專利名稱：轉(zhuǎn)化生長因子α-H1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途，以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明的多肽為人轉(zhuǎn)化生長因子α-H1(TGFα-H1)。本發(fā)明還涉及抑制這種多肽的作用。
TGFα-H1是表皮生長因子(EGF)家族的新成員，EGF生長因子超基因家族包括大量的醫(yī)學(xué)上非常重要的生長因子，如α轉(zhuǎn)化生長因子(TGFα)亞族。
生長因子的EGF家族除TGF-α外還包括雙調(diào)蛋白、cripto、heregulin和肝素結(jié)合EGF，最近發(fā)現(xiàn)的這一家族的成員是betacellulin，其從小鼠胰腺β腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化得到(Sasada，et al.，B.B.R.C.1901173-9(1993))。這一基因發(fā)現(xiàn)在腎、肝組織和各種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)。
1992年5月19日頒發(fā)的USP5,115,096中公開了純化并且結(jié)構(gòu)和功能得以鑒定的雙調(diào)蛋白，雙調(diào)蛋白是一種雙功能細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，其在致瘤細(xì)胞中有潛在的抑制DNA合成的活性，并促進(jìn)某些正常細(xì)胞的生長。已克隆了雙調(diào)蛋白基因并用于構(gòu)建質(zhì)粒以指導(dǎo)生物活性的雙調(diào)蛋白在轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞中表達(dá)。
TGFα具有多效生物學(xué)效應(yīng)，TGFα家族的某些成員的產(chǎn)量在某些疾病狀態(tài)下，例如癌癥、皮膚病、眼疾以及在炎癥或傷口愈合位點(diǎn)通常升高。TGFα家族的成員及其關(guān)聯(lián)受體已被深入研究了若干年，并且最近出版了綜述(Prigent and Lemoine，Progress inGrowth Faclor Research 41-24(1992))；Schultz et al.，J.Cell.Biochem45346-352(1991)；Derynck，R.，Mol.Reprod.and Dev.273-9(1990))。
正常成人的TGFα在各種組織中表達(dá)，包括皮膚、腦、胃腸粘膜、乳腺組織(包括未婚、懷孕和哺乳的乳腺)、激活的巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞，并且TGFα還具有血管生成活性(Kudlow，J.E.，and Bjorge，J.D.，Seminars in Cancer Biology，1293-302(1990)。
除了其參與控制各種疾病中的細(xì)胞增殖外，TGFα生長因子對于胚胎發(fā)生和維持正常成人的生理狀態(tài)也是重要的。這些生長因子影響許多過程；有證據(jù)表明TGFα參與胚胎發(fā)生的若干方面，因?yàn)槠湓谖词芫穆鸭?xì)胞、植入前胚胎和母性蛻膜(maternaldecidua)中表達(dá)，其可能在植入或胎盤發(fā)育中起重要作用。缺少有功能的TGFα基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(“失效”小鼠)具有異常的皮膚構(gòu)造、卷毛、卷胡，它們經(jīng)常發(fā)生角膜炎，這些證據(jù)提示TGFα在決定皮膚構(gòu)造和調(diào)節(jié)毛發(fā)生長方面起關(guān)鍵作用(Mann et al.，Cell 73249-261(1993))。α轉(zhuǎn)化生長因子家族的許多成員對于來源于多種組織的癌細(xì)胞是自分泌和/或旁分泌生長因子，例如乳腺(TGFα)、結(jié)腸(cripto)和胰腺(betacellulin)。betacellulin是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)力的促分裂原(Shing et al，Science，2591604-1607(1993))；雙調(diào)蛋白(AR)根據(jù)所測試的靶細(xì)胞和加到該細(xì)胞的濃度而具有生長刺激性能或生長抑制性能(Shoyab et alScience 2431074-1076(1989))。例如，AR刺激人包皮成纖維細(xì)胞的增殖，AR還抑制A431細(xì)胞系的生長。
另外，TGFα生長因子與下列疾病狀態(tài)相關(guān)a)腫瘤，最近的研究表明給予對小鼠的TGFα(和/或其家族成員)活性具有拮抗作用的制劑可抑制腫瘤(Cook et al.，CancerResearch，523224-3227(1992))；b)皮膚病，例如銀屑病(Cook et al.，CancerResearch，523224-3227(1992))；c)傷口愈合(Schultz et al.，J.Cell.Biochem45346-352(1991))。
人型α轉(zhuǎn)化生長因子(TGFα)是一種含50個(gè)氨基酸和3個(gè)二硫鍵的小的6Kda促分裂蛋白，TGFα與EGF受體相互作用并激活其內(nèi)在蛋白激酶。Kudlow，J.E.and Bjorge，J.D.，Cancer Biology，1293-302(1990)描述了TGFα在正常生理學(xué)中的作用。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤中，TGFα的表達(dá)是最占優(yōu)勢并最豐富的，但在某些成人正常組織(腦、角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞、腦垂體)中也檢測到低或中等水平的TGFα。在發(fā)育的胚胎中，在特定的時(shí)間和特定的組織中也可檢測到TGFα的表達(dá)，最明顯的是在發(fā)育的腦、腎和肝中。
目前已被純化和克隆的這一家族的幾乎所有成員均被發(fā)現(xiàn)含有6個(gè)保守的半胱氨酸，其形成二硫鍵以產(chǎn)生三個(gè)肽環(huán)，從而具有類似的二級結(jié)構(gòu)。另外，所有這些生長因子均以一大得多的膜結(jié)合的糖基化的前體而合成。TGFα-H1含有所有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基。
生長因子的這一家族與還包括c-erb-2和c-erb-3的EGF受體家族相互作用，其配位體尚未被鑒別(Prigent and Lemoine，Prog.in Growth Factor Res.，41-24(1992))。在人瘤形成中的這些受體的參與作用已被廣泛地研究，已發(fā)現(xiàn)這些受體的過量表達(dá)與某些癌癥形式的預(yù)后不良有關(guān)(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992))。也已發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞顯著地合成高水平的TGFα和/或這一家族的其它成員。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了新的成熟多肽，其是人轉(zhuǎn)化生長因子αH1(TGFα-H1)，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了一種多肽，其是TGFα-H1的可溶性片段，即不帶轉(zhuǎn)膜部分的TGFα。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種通過重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了為診斷和治療目的而使用這種多肽、或使用編碼這種多肽的多核苷酸的方法，例如刺激傷口愈合、在損傷或AIDS癡呆后恢復(fù)正常神經(jīng)學(xué)功能、治療眼疾、瞄準(zhǔn)并殺傷某些細(xì)胞、治療腎病或肝病、以及促進(jìn)頭發(fā)毛囊發(fā)育。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了抗TGFα-H1的抗體或其可溶性片段。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，其可用于抑制這種多肽的作用，例如治療腫瘤和銀屑病并診斷癌癥。
本發(fā)明的這些及其它方面根據(jù)本文的教導(dǎo)對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將是顯而易見的。
下述附圖旨在說明本發(fā)明的實(shí)施方案，并非限制本發(fā)明的范圍。


圖1示出TGFα-H1 cDNA的開放讀框的預(yù)計(jì)的氨基酸翻譯。數(shù)字標(biāo)始于第7位，因?yàn)樵?-6位的合成BamHI接頭(未示出)用于克隆基因。還示出了位于406位的最終終止密碼子。所示下列編碼132個(gè)氨基酸。通過與TGFα基因家族的其它成員比較可以看出只有下劃線的50個(gè)氨基酸是生產(chǎn)可溶性生物活性生長因子所必需的(見圖3)。
圖2示出TGFα-H1 cDNA的全部3286個(gè)核苷酸的核苷酸序列，在1位的合成BamHI接頭和在3286位的合成XhoI接頭以黑體示出。編碼TGFα-H1蛋白的開放讀框用下劃線示出，并且后跟最終終止密碼子(以黑體示出)。用標(biāo)準(zhǔn)的IUPAC密碼示出序列中長3’非翻譯區(qū)的未定之處。
圖3示出TGFα-H1與TGFα基因家族的其它成員之間的對比，星號*示出這一家族的生長因子分子的生物學(xué)活性所必需的6個(gè)重要的保守的半胱氨酸殘基的位置。下劃線的TGFα的50個(gè)氨基酸殘基是已證明對于可溶性生長因子的活性所必需的氨基酸殘基。(Amphi＝雙調(diào)蛋白)圖4為示出本發(fā)明的多肽的RNA表達(dá)模式的northern印跡分析結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離出的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或者編碼由ATCC保藏號--------的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
本發(fā)明的多核苷酸在衍生自人腦和胎兒組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，其與TGFα基因家族在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，含有一編碼132個(gè)氨基酸的成熟多肽的開放讀框，其與TGFα基因家族的一些成員具有明顯的同源性，這些成員包括TGFα本身和其它成員如雙調(diào)蛋白和cripto。另外，在所有成員的一個(gè)特征基序中存在的6個(gè)半胱氨酸在TGFα-H1中是保守的。
在圖1中，下劃線的50個(gè)氨基酸是TGFα-H1的可溶性片段，即，不包括轉(zhuǎn)膜部分。與TGFα類似，TGFα-H1的可溶形式通過蛋白裂解從一較大的氨基酸膜內(nèi)在糖蛋白前體中釋放，見Derynck，R.，Mol.Repro.and Dev.，273-9(1990)(Derynck，Mol.Reprod.Devel.，273-9(1990))。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，與圖1的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列或其可溶形式；成熟多肽的編碼序列或其可溶形式和另外的編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列或其可溶形式(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或編碼由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽或其可溶形式的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1所示的相同成熟多肽或其可溶形式或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、置換變異體和增加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1所示的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸的另一種形式，其可以置換、缺失或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內(nèi)與有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸融合，例如前導(dǎo)序列，其是用于控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導(dǎo)序列可以由宿主細(xì)胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸殘基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原并是蛋白質(zhì)的非活性形式，一旦序列原被切掉，則保留一活性成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一成熟蛋白，或編碼一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少50％、優(yōu)選70％的同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％同一性的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對根據(jù)35U.S.C112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時(shí)，其是參照。制造、使用或銷售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的TGFα-H1多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增TGFα-H1基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中特別是載體或質(zhì)粒中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
如上所述，可通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
可通過各種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，一般地，該DNA序列通過本領(lǐng)域已知的程序插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些程序和其它程序被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動子，E.coli lac或trp啟動子，λ噬菌體PL啟動子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還含有一用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動子或調(diào)控序列的載本轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動子，它們是可商購的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，PQE60，PQE-9(Qiagen)，Pbs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLneo，pSV2cat，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)?；蜉d體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動子區(qū)可以選自使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體的任何所需基因，兩個(gè)合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PA，PL和trp；真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibne r，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘?，也可通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引入本文作參考。
高等真核生物對編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱體克蛋白的操縱子。在合適的階段，雜合結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，雜合序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號一起插入帶有功能啟動子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，這些商購質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列。可使用源自SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)、早期啟動子、增強(qiáng)子、剪接體和多腺苷酸化位點(diǎn)以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
可通過硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析(例如使用在固相支持物上的DNA或核苷酸)、羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化TGFα-H1或其可溶形式。優(yōu)選的是在純化過程中存在低濃度(約0.1-5mM)的鈣離子(Price，et al.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)型，最后，可采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成過程的產(chǎn)物，或者通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，通過培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞)而生產(chǎn)。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以用哺乳類或其它真核類的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多肽可用于在EGF受體的EGFR家族中鑒定受體，這一家族目前包括EGFR1、EGFR2、EGFR3和EGFR4受體，EGFR2又稱erb-2，這一分子在各種診斷和治療中有用(Prigent，S.A.，and Lemoine，N.R.，Prog.in Growth Factor Res.，41-24(1992))。TGFα-H1可能是一或多種這些受體以及未被識別的新EGF型受體的一個(gè)配位體。TGFα-H1的使用有助于這種受體的識別、鑒定和克隆。
本發(fā)明的多肽還可用于恢復(fù)或增強(qiáng)由于損傷或其它損害病理(如AIDS癡呆、老年性癡呆等)而喪失的神經(jīng)功能。已發(fā)現(xiàn)TGFα和其同系物在腦的大部分中是EGF/TGFα受體的最豐富的配位體(Kaser，et al.，Brain Res Mol Brain Res16316-322，(1992))。與EGF僅存在于腦的較小的更集中的區(qū)域相反，TGFα似乎在腦的各個(gè)區(qū)域中均有廣泛的分布，提示TGF-α可能在腦組織中其生理學(xué)作用。在腦中的這些大量的TGFα受體位點(diǎn)表明TGF在促進(jìn)正常腦細(xì)胞的分化和功能方面起重要作用，因此，當(dāng)神經(jīng)功能喪失時(shí)，給予本發(fā)明的多肽可以刺激大腦并增強(qiáng)合適的生理學(xué)功能。
TGFα-H1或其可溶形式還可用于治療眼疾，例如角膜炎。各種實(shí)驗(yàn)包括了這種病理中的TGFα基因家族的各種成員，一篇最近的論文總結(jié)了與這些生長因子在眼疾中所起的作用相關(guān)的資料(Mann et al Cell 73249-261(1993))。最近的實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺乏TGFα基因的一些小鼠出現(xiàn)由于白細(xì)胞和其它細(xì)胞滲入眼睛固有質(zhì)而引起的角膜炎。
另外，TGFα生長因子對于其靶細(xì)胞的特異性可被用作為摧毀靶細(xì)胞的機(jī)制，例如，TGFα-H1或其可溶形式可(通過各種方法)與毒性分子例如使靶細(xì)胞失活的放射性藥物偶合，這些生長因子-毒素融合體殺傷靶細(xì)胞(在某些情況下通過各種“旁觀者”效應(yīng)殺傷鄰近細(xì)胞)。這種毒素-融合基因的一個(gè)最近的例子由Mesri，et al在J.Biol.Chem.2684853-62(1993)中公開。
以這種方式，TGFα-H1可用作抗瘤化合物。對于體內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明的多肽可以各種方式給藥，包括但不限于注射、輸注、局部、非腸道給藥等?？赏ㄟ^任何生理學(xué)可接受載體如磷酸緩沖的鹽水、鹽水、無菌水等給藥。TGFα-H1及其相關(guān)分子還可包在脂質(zhì)體中，并可以與識別并結(jié)合于腫瘤或細(xì)胞特異性抗原的抗體輟合從而提供一種用于“瞄著”細(xì)胞的方法。
TGFα-H1多肽片段還可用于治療某些腎臟疾病，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)腎臟中有這些生長因子的表達(dá)。因此，這些因子對于保持這一器官的正常生理狀態(tài)是必需的。
治療還涉及肝再生/肝功異常，因?yàn)樵诓糠指吻谐图毙愿渭?xì)胞壞死TGFα和其同系物與肝細(xì)胞生長因子能引起肝細(xì)胞再生(Masuhara，M.et al，Hepatology 161241-1249(1992))。
TGFα-H1的一個(gè)顯著用途涉及傷口愈合。本發(fā)明的組合物可以用于治療各種傷口，包括幾乎所有的皮膚傷口、角膜傷口和機(jī)體的上皮系中空器官的損傷。適合治療的傷口包括由損傷如燒傷、擦傷和刀傷引起的傷口，以及外科程序如外科手術(shù)和皮膚移植產(chǎn)生的傷口。適于用本發(fā)明的多肽治療的其它病情包括慢性病如慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍和其它不愈合性(熱帶性)疾病。
TGFα-H1或其可溶片段可以摻入生理學(xué)可接受載體以用于感染區(qū)域，載體的性質(zhì)可有各種變化并取決于欲施用的位置。用于皮膚時(shí)通常優(yōu)選的是以乳狀或膏狀體為基；合適的基底材料包括羊毛脂，Silvadene(Marion)(特別是用于治療燒傷)、Aquaphor(Duke Laboratories，South Norwalk，Conn.)等。如果需要，可將含TGFα-H1的組合物摻入繃帶及其它傷口包扎物以使傷口持續(xù)與該肽接觸。氣霧劑有時(shí)也可應(yīng)用。
在治療組合物中的TGFα-H1的濃度不是重要的，但應(yīng)足以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖。該組合物可局部用于感染區(qū)域，典型地用作眼藥水或用于皮膚時(shí)作為乳液、藥膏或藥液。當(dāng)用于眼疾時(shí)，最好經(jīng)常使用，通常以少于等于4小時(shí)的間隔使用。用于皮膚時(shí)，希望的是在愈合過程中治療組合物能持續(xù)保持在感染區(qū)域，每天施用該治療組合物2-4次或更頻繁。
本發(fā)明的多肽的用量將根據(jù)給藥方式、所采用的其它活性化合物等而變化，通常為約1μg-100μg。本發(fā)明的多肽可與生理學(xué)可接受的載體如鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水等一起使用?；衔锏挠昧扛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)確定，根據(jù)細(xì)胞在體外對本發(fā)明的多肽或含本發(fā)明的多肽的制劑的反應(yīng)以及實(shí)驗(yàn)動物對其的反應(yīng)決定。
TGFα-H1或其可溶性片段可以用于調(diào)節(jié)血管生成、骨骼再吸收、免疫反應(yīng)以及突觸和神經(jīng)元效應(yīng)器功能。TGFα-H1還可以用于調(diào)節(jié)花生四烯酸級聯(lián)系統(tǒng)。
TGFα-H1或其可溶性片段還可以用于與終末分化相關(guān)的應(yīng)用。許多TGFα因子及其同系物在其靶細(xì)胞中誘導(dǎo)終末分化，可通過給予該因子并誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡而在體內(nèi)利用這一性質(zhì)，這一療法正考慮用于與醫(yī)學(xué)上不希望的細(xì)胞類型的過量增殖相關(guān)的疾病如癌癥和其它增殖性疾病(例如炎癥、銀屑病等)。除了體內(nèi)給藥，也有各種情況需體外給藥，例如，可通過用生長因子和/或其衍生物治療細(xì)胞而在體外清除骨髓中不需要的細(xì)胞群。
相關(guān)的治療還涉及脫發(fā)、掉發(fā)及其它影響頭發(fā)毛囊發(fā)育的皮膚病。各種證據(jù)表明在這些病情中均有TGFα生長因子的參與。如上所述，進(jìn)行了工程操作以在其TGFα基因中包含一無效突變的“失效”小鼠顯現(xiàn)了與頭發(fā)合成的數(shù)量和質(zhì)量相關(guān)的異常，另外，在小鼠中的作圖研究表明一些影響頭發(fā)生長的突變定位在TGFα基因座(Mann et al，Cell73249-261(1993))。 TGFα-H1或其衍生物的局部或全身應(yīng)用可以治療一些形式的脫發(fā)和掉發(fā)，這些權(quán)利要求屬于本發(fā)明的范圍。
通過系統(tǒng)性臨床給予TGFα-H1生長因子可以部分或全部消除一些疾病病理，給藥可以以基因療法的形式(見下述)；或通過給予由TGFα-H1 DNA的重組構(gòu)建體合成的或肽化學(xué)合成的肽或蛋白質(zhì)(Woo，et al.，Protein Engineering 329-37(1989))。
基因療法是在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的多肽。
因此，例如，可用編碼來自體內(nèi)的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對細(xì)胞如骨髓細(xì)胞進(jìn)行工程化，隨后將工程化的細(xì)胞再提供給需用多肽治療的患者，這些方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒利用本領(lǐng)域熟知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行工程化。
類似地，例如也可通過本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行工程化以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域所公知的，可將生產(chǎn)含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的工程化并在體內(nèi)表達(dá)多肽。
通過這種方法給予本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)是顯而易見的。例如，用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結(jié)合后可用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
基因療法的另一種方法是給藥可通過直接注射裸露的或膠囊化的(例如脂質(zhì)體等)TGFα-H1 DNA而完成。
本發(fā)明的多肽可以與合適的藥物載體結(jié)合應(yīng)用，這種組合物包括治療有效量的蛋白質(zhì)以及藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖的鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其結(jié)合物。配制品應(yīng)適合給藥方式。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個(gè)填充有一或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)出具的通知，該通知反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)許可其為人體用而生產(chǎn)、使用或銷售。另外，本發(fā)明的多肽可以與其它藥物化合物結(jié)合應(yīng)用。
用于誘導(dǎo)或抑制對TGFα-H1敏感的靶細(xì)胞群的增殖的最有效的濃度可通過向細(xì)胞加入各種量的TGFα-H1并檢測其反應(yīng)而確定。另外，增強(qiáng)或降低TGFα-H1的產(chǎn)量的藥物可通過用該感興趣的制劑治療的細(xì)胞檢測TGFα-H1信息或蛋白質(zhì)的合成而測定。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個(gè)別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個(gè)外顯子并因而不會使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對含有個(gè)別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個(gè)快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體-特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至500或600個(gè)堿基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于與獨(dú)特的染色體位置結(jié)合以具有足夠的信號強(qiáng)度便于檢測。FISH需要使用衍生EST的克隆，越長越好。例如，2000bp是好的，更好為4000bp，而超過4000則可能不是獲得好結(jié)果所必須的，因其時(shí)間不合理。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中發(fā)現(xiàn)(可在線從Johns Hopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個(gè)體和未感染個(gè)體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個(gè)體中觀察到某一突變而未在任何正常個(gè)體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的致病基因中的一個(gè)(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個(gè)基因)。
感染個(gè)體和未感染個(gè)體的比較通常是首先尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變，如可從染色體涂片上觀察到的或者用基于該cDNA序列的PCR檢測到的缺失或易位。最后，需要對來自一些個(gè)體的基因進(jìn)行全測序以證實(shí)存在突變并從多態(tài)性中區(qū)分突變。
本發(fā)明還涉及用反義技術(shù)體內(nèi)抑制TGFα-H1，反義技術(shù)通過三螺旋形成或反義DNA或RNA可用于控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)設(shè)計(jì)長度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一DNA寡核苷酸以互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄涉及的基因的某區(qū)域(三螺旋-見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；and Dervanet al，Science，2511360(1991))，從而防止TGFα-H1的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成TGFα-H1(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。
或者，上述寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域公知的程序輸送到細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以體內(nèi)表達(dá)以通過上述方式抑制TGFα-H1的生產(chǎn)。
因此，TGFα-H1的反義構(gòu)建體可以用于抗腫瘤治療，因?yàn)樽罱难芯勘砻髟谛∈笾幸种颇[瘤細(xì)胞的TGFα(或其同系物)的分泌或表達(dá)可以抑制腫瘤。這種抑制劑可以是反義寡核苷酸、單克隆抗體等。反義寡核苷酸防止細(xì)胞生產(chǎn)生長因子，而抗體與表面結(jié)合的或分泌的生長因子結(jié)合并中和之。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽或其體內(nèi)受體的抗體可以通過將多肽直接注射給動物或?qū)⒍嚯慕o予動物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。
為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產(chǎn)人單克隆多肽的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4,946,778)可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
特異于TGFα的抗體可用于癌癥的診斷和治療，因?yàn)樵谫樕驮錾^程中許多中癌細(xì)胞增量調(diào)節(jié)TGFα家族的各種成員。這些抗體與TGFα-H1結(jié)合并使之失活?？筎GFα(和/或其家族成員)的單克隆抗體正臨床用于診斷和治療某些疾病，如(但不限于)贅生和增生性生長異常。贅生組織對生長因子表達(dá)的增量調(diào)節(jié)形成了許多血清檢測的基礎(chǔ)，該檢測是是檢查在感染患者血中生長因子的增加。這些檢測不僅典型地適用于診斷裝置，還適用于預(yù)后裝置(以檢測手術(shù)、化療等后的隱藏腫瘤細(xì)胞的存在)。
另外，表達(dá)TGFα-H1受體的惡性細(xì)胞可在受體結(jié)合分析中用標(biāo)記的TGFα-H1或TGFα-H1相關(guān)分子檢測，或用抗TGFα-H1受體本身的抗體檢測。可根據(jù)TGFα-H1受體的存在和密度區(qū)分細(xì)胞，從而提供一種方法預(yù)測這種細(xì)胞對TGFα-H1的生物活性的易感性。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽的拮抗劑/抑制劑，該拮抗劑/抑制劑抑制或消除該多肽的功能。
因此，例如，拮抗劑與本發(fā)明的多肽結(jié)合并抑制或消除其功能，拮抗劑例如可以是與多肽結(jié)合的抗體，或在某些情況下是寡核苷酸。抑制劑的一個(gè)例子是與多肽結(jié)合并占據(jù)多肽的催化位點(diǎn)的小分子從而使催化位點(diǎn)不能與底物接觸，進(jìn)而防止正常的生物學(xué)活性，這些小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
或者，可以采用與受體(本發(fā)明的多肽正常與該受體結(jié)合)結(jié)合的本發(fā)明的多肽的拮抗劑，該拮抗劑可以是緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)以便它們識別并結(jié)合于天然蛋白質(zhì)的受體位點(diǎn)，但它們是天然蛋白質(zhì)的無活性形式并由此因?yàn)槭荏w位點(diǎn)被占據(jù)而防止TGFα-H1的作用。以這種方式，拮抗劑/抑制劑還可用于治療某些皮膚病，如銀屑病。最近的研究發(fā)現(xiàn)在取自如銀屑病損害的皮膚活體組織中有升高水平的這些生長因子的表達(dá)(Cook etal Cancer Research 523224-3227(1992))。
拮抗劑/抑制劑還可用于診斷檢測癌癥，因?yàn)門GFα-H1可由某些類型的腫瘤細(xì)胞增量調(diào)節(jié)，拮抗劑可用在一分析中確定TGFα-H1的升高的水平。這些拮抗劑/抑制劑還可用于治療癌癥，因?yàn)樗鼈冏钄嗄[瘤上的TGFα-H1受體位點(diǎn)，在小鼠中抑制TGFα或其同系物的活性導(dǎo)致抑制腫瘤。
拮抗劑/抑制劑可與例如上述的藥物學(xué)可接受載體形成組合物而應(yīng)用。
以下將參照實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤彽玫降模蛘呤枪娍梢圆皇芟拗频氐玫降?，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時(shí)的溫育時(shí)間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實(shí)施例1從插入有TGFα-H1的Bluescript為基的載體中切下TGFα-H1的開放讀框并置入稱為pQE9的新型克隆載體(見下述)。這一載體可以接受BamHI-HindIII片段。BamHI-HindIII相容性限制片段的產(chǎn)生是由TGFα-H1通過使用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’末端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增以合成插入片段。5’寡核苷酸引物的序列為5’-ATTCTAGTTGGATCCGATGGACTACAATATCGACCA-3’，其含有一BamHI限制性酶位點(diǎn)(下劃線)，后接21個(gè)TGFα-H1編碼序列的核苷酸；3’引物序列為5’-CTCCCTCAAAGGAAGCTTTTAAGAGC-3’，其含有互補(bǔ)于位于TGFα-H1基因的3’非翻譯區(qū)內(nèi)的天然存在的HindIII位點(diǎn)(下劃線)的序列。該BamHI-HindIII位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的BamHI-HindIII位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Amp′)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)控啟動子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記(6-His)和限制性酶克隆位點(diǎn)。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株M15/rep4(得自Qiagen，商標(biāo)m15/rep4)，該菌株含有多拷貝的表達(dá)lacI阻抑物并賦予卡那霉素抗性(Kan′)的質(zhì)粒pREP4。在LB平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中將含有所需構(gòu)建物的克隆培養(yǎng)過夜(O/N)，O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600(O.D.000)為0.4-0.6。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡哺糖苷)至終濃度為1mM，通過使lacI阻抑物失活，IPTG誘導(dǎo)激活P/O，使基因表達(dá)水平提高。再培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞溶解在離液劑6M鹽酸胍中，澄清后，在使得與含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，通過鎳-螯合柱層析(Hochuli，E.et al.，Genetic Engineering，Principles & Methods，1287-98(1990))從溶液中純化溶解的TGFα-H1。在6M鹽酸胍pH5.0中從柱中洗脫TGFα-H1，并為復(fù)性目的調(diào)整至3M鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mM谷胱甘肽(還原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。將這一溶液溫育12小時(shí)后，將蛋白質(zhì)對50mM磷酸鈉透析。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，對本發(fā)明作出各種改進(jìn)和變動是可能的，因此，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于所述的方式實(shí)施。
序列表(1)一般信息(i)申請人MEISSNER，ET AL。(ii)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)化生長因子α-H1(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵編07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型3.5寸軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/208,008(B)申請日1994年3月8日(C)分類(v)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(vi)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注冊號36，134(C)案號/文檔號325800-98(viii)通訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度400堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GATGGACTAC AATATCGACC AGATGTGAAA GATGCTAGTC ATCAAAGAGA AGATGGGATT60ATTGGAAACC ACATGCCTTG CCCTGAAAAC CTCAATGGTT ACTGCATCCA TGGAAAATGT 120GAATTCATCT ATTCTACTCA GAAGGCTTCT TGTAGATGTG AATCTGGCTA CACTGGACAG 180CACTGTGAAA AGACAGACTT TAGTATTCTC TATGTAGTGC CAAGTAGGCA AAAGCTCACT 240CATGTTCTTA TTGCAGCAAT TATTGGAGCT GTACAGATTG CCATCATAGT AGCAATTGTA 300ATGTGCATAA CAAGAAAATG CCCCAAAAAC AATAGAGGAC GTCGACAGAA GCAAAACCTA 360GGTCATTTTA CTTCAGATAC GTCATCCAGA ATGGTTTAAA 400(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度132個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Gly Leu Gly Tyr Arg Pro Asp Val Lys Asp Ala Ser Asp Gln5 10 15Arg Glu Asp Val Tyr Ile Glv Asn His Met Pro Cys Pro Glu Asn20 25 30Leu Asn Gly Tyr Cys Ile His Gly Lys Cys Glu Phe Ile Tyr Ser35 40 45Thr Gln Lys Ala Ser Cys Arg Cys Glu Ser Gly Tyr Thr Gly Gln50 55 60His Cys Glu Lys Thr Asp Phe Ser Ile Leu Tyr Val Val Pro Ser65 70 75Arg Gln Lys Leu Thr His Val Leu Ile Ala Ala Ile Ile Gly Ala80 85 90Val Gln Ile AIa Ile Ile Val Ala Ile Val Met Cys Ile Thr Arg95 100 105Lys Cys Pro Lys Asn Asn Arg Gly Arg Arg Gln Lys Gln Asn Leu110 115 120Gly His Phe Thr Ser Asp Thr Ser Ser Arg Met Val125 130(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度3288堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GGATCCGATG GACTACAATA TCGACCAGAT GTGAAAGATG CTAGTGATCA AAGAGAAGAT 60GTTTATATTG GAAACCACAT GCCTTGCCCT GAAAACCTCA ATGGTTACTG CATCCATGGA120AAATGTGAAT TCATCTATTC TACTCAGAAG GCTTCTTGTA GATGTGAATC TGGCTACACT180GGACAGCACT GTGAAAAGAC AGACTTTAGT ATTCTCTATG TAGTGCCAAG TAGGCAAAAG240CTCACTCATG TTCTTATTGC AGCAATTATT GGAGCTGTAC AGATTGCCAT CATAGTAGCA300ATTGTAATGT GCATAACAAG AAAATGCCCC AAAAACAATA GAGGACGTCG ACAGAAGCAA360AACCTAGGTC ATTTTACTTC AGATACGTCA TCCAGAATGG TTTAAACTGA TGACTTTTAT420ATGTACACTG ACCATGTGAT GTACATTTAT TATGTCTTTT TTTAAAGAAT GGAAATATTT480ATTTCAGAGG CCTTATTTTT GGACATTTTT AGTGTAGTAC TGTTGGCTCG TATTTAGAAT540ATTCAGCTAC GACAGTTTTG GACTGTTTAG TAGTCTTTGT TTTATGTTTT TAAATACAGA600AATTGCTTTC ACAAATTTGT ACCACATGGT AATTCTAAGA CTTGTTCTTT ACCCATGGAA660TGTAATATTT TKGGAAAGAT CGACTACTTC ACAAATGGGT TATAAAGTCA TATTCCACTT720CTTCCACAAA TGACCACAGG AAATTGACCA ACCATGAACT TAARGAATCG CCTGTCGRGR780GTTACAGRAG RTGAAGGACC ARGACGCTCC TCTTACCATT GTGACTGTGC TGGACAAAGT840AGCCTCCATC GTGGACAGTG TGCAGGCAAG CCAGAAGAGA ATAGAAGAGA GACACAGGGA900AATGGAAAAT GCCATAAAAT CCCTCCAGAT TGACCTGTTG RAGCTTTCAC AGTCGCATAG960CAATACAGGG CATATCATTA ACAAATTGTT TGAGAAAACC CGAAAAGTTA GTGCTCACAT 1020TAAAGATGTG AAAGCCCGGG TCGAGAAGCA ACAAATTCAT GTTAAAAAAG TTGAAGTCAA 1080GCAAGAGGAA ATAATGAAGA AAAACAAATT CCGCGTGGTA ATATTCCAGG AGAAGTTTCG 1140GTGTCCGACA TCCCTGTCTG TTGNTTAAAG ACAGAAACCT AACTGAGAAC CAAGAAGAGG 1200ATGATGATG ATATCTTTGGA TCCCCCAGTA GGATCTTGTC TTCGGATGAA GATTATTATG 1260TTGAAGAAA GCAGGTCTTGC CAGGCTTAGG AAGTCCGGCC AGGAGCCCCT TGATAATATC 1320CAGAAGGCN TTTTCCAAAGA AAACTGCGAA GACCCGGCAG AATCTTGACC AGAAAGTGAA 1380CGAATTAGA ACTAGAATAGT GACCCCCGAG AGGAGAGAGA GGCTAAGGCA GTCAGGAGTA 1440GAGGCTGAG TACAGTCAGGG GAGAGGCTGA GACAGTCAGG GGGAGAGGTT TAAGAAATCT 1500ATTTCTAAT GCAGCTCCCTC AAAGGAAGCT TTTAAGATGC GCAGCCTCAG GAAAGGTAAG1560GACCGAACA GTGGCTGAAGG TGAGGAATTG TGCCAGGGGA GATGGTGTTG GACATCAWTG1620SCAGGAGCG AGTCTTCTKGG SCCCATCAGK GAGCTCTWCT CTGATGAGTC ARTGACCAAA1680AMACGAGGC AGCCAGGCCGG TGTATCCTCC CCATGAAGGA AGAGAAATCC CCACCCCCGA1740RCCTTTAAA AGTTACTTTTA AATCTCAGGT GAAAGTAGAG GATGATGAAT CTCTTTTGGT1800TAGATTTAA AGCACTCATCG TAAAGAGGGA ATTAAGTATA TCCTAAATAT GAATCTCCTA1860ATCATGCAG TTTTAGTTTGA ATAGTGTAGT CGTCYACATT TCTGTGCCAT GTAGGAAAAC1920ATAAATGTA ATTTTTTTCTT ATATTTAAAA TCTTGAAGAT AATATAAATA TTATTATCAC1980TCTTTCTCA TGGCAGCTGTG GATTTTTTAG TTCCTTTCTC TTGTCCACCA GAAAAATAGT2040TTCCTAGGT TGGGCCAGTTA CGTGTTTGGT AAGGGCAACT TTGCGSCCGT CATTTGCAGG2100AGAACTCTA AATATTGGTTA GGATTAATAT TGTGGCCASC CTCMAAGGGG AATAACTCAT2160GTGTGGGTT ATATCGTCCAG ATGTTCAGAT CAACAGATTT GTTAGTAAAT TAGCAGTCAC2220ACCCCTTTT TTGATGCTTTC ACATTAAAAA ATTGAAGTTT TGGACTTGAG CATTTGGCTC2280TAGTATCAT AGCTTTACTTA AAAGAAAACC CTGGSCAAGT CATCATCTGC TTATTCTCAT2340CAGTAAAAA TGGAGAGGGTT GGCCTCTSCT KCCTGCCTCA GAGGACTGTT GTGATGATCA2400AAGGAAATG GTACACATTCT GGGGGAACAA GAAGCACACC CAGAGAAAAC AARCCTCATC2460AGTTCCTCC CAAACAGAATG GAAAGAGTTA CACCTTCTGA WAAGCCCTCA GCACCAATCA2520GTAAGGTCC TAGGTTGGAGA GAAACTAAAG CTGGTCTTCA GAARCCTTTT CACAGAATCA2580AGAGTGAAA AATAAGTAAAT GTTTGGGTGW CCACTTTTTC ATCAGACTAA CTATATCTTG2640GGTTTTAGT TGGGTCCAAAT GTTCCCCAGC CAGACCCTTT CTAATTTCCT TTTGATTAAG2700ATCTTTGGT GGACTATAGCA CNTAAATTTG TTTAAGCAGT ATGAGGCATA AAATTGTGAC2760TATGTTTCT AAAGTCGGCCC TGATGCATTG GGTTTGGAAA TGACCACAAA TATTCCTGTT2820TTCCTGAGT GTACCCTTCAG GGTCCAGCTG TCCAAAACAG TGTTGATAGG AGTTCATCAT2880ACCTCCTTT GGGAGGAAGCC AAGATTCTCC TTATCTTTTA GCTTTAAGAT CCGTGGAATC2940CAGGAAGAG AACAATGTCTA TTGTTGCTAA AGAAAGAAAG AAATGGGCCG GGTGTGGTGG3000CTCACGGGG AGTAATCCCAG CACTTTGCGA GGCCGAGGTG GGTGAATCAC CTGAGGTCAG3060AAGTTCACG ACCAGCCTGAC CAACATGGCG AAACCCTGAC TCTACTGAAA AAACCAAAAT3120TACTGGGCA TGGTGGCATGC GCCTGTCCCA GCTACTCAGG AGGCTGAGAC AGGAGAATTG3180CTTGAACCC AGGAGGCGGAG GTTCAGTGAA CCGAGATTGT TCCACTCACT CAAGCCTGGG3240CCAAAGAGC CAGACTCTGTT TCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AACTCGAG 3288
權(quán)利要求
1.一種編碼TGFα-H1的分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自如下一組(a)編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的TGFα-H1多肽或者所述多肽的活性片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由ATCC保藏號75698所含cDNA編碼的氨基酸序列的TGFα-H1多肽或者所述多肽的活性片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼TGFα-H1的可溶性片段。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的TGFα-H1。
7.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼由ATCC保藏號75698的cDNA編碼的TGFα-H1多肽。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸，具有圖1所示的TGFα-H1的編碼序列。
9.權(quán)利要求2的多核苷酸，具有ATCC保藏號75698所保藏的TGFα-H1的編碼序列。
10.含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
11.用權(quán)利要求10的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
12.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，包括用權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
13.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法、包括用權(quán)利要求10的載體對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化。
14.可與權(quán)利要求2的DNA雜交并編碼具有TGFα-H1活性的多肽的分離的DNA。
15.一種多肽，選自如下一組(i)具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的TGFα-H1多肽及其活性片段、類似物和衍生物；(ii)由ATCC保藏號75698的cDNA編碼的TGFα-H1多肽及所述多肽的活性片段、類似物和衍生物。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中該多肽是具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的TGFα-H1。
17.抗權(quán)利要求15的多肽的抗體。
18.抗權(quán)利要求15的多肽的拮抗劑/抑制劑。
19.治療需要TGFα-H1的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求15的多肽。
20.治療需要抑制TGFα-H1的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求18的拮抗劑/抑制劑。
21.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求15的多肽和一藥物學(xué)可接受載體。
22.權(quán)利要求15的多肽，其中該多肽是TGFα-H1的可溶性片段。
23.權(quán)利要求19的方法，其中通過提供給患者編碼所述多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而給予治療有效量的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了人TGFα-H1多肽和編碼這種TGFα-H1多肽的DNA(RNA)，還提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，以及抗這種多肽的抗體和拮抗劑。這種多肽可以和合適的藥物學(xué)載體或稀釋劑結(jié)合以提供針對各種疾病的診斷、治療和/或預(yù)防效果。本發(fā)明還提供了為治療目的使用所述抗體和拮抗劑抑制TGFα-H1的方法。
文檔編號C12N15/12GK1143386SQ94195051
公開日1997年2月19日 申請日期1994年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月8日
發(fā)明者保羅·S·梅斯納, 麗貝卡·富得那, 馬克·D·亞當(dāng)斯 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司