專利名稱：單核細胞趨化蛋白-4的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新識別的多核苷酸、由此多核苷酸編碼的多肽以及這些多核苷酸和多肽的用途和制備。更具體地說，本發(fā)明的多肽是單核細胞趨化蛋白-4(MCP-4)。本發(fā)明還涉及抑制這些多肽的作用的方法。
有三種形式的單細胞趨化蛋白，即，MCP-1、MCP-2、MCP-3。所有的這些蛋白均已作了結構和功能上的鑒定，且也已經作了克隆和表達。MCP-1和MCP-2具有吸引白細胞(單核細胞和白細胞)的能力，而MCP-3也具有吸引嗜伊紅性粒細胞和T淋巴細胞(Dahinderi，E.等，J.Exp.Med.，179751-756(1994))的能力。
起初，人單核細胞特異性吸引因子是從神經膠質瘤細胞系和單核細胞細胞系中純化的(Matsushima，K.等，J.Exp.Med.，1691485-1490(1989))。此因子是由Matsuhima等最初設計的神經膠質瘤衍生的趨化因子(GDCF)和單核細胞趨化和活化因子(MCAF)。此因子現(xiàn)稱作MCP-1。隨后克隆的MCP-1的cDNA顯示，它與鼠JE基因極其相似。JE基因可以通過血小板衍生的生長因子在鼠纖維瘤中大量誘導(Cochran，B.H.等，Cell 33939-947(1983))。鼠JE與MCP-1極其相似。MCP-1與鼠JE在68個共有的N-末端殘基區(qū)有62％相同。JE和MCP-1是種同系物被廣泛地接受。本發(fā)明的多肽-MCP-4結構和功能上與MCP-1和鼠JE蛋白相關，參見圖2。
施用JE/MCP-1來抑制脊椎動物中瘤形成的方法公開于PCT專利申請WO-92/20372中，其中還公開了一種通過施用JE/MCP-1來治療惡性腫瘤的局部并發(fā)病的方法和防治寄生感染的方法。已發(fā)現(xiàn)，JE/MCP-1蛋白在惡性腫瘤細胞中的表達抑制了細胞在體內形成腫瘤的能力。
人MCP-1是具有8,700道爾頓的76個氨基酸的堿性肽。MCP-1主要在單核細胞、嗜伊紅性粒細胞和纖維瘤細胞中誘導表達(Leonard，E.J.和Yoshimura，T.，Immunol.Today，1197-101(1990))。誘導這種表達的的因子是IL-1、TNF或脂多糖處理。
MC-1的其它的性能包括以百日咳毒素方式強烈吸引成熟人嗜堿性粒細胞的能力。MCP-1是能直接誘導由嗜堿性粒細胞釋放的組胺的細胞因子(Bischoff，S.C.等，J.Exp.Med.，1751271-1275(1992))。再者，MCP-1通過用白介素3、白介素5、或粒細胞/巨噬細胞克隆刺激因子預處理的嗜堿性粒細胞來促進白細胞三烯C4的形成。MCP-1誘導的嗜堿性粒細胞介體釋放會在變應性發(fā)炎和其它表達MCP-1的病理中起重要作用。
具有編碼人單核細胞趨化和活化因子(MCAF)的核苷酸序列的克隆揭示了由推定的23個氨基酸殘基的信號肽序列和76個氨基酸殘基的成熟MCAF序列組成的MCAF多肽的一級結構(Furtani，Y.H.等，Biochem.Res.Commu.，159249-55(1989))。人神經膠質瘤衍生的單核細胞趨化因子(GDCF-2)的完整氨基酸序列也被測定。此肽吸引人單核細胞，但不吸引嗜中性白細胞。GDCF-2包含76個氨基酸殘基是確定的。此肽鏈含有4個半胱氨酸，在11、12、36和52位上，它產生一對環(huán)，群集在二硫鍵上。再者，MCP-1基因已指定到人染色體17上(Mehrabian，M.R.等，Genomics，9200-3(1991))。某些數(shù)據(jù)示意MCP-1的潛在作用是介導動脈壁的單核細胞滲入。單核細胞看來是作為泡沫細胞的祖細胞和介導內膜增生的生長因子動力源兩者的動脈粥樣化形成機理的中心(Nelken，N.A.等，J.Clin.Invest.，881121-7(1991))。也已經發(fā)現(xiàn)，MCP-1的滑液產生在與類風濕性關節(jié)炎有關的炎癥期間的單核巨噬細胞的補充上起重要作用，并且滑液組織巨噬細胞是這種細胞因子的主導來源。已發(fā)現(xiàn)，MCP-1含量在來自類風濕關節(jié)炎患者的滑液中明顯高于來自骨關節(jié)炎患者或來自其它關節(jié)炎患者的滑液(Koch，A.E.等，J.Clin.Invest.，90772-9(1992))。
MCP-2和MCP-3歸類于前炎癥蛋白亞族，并且功能上與MCP-1有關，因為它們特異性地吸引單核細胞，但不吸引嗜中性白細胞(VanDamme，J.Exp.Med.，17659-65(1992))。MCP-3顯示出分別71％和58％同源于MCP-1和MCP-2。MCP-3是調節(jié)巨噬功能的炎癥細胞因子。
本發(fā)明的一個方面是提供新穎的為MCP-4的成熟多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
本發(fā)明的另一方面是提供編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
本發(fā)明的再一方面是提供一種用重組技術生產這些多肽的方法。
本發(fā)明的再一方面是提供為治療目的利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸來(例如)治療腫瘤、促進傷口愈合、防治寄生性感染和調節(jié)血細胞生成的方法。
本發(fā)明的再一方面是提供這些多肽的抗體。
本發(fā)明的再一方面是提供這些多肽的興奮劑/抑制劑。為治療目的可用來抑制這些多肽的作用，例如，治療類風濕關節(jié)炎、肺炎、過敏、傳染性疾病和用來預防炎癥和動脈粥樣硬化。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖是說明本發(fā)明的具體實施方案，而不是旨在限定由權利要求書所包括的本發(fā)明的范圍。


圖1描述cDNA序列和相應的MCP-4的推斷的氨基酸序列。所示的119個氨基酸序列是全長蛋白，大致前22個氨基酸表示前導序列，97個氨基酸長是蛋白的成熟形式。采用標準的氨基酸單字母縮寫。
圖2說明MCP-4和鼠JE蛋白的cDNA序列的同源性。在各三個片斷的頂端序列是MCP-4，底端序列是鼠JE蛋白。
圖3顯示人細胞中MCP-4的mRNA轉錄物的Northern印跡分析結果。
圖4顯示細胞表達和純化后MCP-4的帶型。
圖5是pQE-9載體的示意性圖解。
本發(fā)明的一個方面是提供一種分離的核苷酸(多核苷酸)，它編碼具有圖1所示的推斷的氨基酸序列的成熟多肽或1994年3月10日以的ATCC保藏號75703保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
本發(fā)明的多核苷酸是從活化的單核細胞cDNA文庫發(fā)現(xiàn)的。它含有編碼大致119個氨基酸長度的且其中前22個氨基酸殘基是推定的前導序列的蛋白的開放讀框。因此成熟蛋白預計為97個氨基酸長度。它結構上與鼠單核細胞趨化蛋白(MCP-1和JE)有關，顯示27％相同，和56％相似于整個人MCP-1蛋白序列。所述多肽含有出現(xiàn)于特征基序的所有趨化因子中的所有四種半胱氨酸殘基。與鼠MCP-1/JE相比，這些半胱氨酸間的間隔得到保留，強烈表明此新基因是趨化因子。
本發(fā)明的多肽可以是RNA形式或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，且如果是單鏈，單鏈可以是編碼鏈和非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1中所示的編碼序列相同或與保藏的克隆的相同，或可以是不同的編碼序列，該不同的編碼序列(由于基因密碼的重復或簡并的結果)，編碼的成熟多肽與圖1的DNA或保藏的cDNA所編碼的相同。
編碼圖1的成熟多肽的或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括只是成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和附加編碼序列(如前導序列或分泌序列或前蛋白序列)；成熟蛋白的編碼序列(和可無可無的附加編碼序列)和非編碼序列(如成熟多肽的5′和/或3′編碼序列的內含子或非編碼序列)。
術語“編碼多肽的多核苷酸”包括僅為多肽的編碼序列的多核苷酸以及包括附加編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上面描述的多核苷酸的變異體類，這些變異體編碼具有圖1所示的推斷的氨基酸序列或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。多核苷酸的變異體可以是天然產生的多核苷酸的等位變異體或非天然產生的所述多核苷酸的變異體。
如此，本發(fā)明包括多核苷酸及其變異體。所述的多核苷酸編碼如圖1所示的成熟多肽或與保藏的克隆的cDNA所編碼的相同的成熟多肽。所述的多核苷酸變異體編碼圖1所示的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸衍生物包括缺失變異體、取代變異體和添加或插入變異體。
如上文指出的，多核苷酸可以具有一編碼序列，它是圖1所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產生的等位變異體。正如本領域所公知的，等位變異體是多核苷酸序列的可變形式，它可以取代、缺失或添加一個或多個核苷酸，而基本上不改變編碼多肽的功能。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以以相同的讀框融合進幫助從宿主表達和分泌多肽的多核苷酸序列中，所述序列例如，一種作為分泌序列在控制多肽由宿主轉運上起作用的前導序列。具有前導序列的多肽是前蛋白(preprotein)且可以具有被宿主裂解形成多肽的成熟形式的前導序列。多核苷酸也可以編碼為成熟多肽加上附加的5′氨基酸殘基的原蛋白。具有原序列的成熟蛋白是原蛋白(proprotein)且是該蛋白的失活形式。一旦原序列被裂解，產生的便是活性蛋白。
這樣，例如，本發(fā)明的多核苷酸可編碼成熟蛋白，或具有前序列的成熟蛋白或具有原序列和前序列(前導序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有以讀框融合于可使本發(fā)明多肽純化的標記序列中的編碼序列。標記序列可以是由pQE-9載體供給六組氨酸標記物的標記序列，該標記物提供在細菌宿主的條件下純化的融合于標記中的成熟多肽，或，例如，當采用哺乳動物例如COS-7細胞時，標記序列可以是血凝素(HA)標記物。HA標記物相應于流感血凝素蛋白衍生的表位(Winson，I.等，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及這樣一些多核苷酸，它們雜交到上面所述的序列上(如果序列間有至少50％和最好是70％的相同)。本發(fā)明特別涉及在嚴格的條件下雜交到上述多核苷酸上的多核苷酸。本文中，術語“嚴格的條件”意思是只有在序列間至少95％和最好是97％相同時，雜交才會發(fā)生。在一些優(yōu)選實施方案中，雜交到上面所述多核苷酸上的多核苷酸編碼基本上保留與由圖1的cDNA或保藏的cDNA所編碼的多肽相同的生物學功能或活性的多肽。
本文中的保藏物會按照《國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約》的要求保藏。這些保藏僅為了為本領域技術人員提供方便，并不是35 U.S.C.$112.條款所要求的保藏。保藏材料中所含的多核苷酸序列以及由此編碼的多肽的氨基酸序列一并作為本文的參考，并用于解決與本文中任何序列描述有關的矛盾。制造、使用或出售保藏的材料應經許可，本文中未給予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有推定的圖1所示的氨基酸序列或由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的MCP-4多肽，以及這些多肽的片段、類似物和衍生物。
術語“片段”、“衍生物”和“類似物”，當指的是圖1的多肽或cDNA編碼的多肽時，意思是基本上保留了與這種多肽相同的生物學功能或活性的多肽。由此，類似物包括一種原蛋白，該原蛋白可以通過切割原蛋白生成活性成熟多肽來活化。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1所示的多肽或保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中一種或多種氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代的多肽，并且這種取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)其中一種或多種氨基酸殘基包括取代基的多肽，(iii)其中成熟多肽與另一化合物融合的多肽，如增加多肽上的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(iv)其中附加的氨基酸融合到成熟多肽上的多肽，如前導序列或分泌序列或采用來純化成熟多肽或原蛋白的序列。由于本文的教導，這些片段、衍生物和類似物在本領域技術人員的知識范圍內。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，且優(yōu)選純化至均質。
術語“分離的”意思是指材料從其原環(huán)境(例如，其自然環(huán)境，如果天然存在)移出。例如，存在于活體動物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分離的，但是從自然體系中的部分和全部共存物質中分離出來的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或這些多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍是分離的，這樣，這種載體或組合物便不是其環(huán)境的一部分。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體、通過遺傳工程產生的攜帶有本發(fā)明的載體的宿主細胞和用重組技術生產本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細胞通過基因工程(轉導或轉化或轉染)而帶上本發(fā)明的載體，本發(fā)明的載體可以是例如克隆載體或表達載體。載體可以是例如質粒形式、病毒顆粒、噬菌體等。工程宿主細胞可以在改進的適宜于活化啟動子、篩選轉化體或擴增MCP-4基因的常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如，溫度、pH等等，是選來表達的宿主細胞預先采用的那些，且它們對普通技術人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經重組技術生產多肽。由此，例如，多核苷酸可以包括在表達多肽的多種表達載體之任一中。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成DNA序列，例如，SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質粒；由質粒和噬菌體DNA、病毒DNA(如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒)組合衍生的載體。然而，只要載體在宿主中可復制和穩(wěn)定，則任何載體均可以使用。
適宜的DNA序列可以通過多種方法插入載體。通常，DNA序列是通過現(xiàn)有技術已知的方法插入適宜的限定性內切酶位點。這些方法和其它的方法在本領域熟練技術人員的知識范圍內。
表達載體中的DNA序列經操作連接到適宜的表達控制序列(啟動子)上以導引mRNA合成。這些啟動子的代表性例子可以提到的有LTR或SV40啟動子，E.coli.lac或trp、噬菌體λPL啟動子和原核細胞和真核細胞或它們的病毒的基因中的已知的控制表達的其它啟動子。表達載體也可以含有翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體也可以包括適宜的擴增表達的序列。
此外，表達載體最好含有一種或多種標記基因，以提供用以篩選轉染宿主細胞的表型特征，如二氫葉酸還原酶或真核細胞培養(yǎng)的新霉素抗性(或如E.coli中四環(huán)素或氨芐青霉素抗性)。
如上面所述的含適宜DNA序列的載體，以及適宜的啟動子或控制序列，可以用來轉化適宜的宿主，使此宿主表達蛋白。
適宜的宿主的代表性例子可以提到的有細菌細胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅屬和sf9；動物細胞，如CHO、COS或Bowes melanoma；植物細胞，等。由于本文的教導，選擇適宜的宿主在本領域技術人員的知識范圍內。
更具體地說，本發(fā)明也包括包含上面廣義地描述的一種或多種序列的重組構建體。這些構建體包含載體，如質粒和病毒載體，這些載體中已經以正或反方向插入本發(fā)明的序列。在此實施方案的優(yōu)選的方面，此構建體還包含調節(jié)序列(包括(例如)可操作連接于序列上的啟動子)。大量的適合載體和啟動子是本領域技術人員已知的，并且可以購得。下列載體以例子的方式提供。細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluscript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNh46A(Stratagene)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核細胞pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，只要它們在宿主中可復制和穩(wěn)定，其它的質粒或載體也可以采用。
采用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其它帶有選擇標記的載體可以將啟動子區(qū)從任何所需的基因中選出。二個適宜的載體是PKK232-8和PCM7。具體給出名字的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gbt、λPR、PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、源自逆轉錄病毒的LTRs、和鼠金屬硫蛋白-I。選擇適宜的載體和啟動子是在本領域普通技術人員的知識范圍內。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高級真核細胞(如哺乳動物細胞)或低級真核細胞(如酵母細胞)，或宿主細胞可以是原核細胞(如細菌細胞)。將構建體導入宿主細胞可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-Dextran介導的轉染、或電穿孔來實施(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
宿主細胞中的構建體可以以常規(guī)的方法使用，產生由重組序列編碼的基因產物。另外，本發(fā)明的多肽可以通過常規(guī)多肽合成儀合成。
成熟蛋白可以在適宜的啟動子控制下在哺乳動物、酵母、細菌、或其它細胞中表達。無細胞翻譯體系也可以采用來使用由本發(fā)明的DNA構建體衍生的RNA生產這些蛋白。用于原核細胞和真核細胞的適宜的克隆和表達載體描述于，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)。此文的公開并入本文作為參考。
高級真核細胞對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉錄由將增強子序列插到載體中而增加。增強子是DNA順式作用因子，通常約10-300bp，它作用于啟動子，增加啟動子的轉錄。例子包括位于復制起點后側bp100-270的SV40增強子(一種巨細胞病毒早期啟動子增強子)，在復制起點后側的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。
通常，重組蛋白載體將包括復制起點和允許宿主轉染的選擇標記(例如，E.coli的氨芐青霉素抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因)，和由下游結構序列的正轉錄的高級表達基因衍生的啟動子。這種啟動子可以由編碼糖酵酶的操縱子衍生，糖酵酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱激蛋白等。異源結構序列與翻譯起始和結束序列(且優(yōu)選能夠定向分泌翻譯的蛋白入壁膜間隙或胞外介質的前導序列)在適宜的相中裝配。任選地，異源序列可以編碼包括賦予所期特征的N-末端識別肽的融合蛋白，所期特征如穩(wěn)定性或簡化純化表達重組產物。
細菌用的有用的表達載體通過將編碼所需的表達蛋白的結構DNA序列與適合的翻譯起始和結束信號一起插到具有功能性啟動子的可操縱讀相中來構建。載體應包含一種或多種表型選擇標記物和復制起點，以確保載體的保持和(如果希望)提供在宿主中的擴增。轉染的適合的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒菌和各種假單孢桿菌屬和鏈霉菌屬的種類，也可以選擇采用其它的宿主。
作為代表性但非限定性的例子，細菌用的有用的表達載體包含選擇標記和細菌的復制起點，該選擇標記和細菌的復制起點源于市售的包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的基因元件的質粒。這些商售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。將這些pBR322“骨架”部分與適宜的啟動子和欲表達的結構序列組合。
在適合的宿主菌株轉染和該宿主菌株生長至適宜的細胞密度后，選擇啟動子通過適宜的方式(例如，溫度轉變或化學誘導)誘導和將細胞再培養(yǎng)一段時期。
細胞典型地通過(用物理或化學的方式破裂)離心收集，并且保留所得的粗提取物作再純化。
采用來表達蛋白的微生物細胞可以用任何方便的方法破裂，包括凍融循環(huán)、聲處理、機械破裂、或使用細胞溶胞劑，這些方法是本領域技術人員所熟知的。
各種哺乳動物細胞培養(yǎng)體系也可以用來表達重組蛋白。哺乳動物表達體系的例子包括猴腎纖維瘤的COS-7系(描述于Gluzman，Cell，23175(1981)中)，和其它的能夠表達匹配載體的細胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa、和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含復制起點、適合的啟動子和增強子、以及任何需要的核糖體結合位點聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄結束序列、和5′側翼非轉錄序列。由SV40剪接位點和聚腺苷酸化位點衍生的DNA序列可以用來提供所需的非轉錄基因元件。
多肽可以通過如下方法從重組細胞的培養(yǎng)物中回收和純化硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酰纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥磷灰石色譜法和卵磷脂色譜法。優(yōu)選在純化期間有低濃度的(大致0.15-5mM)的鈣離子存在(Price等，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可以使用蛋白質重折疊步驟以完善成熟蛋白的構型。最后，可以采用高效液相色譜來進行最終純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然的純化產物，或是化學合成方法的產物，或是用重組技術從原核或真核宿主(例如，用培養(yǎng)基中的細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)生產的。根據(jù)用在重組生產方法中的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
具體就MCP-4而言，本發(fā)明的多肽可以用來促進傷口的愈合。因為MCP-4是趨化因子，它是白細胞(如單細胞、T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞等)的趨化物；因此，它導致靶免疫細胞滲入傷口區(qū)域。
MCP-4多肽也可以用作抗腫瘤治療劑和用作治療惡性腫瘤的局部并發(fā)癥如側滲出(plural effusions)或腹水。將MCP-4注入牽涉到的解剖位置可以導致局部單細胞累積和活化。
活體中MCP的存在伴隨著嗜伊紅性粒細胞存在的局部增加。嗜伊紅性粒細胞具有殺死侵入組織的寄生蟲幼蟲(如在血吸蟲病、毛病和蛔蟲病中的寄生蟲幼蟲)的與眾不同的功能。
MCP-4可以通過調節(jié)各種造血祖細胞活化和分化而在調節(jié)血細胞生成上起作用。
根據(jù)本發(fā)明，多肽也可以通過在活體表達這些多肽來使用，這通常稱作“基因治療”。
例如，患者的細胞可以在體外用編碼MCP-4多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進行基因工程操作，然后將工程化的細胞提供給欲用此多肽治療的患者。這些方法是本領域熟知的。例如，細胞可以通過使用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉錄病毒，用本領域已知的基因工程方法操作。
同樣，細胞可以在體內經基因工程技術處理，在體內通過例如本領域已知的方法表達MCP-4多肽。正如本領域所知的，生產含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒的生產細胞，可以施用于患者體內，體內產生工程細胞，并且在體內表達多肽。施用本發(fā)明多肽的這些和其它的方法，由于本發(fā)明的教導，對本領域的技術人員來說是顯而易見的。例如，工程細胞的表達載體可以不是逆轉錄病毒，例如，可以是在與合適的運送載體組合后，用來在體內產生工程細胞的腺病毒。
本發(fā)明的多肽可以與合適的藥用載體組合使用。這種組合物包含治療有效量的多肽，和藥用可接受的載體或賦型劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘醇、乙醇及其組合。這些制劑應適合于施用方式。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構給出的指示形式的提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的途徑。MCP-4以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。給藥于患者的MCP-4的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、欲治療者的自然條件和診斷醫(yī)生的判斷。通常，MCP-4將以至少約10μg/Kg體重的量給藥，且在大多數(shù)情況下給藥量不超過約每日8mg/Kg體重?？紤]到給藥途徑、癥狀等，在大多數(shù)情況下，劑量是約每日10μg/Kg至約1mg/Kg體重。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列特異性地以單個人染色體的具體位置為靶標，且可以與此染色體雜交。而且，目前需要鑒定在染色體上的具體位點?，F(xiàn)在，很少有基于實際序列數(shù)據(jù)(重復多型性)的染色體標記試劑可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，將DNA作圖于染色體上，是將這些序列與相關于疾病的基因相關聯(lián)的重要的第一步。
簡單地說，通過由cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)，可以將序列對染色體作圖。用cDNA的計算機分析迅速地選擇不跨過基因組DNA的一個外顯子的引物，由此復雜了擴增程序。然后，將這些引物用于PCR篩選含有單個人染色體的體細胞雜種。只有這些含有相應于引物的人基因的雜種會產生擴增的片段。
體細胞雜種的PCR作圖是將具體的DNA指定到具體的染色體的快捷方法。使用帶有相同的寡核苷酸引物的本發(fā)明，可以用來自特定的染色體的片段的一組實驗對象(panel)或類似方式大量基因組克隆集合體來獲得亞定位(sublocalization)。可以相似地用來作圖于其染色體的其它作圖策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和通過雜交到構建體染色體特定cDNA庫的預篩選。
對擴散的中期染色體的cDNA克隆的熒光原位雜交(FISH)可以用來在一個步驟中精確的染色體定位。此技術可以用在短到500或600堿基的cDNA；然而，大于2,000bp的克隆更趨向于結合到簡單檢測的足夠信號強度的特異染色體位置。FISH需要使用由EST衍生的克隆，克隆越大越好。例如，2,000bp就可以，4,000更好，而大于4,000或許不是獲得良好的結果(時間上合理的百分比)所需要的。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列作圖到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于，例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(通過與Johns Hopkins University WelchMedical Library聯(lián)機可以獲得)。然后通過關聯(lián)分析，確定基因與業(yè)已作圖到一些染色體區(qū)域的疾病的關系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列的不同。如果在一些或所有的患病個體中觀察到突變，而在任何正常個體中未觀察到，則突變可能是疾病的動因。
用目前的物理作圖和基因作圖技術的分辨能力，精確定位至與疾病有關的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb一個基因)。
比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體伸展可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。最后，幾個個體的基因完整排序是確證突變存在和突變與多型區(qū)別所需要的。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達它們的細胞，可以用作免疫原，用來生產其抗體。這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合鏈、單鏈抗體，和人化抗體，以及Fab片段，或Fab表達庫的產物?？梢杂帽绢I域各種已知的方法來生產這些抗體和片段。
針對相應于本發(fā)明序列的多肽產生的抗體，可以通過直接將多肽注射入動物(優(yōu)選非人)來獲得。這樣獲得的抗體然后會與其多肽結合。在這種方式中，甚至編碼僅一個多肽的片段的序列也可以用來產生結合整個天然多肽的抗體。然后，這些抗體可以用來將多肽從表達此多肽的組織中分離出來。
為制備單克隆抗體，可以使用任何提供通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)物生產的抗體的技術，這些技術的例子包括雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975，Nature，256495-497)，trioma技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，Immuolgy Today 472)，和生產人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Terapy，Alan R.Liss，Inc.，pp77-96)。
為生產單鏈抗體而描述的技術(USP 4,946,778)可以改進用來生產本發(fā)明的免疫多肽產物的單鏈抗體。
本發(fā)明還涉及定量和定性檢測MCP-4水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括ELISH測定和放射免疫測定。試驗中檢測的MCP-4水平可以用作解釋MCP-4在各種疾病中的重要性和用于診斷MCP-4可以起作用的疾病。
本發(fā)明提供了鑒定MCP-4受體的方法。編碼MCP-4受體的基因可以由表達克隆鑒定。簡而言之，聚腺苷酸化的的RNA由相應MCP-4的細胞制備，并且將從RNA產生的cDNA文庫分成集合體，用來轉染COS細胞或其它不響應MCP-4的細胞。將生長在玻璃斜板上的轉染細胞暴露于標記的MCP-4下。MCP-4可以用已知的各種方式標記，所述的方式包括位點特異的蛋白激酶的識別位點的碘化或排除。固定和培養(yǎng)之后，將斜板進行放射自顯影分析。鑒定陽性集合體，制備亞集合體、用重復亞集合體再轉染和再篩選，最終產生編碼推定受體的單克隆。作為受體鑒定的另一方法，標記的MCP-4可以是與細胞膜或表達MCP-4受體分子的提取制備物相連的光親和性的。交聯(lián)材料通過PAGE拆分，并暴露于X射線膠片。含有MCP-4受體的的標記配合物可以切除、拆分成肽片段，并且進行蛋白微排序。從微排序獲得的氨基酸序列，可用來設計一組產生寡核苷酸探針，以篩選cDNA庫，鑒定編碼推定受體的基因。
本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定提高(興奮劑)或阻遏(拮抗劑)MCP-4與其受體相互作用的藥劑的方法。興奮劑提高MCP-4的生物功能，而拮抗劑降低或消除這類功能。例如，哺乳動物細胞或表達MCP-4的膜制劑能在藥物的存在下與標記的MCP-4一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。另外，在MCP-4與其受體相互作用之后，測定已知的第二信使體系的響應，將藥物存在或不存在作比較。這類第二信使體系包括但不限于，cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明多肽的拮抗劑/抑制劑分子。拮抗劑包括MCP-4的陰性優(yōu)勢突變體。MCP-4是四聚多肽，其中一個突變單位會造成整個多肽無功能。MCP-4的陰性優(yōu)勢突變體結合到MCP-4受體上，但不能活化其結合的細胞(白細胞和單核細胞)。檢測MCP-4陰性優(yōu)勢突變體的試驗是體外趨化性試驗，其中用帶有無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜的多井趨化室，在強的拮抗劑/抑制劑或興奮劑分子的存在和不存在下，測定MCP-4對白細胞的趨化物能力。
抑制劑的例子是反義DNA或RNA構建體。通過三螺旋體形成或反義DNA或RNA(兩方法均是以多核苷酸與DNA或RNA結合為基礎)反義技術可以用來控制基因表達。例如，編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸序列的5′編碼部分，可以用來設計約10-40堿基對長度的的反義RNA寡核苷酸。設計DNA寡核苷酸，互補于涉及轉錄的基因區(qū)域(三螺旋體--參見Lee等，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney等，Science，241456(1988)；和Dervan等，Science，2511360(1991)，由此防止轉錄和MCP-4的產生。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交，并且阻遏mRNA分子翻譯入MCP-4中(反義--Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。另外，反義RNA和DNA可以轉運到細胞，這樣，它們在體內表達，以抑制MCP-4的產生。
拮抗劑的另一例子是MCP-4的肽衍生物，該衍生物是MCP-4的天然或合成修飾類似物，該類似物失去生物功能但仍識別和結合于受體，由此有效地阻遏受體。
由于急性和慢性炎癥性肺疾病與肺中的單核巨嗜細胞的匯集有關，因此，通過防止吸引單核細胞至傷口或創(chuàng)傷處，拮抗劑/抑制劑可以用來治療炎癥，以及調節(jié)正常肺巨嗜細胞數(shù)量。它們也可以用來治療關節(jié)炎，因為發(fā)現(xiàn)MCP的量在類風濕關節(jié)炎患者的滑液中明顯增高，說明滑液生產的MCP吸引單核細胞，單核細胞的流入和吸引在變性和炎癥性關節(jié)炎的病理上是重要的。
由于MCP介導單核細胞滲入動脈壁，而單核細胞滲入動脈壁導致動脈粥樣壞死，因此拮抗劑/抑制劑也可以用來治療動脈粥樣壞死，以及由于業(yè)已顯示MCP直接誘導嗜堿性粒細胞釋放組胺，因此拮抗劑/抑制劑可以用來防止過敏。
由于結核病靶細胞(通常是單核細胞)引起單核細胞釋放MCP，而MCP吸引更多的單核細胞至肺，引起嚴重的炎癥，因此拮抗劑/抑制劑也可用來治療傳染疾病如結核病。拮抗劑/抑制劑也可以用在有(例如如上面所述的)藥學上可接受載體的組合物中。
本發(fā)明還涉及介導特異于MCP-4的潛在拮抗劑/抑制劑的試驗方法。這種試驗的例子，在適宜的條件下，將MCP-4受體和帶有膜結合MCP-4受體或重組MCP-4受體的潛在拮抗劑/抑制劑結合進行競爭抑制試驗。MCP-4可以是標記的(如用放射性)，這樣由結合到受體的MCP-4的數(shù)量可以測定潛在的拮抗劑/抑制劑的有效性。
參照下列實施例進一步描述本發(fā)明；然而，應當理解，本發(fā)明不限于這些實施例。所有的份或量均按重量計，除非另有指明。
為了便于理解下列實施例，下面將對一些常出現(xiàn)的方法和/或術語作描述。
“質粒”可縮略成較低位置上的p，其前和/或后接大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質粒可以是市售的，非限制性的公眾可得的，或可以根據(jù)公開的方法由市售質粒構建。此外，與所描述的質粒等同的質粒是本領域所知的且對普通技術人員而言是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用只作用于DNA某些序列的限制性內切酶將DNA催化切割。本文所用的各種限制性內切酶是市售的，并且其反應、輔助因子和其它要求是本領域普通技術人員已知的。為分析的目的，典型地，1μg質?；駾NA片段使用在20μl緩沖液中的約2單位的酶。為分離DNA進行質粒構建的目的，典型地，用在更大體積中的20-250單位的酶消化5-50μg的DNA。具體的限制性內切酶的適宜緩沖液和底物量由廠家詳細說明，通常采用的是在37℃培養(yǎng)1小時，但可以根據(jù)供應商的指示變化。消化后，將反應物直接移于聚丙烯酰胺凝膠上，分離345Xelectr(所需的片段)。
切割片段的大小分離是用由(Goeddel，D.等，Nucleic Acids Res.，84057(1980))描述的8％聚丙烯酰胺凝膠進行的。
“寡核苷酸”是指可以化學合成的單鏈多脫氧核糖核酸或兩條互補鏈的多脫氧核糖核酸。這些合成的寡核苷酸沒有5′磷酸，因此若沒有在激酶存在下添加帶ATP的磷酸，則不與另一寡核苷酸連接。合成寡核苷酸會與未曾脫磷酸化的片段相連接。
“連接”是指兩個雙鏈核酸片段形成磷酰二酯鍵的過程(Maniatia，T.等，ID.，p.16)。除非另外指定，使用已知的緩沖液和條件，每0.5μg的大致等摩爾量的欲連接DNA片段用10單位的T4 DNA連接酶(“連接酶”)，可以完成連接。
除非另有指明，轉化是按照Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，Virology，52456-457(1973)中描述的方法實施的。實施例1MCP-4的細菌表達和純化編碼MCP-4的DNA序列(ATCC#75703)用相應于加工的MCP-4蛋白的5′和3′序列(減去信號肽序列)和載體序列MCP-4基因的3’的PCR寡核苷酸引物起始擴增。相應于MCP-4的附加核苷酸分別加到5′和3′序列上。5′寡核苷酸引物具有序列5′-TCAGGATCCCCTACGGGCTCGTGGTC-3′，該序列含有Bam H1限制性內切酶位點，接著是從加工的蛋白密碼子的假定末端氨基酸開始的MCP-4編碼序列的18個核苷酸。 3′序列3′-CGCTCTAGAGTTAAAACGACGGCCAGT-5′含有XbaI位點和位于MCP-4 DNA插入物3’的pBluescript SK載體序列的互補序列。限制性內切酶位點對應于在細胞表達載體上的限制性內切酶位點(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。
pQE-9編碼抗體抗性(Amp′)，復制的細菌原(ori)，IPTG可調節(jié)啟動子操縱子(P/O)，核糖體結合位點(RBS)，6-His標記物和限制性內切酶位點。然后用BamH1和Xab I消化pQE-9。將擴增序列連接入pQE-9，并且插入帶有編碼組胺標記物和RBS的序列的讀框中。圖5是這種排列的示意圖。然后用連接混合物通過下述方法轉化E.coli菌株m15/rep4(可從Qiagen得到，商標名M15/rep4)Sambrook，J.等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory Press，1989。M15/rep4含有表達lacI阻抑物和賦予卡那霉素抗性(Kan′)的質粒pREP4的多個拷貝。通過在LB板上的生長能力識別轉化體，并且篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。質粒DNA通過限制性分析分離和確定。將含有所需構建物的克隆在補充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB介質中的液體培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。用O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比率來接種大量的培養(yǎng)物。將細胞生長到光學密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間。然后將IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃苷)加至終濃度1mM。通過失活lacI阻抑物、IPTG誘導清除P/O，導致增加的基因表達。將細胞再生長3至4小時。細胞沉淀用6摩爾鹽酸胍離液劑溶解。澄清后，在允許緊密結合含有6-His標記物的蛋白的條件下，通過在Nickel-Chelate柱上色譜，將溶解的MCP-4從此溶液中純化出來。Hochli，E.等，J.Chromatography 41l177-184(1984)。用6摩爾的鹽酸胍pH5.0將MCP-4(純度95％)從柱上洗脫，并且為復性的目的，調節(jié)至3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mM谷胱苷肽(還原)和2摩爾谷胱苷肽(氧化)。在此溶液中溫育12小時后，將蛋白對10mM磷酸鈉透析。圖4。實施例2人細胞中MCP-4的表達方式進行Northern印跡分析，測定人細胞中MCP-4的表達水平。用RNAzolTM B體系(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分離總細胞RNA樣品。從各具體的人組織分離約10μg的總RNA，在1％瓊脂糖凝膠上分離，并且印跡到尼龍濾器上(Sambrool，fritsch和Maniatis，M olecular Cloning，Cold Spring HarborPress，(1989))。按照Stratagene Prime-It試劑盒用50ngDNA片段做標記反應。標記的DNA用Select-G-50柱純化。(5 Prime-3 prime，Inc.5603Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)。然后，濾器用放射標記的全長MCP-4基因，在65℃下，以1,000,000cpm/ml的速率在0.5MNaPO4、pH 7.4和7％SDS中雜交過夜。用0.5×SSC、0.1％SDS在室溫下沖洗兩次和在60℃沖洗兩次后，將濾器與強化熒光屏一起暴露在-70℃下。MCP-4的信使RNA富含于活化和失活的T細胞、單核細胞和T細胞系中。
鑒于上面的教導，本發(fā)明的許多改變和變化是可能的，并且在所附的權利要求的范圍內，除了具體描述的之外，本發(fā)明也可以實施。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI，ET AL.(ii)發(fā)明名稱單核細胞趨化蛋白-4(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西(E)國家美國(F)郵編07068(V)計算機可讀形式(A)媒體類型3.5英寸磁盤(B)計算機IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)當前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號在優(yōu)申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)代理人/代理機構信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D。(B)登記號36，134(C)證書號325800-160(ix)通訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度360個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(Xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCAGGCC TGATGACCAT AGTAACCAGC CTTCTGTTCC TTGGTGTCTG TGCCCACCAC60ATCATCCCTA CGGGCTCTGT GGTCATACCC TCTCCCTGCT GCATGTTCTT TGTTTCCAAG120AGAATTCCTG AGAACCGAGT GGTCAGCTAC CAGCTGTCCA GCAGGAGCAC ATGCCTCAAG180GGAGGAGTGA TCTTCACCAC CAAGAAGGGC CAGCAGTTCT GTGGCGACCC CAAGCAGGAG240TGGGTCCAGA GGTACATGAA GAACCTGGAC GCCAAGCAGA AGAAGGCTTC CCCTAGGGCC300AGGGCAGTGG CTGTCAAGGG CCCTGTCCAG AGATATCCTG GCAACCAAAC CACCTGCTAA360(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度119個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Gly Leu Met Thr Ile Val Thr Ser Leu Leu Phe LeuGly Val-20 -15 -10Cys Ala His His Ile Ile Pro Thr Gly Ser Val Val Ile ProSer Pro-5 1 510Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys Arg Ile Pro Glu Asn ArgVal Val15 2025Ser Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Ser Thr Cys Leu Lys Gly GlyVal Ile30 35 40Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gln Gln Phe Cys Gln Asp Pro LysGln Glu45 50 55Trp Val Gln Arg Tyr Met Lys Asn Leu Asp Ala Lys Gln LysLys Ala60 65 70Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala Val Lys Gly Pro Val GlnArg Tyr75 80 8590Pro Gly Asn Gln Thr Thr Cys9權利要求
1.一種分離的多核苷酸，它選自由下列物質所組成的組(a)編碼具有圖1所示的推定的氨基酸序列的MCP-4多肽或所述多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由包含在ATCC 75703中的cDNA編碼的氨基酸序列的MCP-4多肽或所述多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸是DNA。
3.權利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸是RNA。
4.權利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸是基因組DNA。
5.權利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼具有圖1所示的推定的氨基酸序列的MCP-4。
6.權利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼由ATCC 75703的cDNA編碼的MCP-4多肽。
7.權利要求1的多核苷酸，它具有如圖1中所示的MCP-4的編碼序列。
8. 利要求2的多核苷酸，它具有以ATCC 75703保藏的MCP-4的編碼序列。
9.一種載體，它含有權利要求2的DNA。
10.具有權利要求9的載體的基因工程的宿主細胞。
11.一種生產多肽的方法，它包括由權利要求10的宿主細胞表達由所述的DNA編碼的多肽。
12.一種生產能夠表達多肽的細胞的方法，它包括用基因工程技術構建具有權利要求9的載體的細胞。
13.一種分離的DNA，它能雜交到權利要求2的DNA上，且編碼具有MCP-4活性的多肽。
14.一種多肽，它選自由下列物質所組成的組(i)具有圖1所示的推定氨基酸序列的MCP-4多肽或其片段、類似物或衍生物；和(ii)具有由包含在ATCC 75703中的cDNA編碼的氨基酸序列的MCP-4多肽或所述多肽的片段、類似物或衍生物。
15.權利要求14的多肽，其中所述的多肽是具有圖1所示的推定的氨基酸序列的MCP-4。
16.權利要求14的多肽的抗體。
17.權利要求14的多肽的興奮劑。
18.權利要求14的多肽的拮抗劑/抑制劑。
19.一種治療需要MCP-4的患者的方法，它包含向患者施用治療有效量的權利要求14的多肽。
20.一種治療需要抑制MCP-4的患者的方法，它包含向患者施用治療有效量的權利要求18的拮抗劑/抑制劑。
21.一種藥物組合物，它包含權利要求14的多肽和藥學上可接受的載體。
22.權利要求19的方法，其中所述治療有效量多肽是通過提供給患者在體內編碼所述多肽和表達所述多肽的DNA而施用的。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼多肽MCP-4的多核苷酸、這類多肽、其抗體和拮抗劑/抑制劑，以及所述多肽和拮抗劑/抑制劑在治療下列疾病上的用途腫瘤、傷口、寄生蟲感染、血生成調節(jié)、炎癥、風濕性關節(jié)炎、肺炎、過敏、動脈粥樣壞死和傳染病(如肺結核)。
文檔編號C12P21/06GK1152315SQ94195131
公開日1997年6月18日 申請日期1994年5月16日 優(yōu)先權日1994年5月16日
發(fā)明者H·D·李, S·M·魯賓, G·G·薩頓三世 申請人:人類基因組科學公司