血液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體是涉及一種血液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的 方法與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和難以根治的重要原因。而腫瘤的微轉(zhuǎn)移 (micrometastasis)是指少數(shù)具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移到血液、淋巴結(jié)、 骨髓或遠(yuǎn)處器官中。目前臨床的檢測(cè)手段很難發(fā)現(xiàn)這種微轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，在癌癥發(fā) 展的早期，已有微轉(zhuǎn)移發(fā)生。循環(huán)癌細(xì)胞（circulating tumor cells,CTCs)是自發(fā)或因診 療操作，由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移病灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后 復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志。CTCs的早期檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù) 發(fā)、評(píng)估療效及預(yù)后或選擇合適的個(gè)體化治療。
[0003] 目前CTCs檢測(cè)的主要方法有傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)方法，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，流式細(xì) 胞分選（fluorescence-activated cell scanning/sorting，F(xiàn)ACS)，免疫磁性分離 (magnetic-activated cell separation, MACS),稀有細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，以及基于表面拉 曼增強(qiáng)（SERS)和量子點(diǎn)的新方法。
[0004] 傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)方法CTCs是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。但由于CTCs在外 周血中的數(shù)量常小于1/10 6,如果通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞涂片方法，理論上，每份標(biāo)本將需要制備 1000張涂片才可能檢測(cè)到CTCs。而通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-PCR方法檢測(cè)癌變組織特異性標(biāo)志的mRNA 來(lái)間接確定血液中的CTC的存在。由于實(shí)驗(yàn)污染，非常規(guī)轉(zhuǎn)錄，采血過(guò)程中其它來(lái)源細(xì)胞的 污染，以及PCR本身的特點(diǎn)決定該方法的假陽(yáng)性非常高 [12]。因此在進(jìn)行檢測(cè)前對(duì)CTCs進(jìn)行 快速有效富集是該技術(shù)的關(guān)健。目前的細(xì)胞富集方法主要有基于流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁性分 離技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)篩選細(xì)胞的速度為IO 3-IO4/秒，CTCs在外周血中的數(shù)量稀少，為提高 陽(yáng)性率長(zhǎng)需要檢測(cè)IO7-IO 8個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，這樣一次篩選需要幾小時(shí)，速度慢，試劑消耗也 非常大，難以常規(guī)應(yīng)用。而免疫磁性分離的細(xì)胞篩選速度可以達(dá)到IO 6-IO7/秒，適合大量細(xì) 胞的篩選，富集后的細(xì)胞可以在一張載玻片上進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，也可以進(jìn)行流式檢 測(cè)。此方法比單純采用RT-PCR或免疫組化法敏感性高10-100倍，從而減少了假陽(yáng)性和假 陰性。熒光顯微鏡為基礎(chǔ)的稀有細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)其主要的特點(diǎn)是能夠快速的分析大量的 顯微鏡視野，并將信息以數(shù)字模式儲(chǔ)存圖像，通過(guò)坐標(biāo)系統(tǒng)記錄靶細(xì)胞在載玻片上的位置， 進(jìn)一步通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡分析細(xì)胞的形態(tài)。通過(guò)此系統(tǒng)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CTCs 陽(yáng)性的靈敏度和特異性都非常高。
[0005] CTCs的出現(xiàn)可能發(fā)生在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的早期，因此它的檢出有可能成為一種比 目前常規(guī)的腫瘤診斷方法(病理學(xué)，影像學(xué)和血清學(xué))更早的腫瘤診斷手段。但是由于CTCs 在外周血中的數(shù)量極少，而且容易與白細(xì)胞混淆，目前的檢測(cè)的方法還很難達(dá)到臨床的標(biāo) 準(zhǔn)。因此急需發(fā)展一種能夠靈敏，準(zhǔn)確，快速的檢測(cè)CTCs的新方法。
[0006] 鄰近連接技術(shù)（proximity ligation assay, PLA)是由瑞典烏普薩拉大學(xué)的 Landegren U課題組最早發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基于核酸的蛋白檢測(cè)新技術(shù)。該方法利用一對(duì)鄰 近探針（proximity probes)對(duì)祀分子進(jìn)行雙識(shí)別，在連接子的作用下，這對(duì)鄰近探針通過(guò) 連接反應(yīng)形成新的模板序列。這一可擴(kuò)增的模板序列能以PCR的方式進(jìn)行放大和檢測(cè)。兩 個(gè)偶聯(lián)有寡核苷酸的連接探針通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)分別與目標(biāo)蛋白結(jié)合，與連接探針上不 同的寡核苷酸序列有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的連接子的加入，使2個(gè)探針上的寡核苷酸因?yàn)榕c同一個(gè)連 接子雜交而形成長(zhǎng)的新雜交鏈。通過(guò)連接酶的連接反應(yīng)，有缺口的雜交鏈被連接成完整的 長(zhǎng)鏈。而此時(shí)通過(guò)PCR擴(kuò)增可以簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白X的級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)。
[0007] 鄰近連接技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于它結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR的高靈敏度和抗原抗體反 應(yīng)的高特異性。鄰近連接技術(shù)將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)變成為對(duì)擴(kuò)增DNA的檢測(cè)，因此具有極 高的檢測(cè)靈敏度，而且鄰近連接反應(yīng)的苛刻條件(雙探針必須同時(shí)結(jié)合到目標(biāo)蛋白，且相互 間距離足夠貼近時(shí)，鄰位連接反應(yīng)才能夠發(fā)生)使得PLA技術(shù)與一般的ELISA，免疫PCR或 其它蛋白檢測(cè)方法相比，具有更高的特異性。該技術(shù)自首次報(bào)道后發(fā)展迅速，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng) 用到蛋白質(zhì)定量分析及蛋白質(zhì)-核酸相互作用研究等研究中，并初步形成了商品化檢測(cè)試 劑盒。可以直接分析復(fù)雜生物樣品中的微量蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建了一種新型的連接酶激活型探針來(lái)檢測(cè)血液中CTCs。這種方法利 用一對(duì)親和探針對(duì)CTCs上特異抗原進(jìn)行雙識(shí)別，在連接酶的作用下發(fā)生接近連接，繼而產(chǎn) 生可通過(guò)PCR擴(kuò)增而得到的檢測(cè)信號(hào)，從而將對(duì)CTCs上特異抗原的檢測(cè)轉(zhuǎn)變成為對(duì)DNA的 檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中CTCs放大檢測(cè)。
[0009] 針對(duì)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞及循環(huán)癌細(xì)胞檢測(cè)中存在的上述矛盾，本發(fā)明所要解決的技術(shù) 問(wèn)題之一是提供一種連接酶激活型探針來(lái)檢測(cè)血液中CTCs的方法。這種方法利用一對(duì)親 和探針對(duì)CTCs上特異抗原進(jìn)行雙識(shí)別，在連接酶的作用下發(fā)生接近連接，繼而產(chǎn)生可通過(guò) PCR擴(kuò)增而得到的檢測(cè)信號(hào)，從而將對(duì)CTCs上特異抗原的檢測(cè)轉(zhuǎn)變成為對(duì)DNA的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn) 對(duì)血液中CTCs分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的之一是提供一種血液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的試劑盒。
[0011] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0012] 一種信號(hào)放大檢測(cè)血液中循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒，包括有：
[0013] c)偶聯(lián)循環(huán)癌細(xì)胞上抗原的特異性抗體1的探針A ;
[0014] d)偶聯(lián)循環(huán)癌細(xì)胞上抗原的特異性抗體2的探針B;
[0015] c )連接探針A和探針B的連接子。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供一種人乳腺癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大試劑盒。
[0017] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0018] 一種人乳腺癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大試劑盒，包括有：
[0019] a)偶聯(lián)抗體Trastuzumab抗體的探針A，所述探針A的堿基組成如SEQ ID NO. 1 所示，
[0020] b)偶聯(lián)單鏈抗體Anti-HER2-scFv的探針B，所述探針B的堿基組成如SEQ ID NO. 2所示，
[0021] c )堿基組成如SEQ ID NO. 2所示的連接子。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有連接酶。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供一種一種人乳腺癌檢測(cè)試劑盒。
[0024] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0025] -種人乳腺癌檢測(cè)試劑盒，包括有：
[0026] a)偶聯(lián)抗體Trastuzumab抗體的探針A，所述探針A的堿基組成如SEQ ID NO. 1 所示，
[0027] b)偶聯(lián)單鏈抗體Anti-HER2-scFv的探針B，所述探針B的堿基組成如SEQ ID NO. 2所示，
[0028] c )堿基組成如SEQ ID NO. 2所示的連接子；
[0029] D)堿基組成如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物。
[0030] 本發(fā)明的另一目的是提供一一種血液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的方法，它具 有定量、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)腫瘤細(xì)胞及定量細(xì)胞表面特異受體密度的優(yōu)點(diǎn)。
[0031] 實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0032] -種血液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的方法，包括以下步驟：
[0033] (1)將探針A偶聯(lián)有血液中循環(huán)癌細(xì)胞上的抗原的特異性抗體1，
[0034] (2)將探針B偶聯(lián)血液中循環(huán)癌細(xì)胞上的抗原的特異性抗體2,所述特異性抗體2 與特異性抗體1不相同；
[0035] (3)將血液中循環(huán)癌細(xì)胞與步驟（1)中的所述探針A和步驟（1)中的所述探針B 孵化，所述探針A和所述探針B分別通過(guò)抗原抗體結(jié)合，結(jié)合到細(xì)胞上；
[0036] (4)加入連接子，探針A與探針B互補(bǔ)雜交；
[0037] (5)加入連接酶，所述探針A與探針B因接近連接而形成新的完整的長(zhǎng)鏈。
[0038] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種連接酶激活型探針?lè)糯驝TCs檢測(cè)信號(hào)的方法。連接酶激活型 探針檢測(cè)CTCs的最大優(yōu)點(diǎn)在于它同時(shí)具備了實(shí)時(shí)定量PCR的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的 高特異性。它將對(duì)細(xì)胞的抗原的檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增的DNA的檢測(cè)，因此具有極 高的檢測(cè)靈敏度，而鄰近連接反應(yīng)的苛刻條件(雙探針必須同時(shí)結(jié)合到靶標(biāo)抗原上，且相互 間距離足夠貼近時(shí)，連接反應(yīng)才能夠發(fā)生）使得這種方法具有比普通PCR方法更高的特異 性。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明液中循環(huán)癌細(xì)胞的檢測(cè)信號(hào)放大的原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 針對(duì)目前CTCs檢測(cè)方法中存在的不足，本發(fā)明建立新型的CTCs檢測(cè)方法方法以 提高血液中的CTCs檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。本發(fā)明主要是針對(duì)現(xiàn)有CTCs的PCR檢測(cè)技術(shù) 中存在的不足進(jìn)行創(chuàng)新和改進(jìn)，設(shè)計(jì)一種連接酶激活型納米探針以同時(shí)提高CTCs檢測(cè)的 靈敏度和準(zhǔn)確度。在這