一種檢測奶牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設(shè)計方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)交叉學(xué)科，特別涉及一種應(yīng)用于奶牛乳腺組 織IncRNA表達的檢測的基因芯片的設(shè)計方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA，IncRNA)是長度大于200個核苷酸非編碼 RNA，近幾年成為備受矚目的哺乳動物轉(zhuǎn)錄組重要成員。IncRNA能直接與染色質(zhì)結(jié)合并募集 作用因子發(fā)揮其作用，又能參與組蛋白修飾、募集調(diào)控因子修飾抑制因子等達到基因沉默。 在轉(zhuǎn)錄前調(diào)控中，IncRNA通過與蛋白質(zhì)相互作用參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，如作為調(diào)控因子或 共調(diào)控因子通過形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體實現(xiàn)調(diào)控；在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中，IncRNA主要通過與靶 基因的互補配對形成二聚體，掩蓋與轉(zhuǎn)錄加工的位點，以此來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的剪切、拼接 和翻譯等過程。IncRNA的調(diào)控作用在生理和疾病過程中扮演的重要角色逐漸引起人們廣泛 的關(guān)注。
[0003] 隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，IncRNA在各領(lǐng)域的研宄已取 得了一定的進展，各物種已鑒定的IncRNA的數(shù)量逐漸增加，目前人、大鼠和小鼠已有商業(yè) 化的基因芯片，而其它物種只有依靠 RNA測度測序，并結(jié)合已知數(shù)據(jù)庫查詢等方法來進行 IncRNA研宄。在牛IncRNA研宄方面，已有數(shù)例相關(guān)報道，相關(guān)數(shù)據(jù)庫中已確認的IncRNA也 較少，如ensembl數(shù)據(jù)庫為797條，Billerey等（2014)報道了利木贊牛背最長肌584條基 因間IncRNA(IincRNAs)。另外，目前也無牛商業(yè)化的IncRNA芯片可供選擇。鑒于目前和將 來有關(guān)IncRNA研宄發(fā)展的需要，急需一種成本相對較低且快速的IncRNA檢測方法。而本 研宄設(shè)計的基于牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，可以滿足國內(nèi)外市場有關(guān)牛乳 腺組織IncRNA的研宄，同時對牛其它組織器官IncRNA表達、功能等方面的研宄也有很好的 借鑒作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對目前市場上并無商業(yè)化的可用于牛IncRNA研宄的基因芯片的問題，本發(fā)明 的目的是提供一種檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，以滿足對牛乳腺組織 IncRNA研宄的需要。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 一種檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，包括以下步驟：（1)以1頭 正常泌乳奶牛和1頭患有乳房炎奶牛為樣本，取其乳腺組織，提取其總RNA，并混合；（2)混 合后的總RNA去核糖體RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列；（3)得到的 mRNA隨機打斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，再合成cDNA第二 鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭， 然后降解第二條鏈；(4)然后進行片段大小選擇，進行PCR擴增，構(gòu)建文庫；（5)最后建好的 測序文庫用 Illumina HiSeqTM 2000 進行測序；（6)然后獲取 Clean reads、Cufflinks 重 構(gòu)轉(zhuǎn)錄本、non-coding RNA庫注釋，和KEGG、NR、COG、SWISSPROT四個數(shù)據(jù)庫進行蛋白庫比 對，過濾和去除mRNA，最后經(jīng)CPC預(yù)測，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA預(yù)測序 列結(jié)果文件；（7)在此基礎(chǔ)上，根據(jù)牛編碼蛋白質(zhì)的基因序列（即mRNA)和IncRNA序列，開 發(fā)并設(shè)計同時檢測奶牛乳腺組織IncRNA和mRNA的芯片。
[0007] 步驟⑶中，以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加 入緩沖液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成 cDNA 第二鏈。
[0008] 步驟⑶中，通過UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二條鏈。
[0009] 步驟（4)中，用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是：
[0011] 按照傳統(tǒng)方法，對IncRNA和mRNA進行研宄時，需要分別進行轉(zhuǎn)錄組測序外加基因 表達譜芯片進行檢測，這樣每個樣本的成本大概為3-4萬元（按目前市場計算），分析測試 時間約為3個月。如引入本發(fā)明設(shè)計并開發(fā)的基因芯片，每個樣本成本只需6000元，節(jié)約 成本3萬元/樣本左右，同時分析時間可縮短到20-30天以內(nèi)。這樣不僅節(jié)約了成本，且大 大縮短了分析時間，為科研人員贏得寶貴的時間。
[0012] 本發(fā)明的基于牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，可以滿足國內(nèi)外市場有 關(guān)牛乳腺組織IncRNA的研宄，同時對牛其它組織器官IncRNA表達、功能等方面的研宄也有 很好的借鑒作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明得到的芯片的雜交信號圖；
[0014] 圖2是利用本發(fā)明得到的芯片得到的6個樣本聚類圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明。
[0016] 一種檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，以1頭正常泌乳奶牛和1頭 患有乳房炎奶牛為樣本，取其乳腺組織，提取其總RNA，并混合；混合后的總RNA去核糖體 RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列；得到的mRNA隨機打斷成為短片段，再 以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTP S、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗 脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，然后通過UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二 條鏈；然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增，構(gòu)建文庫；最后建好的測 序文庫用Illumina HiSeqTM 2000進行測序；然后獲取Clean reads、Cufflinks重構(gòu)轉(zhuǎn)錄 本、non-coding RNA庫注釋、和KEGG、NR、C0G和SWISSPROT四個數(shù)據(jù)庫進行蛋白庫比對，過 濾和去除mRNA，最后經(jīng)CPC預(yù)測，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA預(yù)測序列結(jié)果 文件；在此基礎(chǔ)上，根據(jù)牛編碼蛋白質(zhì)的基因序列（即mRNA)和IncRNA序列，開發(fā)并設(shè)計同 時檢測奶牛乳腺組織IncRNA和mRNA的芯片。
[0017] 名詞解釋：
[0018] polyA :多聚腺苷酸，通常位于mRNA上的150-200個腺苷酸殘基。
[0019] dNTPs :三磷酸堿基脫氧核苷酸。
[0020] RNase H :Ribonuclease H，中文名為核糖核酸酶 Η。
[0021] DNA polymerase I :DNA 聚合酶 I 〇
[0022] UNG酶：Uracil-N-Glycosylase酶，中文名為尿喃啶-N-糖基化酶。
[0023] 利用本專利設(shè)計并開發(fā)的芯片，得到芯片雜交信號圖和6個樣本聚類分析圖分別 如圖1和圖2所示。
[0024] 具體設(shè)計文件如表1-3 :
[0025] 表 1
【主權(quán)項】
1. 一種檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，其特征在于：包括以下步驟： (1)以1頭正常泌乳奶牛和1頭患有乳房炎奶牛為樣本，取其乳腺組織，提取其總RNA，并 混合；（2)混合后的總RNA去核糖體RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列； (3)得到的mRNA隨機打斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，再合 成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A， 加測序接頭，然后降解第二條鏈；(4)然后進行片段大小選擇，進行PCR擴增，構(gòu)建文庫；（5) 最后建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM 2000進行測序；（6)然后獲取Clean reads、 Cuff links重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本、non-coding RNA庫注釋，和1^66、順、〇?、31133?1?01'四個數(shù)據(jù)庫進 行蛋白庫比對，過濾和去除mRNA，最后經(jīng)CPC預(yù)測，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA預(yù)測序列結(jié)果文件；（7)在此基礎(chǔ)上，根據(jù)牛編碼蛋白質(zhì)的基因序列和IncRNA序列，開 發(fā)并設(shè)計同時檢測奶牛乳腺組織IncRNA和mRNA的芯片。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，其特征在于： 步驟（3)中，以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、 dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成 cDNA 第二鏈。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，其特征在于： 步驟（3)中，通過UNG酶降解第二條鏈。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測奶牛乳腺組織IncRNA基因芯片的設(shè)計方法，其特征在于： 步驟（4)中，用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測奶牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設(shè)計方法，以1頭正常泌乳奶牛和1頭患有乳房炎奶牛為樣本，取其乳腺組織，提取其總RNA，并混合；去核糖體RNA，再去含polyA的RNA；得到的mRNA隨機打斷成為短片段，合成cDNA第一鏈、cDNA第二鏈，洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，降解第二條鏈；進行片段大小選擇，PCR擴增，構(gòu)建文庫；建好的測序文庫進行測序；然后獲取Clean？reads、Cufflinks重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本、non-coding？RNA庫注釋，進行蛋白庫比對，過濾和去除mRNA，經(jīng)CPC預(yù)測，得到Long？Chain？Non-Coding？RNA預(yù)測序列結(jié)果文件；根據(jù)牛編碼蛋白質(zhì)的基因序列和lncRNA序列，開發(fā)并設(shè)計同時檢測奶牛乳腺組織lncRNA和mRNA的芯片?？梢詽M足有關(guān)牛乳腺組織lncRNA的研究，對牛其它組織器官lncRNA表達、功能等方面的研究也有借鑒作用。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561261
【申請?zhí)枴緾N201410629821
【發(fā)明人】毛永江, 朱小瑞, 邢世宇, 李銳, 楊章平
【申請人】揚州大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月10日