專利名稱：一種利用issr分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于牧草種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定牧草的方法。
背景技術(shù)：
狼尾草屬(Pennisetum Rich.)牧草為一年生或多年生禾本科牧草,是優(yōu)質(zhì)的牧草資源。其中象草(P. purpureum)具有高產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富并喜高溫多雨等特點(diǎn),美洲狼尾草 (P. americanum)品質(zhì)優(yōu),適口性好,美洲狼尾草(父本)與象草(母本)的種間三倍體雜種雜交狼尾草兼具父本與母本的優(yōu)點(diǎn)，并有適應(yīng)性強(qiáng)、供草期長(zhǎng)的特點(diǎn)，作為草食動(dòng)物優(yōu)良的青飼料，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。隨著研究的深入，優(yōu)質(zhì)狼尾草的引種和選育就顯得越來(lái)越重要，然而由于狼尾草屬種內(nèi)種間反復(fù)雜交，導(dǎo)致遺傳分化越來(lái)越多樣，新老品種繁多，品種間的形態(tài)學(xué)差異越來(lái)越小，且不同地域經(jīng)常交換，造成同名異物或同物異名現(xiàn)象，單靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法已經(jīng)很難區(qū)分如此眾多的品種，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，從DNA分子的角度準(zhǔn)確可靠地對(duì)品種進(jìn)行基因鑒定成為可能，現(xiàn)階段已被廣泛應(yīng)用。DNA分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA 水平遺傳多態(tài)性的直接反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記一形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有較多的優(yōu)越性在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；不受外界環(huán)境影響；大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，有利于選擇隱性性狀；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速?，F(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于物種品種鑒定、未緣關(guān)系鑒別、遺傳育種、基因定位、基因克隆等方面。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats,簡(jiǎn)單序列重復(fù))分子標(biāo)記是 Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來(lái)的,屬于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的一種。其基本原理是利用生物基因組中廣泛存在的簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR(Simple Sequence Repeat)設(shè)計(jì)引物,無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序，在PCR反應(yīng)中，對(duì)與引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。所擴(kuò)增的Inter SSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可在不同種間通用，不像SSR標(biāo)記引物具有較強(qiáng)的種特異性；與RAPD標(biāo)記相比，穩(wěn)定性高，獲得的信息量大；與PFLP相比，具有檢測(cè)方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。由于ISSR分子標(biāo)記快速、簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，并且ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性高，因此可用于植物品種鑒定。ISSR-PCR可擴(kuò)增出大量特異性DNA片段，這些特異性片段的組合可作為某一品種區(qū)別于其他品種的獨(dú)特標(biāo)記，也有人稱之為“指紋”。通過檢測(cè)樣品是否具有特有的“指紋”，可以有效的進(jìn)行品種鑒定。Charter利用ISSR分子標(biāo)記區(qū)分鑒定了可可豆種質(zhì)，魏臻武在苜?；蚪MISSR分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了苜?；蚪MDNA指紋圖譜， 作為苜蓿品種鑒定的依據(jù)。但至今國(guó)內(nèi)外未見應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法區(qū)分鑒定狼尾草屬牧草的報(bào)道。狼尾草屬牧草種子和幼苗形態(tài)相近，不易區(qū)分，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法鑒定狼尾草屬牧草，一方面可彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足，另一方面可促進(jìn)引種、選育過程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835其核苷酸序列分別為
UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG ；
UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。
所述ISSR分子標(biāo)記所用引物還可包括UBC817或UBC843，其核苷酸序列分別為
UBC817-CACACACACACACACAA ；
UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。
所述鑒定方法的具體步驟為
(I)提取狼尾草屬DNA，構(gòu)建DNA池；
(2)利用ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增狼尾草屬DNA ；
(3)構(gòu)建狼尾草屬DNA電泳模式圖；。
(4)鑒定狼尾草屬牧草。
步驟(I)所述狼尾草屬牧草的DNA池分別由每種材料的三個(gè)單株的DNA等量混
合稀釋而成，DNA終濃度為10ng/yL。步驟(2)所述ISSR-PCR反應(yīng)引物及核苷酸序列為 UBC815 ((CT) 8G)、UBC835 ((AG) 8YC)。步驟(2)所述ISSR-PCR反應(yīng)體系及程序25 μ L體系Taq酶2U、10 X Taq Buffer 2. 5 μ L、25mM/L 的 Mg2+L 5 μ L、2. 5mM/L 的 4 種 dNTP 混合物 I. 2 μ L、IOng/ μ I 的引物 I. 5 μ L、IOng/ μ I DNA 模板 I. 5 μ L、ddH20 補(bǔ)足 25 μ L ；;擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性 3min, 94°C 變性45s, 50 60°C退火45s, 72°C延伸45s,循環(huán)38次，72°C再延伸IOmin0步驟(3)中用1%瓊脂糖凝膠，O. 5XTBE緩沖液為介質(zhì)電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)電泳圖繪制電泳模式圖。所述繪制電泳模式圖，以最終ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、品種區(qū)分度高的電泳圖譜為基礎(chǔ)，選取條帶清晰的多態(tài)性位點(diǎn)繪制電泳模式圖，可直觀的區(qū)分狼尾草屬7種牧草。本發(fā)明還提供了上述方法在鑒定狼尾草屬牧草中的應(yīng)用。所述狼尾草屬牧草優(yōu)選為雜交狼尾草一號(hào)、雜交狼尾草二號(hào)、雜交狼尾草三號(hào)、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草。本發(fā)明有效解決了狼尾草屬牧草在引種、選育、生產(chǎn)中單靠形態(tài)無(wú)法進(jìn)行品種區(qū)分的困難。ISSR分子標(biāo)記快速、簡(jiǎn)便、可靠、穩(wěn)定性高、DNA需要量少，可減輕傳統(tǒng)品種區(qū)分所帶來(lái)的工作量。本發(fā)明大大改善了品種在生產(chǎn)推廣過程中，以劣充優(yōu)，魚龍混雜，以假亂真的問題。建立起的ISSR-PCR產(chǎn)物電泳模式圖可直觀的顯示種(品種)之間基因的差異性，保證生產(chǎn)科研中種(品種)真實(shí)性、一致性，快速有效的鑒定其身份，也可為新品種的登記提供有力的證據(jù)，可確保其在生產(chǎn)上的大力推廣。


圖I引物UBC815擴(kuò)增結(jié)果；圖2引物UBC835擴(kuò)增結(jié)果；圖3引物UBC815擴(kuò)增電泳模式圖；圖4引物UBC835擴(kuò)增電泳模式圖；圖5引物UBC817擴(kuò)增結(jié)果；圖6引物UBC843擴(kuò)增結(jié)果；圖7引物UBC817擴(kuò)增電泳模式圖；圖8引物UBC843擴(kuò)增電泳模式圖。其中，I代表雜交狼尾草一號(hào)，2代表雜交狼尾草二號(hào),3代表雜交狼尾草三號(hào),4代表象草，5代表雜交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表闊葉狼尾草。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I篩選狼尾草屬的ISSR分子標(biāo)記(I)以搜集到的狼尾草屬主要的2個(gè)種及其雜交種的7份材料為對(duì)象，分別為雜交狼尾草一號(hào)、雜交狼尾草二號(hào)、雜交狼尾草三號(hào)、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草；(2)幼苗培養(yǎng)選取各品種均勻一致的種子各100粒，溫室條件下，培養(yǎng)20d，形成的正常幼苗作為試驗(yàn)材料；(3)采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根試劑公司)進(jìn)行單株幼苗的總 DNA提取，每種材料隨機(jī)選取三單株，采用O. 8%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)并用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA樣品的濃度見表1，制備每種材料的DNA池，使DNA終濃度為IOng/ μ L ；表I樣品DNA濃度測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法，其特征在于，ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835，其核苷酸序列分別為UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG ；UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述ISSR分子標(biāo)記所用引物還可包括 UBC817或UBC843，其核苷酸序列分別為UBC817-CACACACACACACACAA ；UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)提取狼尾草屬DNA，構(gòu)建DNA池；(2)利用ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增狼尾草屬DNA；(3)構(gòu)建狼尾草屬DNA電泳模式圖；(4)鑒定狼尾草屬牧草。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述狼尾草屬牧草的DNA池分別由每種材料的三個(gè)單株的DNA等量混合稀釋而成，DNA終濃度為IOng/ μ L。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述ISSR-PCR反應(yīng)所用引物為 UBC815 和 UBC835。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述ISSR-PCR反應(yīng)體系及程序?yàn)?25 μ L 體系Taq 酶 2U、10XTaq Buffer 2· 5 μ L、25mM/L 的 Mg2+L 5 μ L、2. 5mM/L 的 4 種 dNTP 混合物 I. 2 μ L、IOng/ μ I 的引物 I. 5 μ L、IOng/ μ I 的 DNA 模板 I. 5 μ L、ddH20 補(bǔ)足 25 μ L ； 擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min，94°C變性45s，50 60°C退火45s，72。。延伸45s，循環(huán)38次， 72°C再延伸 IOmin0
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中用1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE緩沖液為介質(zhì)電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)電泳圖繪制電泳模式圖。
8.如權(quán)利要求I 7任意一項(xiàng)所述的方法在鑒定狼尾草屬牧草中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述狼尾草屬牧草為雜交狼尾草一號(hào)、雜交狼尾草二號(hào)、雜交狼尾草三號(hào)、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草。
全文摘要
本發(fā)明屬于牧草種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835，其核苷酸序列分別為UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。本發(fā)明填補(bǔ)了應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法區(qū)分狼尾草屬牧草種(品種)的空白，本發(fā)明最終繪制的區(qū)分試驗(yàn)所用7份狼尾草屬牧草材料的電泳模式圖，可作為區(qū)分鑒定這7份材料的依據(jù)。本發(fā)明擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不可靠因素，快速、準(zhǔn)確的區(qū)分7份狼尾草屬牧草材料，作為種、品種、品系審定的可靠依據(jù)，確保種質(zhì)在生產(chǎn)上的大力推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586449SQ20121005748
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者于曉丹, 劉斯佳, 張?zhí)N薇, 李洪超, 楊富裕, 毛培勝, 王樂 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)