專利名稱：血液攜帶的間質(zhì)細胞的制作方法
1.概述本發(fā)明涉及一個哺乳動物血液攜帶的細胞類群，它們能表達出一個獨特的表面標志圖樣，其中包括結(jié)締組織成纖維細胞的一些典型的標志，這些細胞在此稱作“血液攜帶的間質(zhì)細胞”。具體地說，本發(fā)明涉及這些血液攜帶的間質(zhì)細胞的分離、表征和應用。本發(fā)明的細胞與外周血液白細胞之間可由其特殊的大小、形態(tài)、細胞表面表型和生物學活性區(qū)分開，同樣也可以通過其他表面表型標志將其與結(jié)締組織成纖維細胞區(qū)分開。如動物模型所示，這些在培養(yǎng)物中和在體內(nèi)增殖的細胞，能夠從血液遷移到創(chuàng)傷部位。因此，這樣的血液攜帶的間質(zhì)細胞可能有非常廣泛的應用，包括但不限于加快創(chuàng)傷愈合、組織重塑和基因治療。
2.發(fā)明背景2.1創(chuàng)傷愈合創(chuàng)傷可以被認為是組織的正常結(jié)構(gòu)的物理性截斷，它可能是由于物理或者化學的原因，例如燒傷，擦傷，割傷或者外科手術過程造成的。就皮膚而言，既然它通常的功能是作為身體的第一道防線，則皮膚的創(chuàng)傷可能會嚴重地損害個體的抗感染能力，除了痛苦、不適外更會導致個體對偶發(fā)性感染的易感性。因此，非常需要開發(fā)這方面的藥劑和方法，以促進快速治愈創(chuàng)傷的應答。
當創(chuàng)傷發(fā)生時，機體啟動了一個相互協(xié)同的修復應答，這是一系列復雜的過程，包括了體液和細胞兩方面因素，而且這個過程持續(xù)幾天到幾周的時間。特別是據(jù)顯示，創(chuàng)傷愈合依賴于特異類型的細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)之間的相互作用(克拉克，1989，現(xiàn)代細胞生物學評論，11000)。創(chuàng)傷愈合的第一步包括被認為是血小板的血液攜帶細胞的活動。這些細胞在創(chuàng)傷部位聚集，并且建立起一道臨時屏障以阻止血液的流失。血小板的這一作用是通過分泌催化血塊形成的凝血酶和其他因子完成的，這些因子吸引其他的細胞到受損的部位。
在最初的二十四小時過后，更多的細胞成分到達并對創(chuàng)傷愈合過程發(fā)揮作用。血液攜帶的嗜中性白細胞和單核細胞遷移到創(chuàng)傷部位。這些細胞在某種程度上能中和入侵微生物和分泌能夠清除最初血塊的酶類。這時是通常所指的傷口愈合中的“發(fā)炎”階段，巨噬細胞開始通過分泌多種炎癥細胞因子而發(fā)揮重要作用，例如腫瘤壞死因子(TNF)，白細胞介素如IL-1、IL-6、IL-8、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等，以及生長因子如表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，來源于血小板的生長因子(PDGF)，以抵抗感染和補充其他細胞種類。這些細胞種類包括上皮和結(jié)締組織細胞，尤其是成纖維細胞，它們最終修復組織損壞的部位。組織修復的最后一個階段是組織的重塑，包括膠原蛋白交聯(lián)，膠原溶解，膠原合成，以增強傷口內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性。遺憾的是，全過程要相當長的時間才能完成。
為了加快創(chuàng)傷愈合過程，防止或減少感染和對深層組織的進一步損害，近年來許多種方法都已被研究過。一種相對傳統(tǒng)的方法包括將健康的組織移植到創(chuàng)傷部位上，尤其是用從身體其他部位獲得的自體組織(貝爾等，1983，皮膚學研究雜志，8125)。另一種方法是給予能夠提高趨藥性、促進細胞增殖的細胞因子，諸如PDGF、TGF-β和FGF(皮爾斯等，1989，細胞生物學雜志，109429；拉伯利等，1988，科學，241708)。
2.2創(chuàng)傷愈合過程涉及到的細胞類型在幾天到幾周的時間中，組織修復和重塑持續(xù)進行。在皮膚中發(fā)生表皮化過程，即當下層的真皮被修復時，鄰近的表皮細胞在創(chuàng)傷部位生長來保護真皮。結(jié)締組織間質(zhì)細胞，也被認為是成纖維細胞，是創(chuàng)傷修復的后一階段的首要介體。這些細胞在創(chuàng)傷部位內(nèi)增殖，產(chǎn)生膠原蛋白和其他基質(zhì)成分。在這一階段，細胞和大分子構(gòu)成的網(wǎng)狀組織被建立起來，以負責特殊的組織或器官最終的組織再生。平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞也移至創(chuàng)傷部位。新的血管系統(tǒng)形成，用以支持和營養(yǎng)新建的組織。
創(chuàng)傷修復的主要細胞介體包括血液攜帶的血小板和白細胞，例如嗜中性細胞和單核白細胞，單核白細胞遷移到受傷區(qū)域后成為巨噬細胞。這些血液來源的白細胞可以抵抗感染并分泌細胞因子和生長因子。而且，周圍結(jié)締組織的成纖維細胞也向受傷部位內(nèi)生長以提供更多的細胞因子和細胞外基質(zhì)蛋白。但是在本發(fā)明之前，還從未有人描述過有參與和加強創(chuàng)傷修復過程能力的血液攜帶的成纖維細胞樣細胞類群。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及與創(chuàng)傷愈合有關的哺乳動物血液攜帶的間質(zhì)細胞，分離這些細胞的方法，以及應用這些細胞促進創(chuàng)傷愈合和組織修復的方法。
本發(fā)明部分基于申請人的發(fā)現(xiàn)，即一類相對較大的，紡錘形的，成纖維細胞樣的細胞，它們可以從人和鼠類外周血中分離并培養(yǎng)。用對多種已知的細胞標志特異的抗體來對這些細胞進行表型分析，表明這些細胞來源于間質(zhì)細胞，因為它們表達了典型的成纖維細胞標志如膠原蛋白、波形蛋白、纖維結(jié)合素。在細胞培養(yǎng)物中，這些大型紡錘形細胞與小型圓細胞共存，后者也表現(xiàn)出成纖維細胞樣的表型。因此，這些間質(zhì)細胞能夠通過它們的大小、形態(tài)和特殊的表型與其他外周血白細胞區(qū)別開來。因為相對于已知的血液細胞類型而言，這些細胞的表面標志形式與成纖維細胞表型一致，因此這些細胞在此被稱為“血液攜帶的間質(zhì)細胞?！北景l(fā)明以實施例的方式描述了人體血液細胞被分離、培養(yǎng)和其細胞表面表型鑒定。在體外，間質(zhì)細胞的擴增與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以劑量依賴方式相關。在體內(nèi)，可觀察到相應的鼠類細胞類群遷移到實驗性地移植到動物身上的創(chuàng)傷腔(wound chamber)中。
在此描述的血液攜帶的間質(zhì)細胞，和這些細胞產(chǎn)生的各種因子的廣泛應用，都被包含在本發(fā)明中，特別是在改善傷口愈合方面，包括但不限于皮膚創(chuàng)傷、角膜創(chuàng)傷、具上皮內(nèi)表層的器官創(chuàng)傷、擦傷、刀傷、燙傷、慢性潰瘍、炎癥和類似情況以及外科手術過程引起的創(chuàng)傷。
另外，間質(zhì)細胞可以通過遺傳工程來表達所需的一種或幾種基因產(chǎn)物?；蚬こ碳毎梢员挥糜隗w內(nèi)(例如，或者還給自體宿主，或者送入一合適的受體)以局部地或全身性地釋放它們的基因產(chǎn)物。
4.附圖簡述

圖1細胞熒光測量中入射光的前向散射和側(cè)向散射表明，經(jīng)過培養(yǎng)后細胞類群的大小和顆粒性結(jié)構(gòu)增加。
圖1A新分離的培養(yǎng)前的外周血淋巴細胞。
圖1B培養(yǎng)四周后回收的細胞。
圖2粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子導致血液攜帶的間質(zhì)細胞的擴增。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及哺乳動物血液攜帶的間質(zhì)細胞，分離和表征這些細胞的方法，以及這些細胞的種種應用方法，這些應用包括但不限于創(chuàng)傷愈合和基因治療。
本發(fā)明將在下面進行詳述，其目的在于描述而不是限制。這里描述和舉例說明的從人體血液中分離間質(zhì)細胞的特殊步驟和方法僅僅是說明性的。本領域已知的其他相似的步驟和方法同樣適用。并且，相似的技術可能適用于分離非人類的哺乳動物血液中的間質(zhì)細胞。
5.1.血液攜帶的間質(zhì)細胞的分離本發(fā)明提供了從外周血或其他生理來源富集和/或純化間質(zhì)細胞的方法。這些細胞具有的生物活性允許不必在絕對潔凈的裝置中使用它們。雖然優(yōu)選的是血液，但是本發(fā)明中的間質(zhì)細胞也可從它們存留或成熟的任何組織中分離出來，這些組織包括但并不限于骨髓、胎肝、或胚卵黃囊。
為了從外周血液中獲得與創(chuàng)傷愈合有關的間質(zhì)細胞，需使用多種分離步驟。第六節(jié)所描述的實施例中的分離方法的變化被包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。依照本發(fā)明的這個方面，血液攜帶的間質(zhì)細胞可以根據(jù)有或沒有特異性細胞表面標志來分離。這些技術包括流式細胞計數(shù)法(使用熒光激活的細胞分選器)，生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白鏈菌素分離法(使用了與表面標志偶聯(lián)的生物素特異性的多克隆或單克隆抗體，以及與固體支持物，比如親和柱基質(zhì)或塑料表面，結(jié)合的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)，磁性分離法(利用抗體包被的磁珠)，破壞性分離法(例如抗體加補體或與細胞毒素或放射性同位素偶聯(lián)的抗體，用以移去不需要的細胞類群)。
或者，所述間質(zhì)細胞可以通過下述方法分離重復的密度梯度離心、外源凝集素層析、親和層析(包括正向選擇和反向選擇)，或這些方法聯(lián)合使用。正向選擇法可以應用具有抗間質(zhì)細胞特異性的表面標志的抗體的親和層析法。例如，在密度梯度離心或塑料粘附后，血液中的大部分的單核細胞被去掉，這時一種抗波形蛋白的抗體就可被用來正向選擇間質(zhì)細胞。反向選擇法包括了對在此公開的操作規(guī)范的修改，見后。實質(zhì)上，一個間質(zhì)細胞制備物可以和一個或更多抗細胞表面抗原的抗體直接反應，所述抗原與間質(zhì)細胞的遷移無關。可以應用任何抗T細胞，B細胞，單核細胞，自然殺傷細胞(NK)，樹突狀細胞和粒性白細胞標志的抗體。這樣的抗體包括例如對T細胞特異的抗-CD3，抗-CD4，抗-CD5，抗-CD8，抗-αβ，抗-γδT細胞受體；對B細胞特異的抗-CD12，抗-CD19，抗-CD20；對單核白細胞特異的抗CD-14；對NK細胞特異的抗CD-16，抗CD-56。這些抗體可以重復性地結(jié)合使用或按一定順序使用來富集間質(zhì)細胞。一旦結(jié)合了抗體，細胞會吸附于包被了抗鼠抗體(因為多數(shù)抗細胞表面標志的單抗是小鼠產(chǎn)生的)的固體表面柱，從而被分離；或者，如果抗體與生物素偶聯(lián)，可以用抗生物素蛋白包被的表面分離結(jié)合抗體的細胞；或者，如果抗體偶聯(lián)于磁珠，可在磁場中分離抗體識別的表達抗原的細胞。
5.2.血液攜帶的間質(zhì)細胞的特征描述如本文實施例所述，血液攜帶的細胞可以用免疫化學的方法在外周血中檢測到，并且可以被多種步驟純化到均一。細胞在短期培養(yǎng)中分為形態(tài)學上截然不同的兩類，一種“圓形”的細胞類型和一種“紡錘形”的成纖維細胞狀的細胞類型。在短期培養(yǎng)中，圓形細胞似乎是由淋巴細胞和一種小的圓形細胞組成的混合物，后者象紡錘形細胞，有成纖維細胞樣的表型。長期培養(yǎng)好象加強了間質(zhì)細胞(即表現(xiàn)成纖維細胞表型的圓形和紡錘形細胞)的生長，直至它們在體外成為優(yōu)勢細胞類型。小型的圓形間質(zhì)細胞代表的可能是紡錘形間質(zhì)細胞的有絲分裂活躍期。因此在短期培養(yǎng)中的初始淋巴細胞類群，即在沒有特異淋巴因子的培養(yǎng)條件下壽命有限的細胞，最后將生成更持久的間質(zhì)細胞。
本發(fā)明中的細胞被表征為源于間質(zhì)細胞，因為與得自血液的細胞相比，它們有不尋常的表面表形。特別是，這些細胞表達波形蛋白、纖維結(jié)合素、I和III型膠原蛋白，這些是成纖維細胞的典型標志。相反地，這些細胞不表達細胞角蛋白、馮·威利布蘭德因子、肌間線蛋白、層粘連蛋白和平滑肌細胞α肌動蛋白，所有這些蛋白是上皮、內(nèi)皮和平滑肌細胞常用的識別標志。而且，外周血白細胞典型地表達的抗原如CD3，CD4，CD8，和CD56在血液攜帶的間質(zhì)細胞中也不出現(xiàn)。有趣的是，這些細胞對CD34卻是陽性的，而CD34是造血干細胞的標志，這說明這里所說的間質(zhì)細胞可能源于骨髓。
本發(fā)明的間質(zhì)細胞在細胞熒光圖象法入射光前向和側(cè)向散射中表現(xiàn)出比外周血液淋巴細胞大些和更具顆粒狀結(jié)構(gòu)。它們呈現(xiàn)出一種獨特的紡錘形的形態(tài)學特征，這對于成纖維細胞是典型的而對于其他得自血液的細胞卻是不典型的。因此，綜上所述，血液攜帶的間質(zhì)細胞是一個獨特的類群，基于它們的大小、細胞表面表形和形態(tài)學性質(zhì)，它們不同于所有前面描述過的來源于血液的細胞類群。
5.3.血液攜帶的間質(zhì)細胞的培養(yǎng)和擴增用常用的標準培養(yǎng)技術長期在培養(yǎng)基中體外增殖已分離的血液攜帶的間質(zhì)細胞對本領域的技術人員來說是熟知的。優(yōu)選地，使用富含血清的培養(yǎng)基，更優(yōu)選地，用含有20％胎牛血清的培養(yǎng)基(例如可參照6.1.1，見后)?，F(xiàn)已表明，細胞的生長在加入GM-CSF后被進一步加強。從上面的敘述可以知道，從外周血中獲得的白細胞的短期培養(yǎng)物含有混雜的淋巴細胞類群，而成纖維細胞標志陽性細胞在長期培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。GM-CSF加速了成纖維細胞樣細胞在培養(yǎng)物中占優(yōu)勢的過程。另外，被分離的細胞可用于基因工程表達內(nèi)源的GM-CSF以便以一種自動分泌的方式維持長期生長。(參照5.4，見后)。在這種方式下產(chǎn)生的連續(xù)細胞系或者克隆，可以使后面分離表面標志和細胞因子以及編碼它的基因更容易。血液攜帶的間質(zhì)細胞的長期培養(yǎng)可以在組織培養(yǎng)瓶、搖瓶、生物反應器系統(tǒng)中利用本領域中的任何已知方法進行。事實上，這些間質(zhì)細胞可以對多種其他常規(guī)細胞因子和生長因子有響應。
5.4.血液攜帶的間質(zhì)細胞的應用血液攜帶的間質(zhì)細胞在培養(yǎng)中增殖的能力表明它們可被用于很多方面，如創(chuàng)傷愈合、基因治療，尤其是對于自體和同基因宿主。就這些目的，細胞可以在分離后被直接使用，或在體外培養(yǎng)中導入或不導入外源基因，在培養(yǎng)中表達或不表達基因產(chǎn)物的情況下使用。
目前外源基因在不同器官的真核宿主細胞中穩(wěn)定整合有一個主要障礙，即多數(shù)這樣的細胞不能在體外增殖。由于間質(zhì)細胞可在體外增殖，特別是受到GM-CSF的影響，因此它們可以作為向培養(yǎng)物中導入外源基因的受體的理想候選者。除了血液攜帶的間質(zhì)細胞合成的細胞因子，許多別的細胞因子或粘附分子都可以通過基因工程方法引入這些細胞，這樣能提高它們促進和加速創(chuàng)傷愈合及組織重塑，以及釋放為了治療之用而引入這些間質(zhì)細胞的基因的產(chǎn)物的能力。
通常，這些細胞的基因工程處理方法包括從個體中分離血液攜帶的間質(zhì)細胞，將一個基因轉(zhuǎn)入細胞以及確認該基因的穩(wěn)定整合和所需基因產(chǎn)物的表達。這樣的基因工程細胞可被植入同一個、或一個HLA匹配的或其他適宜的患者體內(nèi)，和/或可用作這些細胞產(chǎn)生的因子和/或其編碼基因的來源。為了本發(fā)明的實施，按下文第六節(jié)中描述的步驟分離的間質(zhì)細胞可用作基因轉(zhuǎn)移實驗的受體。這些細胞能在外源基因?qū)肭啊⒅?、后培養(yǎng)生長。其增殖活力能被GM-CSF加強。為向培養(yǎng)的間質(zhì)細胞導入外源基因，可采用常規(guī)技術，包括但不限于顯微注射、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導法將任何克隆的基因?qū)搿?br> 基因轉(zhuǎn)移的方法之一是使用重組病毒，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒。例如，若用腺病毒表達載體，一個編碼序列可被連接于一個腺病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯控制復合物，如晚期啟動子和三分裂狀先導序列。通過體內(nèi)或體外重組，這個嵌合基因于是被插入病毒基因組。插入到腺病毒基因組的非必要區(qū)段(如E1或E3區(qū)段)將產(chǎn)生一個活的重組病毒，它能在被感染的間質(zhì)細胞中表達基因產(chǎn)物(例見羅甘和申克，1984，美國國家科學院院刊，813655--3659)或者可用牛痘病毒的7.5K啟動子(例見馬科特等，1982，美國國家科學院院刊，797415--7419；馬科特等，1984，病毒學雜志，49857--864；潘尼加利等，1982，美國國家科學院院刊，794927--4931)。由能夠作為染色體外因子復制的牛乳頭狀瘤病毒制成的載體也是候選者(沙夫等，1981，分子細胞生物學，1486)。其DNA進入細胞后不久，該質(zhì)粒即可在每個細胞復制約100到200個拷貝。插入的cDNA的轉(zhuǎn)錄不需要質(zhì)粒整合入宿主染色體，因此能產(chǎn)生高水平表達。通過在質(zhì)粒中插入一個可選擇的標記，比如neo基因，這些載體能被用于穩(wěn)定表達?；蛘?，一個逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可經(jīng)修飾后用作一個載體，它能引入和指導任何所需基因在血液攜帶的間質(zhì)細胞中表達(康尼和馬利甘，1984，美國國家科學院院刊，816349--6353)。應用可誘導的啟動子，如金屬硫蛋白IIA啟動子和熱休克啟動子，也可以實現(xiàn)高水平表達。
為了獲得重組蛋白的長期的、高產(chǎn)量生產(chǎn)，穩(wěn)定表達常是優(yōu)先考慮的。間質(zhì)細胞可被適宜的表達控制因子(如啟動子、增強子、控制序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸部位等等)和可選的標記物控制下的cDNA轉(zhuǎn)化，而不用包含病毒復制起點的表達載體。該可選的標記物提供了對選擇物的抗性，并且使細胞將重組DNA穩(wěn)定地整合到其染色體中并且生長，形成的目的基因，它隨后被克隆和擴增成細胞系。例如，外源DNA被導入間質(zhì)細胞后，細胞在富集培養(yǎng)基中生長1至2天，此后被轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基?？梢圆捎迷S多選擇系統(tǒng)，包括(但不限于)單皰疹病毒胸苷激醇基因(魏格勒等，1977，細胞，11223)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(柴巴爾斯卡和柴巴爾斯基，1962，美國國家科學院院刊，482026)，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移(羅依等，1980，細胞，22817)。另外，對代謝物的抗性也可作為選擇的基礎dhfr基因，它具有氨甲喋呤抗性(魏格勒等，1980，美國國家科學院院刊，773567；歐海爾等，1981，美國國家科學院院刊，781527)；gpt基因，它具有酶酚酸抗性(馬利甘和伯格，1981，美國國家科學院院刊，782072)；neo基因，它具有氨基糖苷G-418抗性(克爾伯瑞-蓋拉平等，1981，分子生物學雜志，1501)；hygro基因，它具有抗?jié)窬?hygronycin)抗性(斯坦特里等，1984，基因，30147)。最近，又發(fā)現(xiàn)一些可選擇基因，即txpB基因，它使細胞能利用吲哚而取代了色氨酸；his D基因，使細胞能利用組氨醇而替代了組氨酸(哈特曼和馬利甘，1988，美國國家科學院院刊，858047)；以及ODC(鳥氨酸脫羧酶)基因，它提供了對鳥氨酸脫羧酶抑制劑-2-(雙氟甲基)-DL-鳥氨酸，即OFMO的抗性(L.麥肯羅格，1987，現(xiàn)代分子生物學討論，冷泉港實驗室)。
可以從外周血中分離出血液攜帶的間質(zhì)細胞，經(jīng)培養(yǎng)擴增后用于廣泛的治療目的，包括但不限于加快創(chuàng)傷愈合。有或沒有外源基因的血液攜帶的間質(zhì)細胞在經(jīng)過純化或部分富集后可被直接應用于外傷部位，包括但不限于嚴重的創(chuàng)傷、灼燒、切割、擦傷、慢性潰瘍和皮膚炎癥。這種細胞在化妝品方面的應用也包括于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
而且，這些細胞也可被直接應用于損傷的組織或器官，例如那些由外傷或手術過程造成的，以修復內(nèi)部器官，比如胃粘膜、心臟組織、骨骼和血管組織，以及那些用傳統(tǒng)方法難以治愈的組織，如關節(jié)軟骨、韌帶、腱和神經(jīng)組織。
另外，這些細胞也可通過多種方法給患者施用，以治療內(nèi)臟的外部或者內(nèi)部損傷，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)輸注等等。施用的方法若能允許細胞的遷移(如靜脈內(nèi)施用)，間質(zhì)細胞將在體內(nèi)遷移到創(chuàng)傷部位，在那里它們可以促進創(chuàng)傷愈合?？梢杂眠@種方式應用基因工程間質(zhì)細胞，將基因產(chǎn)物送至創(chuàng)傷部位；例如因子VIII、生長因子等的基因在這方面可能是有用的。另外，不允許細胞遷移的施用方法可能使被或未被基因工程化的間質(zhì)細胞貯留于施用部位，在那里它們能釋放基因產(chǎn)物到局部環(huán)境和/或全身中。
另一方面，可以設計一些方案來抑制或除去體內(nèi)的這些細胞，例如施用抗特異表面標志的單抗，以治療伴隨有顯著的纖維化的慢性疾病，特別是在過度纖維化的情況下，比如骨髓纖維化、組織細胞增多、肝硬化，瘢痕瘤形成、硬皮病等等。而且，抑制這些細胞遷移到創(chuàng)傷部位可防止傷疤的過量形成。
從個體中獲得的外周血樣品中的血液攜帶的間質(zhì)細胞可以被定量，與健康個體的數(shù)值相比，這種細胞不正常的低或高濃度可能與疾病或紊亂有關。通過形態(tài)學分析、生物活性測定或優(yōu)選地通過免疫化學方法，可對血液攜帶間質(zhì)細胞進行定量。比如，對波形蛋白、纖維結(jié)合素、I或III型膠原蛋白特異的抗體可以被分別或聯(lián)合使用來檢測、量化這些細胞。
5.5血液攜帶的間質(zhì)細胞中的新標志和新細胞因子的鑒定識別血液攜帶的間質(zhì)細胞表達的新抗原性標志的多克隆和單克隆抗體的產(chǎn)生也包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。這樣的抗體可能有廣泛的用途，例如通過親和層析分離和表征血液攜帶的間質(zhì)細胞。該領域內(nèi)許多技術可被用于產(chǎn)生這些間質(zhì)細胞的抗體?？梢杂么婊畹姆蛛x的間質(zhì)細胞、固定化細胞或其膜制備物通過注射免疫多種宿主動物，包括但不限于兔、倉鼠、小鼠、大鼠等。依賴于宿主的種類，可選用不同的佐劑以提高免疫應答，包括但不限于(完全或不完全)福氏佐劑，礦物膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，普盧龍尼克多元醇，多聚陰離子，多肽，石油乳劑，眼孔血藍蛋白，二硝基酚，以及可能有用的人的佐劑如BCG(卡介菌)和微棒狀桿菌。
抗這些細胞上的新抗原的單抗可由任一種能讓培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的技術來獲得。這些技術包括但不限于最先由科勒爾和密爾斯坦描述的雜交瘤技術(1975，自然，256，495--497)，更近一些的人B細胞雜交瘤技術(科斯伯等，1983，現(xiàn)代免疫學，472；科特等，1983，美國國家科學院院刊，802026--2030)，以及EBV雜交瘤技術(科利等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，阿蘭.R.里斯公司，PP.77--96)。也可以用“嵌合抗體”產(chǎn)生技術，該技術是把合適的抗原特異性的小鼠抗體分子基因和一種人的抗體分子基因拼接起來(例見默里森等，1984，美國國家科學院院刊，816851--6855；紐伯格等，1984，自然，312604--608；塔凱達等，1985，自然，314452--454)。另外，產(chǎn)生單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)可以被用來制備單鏈抗體。
可向同源的、同種異體的和異種的宿主注射活的或固定化的血液攜帶的間質(zhì)細胞或其膜制備物。因為單抗能選擇性地結(jié)合于該間質(zhì)細胞而非其它血液細胞，因而能被篩選出來。
含有分子結(jié)合部位的抗體片段可由已知的技術制得。這樣的片段包括但不限于例如F(ab’)2片段可由胃蛋白酶消化抗體分子而得，F(xiàn)ab片段來自于F(ab’)2片段之二硫鍵還原。
血液攜帶的間質(zhì)細胞能遷移到創(chuàng)傷部位的能力表明它們參與自然的創(chuàng)傷愈合反應，這些細胞可能是通過分泌細胞因子和/或與細胞-細胞接觸有關的膜結(jié)合輔助分子發(fā)揮功能的。因此，間質(zhì)細胞可以用作鑒別新的細胞因子和細胞表面輔助分子及其編碼基因的來源。
為了鑒別可能由間質(zhì)細胞產(chǎn)生的新型細胞因子，可建立長期間質(zhì)細胞培養(yǎng)物，或者用病毒或化學物質(zhì)將這種細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞以獲得連續(xù)細胞系。因為多種細胞類型或動物模型能對培養(yǎng)物的上清液產(chǎn)生可檢測的適宜的生物應答，故而可利用它們來直接分析上清液。這些細胞可以被代謝標記，并且將它們的上清液進行生化分析以鑒定具有觀察到的生物活性的可能的蛋白質(zhì)。而且，可通過誘導細胞因子在細胞中的產(chǎn)生來鑒別這些細胞因子。為此，要使細胞暴露于或接觸誘導細胞因子表達、產(chǎn)生的介質(zhì)。許多可誘導別的細胞產(chǎn)生細胞因子的介質(zhì)在這里也可能是有用的。這樣的介質(zhì)包括但不限于鈣離子載體、內(nèi)毒素、佛波酯、已知的細胞因子、化學激活因子、生長因子、激素和/或其它的調(diào)節(jié)物。用SDS-PAGE和/或生物活性鑒定了候選蛋白后，即可用本領域已知的多種技術來純化這種蛋白，包括但不限于SDS制備膠電泳、離子交換色譜、等電聚焦凝膠及其它類型的色譜法。蛋白的純度可用SDS-PAGE來檢驗，由蛋白質(zhì)檢測法來定量，根據(jù)生物檢定來確認其活性并且純化的蛋白可用作制備多抗和單抗的免疫原。
這種純化的蛋白可在生物檢定中被進一步檢測，以刺激和/或抑制不同組織類型的指示細胞系的增殖和/或分化，也可以用放射標記的蛋白通過諸如親和標記的方法鑒別它們的細胞表面受體?？梢杂脤毎蜃犹禺惖目贵w鑒別和定量這些細胞因子的膜結(jié)合形式和分泌形式，從而研究細胞因子的生物合成途徑，親和純化這些蛋白，以及免疫篩選用于編碼序列分子克隆的表達文庫。
6.實施例血液攜帶的間質(zhì)細胞的鑒定、分離和特征描述6.1材料和方法6.1.1從外周血分離細胞和細胞培養(yǎng)血液攜帶的間質(zhì)細胞是從全血，例如人或鼠的血液，中分離的。對人的細胞，用靜脈穿刺法抽取60毫升血到用肝素處理過的注射器內(nèi)并用磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶1地稀釋，稀釋后的血液在蔗糖梯度介質(zhì)下分層，并在室溫下以450×g離心30分鐘。白細胞在紅細胞之上形成了一條帶，這時可得到并用PBS洗并離心三次以上。沉淀的細胞被重懸于25毫升杜氏改性依格斯培養(yǎng)基/20％胎牛血清(FBS)/和0.1％的艮他霉素中。細胞被平鋪在150毫米組織培養(yǎng)皿上。在24小時后，培養(yǎng)基和非粘附細胞被吸出并換上新鮮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每周要換成新鮮的并進行間隔計數(shù)。
6.1.2免疫熒光和細胞熒光圖象分析在某些情況下，細胞被接種在底部放有顯微鏡蓋玻片的小池中。這樣就可用點狀免疫熒光在13毫米的蓋玻片上對培養(yǎng)四周的細胞進行觀察。為了進行分析，玻片被從培養(yǎng)皿中移出，用PBS洗兩遍，用3.5％的甲醛浸沒固定20分鐘。細胞再用PBS洗一遍，在-20℃的70％乙醇中浸7分鐘。然后，用100％乙醇代替70％乙醇，同樣在-20℃下浸沒7分鐘。細胞再浸入-20℃的70％乙醇5分鐘，最后用PBS洗三遍。50微升的初級抗體被含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS以1∶10稀釋后，加到固定化細胞上，在室溫下溫育30分鐘。細胞用PBS洗兩次，之后用加入含3％BSA的PBS以1∶10的比率稀釋50微升的熒光染料偶聯(lián)的二級抗體，在室溫下再溫育30分鐘。為了用兩種抗體進行雙染色，將細胞與帶有不同熒光信號(例如FITC，羅丹明或者得克薩斯紅)的兩種直接偶聯(lián)的抗體按上述方式共同溫育。細胞再用PBS洗兩次，用80％甘油/50mM N-丙基沒食子酸保存，并用熒光顯微鏡分析。
細胞熒光圖象分析也應用于培養(yǎng)四周的細胞。粘附的細胞被輕輕刮下或洗下。用PBS洗過三遍并計數(shù)后，細胞以5×106/毫升密度重懸于含有1％BAS的PBS中。3×105個細胞等分在聚苯乙烯管中(10×75mm)，加入10微升未被稀釋的初級抗體，在黑暗中冰浴45分鐘，用1％BAS/PBS洗三遍。10微升二級抗體-熒光染料偶聯(lián)物被加入(如果初級抗體沒有被直接偶聯(lián)熒光染料)，細胞在黑暗中冰浴40分鐘。為了用兩種抗體進行雙染色，將細胞與帶有不同熒光信號(例如FITC，羅丹明或者得克薩斯紅)的兩種直接偶聯(lián)的抗體按上述方式共同溫育。將細胞再用1％BSA/PBS洗三次，重懸于25微升1％BSA/PBS和100微升3.5％甲醛中，在4攝氏度黑暗條件下保存，直至進行細胞熒光圖象分析。細胞可用貝克登·迪金斯FACS 440和科特爾的Profile 2分析。
6.1.3細胞分類熒光活性細胞的分類是把來源于外周血的紡錘形間質(zhì)細胞純化到均一。這些研究應用了貝克登·迪金斯的FACs 440用來分離間質(zhì)細胞，或者按照細胞大小(光線散射)；或者按照特異的細胞表面標志物的表達，這由抗體的特異性反應決定。
按照細胞大小四周的細胞培養(yǎng)物被刮下并計數(shù)，在PBS中洗三次。細胞重懸于PBS中，濃度為5×105/毫升，在分類之前保存在冰浴中。為了在分類之后培養(yǎng)，全部步驟要在無菌的環(huán)境下進行，細胞被收集到DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中并鋪平皿。
按照細胞表面標志物四周的細胞培養(yǎng)物被刮下并計數(shù)，在PBS中洗三次。細胞重懸于PBS中，濃度為5×105/毫升。3×105個細胞等分在聚苯乙烯小管中(10×75mm)，加入10微升未被稀釋的初級抗體，在黑暗中冰浴45分鐘，用1％BAS/PBS洗三遍。10微升二級抗體-熒光染料偶聯(lián)物被加入(如果最初的抗體沒有被直接連接熒光染色)，細胞在黑暗中冰浴40分鐘。為了用兩種抗體進行雙染色，將細胞與帶有不同熒光信號(例如FITC，羅丹明或者得克薩斯紅)的兩種直接偶聯(lián)的抗體按上述方式共同溫育。將細胞再用1％BSA/PBS洗三次，以5×105的濃度重懸于25微升1％BSA/PBS和100微升3.5％的甲醛溶液，在4攝氏度的黑暗條件下保存。如果在分類后細胞還要被培養(yǎng)，細胞被收集到DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中并鋪平皿。
6.1.4試劑這里描述的研究中用的大部分抗體是從貝克登·迪金斯(圣喬斯，加州)處購買的。其他試劑是抗-纖維結(jié)合素，抗-肌間線蛋白，抗平滑肌阿爾法肌動蛋白，(西格瑪公司，圣路易斯，密蘇里州)；抗-波形蛋白(實驗系統(tǒng)公司，瑞利，北卡羅來納州)，抗-膠原蛋白(凱米康公司，特米庫拉，加州)和抗馮威利布蘭德因子(精確)。
6.1.5增殖檢測為檢測成纖維細胞的生長對GM-CSF的反應，用六孔盤培養(yǎng)細胞，每個孔中有5毫升全血中的白細胞。在培養(yǎng)兩周以后，這些細胞用以下四種條件之一來處理沒有GM-CSF(對照)，25UGM-CSF，50UGM-CSF，100UGM-CSF(每毫升)。培養(yǎng)基和GM-CSF每周更換。細胞計數(shù)是在培養(yǎng)皿上劃分一個固定的區(qū)域，每周對該區(qū)域進行人工計數(shù)。每個區(qū)域內(nèi)的成纖維細胞的百分比反映了具有標準成纖維細胞形態(tài)學的細胞的數(shù)量與該區(qū)域全部細胞數(shù)量的比值。
6.1.6遷移實驗創(chuàng)傷腔被移植到鼠的脅腹部的皮下囊中。創(chuàng)傷腔由一個3厘米長的空心硅橡膠管組成(道-康寧公司)，內(nèi)含一塊高壓滅菌的聚乙烯醇海棉(Unipoint公司，NC)。切口被傷口夾封閉，小鼠被監(jiān)測是否感染。植入一周后，用1cc的注射器和25g的針頭經(jīng)皮抽出創(chuàng)口液體。獲得的細胞在DMEM/20％FBS/0.1％艮他霉素中培養(yǎng)。用形態(tài)學和熒光染色技術來分析成纖維細胞特異性標志物。
6.2.結(jié)果經(jīng)過2到4周的培養(yǎng)，非分裂和低粘附性的細胞逐漸減少。同時，粘附的、分裂中的細胞的分離團塊可以被容易地識別出來。細胞在短期培養(yǎng)中分為形態(tài)學上截然不同的兩類，一種“圓形”的細胞類型和一種“紡錘形”的成纖維細胞狀的細胞類型。細胞熒光圖象分析表明這些細胞分為兩個亞群。光散射分析表明，圓細胞表現(xiàn)為“小”細胞，而紡錘形細胞表現(xiàn)為“大”細胞。在短期培養(yǎng)中(如1-2周)，圓形細胞類群是由淋巴細胞和有成纖維細胞表型的細胞組成的混合物。在長期培養(yǎng)中，存活的絕大部分細胞都顯出間質(zhì)細胞的表型。
隨后，可以在熒光顯微鏡下直接觀察(點狀免疫熒光)和細胞熒光圖象分析進行細胞表面標志物的免疫熒光分析。兩種完全不同的細胞類型，被熒光活性分類法(FACs)進一步分離，純化和定性。
通過抗體染色，大型的“紡錘形”細胞被確認為一種間質(zhì)細胞，其表現(xiàn)典型的成纖維細胞標志即I、III型膠原蛋白、波形蛋白、纖維結(jié)合素。這些結(jié)果被概括在表一中。依照大小或免疫熒光的細胞分類，以及隨后的特異性染色，確認了上述細胞類型和表1中的表型分析。并且，這些細胞顯得比外周血白細胞更大和更有顆粒性(圖1)。
表一來源于外周血的，大型紡錘形間質(zhì)細胞表面表構(gòu)型總結(jié)陽性表達 陰性表達MHCII類 T細胞受體(αβ和γδ)CD11bCD3CD11cCD4CD13 CD8CD34 CD11aCD45 CD14波形蛋白 CD16纖維結(jié)合素 CD19I型膠原蛋白 CD25III型膠原蛋白CD33CD38CD44CD54CD56細胞角蛋白馮·威利布蘭德因子肌間線蛋白平滑肌細胞α肌動蛋白層粘連蛋白血液攜帶的間質(zhì)細胞可以在加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)50U/ml的情況下體外增殖。
在小鼠背部實驗性地植入創(chuàng)傷腔。觀察到與人類血液攜帶的間質(zhì)細胞形態(tài)學上一致的鼠類細胞向創(chuàng)傷腔內(nèi)遷移。
本發(fā)明并不局限于實施例中的范圍，那些只是對發(fā)明單方面的說明。事實上，這里描述和說明的本發(fā)明的其他修改，從以下的描述和附圖來看，對本領域的技術人員將是顯而易見的。這樣的修改也包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
文中的參考文獻在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.分離的顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞。
2.權(quán)利要求1中的哺乳動物血液攜帶的細胞，其顯示波形蛋白陽性表型。
3.權(quán)利要求1中的哺乳動物血液攜帶的細胞，其為纖維結(jié)合素陽性。
4.權(quán)利要求1中的哺乳動物血液攜帶的細胞，其為I型膠原蛋白陽性。
5.權(quán)利要求1中的哺乳動物血液攜帶的細胞，其為III型膠原蛋白陽性。
6.權(quán)利要求1中的哺乳動物血液攜帶的細胞，其為CD34陽性。
7.包含顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞的細胞組合物。
8.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞是基本上純系的類群。
9.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞表達波形蛋白。
10.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞表達纖維結(jié)合素。
11.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞表達I型膠原蛋白。
12.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞表達III型膠原蛋白。
13.權(quán)利要求7中的細胞組合物，其中哺乳動物血液攜帶的細胞表達CD34。
14.一種分離顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞的方法，該方法包括用親和分離法處理一群混合的血液細胞，所述親和分離法使用了抗波形蛋白，纖維結(jié)合素，I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的抗體或其組合。
15.一種分離顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞的方法，該方法包括用反向選擇法處理一群混合的造血細胞，所述反向選擇法使用了抗T細胞，B細胞，單核細胞，巨噬細胞和自然殺傷細胞標志的抗體。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中混合的血液細胞類群首先用密度梯度離心分離以便從白細胞級分中收集細胞。
17.一種利用顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞加快創(chuàng)傷愈合的方法，該方法包括給受治療者施用有效量的細胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中細胞是通過靜脈施用的。
19.權(quán)利要求17的方法，其中細胞是局部施用的。
20.權(quán)利要求17的方法，其中的受治療者是人。
21.一種抑制顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞的活性的方法，該方法包括施用有效量的可以與細胞表面標志發(fā)生反應的抗體。
22.一種擴增顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞類群的方法，該方法包括用富含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中培養(yǎng)基包含外源的細胞因子。
24.權(quán)利要求23的方法，其中細胞因子是GM-CSF。
25.一種從顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞中分離細胞因子的方法，該方法包括培養(yǎng)細胞和從細胞培養(yǎng)物中分離細胞因子。
26.權(quán)利要求25的方法，該方法包括在細胞培養(yǎng)物中加入能夠誘導細胞因子產(chǎn)生的藥劑。
27.一種分離細胞表面粘附分子的方法，所述粘附分子是由顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞表達的，該方法包括培養(yǎng)細胞并從細胞培養(yǎng)物中分離粘附分子。
28.一種分離編碼細胞因子的基因的方法，所述細胞因子是由顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞產(chǎn)生的，該方法包括培養(yǎng)細胞并從細胞培養(yǎng)物中分離編碼細胞因子的基因。
29.一種分離編碼細胞表面分子的基因的方法，所述細胞表面分子是由顯示成纖維細胞特征的哺乳動物血液攜帶的細胞產(chǎn)生的，該方法包括培養(yǎng)細胞并從細胞培養(yǎng)物中分離編碼細胞表面分子的基因。
30.顯示成纖維細胞特征的用基因工程方法得到的哺乳動物血液攜帶的細胞，其具有與一控制基因表達的調(diào)控區(qū)可操縱相聯(lián)的所需基因，從而使細胞表達所需基因。
31.一種體內(nèi)施用所需基因產(chǎn)物的方法，該方法包括給需要該基因產(chǎn)物的哺乳動物施用有效量的顯示成纖維細胞特征的用基因工程方法得到的哺乳動物血液攜帶的細胞，所述細胞具有與一控制基因表達的調(diào)控區(qū)可操縱相聯(lián)的所需基因，從而使細胞表達所需基因。
32.一種在外周血中的，哺乳動物血液攜帶的間質(zhì)細胞的定量方法，該方法包括(a)從個體獲得血樣，并(b)對顯示成纖維細胞特征的細胞定量。
33.權(quán)利要求32的方法，其中血液攜帶的間質(zhì)細胞的定量方法為(a)將從血樣中得到的單核細胞與對波形蛋白、纖維結(jié)合素、I型膠原蛋白或III型膠原蛋白或其組合有特異性的抗體一起溫育，以使抗體與細胞結(jié)合；(b)從細胞上洗掉未結(jié)合的抗體，并(c)計量與抗體結(jié)合的細胞的數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個哺乳動物血液攜帶的細胞類群，它們能表達出一個獨特的表面標志圖樣，其中包括結(jié)締組織成纖維細胞的一些典型的標志，這些細胞在此稱作“血液攜帶的間質(zhì)細胞”。具體地說，本發(fā)明涉及這些血液攜帶的間質(zhì)細胞的分離、表征和應用。本發(fā)明的細胞與外周血液白細胞之間可由其特殊的大小、形態(tài)、細胞表面表型和生物學活性區(qū)分開，同樣，也可以通過其他表面表型標志將其與結(jié)締組織成纖維細胞區(qū)分開。如動物模型所示，這些在培養(yǎng)物中和在體內(nèi)增殖的細胞，能夠從血液遷移到創(chuàng)傷部位。因此，這樣的血液攜帶的間質(zhì)細胞可能有非常廣泛的應用，包括但不限于加快創(chuàng)傷愈合、組織重塑和基因治療。
文檔編號C12N5/08GK1149316SQ94195107
公開日1997年5月7日 申請日期1994年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月16日
發(fā)明者A·塞蘭米, R·J·布卡拉 申請人:皮考瓦醫(yī)療研究院