一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬微生物動物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系及其建立方法。本細(xì)胞系為鼠源性細(xì)胞，與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有不到1%的基因差異且均不涉及主要功能蛋白；能自我增殖，連續(xù)傳代；能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原CD11b(OX42),ED1(OX6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-а、IL-1β與iNOS等致炎因子；經(jīng)體內(nèi)移植后能被高效定向募集到視網(wǎng)膜損傷部位并存活，進(jìn)一步促進(jìn)光感受器存活。本發(fā)明細(xì)胞系可用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究，并可作為從外周-中樞（視網(wǎng)膜）的藥物載體。CGMCC No815820130903
【專利說明】一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物動物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，具體涉及一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，尤其是一種能被高效募集到視網(wǎng)膜的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系及其建立方法。

【背景技術(shù)】
[0002]研究報(bào)道，視網(wǎng)膜退行性疾病是一大類嚴(yán)重的致盲性眼病，其中以視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)最為常見。隨著角膜病、白內(nèi)障等可預(yù)防性和可治療性盲的減少，這一類疾病已成為世界范圍內(nèi)致盲的主要眼病。雖然近年來對其發(fā)病機(jī)制及病理生理過程的研究使得人們對這一類疾病形成了更為深刻的認(rèn)知，并視網(wǎng)膜及干細(xì)胞移植等方面都取得了一定的進(jìn)展，然而醫(yī)療實(shí)踐中依然無法從根本上實(shí)現(xiàn)“對因治療”。在致傷因素不能去除的情況下，如何延緩光感受器進(jìn)行性變性、衰退的過程，依然是當(dāng)今視網(wǎng)膜變性疾病防治研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。
[0003]近年來，作為CNS病理事件“傳感器”的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)的功能調(diào)控日益成為各國研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。研究顯示，在病理模型如腦缺血模型中，駐留型MG能夠分泌轉(zhuǎn)化生長因子-beta (TGF-beta)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)，從而減輕神經(jīng)元的缺血性損傷，給予外源性MG也能夠增加缺血海馬回部位⑶NF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，對受損神經(jīng)元產(chǎn)生營養(yǎng)因子依賴性的保護(hù)作用；尤其值得一提的是，作為CNS游走巨噬細(xì)胞，MG在病理狀態(tài)下受到損傷信號的趨化能迅速聚集到受損的神經(jīng)元周圍甚至可以從外周途徑穿越血屏障進(jìn)入CNS。在本申請已公開的前期工作中，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光照射引起光感受器凋亡，凋亡信號誘導(dǎo)視網(wǎng)膜MG向光感受器層聚集，那么是否可以利用MG這一天然的行為特征將其作為活的生物學(xué)工具，從而為視網(wǎng)膜光感受器變性疾病創(chuàng)建一個(gè)新穎卻又安全可靠的從外周——中樞的功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系？
單核吞噬細(xì)胞包括MG的定向遷移能力受歸巢受體的調(diào)控，其中又以CC-趨化因子受體
2(CCR2)的作用最為重要。有研究在小鼠的多發(fā)性硬化的模型中發(fā)現(xiàn)，CCR2與單核巨噬細(xì)胞向腦內(nèi)的浸潤有關(guān)；CCR2對于巨噬細(xì)胞向海馬回軸突損傷部位的募集是必需的；CCR2基因靜默將阻礙MG的趨化聚集從而加速Alzheimer’ s病的進(jìn)展。在已公開的體外研究中，成功構(gòu)建了 Lent1-CCR2載體并將其轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜MG，被轉(zhuǎn)染的MG能大量表達(dá)CCR2蛋白并在體外趨化實(shí)驗(yàn)中顯示出對CCL2的高趨化性。而在視網(wǎng)膜中，光感受器是CCL2的主要來源，損傷狀態(tài)下其表達(dá)明顯上升，成為吸引外源性MG進(jìn)入損傷部位發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵因子。盡管有研究表明在從外周途徑進(jìn)入CNS的過程中，成熟的MG較巨噬細(xì)胞而言對神經(jīng)組織具有更高的親和力，然而從可行性方面考慮，從患者自身的視網(wǎng)膜分離獲取MG再進(jìn)行外周移植是不現(xiàn)實(shí)的，因此需要尋找其他替代細(xì)胞來源。由于小膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中無法自我增殖，建立功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系的另一個(gè)瓶頸就是缺乏足夠的細(xì)胞數(shù)量，現(xiàn)有技術(shù)已公開的小膠質(zhì)細(xì)胞系有BV2、N9等，但其來源均為大腦組織，因此建立可靠的視網(wǎng)膜來源的能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系是當(dāng)務(wù)之急。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能被高效募集到視網(wǎng)膜的鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系一T-MG。本發(fā)明的視網(wǎng)膜高趨化性的小膠質(zhì)細(xì)胞系能用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究。
[0005]本發(fā)明通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)。本發(fā)明基于成功構(gòu)建了 Lent1-SV40-eGFP慢病毒載體的基礎(chǔ)上，將病毒進(jìn)行包裝后轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞(T-MG)，成功轉(zhuǎn)染后采用基因芯片的方法比較轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞其基因表達(dá)譜的變化，結(jié)果顯示僅有1%為差異基因，其生長性、吞噬性、主要生物學(xué)功能(分泌致炎因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等)與親本細(xì)胞保持一致并能自我增殖。進(jìn)一步對T-MG的趨化能力進(jìn)行測定，將T-MG細(xì)胞置于趨化小室的上端，下端放置不同濃度的CCL2，結(jié)果顯示T-MG細(xì)胞能被CCL2趨化進(jìn)入下室其趨化效應(yīng)呈一定的時(shí)間依賴性和濃度依賴性，并且與原代培養(yǎng)的MG相比其趨化性明顯增強(qiáng)。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明將16的T-MG細(xì)胞通過尾靜脈注射和玻璃體腔注射的方式移植入光損傷大鼠模型，結(jié)果顯示光照后3d，視網(wǎng)膜上可發(fā)現(xiàn)少量GFP (+)細(xì)胞，其數(shù)量逐漸增多于14d時(shí)達(dá)到高峰，28d時(shí)仍可見較多，T-MG移植組視網(wǎng)膜外核層厚度較對照組增厚，顯示出初步的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0006]更具體的，本發(fā)明采用原代培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，通過構(gòu)建Lent1-SV40-eGFP慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染并用有限稀釋法挑取單克隆、體外擴(kuò)增和傳代等策略，分離得到了具有自我增殖能力并向視網(wǎng)膜高趨化的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)，已于2013年9月3日保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101，保藏編號:CGMCC N0.8158,分類命名:大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞株Retinal microglia cell。
[0007]本細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性:經(jīng)基因芯片檢測(20，001 probes)，僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白；T-MG能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶Ilb (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-a、IL-1 β與iNOS等致炎因子，這些小膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能并未受慢病毒轉(zhuǎn)染的影響。最為關(guān)鍵的是T-MG能自我增殖，連續(xù)傳代(驗(yàn)證了 10代)并未影響細(xì)胞性狀；體外趨化實(shí)驗(yàn)顯示T-MG能被CCL2趨化，并且其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng)；體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)(尾靜脈注射途徑和玻璃體腔注射途徑)證實(shí)T-MG能夠進(jìn)入視網(wǎng)膜并存活下來，并且視網(wǎng)膜切片的HE染色顯示，光照后14d，T-MG移植組視網(wǎng)膜外核層厚度較對照組(Sham移植組)為厚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)的體內(nèi)移植能延緩視網(wǎng)膜光感受器的變性過程。
[0008]本發(fā)明的細(xì)胞系具有以下特點(diǎn):
1)遺傳背景清楚，生物學(xué)特性穩(wěn)定，
該細(xì)胞系來自于廣泛使用的鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，其生長、吞噬能力、分泌致炎因子等基本生物學(xué)特性與原代細(xì)胞一致，經(jīng)多次傳代及修飾后仍保持穩(wěn)定；
2)應(yīng)用面寬，適用于多種視網(wǎng)膜光感受器變性模型，
該細(xì)胞系可用于延緩強(qiáng)光照射引起的光感受器變性實(shí)驗(yàn)，也可用于研究視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷后趨化因子及其受體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化中的作用； 3)該細(xì)胞系培養(yǎng)條件簡單，趨化能力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期短，
該細(xì)胞系移植入光損傷大鼠模型后能夠進(jìn)入損傷部位存活，并表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0009]本發(fā)明細(xì)胞系為視網(wǎng)膜光感受器變性疾病提供了一個(gè)新穎且安全可靠的從外周-中樞的功能細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體系，可以方便的用于視網(wǎng)膜光感受器變性疾病的防治研究，并可作為從外周-中樞(視網(wǎng)膜)的藥物載體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:顯示了 Lent1-SV40-eGFP轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞后7d，所得的細(xì)胞(T-MG)能自我增殖并傳代，免疫熒光染色結(jié)果顯示T-MG能表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物CDllb (0X42)， EDl (0X6)， Ibal。
[0011]圖2:顯示了免疫熒光染色顯示光照后14d，視網(wǎng)膜上存在GFP(+)細(xì)胞(綠色)并表達(dá)了 MG標(biāo)記物EDl (紅色)，從垂直分布來看，GFP(+)細(xì)胞逐漸向光感受器層即損傷部位遷移，To-to-3復(fù)染。

【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1視網(wǎng)膜高趨化性的小膠質(zhì)細(xì)胞的建系
本發(fā)明所涉及的細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz’s L_15細(xì)胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為37° C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度。傳代時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1:3的比例傳代。
[0013]1.原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):
取出生3d的SD乳鼠，無菌條件下取出眼球，置于盛有預(yù)冷的D-Hank’ s液體的平皿中，在組織顯微鏡下取出視網(wǎng)膜，小心剝除視網(wǎng)膜血管，加入適量0.25%胰蛋白酶，37°C孵育消化15 mir1加入等體積預(yù)冷的含血清培養(yǎng)液終止消化,I 000 r/min離心10 min,棄去上清液，沉淀物用適量含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的培養(yǎng)液重新混懸，調(diào)整細(xì)胞密度至IXlO6 /mL，將10 mL細(xì)胞懸液接種到多聚賴氨酸(12.5 mg/L)包被過的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% (體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱中培養(yǎng)，靜置2d后首次換液，以后每4d換液I次。細(xì)胞培養(yǎng)到14d時(shí)，將T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床上，100 r/min的速度振搖I h，將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，1500 r/min離心10 min,沉淀用含血清的培養(yǎng)液重新混懸，即可得到純化的原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0014]2.按現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建Lent1-SV40_eGFP慢病毒載體；
3.病毒感染原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞
病毒感染前24小時(shí)將細(xì)胞置于6孔板,每孔細(xì)胞量約為5X 105。加入2 ml適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基(含有血清和抗生素)孵育過夜。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)該達(dá)到約50 — 70%平鋪；在室溫下溶化慢病毒顆粒，使用前輕輕混勻，準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基和Polybrene混合物，Polybrene終濃度為:8 Pg/ml。胰酶消化每孔細(xì)胞，收集細(xì)胞后用1.5ml培養(yǎng)基混合物溶于每孔中，加入病毒液(梯度為10，20，50ul/孔)感染細(xì)胞，輕輕振動培養(yǎng)板使其混勻并孵育過夜，待細(xì)胞貼壁。
[0015]4.挑選克隆在顯微鏡下確定克隆的位置后用marker筆在培養(yǎng)器皿的外部底面劃圈,先PBS洗漆一次后，再加入37度預(yù)熱的5% tripsin-PBS溶液(即Iml標(biāo)準(zhǔn)trypsin-EDTA溶液與19mlPBS混合而成)，后用200ul滅菌黃槍頭直接在標(biāo)記的克隆位置反復(fù)洗吹使細(xì)胞完全消化后轉(zhuǎn)移至事先已加入培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)，將所得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代，體外長期培養(yǎng)逾10代，成為連續(xù)傳代的細(xì)胞系，命名為T-MG。
[0016]本發(fā)明通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞并通過克隆挑選策略，分離得到了能自我增殖并向視網(wǎng)膜高趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞系(T-MG)，該細(xì)胞系體外培養(yǎng)生長良好，每4天傳代一次。
[0017]T-MG經(jīng)基因芯片檢測(20，001 probes)，僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白，T-MG能自我增殖，在體外連續(xù)傳代及培養(yǎng)過程中具有遺傳穩(wěn)定性。
[0018]本發(fā)明采用ELISA、吞卩遼實(shí)驗(yàn)、Real-time PCR、Western_blot等分子生物學(xué)檢測方法證實(shí)T-MG能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶IIb (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL_1 β與iNOS等致炎因子；體外趨化實(shí)驗(yàn)顯示T-MG能被CCL2趨化，并且其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng)。
[0019]實(shí)施例2，T-MG細(xì)胞的體內(nèi)移植
1.大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型的建立:
所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在12h明(20?50 Lux)以及12h暗(O?10 Lux)的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7d，光照組大鼠予縫線開瞼，I %阿托品擴(kuò)瞳，經(jīng)24h暗適應(yīng)后，放入光照箱中接受24h2500Lux寬譜藍(lán)光照射,光照結(jié)束后置于黑暗中恢復(fù)24h后送回原正常環(huán)境飼養(yǎng)；
2.T-MG細(xì)胞在光損傷大鼠模型中的體內(nèi)移植:
①光照后ld，將SD大鼠麻醉后，通過尾靜脈注射和玻璃體腔注射兩種方法將16個(gè)T-MG細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植，移植后的7d、14d、28d常規(guī)處理大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，制作雙眼眼球切片及視網(wǎng)膜鋪片；由于T-MG細(xì)胞攜帶GFP基因，因此在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色的陽性細(xì)胞；光照后3d，視網(wǎng)膜上發(fā)現(xiàn)少量GFP (+)細(xì)胞，其數(shù)量逐漸增多于14d時(shí)達(dá)到高峰，28d時(shí)仍可見較多；結(jié)果顯示，從水平空間分布來看，GFP (+)細(xì)胞主要圍繞血管分布，其密度在各象限之間無明顯差別；從垂直分布來看，GFP(+)細(xì)胞逐步向ONL層遷移，能夠進(jìn)入視網(wǎng)膜損傷部位；
②視網(wǎng)膜切片的HE染色顯示，光照后2周，T-MG移植組的視網(wǎng)膜外核層厚度較對照組明顯增厚，表明T-MG細(xì)胞的體內(nèi)移植能促進(jìn)光感受器的存活。
【權(quán)利要求】
1.一種視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，其特征在于，所述的細(xì)胞系為能被高效募集到視網(wǎng)膜的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，其保藏編號=CGMCC N0.8158，具有以下生物學(xué)特性:為鼠源性細(xì)胞，經(jīng)基因芯片檢測(20，OOl probes)，僅有不到200個(gè)基因(1%)與原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有差異且均不涉及主要功能蛋白；能表達(dá)單核-巨噬細(xì)胞表面抗原⑶I Ib (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL-1 β與iNOS等致炎因子；能自我增殖，連續(xù)傳代；其趨化能力較原代小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增強(qiáng)；能通過體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)入視網(wǎng)膜并存活。
2.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，其特征是所述的細(xì)胞系其生物學(xué)特性經(jīng)多次傳代及修飾后保持穩(wěn)定。
3.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞系在體外趨化實(shí)驗(yàn)中能被CCL2高效趨化。
4.按權(quán)利要求1所述的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞系體內(nèi)移植后能被高效定向募集到視網(wǎng)膜損傷部位并存活，具有促進(jìn)光感受器存活作用。
5.權(quán)利要求1的視網(wǎng)膜高趨化性的大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞系在制備從外周-中樞(視網(wǎng)膜)的藥物載體中的用途。
【文檔編號】A61K47/46GK104513808SQ201310459318
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】倪穎勤, 徐格致, 蔣小爽, 張萌, 江睿, 劉天津 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院