用于細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因(bim)缺失突變的檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因（BM)缺失突變的檢 測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種用于檢測(cè)BIM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子 上2903bp缺失突變的檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了 BIM基因是編碼細(xì)胞凋亡基因 BCL2蛋白家族中的一個(gè)成員， 在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明BIM基因外顯子3和外顯子4之間存在的 2903bp的缺失會(huì)造成BM亞型BH3結(jié)構(gòu)缺乏表達(dá)。而這種缺乏表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌病人對(duì)部分 治療藥物有更強(qiáng)的耐藥性。有研究表明，在癌癥病人體內(nèi)，這種刪除與藥物反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間 相關(guān)聯(lián)，并且能夠被用來(lái)預(yù)測(cè)病人在沒(méi)有疾病惡化時(shí)的存活時(shí)間，如攜帶這種刪除突變的 患者的平均無(wú)疾病惡化存活期限為大約6個(gè)半月時(shí)間，而沒(méi)有這種突變的患者則為12個(gè)月 左右。因此，業(yè)內(nèi)認(rèn)為BM缺失的檢測(cè)對(duì)于肺癌患者有相當(dāng)重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 目前，臨床實(shí)踐中對(duì)BIM基因突變檢測(cè)的方法主要包括：電泳、測(cè)序、變性高效液 相色譜（DHPLC)、熒光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。其中，測(cè)序法由于可以讀到 DNA每個(gè)堿基的變化，目前被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但因?yàn)樵摲椒ù嬖陟`敏 度低的缺陷，檢測(cè)異質(zhì)性較高的臨床腫瘤組織樣本時(shí)假陰性率高，同時(shí)，還存在測(cè)序步驟繁 瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備和操作人員要求較高等缺陷，因此，不易形成標(biāo)準(zhǔn)化操作的臨床診斷產(chǎn) 品。另外，DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也存在操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備要求高等缺陷，因此， 目前僅應(yīng)用用科研單位實(shí)驗(yàn)室。
[0004] 綜上所述，為了臨床最終實(shí)現(xiàn)治療肺癌的目標(biāo)，本領(lǐng)域迫切需要尋求簡(jiǎn)單易行，快 速1?效的檢測(cè)肺癌相關(guān)基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種檢測(cè)(包括早期診斷）BIM基因缺 失情況的方法及其檢測(cè)試劑盒。具體涉及一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因（BIM)缺失突變的 方法及其檢測(cè)試劑盒，尤其是檢測(cè)BM基因上第三、第四外顯子之間內(nèi)含子上2903bp缺失 突變的方法及其檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉。
[0007] 本發(fā)明的一種檢測(cè)BM基因缺失情況的方法，具體即檢測(cè)BM基因第三、第四外 顯子之間的內(nèi)含子上2903bp缺失突變情況，缺失型個(gè)體相對(duì)普通人群對(duì)某些藥物的耐藥 性更高。
[0008] 本發(fā)明所述的2903bp缺失，位于BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上(脫氧 核糖核酸（DNA)序列編號(hào)：2903bp缺失位置基于SEQ ID N0:l/5、l/6,上游引物基于SEQ ID N0:2/5、2/6 ;下游引物1基于SEQ ID :3/5 ;下游引物2基于SEQ ID :4/6 ;擴(kuò)增產(chǎn)物基于SEQ ID :5/6、6/6。
[0009] 具體而言，本發(fā)明的檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因（BM)缺失突變的方法，其包括步 驟：
[0010] (a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上 包括2903bp缺失在內(nèi)的產(chǎn)物；
[0011] (b)檢測(cè)步驟（a)產(chǎn)物中2903bp缺失情況。
[0012] 本發(fā)明中，所述的擴(kuò)增BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上2903bp缺失的 引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0013] 上述方法中涉及的擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作方 法。
[0014] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)BM基因缺失情況的檢測(cè)試劑盒，它含有與BM基因第三、第 四外顯子之間的內(nèi)含子上2903bp缺失區(qū)域結(jié)合的探針，所述試劑盒還可以包括特異性擴(kuò) 增BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上2903bp缺失區(qū)域的引物；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施例中，與特異性擴(kuò)增BIM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上2903bp缺失區(qū)域的引物 的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
[0015] 本發(fā)明中，檢測(cè)BM基因缺失情況，即檢測(cè)BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含 子上2903bp缺失突變情況，相關(guān)研究表明缺失型個(gè)體相對(duì)普通人群對(duì)某些藥物的耐藥性 更商；
[0016] 本發(fā)明的方法中，包括檢測(cè)某個(gè)體的BIM缺失情況的步驟，以此判斷某個(gè)體是否 存在有耐藥可能性高于普通人群的差異。
[0017] 在本發(fā)明的一優(yōu)選例中，所述的差異是選自2903bp的缺失情況，2903bp的缺失位 于BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上，其中脫氧核糖核酸（DNA)序列編號(hào)：2903bp 缺失位置基于SEQ ID NO 1/6。
[0018] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中是否存在BM基因第三、第四外顯子之間 的內(nèi)含子上2903bp缺失的方法，其包括步驟 ：
[0019] (a)用BM缺失檢測(cè)特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和
[0020] (b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中缺失情況。
[0021] 本發(fā)明所述的BM基因的詳細(xì)序列可登見(jiàn)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI)(可 參見(jiàn)網(wǎng)址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)
[0022] 本發(fā)明中，對(duì)肺癌病例和正常對(duì)照人群進(jìn)行了 BIM缺失情況實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明 本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉。為BIM基因缺失檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)捷的新途 徑。
[0023] 本發(fā)明的一種用于細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因（BIM)缺失突變的快速檢測(cè)方法其優(yōu)點(diǎn) 有：
[0024] 1、通量更高：相比傳統(tǒng)的PCR而言，本發(fā)明使用R〇che480實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)，通量 更商；
[0025] 2、速度更快：傳統(tǒng)的方法需要擴(kuò)增幾千bp的片段，另需要進(jìn)行電泳鑒定擴(kuò)增片 段，實(shí)驗(yàn)時(shí)間預(yù)計(jì)在5個(gè)小時(shí)以上，而本發(fā)明的方法只需要擴(kuò)增100個(gè)bp左右的片段，所有 實(shí)驗(yàn)在2個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成；
[0026] 3、結(jié)果更直觀：傳統(tǒng)的結(jié)果需要進(jìn)行電泳分析，耗時(shí)耗力，而本方法只需要在實(shí)時(shí) PCR結(jié)束后進(jìn)行分析即可獲得結(jié)果；
[0027] 4、結(jié)果更準(zhǔn)確：眾所周知，檢測(cè)過(guò)程中，每開(kāi)蓋一次便增加一次污染的可能性，相 較傳統(tǒng)檢測(cè)需要開(kāi)蓋后進(jìn)行電泳而言，本方法無(wú)需開(kāi)蓋，將污染可能性降到最小的程度。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的樣本中含有BIM基因2903bp純合缺失的熔解曲 線分析圖。
[0029] 圖2為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的樣本中含有BIM基因2903bp雜合缺失的熔解曲 線分析圖。
[0030] 圖3為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的樣本中不含有BIM基因2903bp缺失的熔解曲線 分析圖。 圖4為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的樣本中含有BM基因2903bp純合缺失、雜合缺失以及 不含有BIM基因2903bp缺失的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】和實(shí)驗(yàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的特征，但是，可以理解的是，說(shuō)明 書(shū)的【具體實(shí)施方式】?jī)H僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，并不能被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí) 施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。粚?shí)驗(yàn) 室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照 制造廠商所建議的條件。
[0032] 實(shí)施例1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
[0033] (一 )、實(shí)驗(yàn)材料
[0034] LightCycler? 480II熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士 Roche公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液 (FastStart Universal SYBR Green Master)購(gòu)自瑞士 Roche 公司。
[0035] (二)、引物設(shè)計(jì)與合成：
[0036] 以BIM基因的部分序列為模板，使用Primer Premier5軟件分析設(shè)計(jì)引物，并由生 工生物合成。
[0037] 檢測(cè)用引物：
[0038] BM基因缺失檢測(cè)上游引物序列：
[0039] 5, -ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG-3'（SEQ ID NO 2)
[0040] BIM基因缺失檢測(cè)下游引物 1 序列：5'-CCCAACCTCTGACAAGTGACC'（SEQ ID NO 3)。
[0041] BIM 基因缺失檢測(cè)下游引物 2 序列：5' -TTGGTGGGAATGTAAAATGGC-3'（SEQ ID NO 4)。
[0042] (三)、樣本檢測(cè)：
[0043] 實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)30例肺癌病例和30例正常對(duì)照人群，每例收集血樣標(biāo)本約2mL，用濃 鹽法抽提基因組DNA，抽提結(jié)果用Nanodrop (Thermo公司）檢測(cè)，
[0044] 按如下體系進(jìn)行突光PCR擴(kuò)增，后用LightCycler? 480II突光定量系統(tǒng)進(jìn)行溶解 曲線分析：
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因缺失突變的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)BIM基因第 三、第四外顯子之間內(nèi)含子上2903bp缺失情況；該方法包括步驟： (a) 抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上包含 2903bp缺失的區(qū)域； (b) 檢測(cè)步驟（a)產(chǎn)物中BM基因的缺失情況。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的2903bp缺失位于BM基因第三、 第四外顯子之間的內(nèi)含子上。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特在于，擴(kuò)增BIM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi) 含子上包含2903bp缺失的區(qū)域的引物序列如SEQ ID N02、SEQ ID N03和SEQ ID N04所 /Jn 〇
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特在于，該方法中還包括特異性擴(kuò)增BIM基因第 三、第四外顯子之間的內(nèi)含子上包含2903bp缺失區(qū)域的引物。
5. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它含有與BIM基因第三、第四外顯子之間 的內(nèi)含子上2903bp缺失區(qū)域結(jié)合的探針，還包括特異性擴(kuò)增BIM基因第三、第四外顯子之 間的內(nèi)含子上2903bp缺失區(qū)域的引物；與特異性擴(kuò)增BM基因第三、第四外顯子之間的內(nèi) 含子上2903bp缺失區(qū)域的引物的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因(BIM)缺失突變的方法及其檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)解子基因(BIM)缺失突變的方法，它包括檢測(cè)BIM基因上第三、第四外顯子之間內(nèi)含子上2903bp缺失的檢測(cè)。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒還含有擴(kuò)增BIM上2903bp缺失區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測(cè)BIM缺失情況，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104561251
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310513126
【發(fā)明人】韓寶惠, 夏金晶, 邵敏華, 黃迅威
【申請(qǐng)人】上海市胸科醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月25日