冠心病相關(guān)基因snp檢測(cè)芯片及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片及其應(yīng)用，包含該基因芯片的試劑盒和使用該芯片或試劑盒檢測(cè)冠心病相關(guān)基因SNP的方法。冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針包含IL-8-251A/T,IL-17A?rs8193037G/A，IL-18-607C/A,MMP-1-519A/G,Connexin37C1019T,在內(nèi)的17-32個(gè)連續(xù)核苷酸。所制備的冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片具有良好的信噪比，所設(shè)計(jì)的探針有良好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各類型的突變位點(diǎn)，并且所述檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，5個(gè)SNP位點(diǎn)可以一步檢測(cè)完成。全自動(dòng)化雜交過程更加方便快捷并且避免了人為操作過程中存在的諸多不確定因素。本發(fā)明的基因芯片和應(yīng)用方法可用于檢測(cè)冠心病的易感基因，為冠心病的早期預(yù)防提供必要信息。
【專利說明】冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片及使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因分析檢測(cè)產(chǎn)品，具體的說是基因檢測(cè)芯片，更具體的說是適用于 與冠心病有關(guān)的基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的基因芯片及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary artery disease,CAD,簡(jiǎn)稱冠心病）是遺 傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的一種多基因復(fù)雜性疾病，且其發(fā)病具有明顯的家族聚集 性，是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的首要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)報(bào)告，2030年世界缺血 性心臟病的死亡人數(shù)將占總死亡人數(shù)的13. 1%。《中國心血管病報(bào)告2011》中指出，我國冠 心病死亡率城市為94. 96/10萬人，農(nóng)村為71. 27/10萬人，較2006年分別增加了 66. 6% 和111.6%，冠心病的防治形勢(shì)刻不容緩.近年來國內(nèi)外研究表明冠心病與多個(gè)基因的SNP 位點(diǎn)有關(guān)。
[0003] Yaling Han等人于2008年就發(fā)現(xiàn)MMP-1基因的-519A/G連鎖不平衡-340C/T分 析AT單倍型顯著增加ACS風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)CX37基因的C1019T C(CC/CT)型攜帶者是北 方漢族人CAD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。隨后Fang Pei等人于2009年發(fā)現(xiàn)IL-18基因的-607C/A 位點(diǎn)可能為北方漢族人AMI的基因風(fēng)險(xiǎn)因子。Xiaolin Zhang等人于2010年發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因中rs8193037位點(diǎn)與CAD風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系顯著，G型（GG/GA)能增加AMI病人中的IL-17A基 因表達(dá)。次年Xiaolin Zhang等人又發(fā)現(xiàn)IL-8基因-251A/T位點(diǎn)為漢族人ACS獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn) 因子對(duì)冠心病有顯著影響。而這些SNP位點(diǎn)的突變率在中國人群中分布均比較廣，所以對(duì) 這些易感基因位點(diǎn)進(jìn)行基因檢測(cè)對(duì)冠心病的早期預(yù)防具有很大的意義。但目前測(cè)定這些 SNP位點(diǎn)的方法主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP)，測(cè)序，序列 特異性引物PCR，熒光定量PCR等方法，不僅操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，通量小不能同時(shí)檢測(cè)那 么多SNP位點(diǎn)，波動(dòng)大，而且影響檢測(cè)結(jié)果的因素多，不易控制，難以滿足臨床檢驗(yàn)的要求， 使臨床至今還無法開展有關(guān)冠心病易感基因的檢測(cè)。
[0004] 基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一。 它是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、CDNA克隆、PCR產(chǎn)物等） 有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團(tuán)修飾的載玻片或硅片、尼龍 膜、硝酸纖維素膜）上形成陣列，通過與實(shí)際樣本(或擴(kuò)增產(chǎn)物）進(jìn)行雜交反應(yīng)，只需一次 實(shí)驗(yàn)。就可高通量獲得所有待檢基因的信息。這種平行檢測(cè)、高信息通量的特點(diǎn)使其在 基因表達(dá)、基因多態(tài)性檢測(cè)等方面的應(yīng)用受到廣泛重視。用基因芯片檢測(cè)IL-8, IL-17A， IL-18, MMP-1，ConneXin37等基因SNP位點(diǎn)，發(fā)揮基因芯片檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，通量大，結(jié)果準(zhǔn)確 等特點(diǎn)，對(duì)于臨床篩選冠心病高危人群，進(jìn)行早期預(yù)防具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)冠心病相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的基因檢測(cè)芯片，還提供了 一種該芯片的使用方法。
[0006] 本發(fā)明的冠心病相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的基因檢測(cè)芯片，包括固相支持物和固定在 所述固相支持物上的寡核苷酸探針；所述寡核苷酸探針包含以下序列中的IL-8-251A/ T、IL-17A rs8193037G/A、IL-18-607C/A、MMP-1-519A/G 和 Connexin37C1019T 在內(nèi)的 17-32個(gè)連續(xù)核苷酸，其中SEQ1和SEQ ID2包含IL-8-251A/T、SEQ3和SEQ4包含IL-17A rs8193037G/A，SEQ5 和 SEQ6 包含 IL-18-607C/A, SEQ7 和 SEQ8 包含 MMP-1-519A/G, SEQ9 和 SEQ10 包含 Connexin37C1019T。
[0007] 為了增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率，所述IL-8-251A/T，IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 位于所述探針的中部。
[0008] 優(yōu)選的，各探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1?10,下劃線的為SNP位點(diǎn)基因型：
[0009] SEQ ID No. 1:AAAGCATACATTTGATAATTCACC (IL-8-251T)
[0010] SEQ ID No. 2:AAAGCATACAATTGATAATTCACC (IL-8-251A)
[0011] SEQ ID No. 3:CTGCGACACGCCACGTAA (IL-17A rs8193037G)
[0012] SEQ ID No. 4:ACTGCGACACACCACGTAAG (IL-17A rs8193037A)
[0013] SEQ ID No. 5:ATCATTAGAATTTTATGTAATAATTTTTACAC (IL-18-607C)
[0014] SEQ ID No. 6:ATCATTAGAATTTTATTTAATAATTTTTACAC (IL-18-607A)
[0015] SEQ ID No. 7:CAATAGGGTACCAGGCAGC (MMP-1-519A)
[0016] SEQ ID No. 8:CAATAGGGTGCCAGGCAG (MMP-1-519G)
[0017] SEQ ID No. 9:GCCAAAAACCCCCAAGT (Connexin37C1019T)
[0018] SEQ ID No. 10:GCCAAAAATCCCCAAGTC (Connexin37C1019T)
[0019] 其中，SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 包含 IL-8-251A/T 位點(diǎn)，SEQ ID No. 3 和 SEQ IDNo·4包含IL-17Ars8193037G/A位點(diǎn)，SEQIDNo·5和SEQIDNo·6包含IL-18-607C/ A 位點(diǎn)，SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 包含 MMP-1-519A/G 位點(diǎn)，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10包含Connexin37C1019T位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述探針還可以在其5'端包含一段氨基修飾 的16?25聚的聚脫氧胸苷酸(聚dT)，優(yōu)選為16聚的聚脫氧胸苷酸。
[0020] 上述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片的使用方法，步驟包括：
[0021] (1)制備待測(cè)樣品的基因組DNA ;
[0022] (2)用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增IL-8基因中包含-251A/T、IL-17A基因中包含 rs8193037G/A、IL-18 基因中包含-607C/A、MMP-1 基因中包含-519A/G 和 Connexin37 基因 中包含C1019T的基因片段；
[0023] (3)將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合；
[0024] (4)將上述混合液與權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片雜 交；
[0025] (5)檢測(cè)芯片的雜交信號(hào)。
[0026] 步驟（2)中，針對(duì)IL-8SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 11和 SE ID No. Q12,針對(duì)IL-17A SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 13和 SEQ ID No. 14,針對(duì)IL-18SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16,針對(duì)MMP-1SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18,針對(duì)Connexin37SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SE ID No. Q19和SEQ ID No. 20 ：
[0027] SEQ ID No.11:TTGGCTGGCTTATCTTCA
[0028] SEQ ID No. 12:GCACCCTCATCTTTTCATT
[0029] SEQ ID No. 13:TTTCTGCCCTTCCCATT
[0030] SEQ ID No. 14:CTTCCCAGGAGTCATCGT
[0031] SEQ ID No. 15:AATCAGTCCTATTGGGGTAA
[0032] SEQ ID No. 16:TTGCCCTCTTACCTGAATT
[0033] SEQ ID No. 17:CCTCCCACCTCAGCCTCT
[0034] SEQ ID No. 18:CCCCAGCACTCACTTTACG
[0035] SEQ ID No. 19:GCCCTCATCCCCACCAT
[0036] SEQ ID No. 20:TCCCCAGCCCAGTCATC
[0037] 所述引物的5'端還可以帶有標(biāo)記基團(tuán)，所述標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于：地高辛分 子（DIG)、生物素分子（Bio)、熒光素及其衍生物分子（FITC等)、其他熒光分子(如Cy3, Cy5 等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶（HRP)等。這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法以及各標(biāo)記物的檢 測(cè)方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)，也可以參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非 放射性操作手冊(cè)》；J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，馬立人主編 《生物芯片》，化學(xué)工業(yè)出版社。
[0038] 所述固相支持物可采用各種基因芯片領(lǐng)域的常用材料。例如但不僅限于尼龍膜， 經(jīng)活性基團(tuán)(如醛基、氨基、異硫氰酸基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
[0039] 本發(fā)明基因芯片的制備可按照生物芯片的常規(guī)制造方法進(jìn)行。例如，如果固相 支持物采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探 針配制成溶液，然后用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通 過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其 制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》；Derisi，幾等于 1997年在《科學(xué)》278 (5338):680-686發(fā)表的"探討基因組內(nèi)基因表達(dá)的代謝和遺傳控制" (Dersi,JL, Iyer VR, Brown P0. Exploring the metablic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 1997;278(5338):680_686)及馬立人等主編。 生物芯片。化學(xué)工業(yè)出版社。
[0040] 制備用于PCR擴(kuò)增的染色體DNA的方法很多，可以從全血中制備，也可以從組織中 制備。具體方法可參閱文獻(xiàn)(丁振諾主編《臨床PCR基因診斷技術(shù)》，世界圖書出版公司）。
[0041] 用PCR方法擴(kuò)增基因組DNA的特定片段已經(jīng)是本領(lǐng)域公知技術(shù)。其中的關(guān)鍵在于 引物設(shè)計(jì)，有關(guān)引物設(shè)計(jì)的方法、軟件均可以從商業(yè)途徑獲得。
[0042] 步驟（5)中檢測(cè)雜交信號(hào)的方法選自堿性磷酸酶催化的四氮唑藍(lán)顯色反應(yīng)，辣根 過氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽顯色反應(yīng)或辣根過氧化物 酶催化的四甲基聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)，或熒光檢測(cè)。
[0043] 取適量擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交緩沖液中與基因芯片雜交。與基因芯片雜交時(shí)，可以先 將基因芯片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交。
[0044] 本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域 一般人員依據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易較易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及 時(shí)間等的最適條件?；蛘咭部蓞⒄胀跎晡逯骶幍摹痘蛟\斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》； J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社。
[0045] 然后根據(jù)標(biāo)記信號(hào)在基因芯片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測(cè)信息。本發(fā)明所述 檢測(cè)基因芯片雜交信號(hào)的方法是基于與抗生物素抗體或親和素或鏈親和素或抗地高辛抗 體或抗熒光素抗體復(fù)合在一起的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(lán)（NBT)和 5_溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽（BCIP)或四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的顯色反應(yīng)。具 體方法可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》。若擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光基團(tuán) 標(biāo)記，也可參照用熒光檢測(cè)設(shè)備(如激光共聚焦掃描儀S Canarray3000等）獲取待測(cè)信息。
[0046] 本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)冠心病相關(guān)基因SNP的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明 所說的基因芯片和使用說明書。
[0047] 本發(fā)明的冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片可用于非診斷目的檢測(cè)IL-8、IL-17A、 IL-18、MMP-1 和 Connexin37 的基因型。
[0048] 本發(fā)明所制備的冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片具有良好的信噪比，所設(shè)計(jì)的探針 有良好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各類型的突變位點(diǎn)，并且所述檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，5個(gè)SNP位 點(diǎn)可以一步檢測(cè)完成。全自動(dòng)化雜交過程更加方便快捷并且避免了人為操作過程中存在的 諸多不確定因素。本發(fā)明的芯片及其試劑盒，可用于檢測(cè)冠心病相關(guān)的易感基因，為臨床篩 選出冠心病高危人群，為冠心病的早期預(yù)防提供必要信息，為提供針對(duì)性治療提供了一種 簡(jiǎn)便易行的解決方案。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1是本發(fā)明基因芯片上的一種點(diǎn)樣陣列；
[0050] 圖2是用本發(fā)明基因芯片檢測(cè)的IL-8-251A/T, IL-17A rs8193037G/A， IL-18-607C/A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 五個(gè) SNP 位點(diǎn)基因型所得結(jié)果的照片。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的更詳細(xì)說明，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。
[0052] 所用基因序列的來源為NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心）：
[0053] IL-8-251A/T (rs4073)
[0054] IL-17A (rs8193037G/A)
[0055] IL-18-607C/A (rsl946518)
[0056] MMP-1-519A/G (rs1144393)
[0057] Connexin37C1019T (rsl764391)
[0058] 實(shí)施例1基因芯片的制備
[0059] 醛基修飾的載玻片（產(chǎn)品編號(hào)：BSM03011，上海百傲科技有限公司）。人工合成（上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）以下SEQ1?10的探針，用水溶解為100pm 〇l/ul濃度 的溶液，然后用2X點(diǎn)樣buffer (產(chǎn)品編號(hào)：BST02010,上海百傲科技有限公司）等比混合。 接著，用Affymetrix公司的GSM417點(diǎn)樣儀按說明書所述方法點(diǎn)制如圖1的陣列（1?10標(biāo) 號(hào)分別為SEQ1?10的探針，0為質(zhì)控探針)。室溫放置過夜。
[0060] 其中各探針的序列為：
[0061] SEQ1 :NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT AAAGCATACATTTGATAATTCACC
[0062] SEQ2: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT AAAGCATACAATTGATAATTCACC
[0063] SEQ3: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CTGCGACACGCCACGTAA
[0064] SEQ4: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT ACTGCGACACACCACGTAAG
[0065] SEQ5 ： nh2-tttttttttttttttt atcattagaattttatgtaataatttttacac
[0066] SEQ6 ： nh2-tttttttttttttttt atcattagaattttatttaataatttttacac
[0067] SEQ7: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CAATAGGGTACCAGGCAGC
[0068] SEQ8: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CAATAGGGTGCCAGGCAG
[0069] SEQ9: NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT GCCAAAAACCCCCAAGT
[0070] SEQ10 ： nh2-tttttttttttttttt gccaaaaatccccaagtc
[0071] 即序列表中SEQ ID No. 1?10的核苷酸，在5'端連接氨基修飾的16聚的聚脫氧 腺苷酸。
[0072] 實(shí)施例2基因組DNA的制備
[0073] 使用上海百傲科技有限公司血液DNA提取試劑盒按說明書操作如下：
[0074] 吸附柱活化：
[0075] 將吸附柱置于收集管中，加入500 μ L緩沖液BH1，靜置2-3min，12, OOOrpm (9, 500Xg)離心30s ;棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入 500 μ L緩沖液BH2,12, OOOrpm (9, 500 Xg)離心30s，棄去收集管中的廢液，將吸附柱放回 收集管中待用。
[0076] 操作程序：
[0077] 1)將20 μ L的蛋白酶K用移液器加入到1.5mL離心管底部。
[0078] 2)將200 μ L的血液樣品加入到離心管中。
[0079] 3)加入200 μ L緩沖液BL到離心管中，振蕩混勻15s。
[0080] 4)離心管 56°C保溫 lOmin。
[0081] 5)短暫離心將離心管蓋的液滴離下。
[0082] 6)加入200 μ L無水乙醇，振蕩混勻15s。短暫離心將離心管蓋的液滴離下。
[0083] 7)取已活化的吸附柱套在2mL收集管中，將上述混合液小心加入吸附柱中，不要 弄濕管口。蓋上管蓋，12, OOOrpm (9, 500Xg)離心lmin，棄取裝廢液的收集管，將吸附柱插 入新的收集管中。
[0084] 8)小心打開吸附柱的管蓋，加入500 μ L緩沖液BW1,不要弄濕管口。蓋上管蓋， 12, OOOrpm (9, 500Xg)離心lmin,倒掉廢液，將吸附柱插入收集管中。
[0085] 9)小心打開吸附柱的管蓋，加入500 μ L緩沖液BW2,不要弄濕管口。蓋上管蓋， 12, OOOrpm (9, 500Xg)離心lmin,倒掉廢液，將吸附柱插入收集管中。
[0086] 10)將吸附柱插入收集管中。12, OOOrpm (9, 500Xg)離心lmin。
[0087] 11)將吸附柱插入干凈的1. 5mL無菌離心管，棄去裝廢液的收集管。小心打開吸附 柱的管蓋，加入60 μ L的洗脫液BE或去離子水。室溫（15?25°C )放置5min，然后12, OOOrpm (9, 500)離心 lmin。
[0088] 12)抽提好的DNA放置-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0089] 實(shí)施例 3 用 PCR 方法擴(kuò)增包含 IL-8-251A/T, IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/ A, MMP-1-519A/G, Connexin37C1019T 等 5 個(gè) SNP 位點(diǎn)的片段
[0090] 合成以下引物：（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）引物下游5'端做生物素 標(biāo)記
[0091] IL-8 上游 SEQ11:5，-TTGGCTGGCTTATCTTCA-3'
[0092] IL-8 下游 SEQ12:Biotin-5, -GCACCCTCATCTTTTCATT-3'
[0093] IL-17A 上游 SEQ13:5, -TTTCTGCCCTTCCCATT-3'
[0094] IL-17A 下游 SEQ14:Biotin-5, -CTTCCCAGGAGTCATCGT-3，
[0095] IL-18 上游 SEQ15:5，-AATCAGTCCTATTGGGGTAA-3'
[0096] IL-18 上游 SEQ16:Biotin-5，-TTGCCCTCTTACCTGAATT-3'
[0097] MMP-1 上游 SEQ17:5, -CCTCCCACCTCAGCCTCT-3，
[0098] MMP-1 下游 SEQ18:Biotin-5' -CCCCAGCACTCACTTTACG-3'
[0099] Connexin37 上游 SEQ19:5，-GCCCTCATCCCCACCAT-3，
[0100] Connexin37 下游 SEQ20:Biotin-5, -TCCCCAGCCCAGTCATC-3'
[0101] 然后用水或TE溶解并稀釋至10pmol/ul。將購置的Taq酶(產(chǎn)品編號(hào)ET101，天根 生化科技有限公司)，d NTP (產(chǎn)品編號(hào)：D0056,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）、雙蒸 水以及實(shí)施例2中獲得的PCR擴(kuò)增模板按以下表1的配方配制PCR擴(kuò)增體系：
[0102] 表 1
[0103]

【權(quán)利要求】
1. 一種冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的 寡核苷酸探針，其特征在于，所述寡核苷酸探針為包含以下序列中的IL-8-251A/T、IL-17A rs8193037G/A、IL-18-607C/A、MMP-1-519A/G 和 Connexin37C1019T 位點(diǎn)在內(nèi)的含 17-32 個(gè) 連續(xù)核苷酸的10個(gè)核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針序 列如 SEQ ID No. 1 ?10 所示，其中 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 包含 IL-8-251A/T，SEQ IDNo·3和SEQIDNo·4包含IL-17Ars8193037G/A，SEQIDNo·5和SEQIDNo·6包含 IL-18-607C/A，SEQIDNo·7和SEQIDNo·8包含MMP-l-519A/G，SEQIDNo·9和SEQID No. 10 包含 Connexin37C1019T ; SEQ ID No. 1:AAAGCATACATTTGATAATTCACC SEQ ID No. 2:AAAGCATACAATTGATAATTCACC SEQ ID No. 3:CTGCGACACGCCACGTAA SEQ ID No. 4:ACTGCGACACACCACGTAAG SEQ ID No. 5:ATCATTAGAATTTTATGTAATAATTTTTACAC SEQ ID No. 6:ATCATTAGAATTTTATTTAATAATTTTTACAC SEQ ID No. 7:CAATAGGGTACCAGGCAGC SEQ ID No. 8:CAATAGGGTGCCAGGCAG SEQ ID No. 9:GCCAAAAACCCCCAAGT SEQ ID No. 10:GCCAAAAATCCCCAAGTC。
3. 權(quán)利要求1或2所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，其特征在于，所述IL-8-251A/ T，IL-17A rs8193037G/A，IL-18-607C/A，MMP-l-519A/G，Connexin37C1019T 位于所述寡核 苷酸探針的中部。
4. 權(quán)利要求1或2所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針 的5'端還包含一段氨基修飾的16-25聚的聚脫氧胸苷酸。
5. 權(quán)利要求4所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針的5'端還包 含氨基修飾的16聚的聚脫氧胸苷酸。
6. 權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片的使用方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 制備待測(cè)樣品的基因組DNA ; (2) 用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增IL-8基因中包含-251A/T、IL-17A基因中包含 rs8193037G/A、IL-18 基因中包含-607C/A、MMP-1 基因中包含-519A/G 和 Connexin37 基因 中包含C1019T的基因片段； (3) 將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合； (4) 將上述混合液與權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片雜交； (5) 檢測(cè)芯片的雜交信號(hào)。
7. 權(quán)利要求6所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片的使用方法，其特征在于，步驟（2) 中，所述針對(duì)IL-8SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 11和SE ID No.Q12， 針對(duì)IL-17A SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14， 針對(duì)IL-18SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16,針 對(duì)MMP-1SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18,針對(duì) Connexin37SNP位點(diǎn)的上游和下游引物核苷酸序列如SE ID No. Q19和SEQ ID No. 20 : SEQ ID No. 11:TTGGCTGGCTTATCTTCA SEQ ID No. 12:GCACCCTCATCTTTTCATT SEQ ID No. 13:TTTCTGCCCTTCCCATT SEQ ID No. 14:CTTCCCAGGAGTCATCGT SEQ ID No. 15:AATCAGTCCTATTGGGGTAA SEQ ID No. 16:TTGCCCTCTTACCTGAATT SEQ ID No. 17:CCTCCCACCTCAGCCTCT SEQ ID No. 18:CCCCAGCACTCACTTTACG SEQ ID No. 19:GCCCTCATCCCCACCAT SEQ ID No. 20:TCCCCAGCCCAGTCATC。
8. 權(quán)利要求6所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片的使用方法，其特征在于，步驟 (2)中，核苷酸序列如SEQ ID No. 11?20所示的用于擴(kuò)增IL-8、IL-17A、IL-18、MMP-1、 Connexin37基因SNP位點(diǎn)目的序列的引物5'端還用生物素、地高辛、突光素、突光素衍生 物、熒光分子、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶進(jìn)行了修飾。
9. 權(quán)利要求6所述冠心病相關(guān)基因SNP檢測(cè)芯片的使用方法，其特征在于，步驟（5) 中檢測(cè)雜交信號(hào)的方法選自堿性磷酸酶催化的四氮唑藍(lán)顯色反應(yīng)、辣根過氧化物酶催化的 5_溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽顯色反應(yīng)或辣根過氧化物酶催化的四甲基聯(lián)苯 胺顯色反應(yīng)，或者熒光檢測(cè)。
10. -種用于檢測(cè)冠心病相關(guān)基因SNP的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要 求1?5任一項(xiàng)所述的基因芯片。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK104099403SQ201310116606
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】韓雅玲, 張效林, 閆承慧, 張佳琦, 康健, 黃明方, 鄔澤峰, 席素雅 申請(qǐng)人:中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院