn)有的腫瘤抗原往往不能誘導(dǎo)強(qiáng)而有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。白細(xì)胞介素12 (Interleukin 12，IL-12)作為一種異源二聚體細(xì)胞因子，能顯著促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞毒活性，促進(jìn)CTL細(xì)胞的應(yīng)答能力，誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN- Y，促使Th細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化等多種生物學(xué)活性。基因疫苗是將DNA直接注入動(dòng)物體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生蛋白刺激免疫系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的蛋白疫苗相比，基因疫苗非常穩(wěn)定，易于貯存；基因疫苗在宿主體內(nèi)可較長時(shí)間存在，抗原基因持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生抗原蛋白，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長效免疫，免疫效果可靠，避免了直接使用蛋白質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)而被抗體中和的弊端。基因治療的載體主要有病毒載體和非病毒載體兩種。到2009年12月份為止，在全世界范圍內(nèi)開展的1347項(xiàng)基因治療臨床方案中，以腺病毒為載體的方案占了其中的25% (342項(xiàng))，高于質(zhì)粒DNA非病毒載體(17.7%)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(20.8%)及其它病毒載體，并呈逐年呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，適應(yīng)癥包括腫瘤、心血管疾病、傳染性疾病(包括艾滋病)等多種重大疾病。目前，基因治療臨床方案基本是單基因治療。雙基因?qū)攵嗖捎脙煞N載體攜帶兩個(gè)不同的基因，但在體內(nèi)研究中幾乎不可能控制兩種腺病毒的感染效率，兩個(gè)基因的表達(dá)量也很難控制?；蛘卟捎迷趦蓚€(gè)基因間插入一個(gè)內(nèi)在的IRES位點(diǎn)共用同一個(gè)啟動(dòng)子，但是往往第二個(gè)基因的表達(dá)效率受第一個(gè)基因表達(dá)的影響，表達(dá)量很難受控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供能夠治療HBV相關(guān)性肝癌的新的靶向基因疫苗。
本發(fā)明提供一種裝載有編碼HBx蛋白的基因和編碼人IL-12蛋白的基因的重組載體，該重組載體能夠在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)HBx蛋白和人IL-12蛋白。其中，上述重組載體中所述的HBx編碼基因的核苷酸序列為Seq ID NO. I所示，所述的人IL-12編碼基因的核苷酸序列為Seq ID NO. 2所示。其中，上述重組載體中所述的編碼HBx蛋白的基因在hEFl-HTLV雜合啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，表達(dá)HBx蛋白的基因的表達(dá)框構(gòu)成是從5’到3’方向依次為hEFl-HTLV雜合啟動(dòng)子、編碼HBx蛋白的基因和SV40加尾信號(hào)。其中，上述重組載體中所述的表達(dá)HBx蛋白基因的表達(dá)框的的核苷酸序列為SeqID NO. 3 所示。其中，上述重組載體中所述的編碼人IL-12蛋白的基因在CMV5啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)，表達(dá)人IL-12蛋白基因的表達(dá)框的構(gòu)成是從5’到3’方向依次為CMV5啟動(dòng)子、編碼人IL-12蛋白的基因和P球蛋白加尾信號(hào)。其中，上述重組載體中所述的表達(dá)人IL-12蛋白基因的表達(dá)框的核苷酸序列為Seq ID NO. 4 所示。其中，所述的重組載體為復(fù)制缺陷型腺病毒，該病毒載體表達(dá)框架具有Seq IDNO. 5所示的核苷酸序列。其中，上述重組載體中所述的復(fù)制缺陷型腺病毒是血清型5的腺病毒。本發(fā)明還提供了含有上述重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了以上述重組載體為主要活性成分的抗肝癌疫苗。本發(fā)明還提供了上述的重組載體在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的用途。顯然，本發(fā)明上述技術(shù)方案中的表達(dá)載體可使用常用的真核表達(dá)載體、分離純化方法也可以參考使用現(xiàn)有的常用方法。而將所述的基因序列及表達(dá)框架構(gòu)建成載體，則可以參照各種基因工程手冊(cè)和具體使用的載體與宿主細(xì)胞的說明進(jìn)行。本發(fā)明首次將在同一載體上同時(shí)表達(dá)腫瘤抗原和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子腺病毒疫苗用于HBV相關(guān)性肝癌的靶向基因免疫治療，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的重組腺病毒疫苗中的雙因子可以起到協(xié)同靶向殺傷HBx陽性的肝癌細(xì)胞的作用，能夠顯著提高治療效果。本發(fā)明為HBV相關(guān)性肝癌的靶向基因免疫治療提供了新的選擇，具有良好的應(yīng)用前景。


圖l、pAdv-HBx/hIL-12 載體 PCR 鑒定。泳道從左到右分別為500bp marker, HBx陽性對(duì)照，克隆1，2，3。圖2、pAdv-HBx/hIL_12載體BamHI和XhoI酶切驗(yàn)證。上部分電泳圖顯示是BamHI酶切圖譜，泳道從左到右分別為100bp marker,克隆I, 2, 3,4, 5,6,未酶切plasmid I。下部分電泳圖顯示是XhoI酶切圖譜，泳道從左到右分別為lkb marker，克隆1，2，3，4，5，6，未酶切plasmid I。圖3、pAd-HBx/hIL_12質(zhì)粒(in BJ5183菌)PacI酶切鑒定圖譜。酶切后DNA電泳圖PacI酶切I 6號(hào)pAd-HBx/hIL-12質(zhì)粒(in BJ5183菌)圖譜，泳道從左到右分別為Ikb marker, I, 2, 3,4, 5,6 號(hào) pAd-HBx/hIL-12 質(zhì)粒，pAd-mPSMA。圖4、pAd-HBx/hIL-12質(zhì)粒(in JM109菌)PacI酶切鑒定圖譜。酶切后DNA電泳圖PacI酶切pAd-HBx/hIL-12質(zhì)粒(in JM109菌)圖譜，泳道從左到右分別為lkb marker,1，4 號(hào) pAd-HBx/hIL-12 質(zhì)粒。圖5、pAd-HBx/hIL-12 質(zhì)粒各自 BamHI，EcoRI, HindIII, XhoI 單酶切圖譜。上部分電泳圖顯示是Plasmid I酶切圖譜，泳道從左到右分別為BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI。上部分電泳圖顯示是Plasmid I酶切圖譜，泳道從左到右分別為BamHI，EcoRI, HindIII,XhoI。圖6、重組腺病毒pAd-HBx/hIL-12包裝293細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變。(A)正常293細(xì)胞(B)轉(zhuǎn)染線性化pAd-HBx/hIL-12的293細(xì)胞圖7、重組腺病毒pAd-HBx/hIL_12PCR鑒定。泳道從左到右分別為lkb marker,HBx 引物 +1，HBx 引物 +2，IL-12 引物 +1，IL-12 引物 +2。圖 8、mIL-12 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果。M =DNAmarker I :mIL_12 的 PCR 產(chǎn)物。圖 9、pAdV-HBx-mIL-12 的酶切鑒定。(A)M DNA marker I Pme I 單酶切 2 NheI和 EcoR I 雙酶切。(B)M DNA marker 1-6 Kpn I 和 Nco I 雙酶切。圖 10、pAd-HBx-mIL-12 的 Pac I 鑒定。M DNAmarker I Pac I 酶切。圖 11、Ad-HBx-mIL-12 的 PCR 鑒定。M DNA marker I :mIL_12 的 PCR 產(chǎn)物 2 HBx的PCR產(chǎn)物。圖12、腫瘤生長曲線和荷瘤小鼠生存時(shí)間。(A)⑶在保護(hù)性免疫模型中，肌肉免疫HBx/IL-12重組腺病毒疫苗IO7Vp/次，每周I次，共3次，結(jié)果表明該疫苗能夠抑制肝癌生長和延長荷瘤小鼠生存時(shí)間；(C) (D)在治療性免疫模型中，待皮下成瘤后，肌肉免疫HBx/mIL-12重組腺病毒疫苗107vp/次，每周I次，共3次，結(jié)果表明該疫苗能夠抑制肝癌生長和延長荷瘤小鼠生存時(shí)間。圖13、CTL體外殺傷腫瘤細(xì)胞活性作用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)。各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞孵育，結(jié)果提示HBx/IL-12重組腺病毒疫苗免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞能特異性殺傷HBx陽性的小鼠肝癌細(xì)胞。(A)脾細(xì)胞特異性殺傷小鼠肝癌細(xì)胞Ifepal-6 (HBx陽性)(B)脾細(xì)胞非特異性殺傷小鼠肝癌細(xì)胞Ifepal-6 (HBx陰性)圖14、HBx/IL-12重組腺病毒對(duì)Th分化的調(diào)節(jié)作用收集各實(shí)驗(yàn)組病毒刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IFN-Y (Thl)、IL-4(Th2)的水平，作為觀察不同Th的指標(biāo)。結(jié)果表明HBx/IL-12重組腺病毒能夠調(diào)節(jié)ThlT細(xì)胞的分化。(A)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y (Thl)的水平(B)小鼠脾細(xì)胞分泌IL_4(Th2)的水平圖15、HBx/mIL-12重組腺病毒疫苗在小鼠體內(nèi)激活CTL后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。各組小鼠的腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色，結(jié)果提示HBx/mIL-12重組腺病毒疫苗免疫可顯著誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞凋亡(A) NS (生理鹽水)(B) Ad-null (C)Ad-HBx (D) Ad-IL-12 (E) Ad-HBx/IL-12 (F)凋亡指數(shù)分析
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將生物學(xué)活性相互協(xié)調(diào)同的兩個(gè)基因HBx和IL-12構(gòu)建在同一個(gè)載體上，利用雙啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)HBx和IL-12，開發(fā)出一種靶向基因免疫治療HBV相關(guān)性肝癌中的雙基因重組疫苗。優(yōu)選的，使用的載體為腺病毒載體。實(shí)施例一 HBx和hIL-12雙基因重組腺病毒載體的構(gòu)建和篩選HBx和hIL-12雙基因重組腺病毒載體的構(gòu)建過程如下在雙基因穿梭載體PAdV-hcERB2/hIL-12(其表達(dá)框核苷酸序列為Seq ID NO. 6所示)的基礎(chǔ)上利用Age I酶切使其線性化，DNA片段進(jìn)行平端化后Nhe I進(jìn)行酶切產(chǎn)生粘性末端。質(zhì)粒pcDNA3. I-HBx (具有Seq ID NO. 7所示的核苷酸序列)用Pme I和Xba I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到-HBx-片段，一端為平末端，一端為Xba I酶切產(chǎn)生的粘性末端。-pAdV-hIL-12-大片段和-HBx-小片段利用T4DNALigase進(jìn)行連接，重組成pAdV-HBx/hIL-12穿梭質(zhì)粒，利用兩步法細(xì)菌內(nèi)同源重組法將pAdV-HBx/hIL-12穿梭質(zhì)粒上的HBx/hIL-12基因重組至腺病毒骨架載體pAdenoVator AE1/E3上，得到腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx/hIL-12，進(jìn)而在293A細(xì)胞中包裝成HBx和hIL-12雙基因重組腺病毒(Ad-HBx/hIL-12)，表達(dá)框具有Seq ID NO. 5所示的核苷酸序列。HBx和hIL-12雙基因重組腺病毒載體的構(gòu)建具體過程如下I.構(gòu)建 pAdV-HBx/hIL-12(I)質(zhì)粒 PAdV-hcERB2/hIL-12 和 pcDNA3. I-HBx 的轉(zhuǎn)化將從_80°C取出凍存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴上待其融化，加入I U L PAdV-hcERB2/hIL-12或pcDNA3. I-HBx質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，冰浴30min。菌液42°C熱激90秒后，立即冰浴2min。加入0. 9mL無抗生素的LB培養(yǎng)基,37°C恒溫?fù)u床上200rpm振搖Ih后,菌液4000rpm/min離心3min,棄上清，留100 y L上清重懸菌體。用玻璃推棒將菌液均勻涂布于含抗生素的固體LB培養(yǎng)基平板表面，37°C倒置培養(yǎng)過夜。(2)質(zhì)粒 pAdV-hcERB2/hIL-12 和 pcDNA3. I-HBx 的提取按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明操作挑取平板上的單克隆菌落，接種于含卡那霉素或氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜；收取l_5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，13000rpm離心I分鐘，棄上清。加入250 y L含有RNase A的重懸Buffer，充分重懸細(xì)菌沉淀后，加入250 u L裂解Buffer，溫和地顛倒混合6_10次，直至溶液變得清亮；隨即加入400 L中和Buffer，立即輕柔地顛倒混合6_10次，室溫放置5分鐘；室溫13000rpm離心10分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理過的Spin Column中，13000rpm離心I分鐘，棄濾液；將500 u L的蛋白去除Buffer加入Spin Column中，13000rpm離心30-60秒，棄濾液；加入600 ii L的Wash Buffer 13000rpm離心lmin,洗漆2次后，空柱13000rpm再離心2分鐘，除去殘留乙醇；待乙醇完全揮發(fā)后加入100 ii L的ddH20，13000rpm離心I分鐘洗脫DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> (3)質(zhì)粒 PAdV-hcERB2/hIL-12 和 pcDNA3. I-HBx 的酶切(制備連接片段)質(zhì)粒pAdV-hcERB2/hIL_12用Age I酶切使其線性化,純化回收后加入FragementKlenow對(duì)此線性化DNA片段平端化，乙醇沉淀后用Nhe I進(jìn)行酶切，純化回收得到-pAdV-hIL-12-片段。質(zhì)粒pcDNA3. I-HBx用Pme I和Xba I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，瓊脂糖凝膠純化回收酶切產(chǎn)物，得到HBx片段，具體酶切的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下l)AgeI 單酶切 pAdV-hcERB2/hIL_12Buffer AgeI5uL PAdV-hcERB2/hIL-1240uLAgeI5uL37°C酶切 lh，75°C IOmin,使 AgeI 酶熱失活2) Fragment Klenow 補(bǔ)平 Age I 酶切 pAdV-hcERB2/hIL_12 產(chǎn)物
F ragment Kl enownI uL
dNTPIuL
pAdV-hcERB2/hIL-12 酶切產(chǎn)物 15uL IOx buffer2uL
H2O6uL37°C 反應(yīng) 30min。3) NheI 單酶切 pAdV-hcERB2/hIL_12 片段
Buffer 24uL
BSA4uL
補(bǔ)平 pAdV-hcERB2/hIL-12 酶切產(chǎn)物 28uLNheI4uL37°C 酶切 Ih。I) PmeI 和 XhoI 雙酶切 pcDNA-HBXBuffer 45uL
BSA5uL
PmeI2.5uL
XhoI2.5uL
pcDNA-HBX25uL
H2OIOuL37。〇酶切211。
(4) pAdV-hIL-12 片段和 HBx 片段連接將經(jīng)酶切處理純化回收的pAdV-hIL-12大片段和HBx小片段進(jìn)行連接。pAdV-hIL-12大片段的兩端分別為平末端和Nhe I酶切產(chǎn)生的粘性末端，HBx小片段兩端分別為平末端和XhoI酶切產(chǎn)生的粘性末端，Nhe I與XhoI屬于同尾酶，二者具有相同的粘性
末端。連接反應(yīng)體系如下
Ligation Buffer 2uLT4 DNA Ligase 2uLpAdV-hIL-12 片段 3uLHBx 片段IOuL
H2O3uL16 °C連接過夜。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化取IOuL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Kana瓊脂平板37 °C過夜培養(yǎng)。(6)搖菌、堿裂解法提取質(zhì)粒、酶切驗(yàn)證及PCR驗(yàn)證挑取平板上單克隆菌落，接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm恒溫振蕩培養(yǎng)過夜；堿裂解法提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR驗(yàn)證和BamHI、XhoI雙酶切驗(yàn)證。pcDNA-HBx經(jīng)PmeI和XhoI雙酶切后回收純化得到的長度為456bp的HBx片段，pAdV-Hl/IL-12經(jīng)AgeI單酶切線性化后回收純化pAdV-IL_12大片段，片段平端化后用NheI進(jìn)行酶切，回收產(chǎn)物與HBx片段連接轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)PCR(圖I)和BamHI或XhoI酶切鑒定(圖2)篩選得到pAdV-hIL-12-HBx陽性克隆，選擇酶切正確的重組克隆送至上海英駿生物有限公司測(cè)序。2.構(gòu)建重組 pAd-HBx/hIL-12 質(zhì)粒腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建采用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法。(I)腺病毒骨架載體pAdenoVator A E1/E3的電轉(zhuǎn)化將I ill病毒骨架質(zhì)粒pAdenoVator A E1/E3加入至含有50 ill BJ5183感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的EP管中，混勻，冰上冷卻；設(shè)定電轉(zhuǎn)儀參數(shù)2500V，5ms ;將混合物加入電轉(zhuǎn)杯， 啟動(dòng)電擊程序；電擊結(jié)束迅速將樣品加入ImL LB培養(yǎng)基中，37°C低速振搖培養(yǎng)40min后涂布于含有氨節(jié)青霉素抗性的平板上，37°C培養(yǎng)過夜；次日挑取最小的菌落克隆，接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒，BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，鑒定正確骨架質(zhì)粒的菌液保種備用。(2) BJ5183/pAdenoVator A E1/E3 感受態(tài)的制備采用氯化鈣法制備經(jīng)鑒定正確的BJ5183/pAden0Vat0r AE1/E3感受態(tài)大腸桿菌。從平板上挑取新活化的單克隆菌落，接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，將該菌液按I : 100的比例接種于IOOml LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2h至0D600 = 0.5左右，冰上放置10分鐘后4°C 3000g離心10分鐘；棄去上清，用預(yù)冷的
0.05mol/L CaCl2溶液IOmL重懸大腸桿菌菌體，冰上放置15-30分鐘后，4°C 3000g離心10分鐘，棄去上清，加入4mL含15%甘油的0. 05mol/L的CaC12溶液重懸大腸桿菌，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，分裝存于_80°C備用。(3)pAdV-HBx/hIL-12質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdenoVator A E1/E3大腸桿菌內(nèi)同源重組將pAdV-HBx/hIL-12質(zhì)粒進(jìn)行FseI線性化，普通化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化入BJ5183/pAdenoVator A E1/E3感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取平板上最小的菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)，小量抽提，PacI酶切鑒定。由于BJ5183為recA+，質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變而不夠穩(wěn)定，我們將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx/hIL-12轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。搖菌、提取質(zhì)粒后PacI單酶切或BamHI, EcoRI, HindIII, XhoI 酶切驗(yàn)證鑒定。挑取體積較小的克隆搖菌后提取質(zhì)粒，并用PacI酶切單酶切鑒定，重組腺病毒質(zhì)粒pAdV-HBx/hIL-12經(jīng)Pac I酶切后，可見約30kb的大片段以及3. Okb的小片段，圖3結(jié)果顯示2，3,4, 5號(hào)克隆可能重組正確。由于BJ5183為recA+，質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變而不夠穩(wěn)定，我們將鑒定正確的2，4，5號(hào)重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx/hIL-12轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。搖菌、提取質(zhì)粒后PacI單酶切I號(hào)和4號(hào)pAd-HBx/hIL-12質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖4所示；同時(shí)我們?cè)俨捎肂amHI，EcoRI, HindIII, XhoI酶切驗(yàn)證鑒定，得到多條條帶，電泳結(jié)果如圖5所示。3.重組腺病毒Ad-HBx/hIL-12的包裝、鑒定(I)重組腺病毒Ad-HBx/hIL-12的包裝PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒Ad-HBx/hIL-12，完全線性化后，乙醇沉淀，再用適量ddH20溶解；2 ii g質(zhì)粒和10 ii L脂質(zhì)體分別稀釋于250 u L無血清培養(yǎng)基，再混合，置于室溫下15-30min ;棄去6孔板中的培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基輕輕洗漆細(xì)胞后,加2mL無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基，將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶，37°C孵箱孵育培養(yǎng)4_6h，4_6h后棄Lipofectamine-DNA混合液，2mL含有抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基。約15天后觀察到細(xì)胞腫脹、變圓，部分細(xì)胞脫壁漂浮，聚集成葡萄狀，表現(xiàn)出典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)，可見明顯的病毒空斑，表明重組腺病毒包裝成功(圖6)。待80%-90%細(xì)胞病變，此時(shí)收集細(xì)胞和上清，37°C /_80°C反復(fù)凍融3次，離心收集的上清為包裝成熟的原代重組腺病毒。(2)重組腺病毒Ad-HBx/hIL-12的鑒定轉(zhuǎn)染15天后，細(xì)胞完全病變時(shí)收集上清和細(xì)胞沉淀，370C /_80°C反復(fù)凍融3次，離心收集的上清為包裝成熟的原代重組腺病毒。取I病毒上清加入IOii I蛋白酶K,55°C孵育Ihr，再煮沸5min，離心后取1_2 y I分別用針對(duì)HBx和hIL_12基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。基因HBx的PCR條件
權(quán)利要求
1.裝載有編碼HBx蛋白的基因和編碼人IL-12蛋白的基因的重組載體，該重組載體能夠在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)HBx蛋白和人IL-12蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組載體，其特征在于所述HBx編碼基因的核苷酸序列為SeqID NO. I所示，所述的人IL-12編碼基因的核苷酸序列為Seq ID NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組載體，其特征在于所述編碼HBx蛋白的基因在hEFl-HTLV雜合啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，表達(dá)HBx蛋白的基因的表達(dá)框的構(gòu)成是從5’到3’方向依次為hEFl-HTLV雜合啟動(dòng)子、編碼HBx蛋白的基因和SV40加尾信號(hào)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述表達(dá)HBx蛋白基因的表達(dá)框的的核苷酸序列為Seq ID NO. 3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組載體，其特征在于所述編碼人IL-12蛋白的基因在CMV5啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)，表達(dá)人IL-12蛋白基因的表達(dá)框的構(gòu)成是從5’到3’方向依次為CMV5啟動(dòng)子、編碼人IL-12蛋白的基因和P球蛋白加尾信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述表達(dá)人IL-12蛋白基因的表達(dá)框的核苷酸序列為Seq ID NO. 4所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組載體，其特征在于所述的重組載體為復(fù)制缺陷型腺病毒，該病毒載體表達(dá)框架的核苷酸序列為Seq ID NO. 5所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于所述的復(fù)制缺陷型腺病毒是血清型5的腺病毒。
9.含有權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的重組載體在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的用途。
11.抗肝癌疫苗，其特征在于所述的抗肝癌疫苗的主要活性成分為權(quán)利要求I 8任一項(xiàng)所述的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，要解決的問題是提供能夠治療HBV相關(guān)性肝癌的新的靶向基因疫苗及其在制備HBV相關(guān)性肝癌靶向基因免疫治療藥物中的用途。本發(fā)明抗肝癌疫苗的主要活性成分為裝載有編碼HBx蛋白的基因和編碼人IL-12蛋白的基因的重組載體，該重組載體能夠在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)HBx蛋白和人IL-12蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的重組腺病毒疫苗能靶向殺傷HBx陽性的肝癌細(xì)胞，表現(xiàn)出良好的抗肝癌效果。本發(fā)明重組腺病毒疫苗為HBV相關(guān)性肝癌的靶向基因免疫治療提供了新的選擇，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102660579SQ20121013494
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者文艷君, 李玉華, 楊莉, 程平, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)