專利名稱：含有轉(zhuǎn)化生長因子α的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種能夠引起對抗自身TGFα的免疫去勢反應(yīng)的疫苗制劑。該疫苗可以用于某些癌癥和其它TGFα相關(guān)疾病的治療。
現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)化生長因子(TGFα)是一種50個氨基酸的多肽，最初分離自逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。開始它被認(rèn)為是一種能夠與表皮生長因子(EGF)競爭結(jié)合EGF-R的分子。然而，抗EGF抗體不能識別TGFα(Todaro等(1976)，Nature 264，26-31)。所以，這兩種生長因子是兩種免疫學(xué)不同的實(shí)體。
TGFα屬于EGF家族。結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白組成了這個家族。該家族的其他成員有EGF、雙調(diào)蛋白(AR)、criptol(CR1)、肝素結(jié)合EGF、β動物纖維素、表皮調(diào)節(jié)素。另一方面痘病毒科包括了EGF相關(guān)蛋白。其中最具代表性的是牛痘病毒生長因子(VGF)。
所有這些分子結(jié)合并活化EGF-R，那就是為什么它們被視為這一受體的配體。這個系統(tǒng)在正常和腫瘤細(xì)胞的生長中發(fā)揮作用。EGF-R是一種170kD的糖蛋白，其基因已經(jīng)被克隆并測序。該受體的胞內(nèi)域伴有酪氨酸激酶蛋白活性。這些蛋白與v-erb-B癌基因產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)同源性，這成為其與腫瘤轉(zhuǎn)化過程關(guān)聯(lián)的證據(jù)(Heldin C.H.(1984)，Cell 37，9-20.)TGFα合成為160個氨基酸的跨膜前體形式(前TGFα)。成熟TGFα，50個氨基酸的可溶形式，是通過蛋白水解斷裂釋放的。人TGFα(hTGFα)顯示出與人EGF(hEGF)具有43％的氨基酸序列同一性，與小鼠或大鼠TGFα有93％同一性。此外，它們的生物學(xué)效應(yīng)不具有種特異性。
許多實(shí)驗(yàn)室的工作已證實(shí)了TGFα調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移和分化的能力(Carpenter和Wahl.(1990)，Springer-Verlag，柏林，69-171頁)。
TGFα是最廣泛存在的EGF-R配體。它在胚胎發(fā)生時的正常組織和成年人的正常及腫瘤組織中表達(dá)。然而，在敲除TGFα的小鼠中并未觀察到大的病理缺陷，并且這些小鼠可以生存并繁衍(Bruce Mann和同事(1993)，Cell，73，249-261)。
在腫瘤發(fā)生過程中，EGF-R活化的旁分泌和自分泌過程的失調(diào)節(jié)是由生長因子表達(dá)的上調(diào)或其受體高合成或突變造成的。
在上皮性腫瘤中測到了高水平的EGF-R。在許多情況下，該受體的過度表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后。
TGFα的誘導(dǎo)常見于腫瘤轉(zhuǎn)化。事實(shí)上，許許多多的研究表明不同部位的上皮性腫瘤中該分子有過度表達(dá)，包括乳腺、肺、腦、肝、前列腺、膀胱、胃腸道、結(jié)腸、生殖(卵巢)和內(nèi)分泌組織等。
盡管TGFα誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機(jī)制尚未明確，已有一些報(bào)道將該生長因子的過度表達(dá)與腫瘤的分級、患者的生存和其它腫瘤標(biāo)記物聯(lián)系起來。此外，一些研究人員已經(jīng)證實(shí)了它們與其它癌基因的關(guān)系，如肝癌中的c-myc。TGFα也是von Hippel-Lindau腫瘤抑制基因(VHL)的標(biāo)靶(總結(jié)在Lee等，(1996)，Growth Factors and Cytokines inHealth and Disease，卷1B，277-318)。
盡管TGFα和EGF以相似的親和力與同一受體結(jié)合，TGFα通常比EGF效力更強(qiáng)，并且在一些情況下，據(jù)述它的效應(yīng)更強(qiáng)和/或更持久(Barrandon和Green(1987)，Cell，50，1131-1137)。據(jù)報(bào)道對于內(nèi)化的TGFα/EGF-R復(fù)合物，TGFα和EGF-R優(yōu)先重新循環(huán)回到細(xì)胞表面，而當(dāng)EGF/EGF-R復(fù)合物內(nèi)化至同一類型細(xì)胞中時，兩種成分都被有效降解(Ebner和Derynck(1991)，Cell Regul.2，599-612)。這些結(jié)果表明每種生長因子生物活性的差異可能是由于細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制不同造成的。
另一方面，TGFα是一種比EGF更強(qiáng)的血管生成因子(Schreiber等，(1986)，Science 232，1250-1253)。
至于在腫瘤中的表達(dá)，有證據(jù)表明某些上皮性腫瘤的細(xì)胞膜中存在EGF前體，但TGFα在上皮性腫瘤中有著最多的表達(dá)，并且與EGF相反，它是通過與EGF-R的自分泌環(huán)起作用的。另一方面，我們中心的結(jié)果顯示在某些上皮性腫瘤的活檢組織中有TGFα表達(dá)而沒有EGF(乳腺異管癌、喉癌)，但其它腫瘤呈現(xiàn)的EGF多于TGFα(非小細(xì)胞肺癌(NSCLC))。這些結(jié)果表明生長因子在不同腫瘤細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)中具有不同的影響。
這些年所累積的關(guān)于EGF-R/EGF-R配體系統(tǒng)和癌癥之間關(guān)系的所有證據(jù)，使該系統(tǒng)成為癌癥免疫治療中極富吸引力的目標(biāo)。
我們小組先前的結(jié)果證實(shí)了可發(fā)展一種基于EGF的疫苗用于癌癥主動免疫治療。事實(shí)上，已經(jīng)獲得了有關(guān)用偶聯(lián)至載體蛋白的hEGF進(jìn)行疫苗接種所產(chǎn)生的免疫原性和低毒性的臨床前期和臨床證據(jù)(González等(1996)，Vaccine Research 5(4)，233-243)。
臨床前期研究顯示用在佐劑中的hEGF免疫小鼠可以增加移植了Ehrlich腹水瘤(EAT)的小鼠的存活(González等(1996)，VaccineResearch 5(4)，233-243)。
制備了hEGF與P64K的融合蛋白。該蛋白含有在P64K的45/46氨基酸間插入的hEGF序列。該融合蛋白被用于免疫小鼠，引起抗hEGF的特異性體液免疫應(yīng)答。所激發(fā)的免疫應(yīng)答使負(fù)荷EAT的小鼠壽命延長(González和同事(1997)，Vaccine Research 6(2)，91-100)。
在兩項(xiàng)針對NSCLC患者的臨床試驗(yàn)中觀察到，與歷史對照組相比較，接種疫苗的患者的生存有增加趨勢。具有抗hEGF高水平抗體反應(yīng)的患者存活顯著增加(González等(1998)，Annals of oncology9，1-5)。
通常接種EGF不會產(chǎn)生抗TGFα的特異性抗體應(yīng)答。然而已經(jīng)獲得的證據(jù)是小鼠模型接種含TGFα的免疫原性制劑后，僅一些小鼠產(chǎn)生了低水平的抗EGF抗體。該抗體應(yīng)答在一些情況下能夠阻斷EGF在體外與其受體的結(jié)合。然而所獲得的抗EGF抗體的水平并不足以產(chǎn)生有效的EGF免疫去勢反應(yīng)并在抗腫瘤作用中發(fā)揮影響。
由于這些生長因子中的每一種在各腫瘤和/或原發(fā)瘤及其轉(zhuǎn)移灶之間作用不同，一種聯(lián)合EGF-R的兩種主要配體TGFα和EGF的疫苗通常對上皮性腫瘤具有更好的抗腫瘤效應(yīng)。
在本發(fā)明之前，尚未有任何治療將含有hTGFα或任何衍生物，或其與EGF-R的其它配體EGF的組合的疫苗制劑用于癌癥主動免疫治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，它含有TGFα或其任何來源的任何衍生物，與載體蛋白遺傳連接(融合蛋白)或通過化學(xué)方法偶聯(lián)，它能夠抑制上皮性腫瘤的生長而無不良副作用。這一作用是通過生長因子免疫去勢機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還要求保護(hù)一種含有hTGFα與hEGF或任何衍生物的組合以及載體蛋白的疫苗組合物。
該疫苗組合物可用于治療依賴TGFα或TGFα/EGF的上皮性腫瘤，或與TGFα相關(guān)的任何其它疾病，如銀屑病(Kapp等(1993)JDermatol Sci，Jun；5(3)133-42)。
在TGFα的詳細(xì)說明中，具有與原分子相同的免疫學(xué)特性和/或相似作用的任何TGFα衍生片段都包括在內(nèi)。那些衍生物，包括但并不排除其它氨基酸的原始置換、改變特定氨基酸以增加穩(wěn)定性和/或活性、化學(xué)修飾等。
更為具體地說，本發(fā)明提供了一種能夠引起自身TGFα免疫去勢反應(yīng)的疫苗組合物，它可以用于某些癌癥和其它與TGFα相關(guān)的疾病的治療。
另一方面本發(fā)明包括了由TGFα和EGF的組合構(gòu)成的疫苗制劑的用途。該疫苗可用于治療在其發(fā)病過程中依賴于這兩種生長因子的腫瘤。
1-免疫原性制劑本發(fā)明使用的疫苗制劑所包含的hTGFα或者通過基因工程的方法與載體蛋白偶聯(lián)(融合蛋白)，或者通過化學(xué)方法與之結(jié)合。這些免疫原性制劑的任何一種中所使用的hTGFα可以是重組的、合成的或來自天然來源。不同的蛋白可以用作載體?？捎米鬏d體蛋白的例子有破傷風(fēng)類毒素、KLH、來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白及其它。疫苗制劑中hTGFα的最佳量波動在每劑5μg至1000μg之間。
另一方面使用了含有hTGFα與hEGF的組合的疫苗制劑(國家藥品注冊辦公室，Office of National Registration of Medication，HEBERMIN Not 1266)。
在TGFα或EGF的詳細(xì)說明中，具有與原分子相同的免疫學(xué)特性和/或相似作用的任何TGFα或EGF衍生片段都包括在內(nèi)。那些衍生物包括但并不排除其它氨基酸的原始置換、改變特定氨基酸以增加穩(wěn)定性和/或活性、化學(xué)修飾，及其它。
A)通過基因工程方法獲得融合蛋白TGFα-載體蛋白使用特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼hTGFα的基因(500bp)。將獲得的DNA片段進(jìn)行消化并在特定的位點(diǎn)克隆至含有編碼載體蛋白的基因的表達(dá)載體中。獲得的蛋白含有兩種分子的一個或多個拷貝?？梢允褂貌溉閯游锛?xì)胞、細(xì)菌或酵母菌作為表達(dá)載體。該載體還可以在載體蛋白的N末端包括6個組氨酸。通過在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)進(jìn)行DNA測序，以及最后使用抗hTGFα的特異性單克隆抗體(R&DSystem)通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對任意大腸桿菌表達(dá)株表達(dá)融合蛋白進(jìn)行分析來證實(shí)所獲得的質(zhì)粒。為獲得蛋白，使用強(qiáng)破壞法破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，然后使用硫酸銨差異沉淀法和色譜法相結(jié)合純化蛋白。最后，在無菌條件下過濾蛋白并保存于-20℃或凍干并保存于4℃直至隨后使用。
B)獲得含hTGFα的化學(xué)結(jié)合物獲得含有與不同載體蛋白(如P64K)結(jié)合的hTGFα的不同制劑?？梢允褂萌魏位瘜W(xué)結(jié)合法。優(yōu)先使用的化學(xué)法是北美專利U.S.Pat，Not.4,302,386；Lee等，1981中所述的使用EMCS物質(zhì)的方法。
或者，可以使用戊二醛結(jié)合方法。簡而言之，將這兩或三種在最終溶液中濃度為1mg/ml的分子與0.05％戊二醛(在總?cè)芤褐?混合?；旌衔镉谑覝叵聹赜?小時，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，在4℃用PBS 1×透析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑并保存于4℃直至使用。
C)獲得將hTGFα和hEGF相結(jié)合的疫苗。
獲得將EGF-R的兩種主要配體相結(jié)合的疫苗可以通過不同方式進(jìn)行1-在注射時按1∶1關(guān)系混合兩種分別含有與載體蛋白相連的hTGFα或hEGF的疫苗。為此目的可以使用每種生長因子與載體蛋白的融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物。疫苗制劑中hTGFα和hEGF的最佳量波動在每劑5μg至1000μg之間。
2-根據(jù)A部分所述獲得一種相似的基因構(gòu)建體，它含有兩種生長因子hTGFα和hEGF，或它們?nèi)魏窝苌锏慕M合。
3-應(yīng)用B部分所述的方法通過化學(xué)方法獲得含hTGFα和hEGF或它們?nèi)魏窝苌锏慕M合與載體蛋白的化學(xué)結(jié)合物。
D)獲得免疫原性制劑為獲得該疫苗組合物理想的免疫原效應(yīng)，可便利地使用合適的佐劑并選擇給藥途徑以使疫苗制劑表現(xiàn)出高免疫原性。
本發(fā)明所述疫苗組合物是通過兩種特定方式制備的1)使用Al(OH)3作為佐劑以獲得水溶液，疫苗制劑吸附在該化合物上。為此目的在不同制劑中用相當(dāng)于5μg到1000μg的TGFα結(jié)合到2到5mg的Al(OH)3上。振蕩該制制1小時，最終的溶液置于4℃保存直至隨后使用。
2)使用不完全弗氏佐劑，形成水/油或油/水乳狀液。融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物與佐劑在最終制劑中的量在40/60到60/40(體積/體積)的范圍內(nèi)。所用體積取決于期望獲得的最終乳狀液。在免疫接種前加入佐劑并將制劑于室溫下振蕩10到30分鐘。
每種免疫原性制劑的最終體積覆蓋了相應(yīng)給藥途徑的適宜范圍。
對于如C部分所述在注射時即刻制備聯(lián)合疫苗的情況，如前所述將與適宜佐劑混合的兩種疫苗通過振蕩混合并注射或者分別注射。
可以通過多種途徑施用疫苗組合物肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和皮內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得編碼成熟TGFα的DNA片段。
使用PSK/TGFα載體(CIGB，古巴)作為模板通過PCR擴(kuò)增編碼hTGFα的基因。該質(zhì)粒含有克隆至商品載體pBluescript KS-(Stragene)的EcoR V位點(diǎn)的hTGFα互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用所述特異性引物擴(kuò)增編碼成熟TGFα(50個氨基酸長(

圖1))的序列N末端5’-GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3’(下劃線，XbaI限制酶切位點(diǎn))C末端5’-CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC-3’(下劃線，EcoRI限制酶切位點(diǎn))簡而言之，在75μL的混合物中使用200ng的PSKTGFα，混合物含有每種特異性引物各500ng，各200mM濃度的脫氧三磷酸核苷酸的混合物，25mM MgCl2和100單位溶于Promega提供的緩沖溶液中的Taq-聚合酶(Promega)，。執(zhí)行30個循環(huán)的變性(94℃ 1分鐘)、退火(60℃ 1分鐘)和延伸(72℃ 30秒)。在第一個循環(huán)之前，將DNA變性4分鐘；最后一個循環(huán)之后，再最后延伸2分鐘。
PCR產(chǎn)物在低熔點(diǎn)(LGT)瓊脂糖凝膠上電泳分離，并按照常規(guī)步驟用苯酚提取來純化擴(kuò)增的基因并用XbaI和EcoRI酶(NEB，USES)消化。按該方案制備的是編碼成熟TGFα的基因片段。
實(shí)施例2獲得融合蛋白TGFα-P64K的表達(dá)載體。
使用表達(dá)載體pM 92(CIGB，古巴)。該質(zhì)粒含有編碼腦膜炎奈瑟氏球菌(B385株)的P64K蛋白的lpdA基因，其受大腸桿菌色氨酸操縱子啟動子(ptrp)和噬菌體T4轉(zhuǎn)錄終止子(tT4)的控制。pM 92編碼氨芐西林和卡那霉素抗生素耐藥性。用pM 92轉(zhuǎn)化Dam-大腸桿菌菌株(GC-366)并使用商品試劑盒(Quiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的方案純化該質(zhì)粒。消化PM92載體并從LGT瓊脂糖凝膠純化。而后用T4連接酶(Gibco BRL)將PM92載體與之前制備的成熟hTGFα的cDNA相連接。所獲質(zhì)粒pMTGFα編碼含有在P64K的45/46氨基酸間插入的hTGFα的融合蛋白。通過瓊脂糖凝膠限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)進(jìn)行DNA測序，以及最后使用hTGFα的特異性單克隆抗體(R&D System)通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析大腸桿菌MM299株中融合蛋白表達(dá)，來證實(shí)該重組質(zhì)粒。圖2顯示了表達(dá)載體pMTGFα獲得過程的圖解。該載體編碼融合蛋白TGFα-P64K。
實(shí)施例3獲得N末端有6個組氨酸的融合蛋白TGFα-P64K的表達(dá)載體(pMHisTGFα)。
依照之前實(shí)施例所述的相同方案獲得表達(dá)載體pMHisTGFα，起始載體為pM224，它包括了一個編碼P64K N末端6個組氨酸的片段。由于與帶有Cu2+或其它金屬的螯合Sepharose結(jié)合增加，該6個組氨酸的標(biāo)記在蛋白純化過程中顯現(xiàn)了優(yōu)勢。
實(shí)施例4融合蛋白(TGFα-P64K)純化。
表達(dá)融合蛋白TGFα-P64K的大腸桿菌(MM299株)在LBA培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨芐西林)中于37℃生長10小時。收集細(xì)胞后，所有的步驟在0-4℃下進(jìn)行。在弗氏壓碎器中于1500kg/cm2破裂細(xì)菌，并于11,000×g下高速離心30分鐘以除去不溶部分。第一步純化使用40％的硫酸銨沉淀以去除部分大腸桿菌蛋白。在4℃11,000×g下進(jìn)一步離心30分鐘以去除得到的沉淀。上清通過疏水作用層析法(TSK-butil，Pharmacia，瑞典)分部分離，使用在pH＝7.2、含0.15M NaCl的Tris-Cl緩沖液中從40％到0％遞減的硫酸銨梯度。然后將所得樣品通過經(jīng)PBS 1×平衡的G200柱(Pharmacia)凝膠過濾而分離，使最終純度大于95％。按照Lowry等(1951)J.Biol.Chem.191，495-498描述的比色法測定蛋白濃度。使用抗P64K和TGFα的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對融合蛋白進(jìn)行表征。
實(shí)施例5融合蛋白(HisTGFα-P64K)純化。
表達(dá)融合蛋白TGFα-P64K的大腸桿菌(MM299株)在LBA培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨芐西林)中于37℃生長10小時。收集細(xì)胞后，所有的步驟在0-4℃下進(jìn)行。在弗氏壓碎器中于1500kg/cm2下破裂細(xì)菌，并于11,000×g下高速離心30分鐘以除去不溶部分。第一步純化使用40％的硫酸銨沉淀以去除部分大腸桿菌蛋白。在4℃11,000×g進(jìn)一步離心30分鐘以去除得到的沉淀。由于蛋白中存在6個組氨酸，上清通過螯合親和層析法(Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia，瑞典)分部分離，使用在pH＝5.5、含0.5M NaCl的Tris-Cl緩沖液中從25mM到500mM遞增的咪唑梯度。然后所得樣品通過經(jīng)PBS 1×平衡的凝膠過濾G25柱(Pharmacia)去除鹽分，達(dá)到95％純度水平。按照Lowry等(1951)J.Biol.Chem.191，495-498描述的比色法測定蛋白濃度。使用抗P64K和TGFα的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對融合蛋白進(jìn)行表征。
實(shí)施例6用hTGFα特異性單克隆抗體(Mab)識別重組蛋白TGFα-P64K。
使用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)確定在融合蛋白中的TGFα是否可以被抗hTGFαMab(Calbiochem)所識別。按傳統(tǒng)步驟將25μg的EGF-P64K、TGFα-P64K或P64K在兩個聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后，將膜與含5％脫脂奶的TBS 1×封閉液一起于4℃溫育過夜。使用TBS 1×-Tween 20(0.05％)簡單沖洗后，將一張膜與抗P64K抗體(1/500)(圖3A)，另一張膜與抗TGFαMab(1/100)(圖3B)一起在室溫下溫育2小時。然后用同樣的溶液洗3次，并將膜在同樣條件下與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(1/1000)一起溫育1小時。最后加入0.004g Fast Net酶底物(Sigma)，該底物在含0.1M Tris-Cl(pH＝8.2)、0.004g萘酚ACE-MX磷酸(Sigma)及400μL NN’二甲基甲酰胺的20mL緩沖液中。用相似的沖洗終止反應(yīng)。觀察到了抗hTGFαMab對TGFα-P64K的特異性識別(圖3)。這一結(jié)果證明融合蛋白中的TGFα保持了能夠被特異性抗體識別的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例7獲得化學(xué)結(jié)合物hTGFα-P64K。
將1毫升在PBS/10mM MgCl2中濃度為2mg/mL的TGFα與1毫升在同樣溶劑中濃度為2mg/mL的P64K相混合。然后加入0.2mL0.5％的戊二醛溶液使最終百分比為0.05％?；旌衔镉谑覝販赜?小時，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，于4℃用PBS 1×透析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑并在4℃保存直至使用。
實(shí)施例8獲得hTGFα、hEGF與P64K的融合蛋白。
使用質(zhì)粒pBEF 10作為模板PCR擴(kuò)增編碼hEGF(150bp)的基因。該質(zhì)粒含有克隆至商品載體pBluescript SKII(Stragene)的EcoR V位點(diǎn)的完整hEGF。用實(shí)施例2所述方法將獲得的DNA連接到pMHisTGFα質(zhì)粒位于P64K C末端的Bam HI位點(diǎn)。這樣就獲得了編碼融合蛋白TE-P64K的pMTGFα-EGF載體。
實(shí)施例9獲得化學(xué)結(jié)合物hTGFα-hEGF-P64K。
將1毫升在PBS/10mM MgCl2中濃度為3mg/mL的TGFα與1毫升在同樣溶劑中濃度為3mg/mL的hEGF和3mg/mL的P64K相混合。然后加入0.6mL 0.5％的戊二醛溶液使最終百分比為0.05％?；旌衔镉谑覝販赜?小時，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，于4℃用PBS 1×透析過夜。在無菌條件下過濾該免疫原性制劑并在4℃保存直至使用。
實(shí)施例10制備含hTGFα的制劑。
如本發(fā)明中詳述的那樣將實(shí)施例2、3、7、8和9中所述的不同免疫原性制劑與Al(OH)3或Montanide ISA 51相混合。所有制劑中hTGFα的用量等于50μg，在實(shí)施例8和9所述的聯(lián)合疫苗中，hTGFα和hEGF的用量為50μg。每種融合蛋白或化學(xué)結(jié)合物制劑使用2毫克Al(OH)3，制劑分別含有50μg hTGFα或hEGF的相當(dāng)物。
實(shí)施例11制備含TGFα-P64K蛋白和EGF-P64K蛋白的聯(lián)合疫苗。
在注射之前，將總體積為0.5mL在0.6mg重組體中的50μg每種生長因子與相同體積的Montanide ISA 51混合并在室溫下振蕩10分鐘。
當(dāng)使用Al(OH)3作為佐劑時，注射之前將在2mg Al(OH)3中含0.6mg每種蛋白的兩種制劑相混合。
實(shí)施例12制備含化學(xué)結(jié)合物TGFα/P64K和EGF/P64K的聯(lián)合疫苗。
于室溫下使用注射器將0.25mL含50μg如實(shí)施例7所述連接到P64K的hTGFα的免疫原性制劑與0.25mL含hEGF的相應(yīng)免疫原性制劑相混合，并如實(shí)施例10所述與0.5mL的Montanide ISA 51混合10分鐘。
當(dāng)使用Al(OH)3作為佐劑時，將吸附于2mg Al(OH)3、分別含有50μg hTGFα或hEGF的前述化學(xué)結(jié)合物各0.5mL相混合。
實(shí)施例13小鼠模型中TGFα-P64K/不完全弗氏佐劑(MontanideISA 51)的免疫原性。
為了證實(shí)疫苗的免疫原性，對6-8周齡的雌性Balb/c小鼠皮下注射與Montanide ISA 51按1∶1混合的58mg(相當(dāng)于5μgTGFα)、116mg(10μg)或0，6mg(50μg)TGFα-P64K。如本發(fā)明的詳細(xì)描述制備免疫原并在免疫前振蕩10分鐘。每只動物接種4劑。在免疫前、一周后及此后每兩周進(jìn)行抽血。從所抽取的動物血中分離血清并采用間接ELISA技術(shù)測定抗hTGFα的特異性抗體滴度。
簡而言之，用含2.5μg/mL hTGFα的pH＝7.2碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液按50μL/孔包被微滴ELISA板(COSTAR)，并在4℃溫育過夜。用PBS 1×-Tween 20(0.05％)沖洗三次后，用PBS 1×-Tween20(0.05％)-SFT(5％)溶液在37℃封閉1小時。立刻加入被免疫小鼠的血清并于37℃溫育2小時。沖洗后，將于PBS 1×-Tween20(0.05％)-SFT(5％)中1/1000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)加入板中在相同溫度下溫育板1小時(50μL/pozo)。最后，在沖洗后，加入在pH＝9.8二乙醇胺緩沖液中終濃度為1mg/mL的酶底物(對硝基苯磷酸(Sigma))(50μL/孔)。在ELISA讀板機(jī)中測量所形成的酶-底物復(fù)合物在405nm的吸光度。
圖4顯示了在用TGFα-P64K免疫的小鼠中獲得的多價抗hTGFα抗體應(yīng)答的動力學(xué)。
由于hTGFα與大鼠或小鼠相應(yīng)因子之間的高度同源性(93％)，可以將此抗hTGFα的免疫應(yīng)答視為抗自身TGFα(小鼠)的應(yīng)答。
實(shí)施例14小鼠模型中TGFα-P64K/Al(OH)3的免疫原性。
使用2mg Al(OH)3作為佐劑，按之前實(shí)施例所述實(shí)施免疫方案。按本發(fā)明的詳細(xì)描述制備免疫原性制劑。對于TGFα獲得的抗體滴度達(dá)1/10000。用于測定抗體滴度的技術(shù)是實(shí)施例13中所述的間接ELISA。
實(shí)施例15小鼠模型中用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐劑(Montanide ISA 51)免疫的小鼠中的IgG亞群分布。
通過實(shí)施例13中所述的間接ELISA技術(shù)，使用1/1000稀釋的與生物素(Jackson)偶聯(lián)的抗不同IgG亞群的特異性抗血清，然后用鏈霉抗生物素蛋白-磷酸酶復(fù)合物(1/1000)，來測定IgG亞群分布。
測定每種IgG亞群相對于被免疫動物血清中的總IgG的比例。按照實(shí)施例13中所述的免疫程序通過皮下(組1)或肌內(nèi)(組2)途徑用含50μg TGFα的融合蛋白免疫動物。圖5是所獲得的亞群分布。研究所用的兩組小鼠均獲得更大比例的IgG1。
實(shí)施例16通過放射受體測定技術(shù)(RRA)測定用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐劑(Montanide ISA 51)免疫的動物血清抑制I125-TGFα結(jié)合的能力。
為測定之前所述的免疫程序中所產(chǎn)生的抗體是否能夠抑制TGFα與其受體結(jié)合，使用了一種稱為RRA的體外技術(shù)。在合成中，如實(shí)施例13中所述獲得的被免疫小鼠的血清與包含100mL人胎盤膜和20mLI125-TGFα(100000cpm)以及330mL緩沖液(pH＝7.4，10mM Tris-Cl，10mM MgCl2和1％BSA)的混合物一起溫育。使用氯胺T方法(Hunter和Greenwood(1962)，Nature，358495-498)將TGFα偶聯(lián)至放射性同位素I125。混合物于室溫下溫育1小時并用1mL之前提到的緩沖液終止反應(yīng)。最后將試管于1000rpm離心30分鐘。洗滌沉淀并晾干。用γ發(fā)射計(jì)數(shù)器(Wallac，芬蘭)檢測放射性。放射性測量值的減少表明由于被測血清的作用，TGFα與其受體的結(jié)合被抑制。在所有被測血清中抑制百分比為50％-80％。
實(shí)施例17測定通過用TGFα-P64K蛋白免疫而產(chǎn)生的抗人EGF(hEGF)體液應(yīng)答。
使用所述的間接ELISA技術(shù)在顯示高抗TGFα抗體滴度的小鼠血清中檢測抗EGF抗體的存在。向包被有hEGF(CIGB)的板內(nèi)加入1/100、1/1000和1/10000稀釋的血清。圖6顯示了用TGFα-P64K蛋白免疫的小鼠血清中獲得的抗EGF抗體滴度。僅在一組被免疫小鼠中獲得了陽性抗EGF抗體應(yīng)答。
然而用一種化學(xué)結(jié)合物EGF-P64K免疫的小鼠未顯示任何水平的抗TGFα抗體。
實(shí)施例18通過用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐劑(MontanideISA 51)免疫而獲得的多克隆抗血清抗hTGFα在體外對人類腫瘤的識別。
將使用TGFα-P64K蛋白與Montanide ISA 51免疫小鼠獲得的多克隆抗血清抗hTGFα用于檢測包埋在石蠟中的腫瘤活檢組織中的TGFα表達(dá)。這些活檢組織獲自接種了基于EGF的疫苗的患者。在一名有高抗hEGF抗體反應(yīng)的患者身上，觀察到了NSCLC腫瘤的消退。然而，后來檢測到了喉部的第二腫瘤。分析這兩個腫瘤的活檢組織并觀察到每一個腫瘤中EGF和TGFα的差異性表達(dá)。圖7中顯示的是不同抗體的反應(yīng)性值。這些結(jié)果證實(shí)了用含TGFα-P64K的疫苗制劑進(jìn)行免疫會產(chǎn)生能識別人體腫瘤中hTGFα的抗hTGFα特異性抗體這一事實(shí)。
實(shí)施例19乳腺癌活檢組織中EGF、TGFα和EGF-R的mRNA表達(dá)。
使用TRIZOL試劑(Life technologies)從乳腺癌腫瘤活檢組織中分離信使核糖核酸(mRNA)并通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換為cDNA。使用對于這些分子中每一種的特異性引物對總cDNA進(jìn)行30個PCR循環(huán)。用一個管家基因(GAPDH)作為內(nèi)對照。獲得的PCR產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳分離并用溴化乙錠來觀察。
圖8顯示了在22個乳腺癌中使用對EGF、TGFα、EGF-R和GAPDH(內(nèi)對照)的特異性引物獲得的結(jié)果。只在1/22的活檢組織中觀察到了EGF mRNA，而在大多數(shù)樣品中觀察到TGFα和EGF-RmRNA的高表達(dá)。這兩個分子表達(dá)之間的高度相關(guān)性提示TGFα/EGF-R自分泌環(huán)在這類腫瘤生長中的重要性(圖9)。
附圖簡要說明圖1成熟hTGFα的基因和氨基酸序列(黑體下劃線字母)。
圖2表達(dá)載體pMTGFα獲得過程圖解。
圖3通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，抗P64K Mab(A)和抗hTGFαMab(B)對TGFα-P64K融合蛋白的識別。對P64K(1)、EGF-P64K(2)和TGFα-P64K(3)進(jìn)行10％SDS-PAGE。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并與抗P64K(A)或TGFα(B)的特異性抗體一起溫育，以表征TGFα與P64K的融合蛋白。
圖4抗hTGFα抗體反應(yīng)動力學(xué)通過間接ELISA技術(shù)測定抗hTGFα特異性抗體滴度。用與Montanide ISA 51混合的相當(dāng)于5μg(A)、10μg(B)和50μg(C)hTGFα的TGFα-P64K蛋白免疫小鼠。x軸代表從每只小鼠收集樣本的天數(shù)，y軸代表所達(dá)到的抗體滴度的倒數(shù)。免疫的天數(shù)在圖A中用箭頭指出(0、14、28和42天)。
圖5用相當(dāng)于50μg TGFα的融合蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG亞群分布。使用TGFα-P64K蛋白經(jīng)皮下(1)或肌內(nèi)(2)免疫所誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)中IgG亞群比例的比較。對每組5只免疫動物，圖中顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
圖6用TGFα-P64K融合蛋白免疫的小鼠中的抗EGF特異性抗體反應(yīng)。圖表中顯示的是在用TGFα-P64K免疫的小鼠中達(dá)到的抗hTGFα和抗EGF抗體的滴度。
圖7通過對EGF疫苗II期臨床試驗(yàn)中接受疫苗接種的患者腫瘤活檢組織的免疫組化分析來測定EGF-R、EGF和TGFα的表達(dá)。這三種分子在肺原發(fā)腫瘤和后出現(xiàn)的喉部第二原發(fā)瘤中的差別活性，在圖中用加號顯示。
圖8EGF、hTGFα和EGF-R mRNA在22個乳腺癌中的表達(dá)。該圖顯示了用對每種分子特異性的引物獲得并在1.5％的瓊脂糖凝膠上分離后用溴化乙錠觀察到的30個PCR循環(huán)的產(chǎn)物。GAPDH mRNA表達(dá)作為內(nèi)對照，也可以看到。
圖9乳腺癌活檢組織中hTGFα和EGF-R mRNA水平之間的關(guān)系通過一個計(jì)算程序(ImagQuant，Amersham)分析用溴化乙錠獲得的條帶強(qiáng)度。x軸顯示對于每個樣品用對EGF-R特異性的引物獲得的PCR產(chǎn)物的強(qiáng)度值與用GAPDH獲得的強(qiáng)度值之間的關(guān)系(相對強(qiáng)度)，y軸是對hTGFα相同的相對強(qiáng)度值。在這兩種分子的表達(dá)之間觀察到了確實(shí)的相關(guān)性(R2＝0.657，P＝0.00121)。
權(quán)利要求
1.引發(fā)抗自身TGFα的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其中所述組合物包含自身TGFα或其任何衍生物作為活性成分以及合適的佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其包含人重組TGFα。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的疫苗組合物，其包含單獨(dú)的或與其它EGF-R配體相組合的自身TGFα作為活性成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的疫苗組合物，其中作為活性成分的自身TGFα和EGF-R配體可任選通過化學(xué)結(jié)合或通過遺傳方式偶聯(lián)至載體蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗組合物，其包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白作為載體蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFα和來自腦膜炎奈瑟菌的P64K蛋白之間的化學(xué)結(jié)合物作為活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFα和來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之間的化學(xué)結(jié)合物作為活性成分，還包含EGF。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFα和來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之間的重組融合蛋白作為活性成分。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其包含TGFα和來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之間的重組融合蛋白作為活性成分，其中所述P64K蛋白的N末端有一個六個組氨酸的尾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，其包含TGFα、來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白和EGF之間的重組融合蛋白作為活性成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的疫苗組合物，其包含不完全弗氏佐劑作為佐劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10的疫苗組合物，其包含Al(OH)3作為佐劑。
13.治療表達(dá)TGFα或任何EGF-R配體的上皮性來源腫瘤惡性疾病的方法，其中使用權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)所述的疫苗組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，用于治療腫瘤，如肺、乳腺、前列腺、胃和卵巢的表皮樣癌，其中使用權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)所述的疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生針對自身TGFα的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含TGFα及其任何衍生物作為活性成分，以及適宜的佐劑。所述疫苗制劑還可包括TGFα和其它生長因子如表皮生長因子(EGF)的組合，從而抑制其進(jìn)展依賴于所述因子的腫瘤的增殖。使用所述組合物可控制表皮樣癌的生長和增殖。
文檔編號A61K47/48GK1482916SQ01821434
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者A·穆萊謝拉, R·佩雷斯羅德里格斯, G·M·岡薩雷斯馬里內(nèi)羅, A·奧瓦雷斯阿科斯塔, T·梅南德斯麥迪納, G·E·吉倫涅托, B·桑切斯拉米雷斯, A 穆萊謝拉, 興估 桌姿, 岡薩雷斯馬里內(nèi)羅, 吉倫涅托, 呃姿拱⒖撲顧, 姿孤薜呂鋦袼, 系濾孤蟮夏 申請人:分子免疫中心