專利名稱：美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種美洲狼尾草組培脫毒成苗的 快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
狼尾草為國(guó)家審定品種，具有產(chǎn)草量高、抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)好、耐刈割和全生育期無 明顯病蟲危害的特點(diǎn)，是草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料和理想的水土保持作物。近年來，隨著雜交 狼尾草優(yōu)質(zhì)紙漿、中密度纖維板生產(chǎn)技術(shù)和作為生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷完善，對(duì)雜交 狼尾草的需求量正在迅速增加。但在品種大面積推廣應(yīng)用時(shí)，發(fā)現(xiàn)雜交狼尾草有一定比例 的雜株，明顯影響雜種優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮及利用，究其原因與純度有關(guān)。狼尾草常遭受病毒侵害， 使品質(zhì)變劣，產(chǎn)量下降，同時(shí)也加速了品種退化。有關(guān)美洲狼尾草技術(shù)快速脫毒繁殖技術(shù)尚 未見正式報(bào)道。組織培養(yǎng)是一種高效的繁殖技術(shù)，采用幼嫩心葉或莖尖分生組織培養(yǎng)，也是獲得 無病種苗的有效途徑。傳統(tǒng)的美洲狼尾草組培快繁方法，愈傷組織誘導(dǎo)及分化的繼代次數(shù) 多，變異率較高，操作繁瑣，污染機(jī)率大；腋芽培養(yǎng)和莖尖生長(zhǎng)錐培養(yǎng)可有效地降低變異率， 但需經(jīng)歷小苗與叢生苗誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等多次繼代。上述兩條途徑通常要對(duì)材 料進(jìn)行至少幾個(gè)月的培養(yǎng)，才可分化出苗，耗時(shí)長(zhǎng)，效率低。因此，迫切需要技術(shù)方法上的改 進(jìn)革新，以節(jié)約資源消耗，提高美洲狼尾草組培效率，為真正實(shí)現(xiàn)GAP栽培和規(guī)?；a(chǎn)提 供技術(shù)平臺(tái)，具有較大的應(yīng)用前景

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中狼尾草常遭受病害侵 害，使品質(zhì)變劣，產(chǎn)量下降，品種退化的缺點(diǎn)，提供一種能大量、快速繁殖美洲狼尾草，又能 脫除所帶病毒并經(jīng)特異檢測(cè)，以確保無毒脫毒、組培與檢測(cè)的配套方法。使美洲狼尾草實(shí)現(xiàn) 從幼嫩心葉和莖尖誘導(dǎo)愈傷組織到分化成完整或半完整的小苗，達(dá)到快速高效，操作簡(jiǎn)化， 降低變異率，節(jié)約成本的目的，為大量生產(chǎn)美洲狼尾草脫毒組培苗奠定良好的基礎(chǔ)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種美洲狼尾草快速繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成苗培 養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽步驟，其特征在于(1)外植體的取材及滅菌步驟取美洲狼尾草莖尖頂部或幼嫩心葉，作為脫毒組 培用外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為75%的乙醇 溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗3 5次，再用質(zhì)量濃度為0. 的氯化汞溶液消毒5 lOmin，然后用無菌水沖洗3 5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng) 度為1 2cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于20-25°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入 光照條件培養(yǎng)，溫度為20 23°C、濕度為60% 65%、光照強(qiáng)度為70 80 μ mol cm-2s-U每天光照12 14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1 1. 5cm ；
(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60μπιο1 cm-2s_l、每天光照16 18h的條件 下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2 5cm即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度 為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至微 枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6 8cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1 2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度 為1 2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2-3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽。一種美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成 苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等步驟，其特征在于(1)外植體的取材及滅菌步驟取美洲狼尾草莖尖頂部或幼嫩心葉，作為脫毒組 培用外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為75%的乙醇 溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗3 5次，再用質(zhì)量濃度為0. 的氯化汞溶液消毒5 lOmin，然后用無菌水沖洗3 5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng) 度為1 2cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于20-25°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入 光照條件培養(yǎng)，溫度為20 23°C、濕度為60% 65%、光照強(qiáng)度為70 80 μ mol cm-2s-U 每天光照12 14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1 1. 5cm ；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s_l、每天光照16 18h的條件 下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2 5cm即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度 為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至微 枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6 8cm。(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1 2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度 為1 2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2-3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽；(7)病毒ELISA檢測(cè)將田間病株所攜帶的花葉病毒(fritillary mosaicVirus, FMV)和Y病毒(Fritillary virus Y，F(xiàn)VY)，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)后，所獲得的大量相關(guān) 病毒外殼蛋白，制備成病毒特異性抗血清后，對(duì)美洲狼尾草組培成苗進(jìn)行病毒ELISA檢測(cè)。其中步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包 含0. 3 0. 5mg/L的ΚΤ、0. 03 0. 05mg/L的IAA、3000_4000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為 1. 5 2. 0%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5. 0 5. 5 ；步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培 養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 05 0. lmg/L的6-BA、0. 01 0. 05mg/L的NAA和質(zhì)量濃度 為2. 0 2. 5%的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步驟(4)中壯苗培養(yǎng)基是以MS固培養(yǎng) 基為基本培養(yǎng)基，且還包含質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5 %的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步 驟(5)中生根培養(yǎng)基是以改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基且還包含0. 5-1. 5mg/L的NAA，1-2. 5mg/L的IBA和質(zhì)量濃度為2. O 2. 5%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. O ； 步驟(6)中生根基質(zhì)按質(zhì)量比為50%的草炭土、25%的蛭石和25%的珍珠巖組成，生 根基 質(zhì)含水量為30% 40%。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明的有益效果是利用美洲狼尾草幼嫩心葉和莖尖產(chǎn)生少量的胚性愈傷組織分化成再生植株，有效 地避免了愈傷加繁過程中，變異的出現(xiàn)，更好地保持了原有材料的種性；建立的美洲狼尾草病毒(FMV和FVY)外殼蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增、克隆、原核表達(dá) 及高靈敏度ELISA檢測(cè)體系，通過該檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用，可保證脫毒美洲狼尾草中無病毒存在， 為進(jìn)一步控制病毒病發(fā)生傳播，美洲狼尾草品種提純復(fù)壯奠定了基礎(chǔ)；建立的美洲狼尾草脫毒組培快繁技術(shù)體系，脫毒效果好，其生根率達(dá)100%，移栽 成活率達(dá)95%以上，適合工廠化育苗，可商品化生產(chǎn)，適用于美洲狼尾草種苗工廠化快速繁 殖，從而大大節(jié)省了傳統(tǒng)方法的繁種用地。為大量工廠化育苗，提供了有力的保障。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更進(jìn)一步了解本發(fā)明的特征及技術(shù)內(nèi)容，通過以下實(shí)施 例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例一(1)外植體的取材及滅菌步驟于5月份，晴好天氣，取美洲狼尾草莖尖頂部，作 為脫毒組培用外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為 75%的乙醇溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量濃度為0. 的氯化汞溶液消 毒5min，然后用無菌水沖洗3次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng) 度為Icm的莖段，接種于一次成苗培養(yǎng)基上，保持莖段形態(tài)學(xué)上端向上的方式將莖段垂直 插入培養(yǎng)基中，置于20°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入光照條件培養(yǎng)，溫度為20°C、濕 度為60% %、光照強(qiáng)度為70 μ mol cm-2s-l、每天光照12h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度 為 Icm ；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、濕 度為70%、光照強(qiáng)度為40 μ mol cm-2s-l、每天光照16h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為 2cm，即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、濕度為 70%、光照強(qiáng)度為40 μ mol cm-2s-l、每天光照16h的條件下培養(yǎng)至微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為4cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1 2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度 為Icm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽；將 成苗周圍的生根基質(zhì)壓實(shí)并在生根基質(zhì)表面和微枝葉面上略噴水，然后覆上保鮮膜在培養(yǎng) 室內(nèi)培養(yǎng)；每天以噴灑的方式澆水5次/周，每天早晚揭膜6min通風(fēng)換氣，7天后去膜，培 養(yǎng)7天；(7)病毒ELISA檢測(cè)將田間病株所攜帶的花葉病毒(fritillary mosaicVirus, FMV)，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)后，所獲得的大量相關(guān)病毒外殼蛋白，制備成病毒特異性抗血清后，對(duì)美洲狼尾草組培成苗進(jìn)行病毒ELISA檢測(cè)。 其中步驟⑵中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含 0. 3mg/L的KT,0. 03mg/L的IAA、3000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為1. 5%的白砂糖，pH值 為5.0;步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0.05mg/L的 6-BA、0.01mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2.0%的蔗糖，pH值為5. 6 ；步驟(4)中壯苗培養(yǎng)基是 以MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含質(zhì)量濃度為2.0%的蔗糖，pH值為5. 6;步驟(5) 中生根培養(yǎng)基是以改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 5mg/L的NAA，lmg/L的 IBA和質(zhì)量濃度為2.0%的白砂糖，pH值為5. 6;步驟(6)中生根基質(zhì)按質(zhì)量比為50%的草 炭土、25%的蛭石和25%的珍珠巖組成，生根基質(zhì)含水量為30%。實(shí)施例二(1)外植體的取材及滅菌步驟于10月份，晴好天氣，取美洲狼尾草幼嫩心葉，作 為脫毒組培用外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為 75%的乙醇溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗5次，再用質(zhì)量濃度為0. 的氯化汞溶液消 毒lOmin，然后用無菌水沖洗5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且 長(zhǎng)度為2cm的莖段，接種于一次成苗培養(yǎng)基上，保持莖段形態(tài)學(xué)上端向上的方式將莖段垂 直插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入光照條件培養(yǎng)，溫度為 23°C、濕度為65%、光照強(qiáng)度為SOymol cm-2s-l、每天光照14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生 長(zhǎng)長(zhǎng)度為1. 5cm ；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、濕 度為80%、光照強(qiáng)度為60 μ mol cm-2s-l、每天光照18h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為 5cm，即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、濕度為 80%、光照強(qiáng)度為60 μ mol cm-2s-l、每天光照18h的條件下培養(yǎng)至微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為 2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽；將 成苗周圍的生根基質(zhì)壓實(shí)并在生根基質(zhì)表面和微枝葉面上略噴水，然后覆上保鮮膜在培養(yǎng) 室內(nèi)培養(yǎng)；每天以噴灑的方式澆水3次/周，每天早晚揭膜6-lOmin通風(fēng)換氣，10天后去膜， 培養(yǎng)10天；(7)病毒ELISA檢測(cè)將田間病株所攜帶的Y病毒(Fritillary virus Y，F(xiàn)VY)，經(jīng) 擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)后，所獲得的大量相關(guān)病毒外殼蛋白，制備成病毒特異性抗血清后， 對(duì)美洲狼尾草組培成苗進(jìn)行病毒ELISA檢測(cè)。其中步驟⑵中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含 0. 5mg/L的KT、0. 05mg/L的IAA、4000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為2. 0%的白砂糖，pH值 為5.5;步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. lmg/L的 6-BA、0. 05mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 5 %的蔗糖，pH值為6. 0 ；步驟(4)中壯苗培養(yǎng)基 是以MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含質(zhì)量濃度為2. 5%的蔗糖，pH值為6. 0 ；步驟(5) 中生根培養(yǎng)基是以改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含1. 5mg/L的NAA，1-2. 5mg/L的IBA和質(zhì)量濃度為2. 5%的白砂糖，pH值為6. O ；步驟(6)中生根基質(zhì)按質(zhì)量比為50% 的草炭土、25%的蛭石和25%的珍珠巖組成，生根基質(zhì)含水量為30% 40%。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，40-50天左右即可得到帶有少量根系的株高約3-5cm的 瓶苗，50-70天左右，獲得帶根的美洲狼尾草完整小苗。一段美洲狼尾草梢部經(jīng)50-70天時(shí) 間可繁殖出100-200株種苗，利用本發(fā)明簡(jiǎn)化了美洲狼尾草組培苗生產(chǎn)的程序，節(jié)約成本， 成苗率高，顯著縮短了美洲狼尾草組培苗的生產(chǎn)周期。但以上所述僅為本發(fā)明的較佳可行實(shí)施例，并非用以局限本發(fā)明的專利范圍，故 凡運(yùn)用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變化，均同理包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種美洲狼尾草快速繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽步驟，其特征在于(1)外植體的取材及滅菌步驟取美洲狼尾草莖尖頂部或幼嫩心葉，作為脫毒組培用外植體；用質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡60s，然后用無菌水沖洗3～5次，再用質(zhì)量濃度為0.1％的氯化汞溶液消毒5～10min，然后用無菌水沖洗3～5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng)度為1～2cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于20 25℃的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入光照條件培養(yǎng)，溫度為20～23℃、濕度為60％～65％、光照強(qiáng)度為70～80μmol cm 2s 1、每天光照12～14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1～1.5cm；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25～28℃、濕度為70％～80％、光照強(qiáng)度為40～60μmol cm 2s 1、每天光照16～18h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2～5cm即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25～28℃、濕度為70％～80％、光照強(qiáng)度為40～60μmol cm 2s 1、每天光照16～18h的條件下培養(yǎng)至微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6～8cm；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1～2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為1～2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2 3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種美洲狼尾草快速繁殖方法，其特征在于其中步驟⑵ 中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良V2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 3 0. 5mg/L的KT、 0. 03 0. 05mg/L的IAA、3000_4000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%的白砂糖，培 養(yǎng)基PH值為5.0 5. 5;步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還 包含0. 05 0. lmg/L的6-BA、0. 01 0. 05mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的蔗糖， 培養(yǎng)基PH值為5. 6 6.0;步驟(4)中壯苗培養(yǎng)基是以MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包 含質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步驟(5)中生根培養(yǎng)基是以 改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基且還包含0. 5-1. 5mg/L的NAA，1-2. 5mg/L的IBA 和質(zhì)量濃度為2.0 2. 5%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5.6 6.0 ；步驟(6)中生根基質(zhì)按質(zhì) 量比為50%的草炭土、25%的蛭石和25%的珍珠巖組成，生根基質(zhì)含水量為30% 40%。
3.一種美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成苗 培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽、脫毒檢測(cè)等步驟，其特征在于(1)外植體的取材及滅菌步驟取美洲狼尾草莖尖頂部或幼嫩心葉，作為脫毒組培用 外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液 浸泡60s，然后用無菌水沖洗3 5次，再用質(zhì)量濃度為0. 1 %的氯化汞溶液消毒5 lOmin， 然后用無菌水沖洗3 5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng)度為 1 2cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于20-25°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入光照 條件培養(yǎng)，溫度為20 23°C、濕度為60% 65%、光照強(qiáng)度為70 80 μ mol cm-2s-l、每 天光照12 14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1 1. 5cm ；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕 度為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至 無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2 5cm即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度為 70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至微枝 生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6 8cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1 2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為 1 2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2-3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽；(7)病毒ELISA檢測(cè)將田間病株所攜帶的花葉病毒(fritillarymosaicVirus, FMV) 和Y病毒(Fritillary virus Y，F(xiàn)VY)，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)后，所獲得的大量相關(guān)病毒 外殼蛋白，制備成病毒特異性抗血清后，對(duì)美洲狼尾草組培成苗進(jìn)行病毒ELISA檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法，其特征在于其中步驟 (2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 3 0. 5mg/L的 KT,0. 03 0. 05mg/L的IAA、3000_4000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%的白砂糖， 培養(yǎng)基PH值為5.0 5.5;步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且 還包含0. 05 0. lmg/L的6-BA、0. 01 0. 05mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的蔗 糖，培養(yǎng)基PH值為5. 6 6. 0 ；步驟⑷中壯苗培養(yǎng)基是以MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且 還包含質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步驟(5)中生根培養(yǎng)基 是以改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基且還包含0. 5-1. 5mg/L的NAA，1-2. 5mg/L 的IBA和質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步驟(6)中生根基 質(zhì)按質(zhì)量比為50%的草炭土、25%的蛭石和25%的珍珠巖組成，生根基質(zhì)含水量為30% 40%。
5.一種美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成苗 培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等步驟，其特征在于(1)外植體的取材及滅菌步驟取美洲狼尾草莖尖頂部或幼嫩心葉，作為脫毒組培用 外植體；用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30s后再用另一份質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液 浸泡60s，然后用無菌水沖洗3 5次，再用質(zhì)量濃度為0. 1 %的氯化汞溶液消毒5 lOmin， 然后用無菌水沖洗3 5次；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在無菌條件下，將消毒好的外植體切成1個(gè)頂芽或腋芽、且長(zhǎng)度為 1 2cm的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于20-25°C的黑暗條件下培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入光照 條件培養(yǎng)，溫度為20 23°C、濕度為60% 65%、光照強(qiáng)度為70 80 μ mol cm-2s-l、每 天光照12 14h的條件下培養(yǎng)至無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1 1. 5cm ；(3)繼代培養(yǎng)步驟將增生的無菌芽一起轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕 度為70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至 無菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2 5cm即為微枝苗；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將每個(gè)微枝苗接種于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C、濕度為 70% 80%、光照強(qiáng)度為40 60 μ mol cm-2s-l、每天光照16 18h的條件下培養(yǎng)至微枝 生長(zhǎng)長(zhǎng)度為6 8cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1 2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為 1 2cm的莖段，然后逐段接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；(6)煉苗移栽步驟將生根培養(yǎng)30天且根系達(dá)2-3cm的完整小苗，進(jìn)行煉苗移栽；將小 苗周圍的生根基質(zhì)壓實(shí)并在生根基質(zhì)表面和微枝葉面上略噴水，然后覆上保鮮膜在培養(yǎng)室 內(nèi)培養(yǎng)；每天以噴灑的方式澆水5次/周，每天早晚揭膜6min通風(fēng)換氣，7天后去膜，培養(yǎng)7 天；(7)病毒ELISA檢測(cè)將田間病株所攜帶的花葉病毒(fritillarymosaicVirus, FMV) 和Y病毒(Fritillary virus Y，F(xiàn)VY)，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)后，所獲得的大量相關(guān)病毒 外殼蛋白，制備成病毒特異性抗血清后，對(duì)美洲狼尾草組培成苗進(jìn)行病毒ELISA檢測(cè)；其中步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0.3 0. 5mg/L的ΚΤ、0. 03 0. 05mg/L的IAA、3000_4000mg/L的卡拉膠和質(zhì)量濃度為1.5 2. 0%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5. 0 5. 5 ；步驟(3)中繼代培養(yǎng)基是以改良MS固培 養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 05 0. lmg/L的6-BA、0. 01 0. 05mg/L的NAA和質(zhì)量濃度 為2. 0 2. 5%的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步驟(4)中壯苗培養(yǎng)基是以MS固培養(yǎng) 基為基本培養(yǎng)基，且還包含質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的蔗糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0 ；步 驟(5)中生根培養(yǎng)基是以改良1/4MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基且還包含0. 5-1. 5mg/L 的NAA，1-2. 5mg/L的IBA和質(zhì)量濃度為2. 0 2. 5%的白砂糖，培養(yǎng)基pH值為5. 6 6. 0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脫毒繁殖方法，包括外植體的取材及滅菌、接種進(jìn)行一次成苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽、脫毒檢測(cè)等步驟。建立的美洲狼尾草脫毒組培快繁技術(shù)體系，脫毒效果好，其生根率達(dá)100％，移栽成活率達(dá)95％以上，適合工廠化育苗，可商品化生產(chǎn)，適用于美洲狼尾草種苗工廠化快速繁殖，從而大大節(jié)省了傳統(tǒng)方法的繁種用地。為大量工廠化育苗，提供了有力的保障。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101953304SQ20101051106
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者趙國(guó)平 申請(qǐng)人:趙國(guó)平