專利名稱：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子αHI的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最新鑒別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的多肽已被推定性地鑒定為轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子α同系物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽已被推定性地鑒定為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α-HI，下文有時(shí)稱為“TGFα-HI”。本發(fā)明也涉及抑制這些多肽的作用的方法。
細(xì)胞生長(zhǎng)和分化似乎是由多種刺激、抑制和協(xié)同因子及激素起始、促進(jìn)、保持和調(diào)節(jié)的。細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制的變化和/或障礙似乎是與生長(zhǎng)相關(guān)的疾病(包括瘤形成)的根本原因。生長(zhǎng)模式(modular)因子和各種病理和生理過(guò)程有關(guān)，這些過(guò)程包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊、生長(zhǎng)和發(fā)育、胚胎發(fā)生、免疫應(yīng)答、造血細(xì)胞的存活和分化、炎癥、組織修復(fù)和改造、動(dòng)脈粥樣硬化和癌變。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGFα)、β-動(dòng)物纖維素(betacellulin)、雙調(diào)蛋白和牛痘生長(zhǎng)因子等都是各種細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件或?qū)ν庠创碳みM(jìn)行應(yīng)答的情況下生產(chǎn)的生長(zhǎng)和分化模式蛋白，并且這些因子也是EGF家族的成員。
這些肽生長(zhǎng)因子通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制影響創(chuàng)傷細(xì)胞。它們也對(duì)很多組織(如皮膚、角膜和胃腸道)的正常創(chuàng)傷愈合起重要作用，并且所有這些因子實(shí)質(zhì)上享有氨基酸序列的同源性，這種同源性包括三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的保守替換。此外，此家族的所有因子都和分子量為170,000的跨膜糖蛋白受體結(jié)合，并且激活受體細(xì)胞質(zhì)區(qū)的酪氨酸激酶活性(Buhrow，S.A.等，生物化學(xué)雜志2587824-7826(1983))。
這種受體由許多典型的細(xì)胞表達(dá)，這些細(xì)胞包括皮膚角質(zhì)化細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和GI道的上皮細(xì)胞。這些肽生長(zhǎng)因子由幾種和創(chuàng)傷愈合有關(guān)的細(xì)胞合成，這些細(xì)胞包括血小板、角質(zhì)化細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞。這些生長(zhǎng)因子既與某些細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化的刺激作用(例如，瘤形成)有關(guān)，也和其它類型細(xì)胞的抑制作用有關(guān)。
β-動(dòng)物纖維素是32-kDa糖蛋白，這種糖蛋白可能是由一個(gè)更大的跨膜前體經(jīng)蛋白水解斷裂加工而成的。β-動(dòng)物纖維素的羧基末端區(qū)和大鼠生長(zhǎng)因子α的羧基末端區(qū)具有50％的序列相似性。β-動(dòng)物纖維素是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中有力的促細(xì)胞分裂劑。
雙調(diào)蛋白是一種雙向功能的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其對(duì)新生物細(xì)胞的DNA合成顯示出有力的抑制活性，卻促進(jìn)某些正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。已經(jīng)指出雙調(diào)蛋白具有包括治療創(chuàng)傷和癌癥在內(nèi)的各種廣泛用途。例如，雙調(diào)蛋白在體外對(duì)幾種上皮來(lái)源的人類癌細(xì)胞系具有有力的抗增值作用。如美國(guó)專利申請(qǐng)5,115,096所示，雙調(diào)蛋白也誘導(dǎo)人類前皮成纖維細(xì)胞的增殖。
TGFα具有多向性生物作用。TGFα某些成員的產(chǎn)生是通過(guò)許多產(chǎn)生瘤的轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞合成的(Ciardiallo等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志4245-57(1990))，以及通過(guò)多種腫瘤(包括腎部、胸部和鱗狀癌、黑素瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)合成(Derynck，R.等，癌研究47707-712(1987))。通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因小鼠(其中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的TGFα)，有直接的證據(jù)表明TGFα的表達(dá)可能是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成其致瘤相應(yīng)物的促進(jìn)因子。TGFα的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出各種致瘤性損傷，致瘤性損傷取決于小鼠株系及調(diào)節(jié)TGFα表達(dá)之啟動(dòng)子的選擇(Sandgren，等，細(xì)胞，611121-1135(1990))。
TGFα也在正常的胚胎發(fā)育和成年人的生理過(guò)程中具有作用(Derynck，R.癌研究進(jìn)展，5827-5(1992))。TGFα在許多組織(包括皮膚、腦、胃腸粘膜和激活的巨噬細(xì)胞)中表達(dá)。因此，TGFα是控制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因子并且對(duì)創(chuàng)傷愈合具有作用(Schreiber等，科學(xué)，2321250-1253(1986))。
本發(fā)明的多肽已經(jīng)被推定性地鑒定為轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)因子TGFα-HI。由于氨基酸序列和人類TGFα同源，所以進(jìn)行了這種鑒定。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新的成熟多肽以及其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人類來(lái)源的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其類似物和其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸用于治療的方法，所述治療方法例如，刺激創(chuàng)傷愈合以便在創(chuàng)傷和AIDS癡呆后恢復(fù)正常的神經(jīng)功能、治療視覺(jué)障礙、靶向某些細(xì)胞、治療腎和肝臟紊亂和促進(jìn)毛發(fā)發(fā)囊發(fā)育、刺激血管形成以便治療燒傷、潰瘍和角膜切口以及刺激胚胎發(fā)生。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長(zhǎng)度足以特異性地與本發(fā)明的核酸序列雜交的核酸分子。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供抗這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所說(shuō)多肽的拮抗劑，其可用于抑制這些多肽的作用，例如，治療角膜炎癥、瘤形成(例如，腫瘤、癌癥)及牛皮癬。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)與本發(fā)明的多肽過(guò)量表達(dá)及編碼這種多肽之核酸序列中的突變有關(guān)的疾病的診斷測(cè)定方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸體外用于與科學(xué)研究、DNA合成及DNA載體的人工合成有關(guān)的目的的方法。
從本文的教導(dǎo)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
下列附圖用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，而無(wú)意于用它們來(lái)限制本發(fā)明權(quán)利要求所包括的范圍。


圖1描述了TGFα-HI的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。推定的信號(hào)序列有下劃線，推定的可溶性部分有雙下劃線。
圖2是人類雙調(diào)蛋白、人類β-動(dòng)物纖維素、人類表皮生長(zhǎng)因子、人類heregulin和人類TGFα-HI(第五排)之間的比較的氨基酸序列同源性的圖解。陰影區(qū)指保守EGF基元，其顯示出在本發(fā)明的多肽中是保守的。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽或由1994年3月4日以保藏號(hào)ATCC 75698保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
可以從人腦或早期腦組織中得到編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸在八周齡胚胎的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。其在結(jié)構(gòu)上和TGFα基因家族相關(guān)。其包含一個(gè)編碼380個(gè)氨基酸殘基之多肽的開(kāi)放讀框，其顯示出與許多TGFα基因家族的成員的明顯的同源性；這些成員包括TGFα本身以及其他成員，例如雙調(diào)蛋白和cripto。此外，出現(xiàn)在所有成員的特征性基元中的6個(gè)半胱氨酸殘基在TGFα-HI中是保守的。
如圖1(SEQ ID NO2)所示的本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽具有推定的信號(hào)序列，這種信號(hào)序列包含圖1(SEQ ID NO2)的1位氨基酸至39位氨基酸，其幫助所述多肽從細(xì)胞分泌。所述多肽被進(jìn)一步加工，加工中圖1(SEQ ID NO2)的40位氨基酸至266位氨基酸從所述多肽上裂解下來(lái)，因?yàn)檫@一氨基酸骨架是推定的前體序列。并且，317位氨基酸至380位氨基酸代表推定的跨膜部分，其被認(rèn)為對(duì)指導(dǎo)所述多肽到特定的靶位點(diǎn)以顯示下文描述的生物學(xué)功能是必需的?？缒げ糠忠部梢詮乃龆嚯闹星谐?，這樣，本發(fā)明多肽推定的可溶部分包含圖1(SEQID NO2)的267位氨基酸至316位氨基酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，其可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1(SEQ ID NO1)所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其可以和圖1的DNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導(dǎo)或分泌序列或蛋白原序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和可有可無(wú)的附加的編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列5＇和/或3＇的非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術(shù)語(yǔ)包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推定的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1(SEQ ID NO1)中所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。本領(lǐng)域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，而實(shí)質(zhì)上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中所說(shuō)的成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中與幫助從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作為分泌序列在控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主細(xì)胞切割形成成熟形式的多肽的前導(dǎo)序列。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是添加有附加的5’氨基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無(wú)活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的就是有活性的成熟蛋白。
這樣，本發(fā)明的多核苷酸例如可以編碼一種成熟蛋白或編碼具有原序列的蛋白質(zhì)或編碼既有原序列又有前序列(presequence)(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其提供來(lái)純化融合進(jìn)標(biāo)記的成熟多肽，或例如當(dāng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。所說(shuō)的HA標(biāo)記相應(yīng)于來(lái)源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一種表位(Wilson，I.等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指和產(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA區(qū)段；其包括在編碼區(qū)前面的和后面的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和尾隨序列)以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
全長(zhǎng)TGFα-HI基因的片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針，用來(lái)分離全長(zhǎng)基因和與此基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針優(yōu)選地是具有至少30個(gè)堿基，并且可以含有，例如50個(gè)或更多的堿基。所說(shuō)的探針也可以用于鑒別相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和基因組克隆或含有包含調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整TGFα-HI基因克隆。篩選的實(shí)例包括通過(guò)利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針來(lái)分離基因的編碼區(qū)。具有互補(bǔ)于本發(fā)明的基因序列之序列的標(biāo)記可以用來(lái)篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫(kù)，以確定探針和哪些文庫(kù)成員雜交。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(條件是兩個(gè)序列之間具有至少70％，優(yōu)選地具有至少90％，更優(yōu)選地具有至少95％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選地具有至少97％的同源性時(shí)雜交才可以發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實(shí)質(zhì)上保持與由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選地是至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選地是至少50個(gè)堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸的探針，例如用于回收多核苷酸或作為診斷探針或作為PCR引物。
這樣，本發(fā)明涉及與編碼圖1(SEQ ID NO2)多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，優(yōu)選地至少90％相同性并且更優(yōu)選地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(這種片段具有至少30個(gè)堿基，優(yōu)選地至少50個(gè)堿基)和這些多核苷酸編碼的多肽。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保持。這些保持物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對(duì)保藏材料的任何制造、使用或銷售需要經(jīng)過(guò)許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”，當(dāng)有關(guān)圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進(jìn)而生產(chǎn)活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說(shuō)的圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基取代)并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的氨基酸殘基；或(ii)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基；或(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)這樣一種，其中附加氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)或分泌序列或用來(lái)純化成熟多肽的序列或原序列。通過(guò)本文的闡述，可以認(rèn)為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，并且優(yōu)選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質(zhì)性的。
術(shù)語(yǔ)“分離的”意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動(dòng)物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開(kāi)的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因?yàn)檫@種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括圖1(SEQ ID NO2)的多肽(特別是成熟多肽)以及和圖1(SEQ ID NO2)的多肽具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更優(yōu)選地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最優(yōu)選地是95％的相似性(最好是95％相同性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這種多肽的部分通常包含至少30個(gè)氨基酸，并且優(yōu)選地是至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所熟知的，兩個(gè)多肽之間的“相似性”是通過(guò)比較一個(gè)多肽和另一個(gè)多肽序列的氨基酸序列和其保守氨基酸取代來(lái)確定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分通過(guò)肽合成可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，此片段可以用作生產(chǎn)全長(zhǎng)多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)產(chǎn)生的，所說(shuō)的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可以在改良的適于激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增本發(fā)明的基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度和pH值等，是以前用于表達(dá)選擇的宿主細(xì)胞的那些，對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來(lái)經(jīng)重組技術(shù)生產(chǎn)多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來(lái)說(shuō)，用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在表達(dá)載體中的所說(shuō)的DNA序列是可操作地連接到適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)mRNA合成表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)上的。這樣的啟動(dòng)子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動(dòng)子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。所說(shuō)的表達(dá)載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該載體也可以包含供擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳎允蛊淠軌虮磉_(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過(guò)本文的闡述，對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，該載體已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包含可操作連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動(dòng)子。大量適合的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體都可以使用，只要它們?cè)谒拗髦锌蓮?fù)制和穩(wěn)定。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體從任何所需的基因選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動(dòng)子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對(duì)適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說(shuō)的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。可以由磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DHAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來(lái)以常規(guī)方式生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成器合成生產(chǎn)。
成熟蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下表達(dá)。采用來(lái)源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來(lái)生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達(dá)載體。
高等真核生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄被插入到載體中的增強(qiáng)子序列增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動(dòng)子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)100至270bp上的SV40增強(qiáng)子、細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)上的多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
一般來(lái)說(shuō)，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表達(dá)基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以是來(lái)自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質(zhì)包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或簡(jiǎn)化純化步驟。
通過(guò)在具有功能性啟動(dòng)子的可操作讀框(reading phase)中插入帶有合適的翻譯起始和終止信號(hào)的編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列來(lái)構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。所說(shuō)載體包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以在宿主來(lái)保證保持載體和需要時(shí)提供擴(kuò)增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種(當(dāng)然其它的也可以選擇來(lái)使用)。
作為一個(gè)代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322“骨架”片段與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。
在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保持所形成的粗產(chǎn)物用于進(jìn)一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可以用來(lái)提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
所說(shuō)的多肽可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時(shí)在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)生產(chǎn)的。依據(jù)重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作人類疾病的治療和診斷的研究試劑和材料。
本發(fā)明的多肽可以用于確定受體的特征。目前，EGF家族的受體包括4個(gè)EGF受體，稱為EGFR1、EGFR2、EGFR3、EGFR4。EGFR2也可以稱為ERB-2，此分子在各種診斷和治療適應(yīng)癥方面是有用的(Prigent，S.A.和Lemoine，N.R.，生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展，41-24(1992))。TGFα-HI多肽可能是一種或幾種這些受體以及鑒定的新EGF類型受體的配體。TGFα-HI的使用有助于這些受體的鑒定、定性和克隆。例如，EGF受體基因代表禽成紅細(xì)胞增多病病毒的v-erb-B癌基因的細(xì)胞同系物。EGF受體的過(guò)量表達(dá)或該蛋白質(zhì)激酶調(diào)節(jié)片段的缺失可以導(dǎo)致細(xì)胞的致瘤轉(zhuǎn)化(Manjusri，D.等，人類細(xì)胞因子，364和381(1991))。
本發(fā)明的多肽也可以用于因創(chuàng)傷或其它破壞性的病理(如AIDS癡呆、老年性癡呆等等)降低的神經(jīng)功能的恢復(fù)或提高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGFα和其同系物是大部分腦中的EGF/TGFα受體的最豐富的配體(Kaser等，腦研究和分子腦研究16316-322，(1992))。與EGF(其只存在于較小的分散的區(qū)域中)相比，TGFα在腦的各種區(qū)域中似乎有廣泛的分布，表明TGFα可能在腦組織中具有生理作用。腦中這些TGFα的眾多受體位點(diǎn)說(shuō)明TGF在促進(jìn)正常腦細(xì)胞分化和發(fā)揮功能方面具有重要作用。因此，在神經(jīng)功能降低的情況下，施用本發(fā)明的多肽可以刺激腦并提高適當(dāng)?shù)纳砉δ堋?br> TGFα-HI和其可溶性形式也可以用于治療視覺(jué)障礙，例如，角膜炎癥。各種實(shí)驗(yàn)表明TGFα-HI基因家族的成員和這種病理有關(guān)。最近的論文概括了一些和這些生長(zhǎng)因子在眼疾病中所起的作用相關(guān)的數(shù)據(jù)(Mann等，細(xì)胞73249-261(1993))。最近的實(shí)驗(yàn)顯示缺乏TGFα基因的小鼠由于白細(xì)胞和其它細(xì)胞對(duì)眼物質(zhì)propria的滲透顯示出角膜炎癥。
此外，TGFα生長(zhǎng)因子對(duì)其靶細(xì)胞的特異性可以用作破壞靶細(xì)胞的機(jī)制。例如，可以通過(guò)各種方法將TGFα-HI或其可溶性形式與毒素分子(例如滅活靶細(xì)胞的放射藥物)偶合。這些生長(zhǎng)因子-毒素融合物殺死靶細(xì)胞(和在某些情況下通過(guò)各種“旁觀者”效應(yīng)殺死鄰區(qū)細(xì)胞)。Mesri等(生物化學(xué)雜志2684853-62(1993))發(fā)表了這種毒素融合基因的最新例子?？梢詫GFα-HI和相關(guān)的分子在脂質(zhì)體中形成膠囊并將其和識(shí)別并結(jié)合腫瘤或細(xì)胞特異性抗原的抗體結(jié)合，從而提供“導(dǎo)向”細(xì)胞的方法。
因?yàn)镋GF家族成員在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中顯示出抗增值作用，所以TGFα-HI可以以同樣的方式用作抗致瘤的化合物。對(duì)于體內(nèi)使用，主題多肽可以以各種方式施用，這些方式包括但不限于注射、灌輸、局部地、腸胃外等等?？梢砸匀魏紊砩峡山邮艿妮d體進(jìn)行施用，這些載體包括磷酸緩沖液鹽水、鹽水、無(wú)菌水等等。
因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)在腎中有這些生長(zhǎng)因子的表達(dá)，所以TGFα-HI也可以用于治療某些腎功能障礙。這樣，這些因子對(duì)此器官正常生理的維持是必需的。
因?yàn)門GFα和其同系物及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在部分肝切除和急性肝細(xì)胞壞死之后，觸發(fā)肝細(xì)胞的再生，所以所說(shuō)的治療也和肝臟的再生或肝臟機(jī)能障礙有關(guān)(Masuhara，M.等，肝臟學(xué)161241-1249(1992))。
與TGFα-HI有關(guān)的有重要意義的治療涉及創(chuàng)傷愈合。本發(fā)明的組合物可以用于治療實(shí)質(zhì)上包括所有的皮創(chuàng)傷、角膜創(chuàng)傷和身體上皮排列穴器官傷害在內(nèi)的各種創(chuàng)傷。適于治療的創(chuàng)傷包括由外傷(如燒傷、擦傷、刀傷)以及外科手術(shù)(如外科切口和皮膚移植)導(dǎo)致的創(chuàng)傷。適于用本發(fā)明的多肽治療的其它病癥包括慢性疾病(如慢性潰瘍，糖尿病潰瘍)和其它非愈合(營(yíng)養(yǎng))病癥。
TGFα-HI或其可溶性片段可以摻入到生理上可接受的載體中以便用于感染的區(qū)域。所說(shuō)的載體的特性變化很大，這種變化依賴于預(yù)期施用的位點(diǎn)。對(duì)于在皮膚上施用，乳油和軟膏基質(zhì)通常是優(yōu)選的；合適的基質(zhì)包括羊毛脂、Silvadene(Marion)(特別是對(duì)于治療燒傷)、Aquaphor(Duke實(shí)驗(yàn)室，South Norwalk，Conn.)等等。如果需要，將包含TGFα-HI的組合物摻入繃帶和其它的創(chuàng)傷包扎物中以便使傷口持續(xù)地暴露在所說(shuō)的肽下。氣溶膠的應(yīng)用也找到了用途。
TGFα-HI在治療組合物中的濃度不是關(guān)鍵的但其應(yīng)該足以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增值?？梢跃植康貙?duì)感染區(qū)施用所說(shuō)的組合物，一般作為滴眼劑施用到眼部或作為乳油、軟膏或洗劑施用到皮膚上。對(duì)于眼部，需要經(jīng)常治療，通常以4小時(shí)或更少的間隔施用。在皮膚上，在愈合的過(guò)程中需要在感染區(qū)持續(xù)保持治療組合物，每天施用治療組合物2至4次或更多次。
本發(fā)明多肽的使用量隨施用方式而變化，其它活性化合物等的使用量通常在1μg-100μg的范圍內(nèi)。本發(fā)明多肽可以和生理上可接受的載體(如鹽水、磷酸緩沖液鹽水等等)一起使用。所述化合物的使用量根據(jù)體外細(xì)胞的反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)多肽或含有實(shí)驗(yàn)多肽的制劑的反應(yīng)由經(jīng)驗(yàn)確定。
TGFα-HI或其可溶性片段可以用于血管形成、骨吸收、免疫應(yīng)答和染色體接合及神經(jīng)元效應(yīng)器功能的調(diào)節(jié)。TGFα-HI也可以用于花生四烯酸級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)。
TGFα-HI或其可溶性片段也可以用于與終末分化相關(guān)的應(yīng)用中。許多TGFα因子和它們的同系物在它們的靶細(xì)胞中誘導(dǎo)終末分化。可以通過(guò)施用所說(shuō)的因子并誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡在體內(nèi)利用這種特性。這種用藥方式是考慮到和醫(yī)學(xué)上不希望的細(xì)胞類型(如癌癥和其它增值障礙(如炎癥、牛皮癬等等))的過(guò)度增值有關(guān)的紊亂。除了體內(nèi)施用，也有許多允許體外施用的情況。例如，可以通過(guò)用所說(shuō)的生長(zhǎng)因子和/或其衍生物治療所說(shuō)的細(xì)胞以從骨髓中清除不需要的細(xì)胞群。
所說(shuō)的應(yīng)用也涉及脫毛、毛發(fā)損失和其它影響毛發(fā)發(fā)囊發(fā)育的皮膚病癥。若干證據(jù)表明這些情況和TGFα生長(zhǎng)因子有關(guān)。經(jīng)基因工程操作TGFα基因中含有無(wú)效突變的“剔除(knockout)”小鼠顯示出和毛發(fā)合成的數(shù)量及質(zhì)量有關(guān)的崎變。此外，小鼠作圖研究已經(jīng)表明一些影響毛發(fā)生長(zhǎng)的突變位于TGFα基因基因座上(Mann等，細(xì)胞73249-261(1993))。TGFα-HI或其衍生物的局部或全身應(yīng)用可以用于治療脫發(fā)及毛發(fā)損失的病癥，這些權(quán)利要求在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
通過(guò)全身臨床施用TGFα-HI生長(zhǎng)因子，某些疾病的病理情況已部分地或完全地改善。所說(shuō)的施用可以以基因治療的形式進(jìn)行，或通過(guò)施用由TGFα-HIDNA重組構(gòu)建體或肽化學(xué)合成法合成的肽或蛋白質(zhì)來(lái)完成(Woo等，蛋白質(zhì)工程329-37(1989))。
本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑化合物的方法。例子是將表達(dá)TGFα-HI受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制劑和潛在的化合物一起培養(yǎng)，檢測(cè)所說(shuō)的化合物由該受體產(chǎn)生第二信號(hào)的能力以確定其是否是有效的激動(dòng)劑。第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解作用。有效的拮抗劑由上文描述的方法確定，其中檢測(cè)到的拮抗劑化合物和所說(shuō)的受體結(jié)合但不能引起第二信使反應(yīng)，進(jìn)而阻斷TGFα-HI與受體結(jié)合。
另一種鑒定對(duì)本發(fā)明多肽之受體特異性的潛在的拮抗劑的方法是競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法，這種方法包括分離過(guò)量表達(dá)本發(fā)明多肽之受體的原生質(zhì)膜，例如，人類A431癌細(xì)胞。將在介質(zhì)(體積大約是10ml)中系列稀釋的含有10nM125I-TGFα-HI的實(shí)驗(yàn)樣品加入到含有潛在的拮抗劑化合物的5ml原生質(zhì)膜中，并在4℃下培養(yǎng)4小時(shí)。將反應(yīng)混合物稀釋并立即通過(guò)微孔濾器。然后迅速洗滌濾器。并在γ計(jì)數(shù)器中測(cè)量結(jié)合的放射性。然后測(cè)量結(jié)合的TGFα-HI的量。在不存在所說(shuō)的化合物的情況下進(jìn)行對(duì)照分析以確定拮抗劑是否能降低結(jié)合的TGFα-HI的量。
潛在的拮抗劑化合物包括抗體或某種情況下和所說(shuō)的多肽結(jié)合的寡肽。另外，潛在的拮抗劑可以是一種密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)和所說(shuō)的多肽的失活形式的受體結(jié)合，進(jìn)而阻止了本發(fā)明多肽的活性。
另一個(gè)潛在的拮抗劑化合物是采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可以通過(guò)三螺旋形成或反義DNA或RNA來(lái)控制基因的表達(dá)，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來(lái)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成與轉(zhuǎn)錄所涉及的基因區(qū)互補(bǔ)(三螺旋-參見(jiàn)Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，進(jìn)而阻止本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為本發(fā)明的多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(CRC出版社，BocaRaton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細(xì)胞中，以便可以體內(nèi)表達(dá)反義RNA和DNA，抑制本發(fā)明多肽的生產(chǎn)。
拮抗劑化合物包括小分子，這些小分子和本發(fā)明的多肽結(jié)合并在受體位點(diǎn)阻斷其活性，這樣，就阻斷了正常的生物活性。小分子也可以和所說(shuō)的多肽的受體結(jié)合，結(jié)果阻止了多肽和受體的結(jié)合。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑可以用來(lái)治療瘤形成，例如，癌和腫瘤。已知小鼠中腫瘤細(xì)胞分泌或產(chǎn)生EGF家族成員的抑制作用造成腫瘤的衰退。
本發(fā)明多肽的拮抗劑也可以治療性地用于治療某些皮膚病癥，例如，牛皮癬。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所說(shuō)的生長(zhǎng)因子家族成員提高的表達(dá)水平在取自疾病(如牛皮癬損傷)的皮膚活組織檢查中將再提高(Cook，et al.，癌研究，523224-3227(1992))。所說(shuō)的拮抗劑和藥學(xué)可接受的載體(如下文描述的)一起用于組合物中。
本發(fā)明的多肽和激動(dòng)劑或拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包含治療有效量的所說(shuō)多肽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。其配方應(yīng)該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個(gè)或多個(gè)填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。這種容器中還可以包括管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品的政府機(jī)構(gòu)的同意。此外，本發(fā)明的多肽或組合物可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說(shuō)的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來(lái)說(shuō)，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過(guò)每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
多肽和多肽形式的激動(dòng)劑和拮抗劑，可以依據(jù)本發(fā)明通過(guò)體內(nèi)表達(dá)這樣的多肽來(lái)利用，這常被稱作“基因治療”。
這樣，例如，可以體外對(duì)患者細(xì)胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行基因工程操作，用工程細(xì)胞向被治療的患者提供所說(shuō)的多肽。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且由本文的描述也顯而易見(jiàn)。例如，可以用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
同樣地，可以通過(guò)例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作，以便體內(nèi)表達(dá)多肽。例如，將包裝(packaging)細(xì)胞用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，以便包裝細(xì)胞能產(chǎn)生含有興趣基因的傳染性病毒顆粒。可以將這種生產(chǎn)細(xì)胞施用給患者以便體內(nèi)將細(xì)胞基因工程化并體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)的多肽。經(jīng)本發(fā)明的描述，通過(guò)這種方式施用本發(fā)明多肽的這些或其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的。
可以獲得上文描述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長(zhǎng)臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和乳房腫瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來(lái)自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？梢允褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動(dòng)子；和人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller，等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它任何啟動(dòng)子(例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，如包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。使用的其它病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。通過(guò)本文的描述，合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動(dòng)子控制下?？梢允褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子)；或異源啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子)；熱休克啟動(dòng)子；清蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人類珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(如單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人類生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。所說(shuō)的啟動(dòng)子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動(dòng)子。
使用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以便形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN細(xì)胞系(Miller，人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)。可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包囊在脂質(zhì)體中，或和脂類偶合，然后施用到宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生傳染性的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然后可以使用這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的基因作為診斷劑。本發(fā)明的基因的突變形式的檢測(cè)使得可以診斷源于本發(fā)明的多肽表達(dá)不足(underexpression)的疾病或疾病的易感性，例如，不適當(dāng)(improper)的傷口治愈、不適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)功能、視覺(jué)障礙、腎和肝功能障礙、毛發(fā)發(fā)囊發(fā)育、血管形成和胚胎形成。
可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)具有本發(fā)明的人基因突變的個(gè)體?？梢詮幕颊叩募?xì)胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)，或在分析前用PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作為一個(gè)例子，可以用與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸互補(bǔ)的PCR引物鑒別和分析其突變。例如，可以通過(guò)與正常基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物大小上的改變來(lái)檢測(cè)缺失或插入。點(diǎn)突變可以經(jīng)擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的RNA或放射性標(biāo)記的反義DNA序列雜交鑒別。經(jīng)核糖核酸酶A消化，或從熔點(diǎn)溫度的不同辨別完美配對(duì)的序列和錯(cuò)配雙鏈體。
可通過(guò)直接的DNA測(cè)序方法揭示參照基因和具有突變的基因間的序列差異。此外，克隆的DNA區(qū)段可以用作探針以檢測(cè)特異性DNA區(qū)段。當(dāng)和PCR結(jié)合時(shí)，這種方法的敏感性大大提高。例如，將測(cè)序引物和雙鏈的PCR產(chǎn)物或由改良的PCR方法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。通過(guò)常規(guī)的放射標(biāo)記核苷酸方法或具有熒光標(biāo)記的自動(dòng)測(cè)序方法確定序列。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過(guò)檢測(cè)在有或沒(méi)有變性劑時(shí)凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上的區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點(diǎn)或部分解鏈溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見(jiàn)，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護(hù)測(cè)定法揭示特定位置上的序列變化，所述測(cè)定法如核糖核酸酶保護(hù)和S1保護(hù)以及化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國(guó)，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測(cè)特定DNA序列，所述方法例如雜交、核糖核酸酶保護(hù)、化學(xué)裂解、直接DNA測(cè)序、或使用限制酶(例如，限制片段長(zhǎng)度多形性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
除很多常規(guī)凝膠電泳和DNA測(cè)序法之外，也可用原位分析檢測(cè)突變。
因?yàn)橄鄬?duì)于正常組織樣品所說(shuō)的多肽的過(guò)量表達(dá)可以檢測(cè)某些疾病(例如，瘤形成、皮膚機(jī)能障礙、視覺(jué)障礙和炎癥)的存在，所以，本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中本發(fā)明的多肽之改變的水平的診斷分析方法。用于檢測(cè)得自宿主的樣品中本發(fā)明多肽水平的分析方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，所說(shuō)的方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析，優(yōu)選地是ELISA測(cè)定。ELISA測(cè)定最初包括制備本發(fā)明多肽之抗原的特異性抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。此外，制備單克隆抗體的報(bào)道抗體。將可檢測(cè)的試劑和報(bào)道抗體結(jié)合，所說(shuō)的試劑如放射性、熒光或在這一實(shí)例中是辣根過(guò)氧化物酶。由宿主獲得樣品，并將其在與樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過(guò)和非特異性蛋白質(zhì)(如牛血清清蛋白)一起溫育，包被皿中任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接下來(lái)，將單克隆抗體在聚苯乙烯皿中保溫，在此期間單克隆抗體與附著于皿上的任何本發(fā)明多肽結(jié)合。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。此時(shí)，將和辣根過(guò)氧化物酶連接的報(bào)道抗體放入皿中，結(jié)果導(dǎo)致報(bào)道抗體和任何結(jié)合到本發(fā)明多肽上的單克隆抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的報(bào)道抗體洗掉。接著向皿中加入過(guò)氧化物酶底物，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的蛋白質(zhì)的量。
也可以使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定確定宿主樣品中本發(fā)明多肽的水平。這種測(cè)定方法包括分離過(guò)量表達(dá)本發(fā)明多肽受體的原生質(zhì)膜。然后將含有已經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明多肽的實(shí)驗(yàn)樣品加入到原生質(zhì)膜中，并將其溫育一段時(shí)間。將可能含有本發(fā)明多肽的宿主樣品加入到反應(yīng)混合物中。然后使反應(yīng)混合物通過(guò)被迅速洗滌的濾器，并測(cè)定結(jié)合的放射性以確定所說(shuō)的受體的競(jìng)爭(zhēng)量，從而確定樣品中本發(fā)明多肽的量。
因?yàn)楹芏囝愋偷陌┘?xì)胞在瘤形成或增殖的過(guò)程中正調(diào)節(jié)(upregulate)TGFα家族的各種成員，所以可以將TGFα-HI的特異性抗體用于癌癥的診斷和治療中。這些抗體和TGFα-HI結(jié)合并失活TGFα-HI。TGFα-HI(和/或其家族成員)的單克隆抗體在臨床上用于某些機(jī)能障礙的診斷和治療，所說(shuō)的機(jī)能障礙包括(但不限于)增生的和致瘤性的生長(zhǎng)異常。致瘤性組織對(duì)生長(zhǎng)因子的表達(dá)的上調(diào)形成了檢測(cè)感染患者血液中生長(zhǎng)因子增加的各種血清測(cè)定的基礎(chǔ)。一般，這種測(cè)定不僅用于診斷性確診(setting)，也用于預(yù)后性確診(以便在外科手術(shù)和化療之后檢測(cè)潛隱的腫瘤細(xì)胞的存在)。
此外，在受體結(jié)合測(cè)定中可以利用標(biāo)記的TGFα-HI或利用TGFα-HI受體本身的抗體檢測(cè)表達(dá)TGFα-HI受體的惡性細(xì)胞。依據(jù)TGFα-HI受體的存在和密度區(qū)別細(xì)胞，進(jìn)而提供預(yù)測(cè)所說(shuō)的細(xì)胞對(duì)TGFα-HI的生物活性之敏感性的方法。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列特異地靶向位于單個(gè)的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前，僅有少數(shù)幾種以實(shí)際的序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)為基礎(chǔ)的染色體標(biāo)記試劑可以用于標(biāo)記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)的重要的第一步。
簡(jiǎn)而言之，通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選10-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計(jì)算機(jī)分析可以快速地選擇引物，其中引物不應(yīng)跨越超過(guò)基因組DNA上的一個(gè)外顯子，否則使得擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有與該引物對(duì)應(yīng)的人基因的雜交體才會(huì)生產(chǎn)擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將一個(gè)特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來(lái)自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實(shí)現(xiàn)亞定位(sublocalization)?？梢灶愃频赜糜趯?duì)染色體作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過(guò)雜交進(jìn)行預(yù)選，從而構(gòu)建出染色體特異性的cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與一個(gè)中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)一步法準(zhǔn)確染色體定位。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長(zhǎng)短的cDNA。關(guān)于該技術(shù)的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦一個(gè)序列已定位到一個(gè)準(zhǔn)確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德?tīng)栠z傳中找到(可以通過(guò)Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫(kù)聯(lián)機(jī)得到)。然后通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來(lái)鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接下來(lái)需要測(cè)定在受影響的和未受影響的個(gè)體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個(gè)體中觀察到的、但是又沒(méi)有在任何一個(gè)正常個(gè)體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病原體。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術(shù)目前的分辨率，一個(gè)被準(zhǔn)確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的病原(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個(gè)基因)。
多肽、其片段或該多肽的其它衍生物或類似物、或者表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
針對(duì)相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽而產(chǎn)生的抗體可以通過(guò)將該多肽直接注射入動(dòng)物體內(nèi)或者通過(guò)將該多肽向動(dòng)物給藥來(lái)得到，其中的動(dòng)物優(yōu)選非人類。然后，如此得到的抗體會(huì)結(jié)合到該多肽上。通過(guò)這種方式，即使是僅僅編碼該多肽的一個(gè)片段的序列也可用于產(chǎn)生能結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后，該抗體可以用于從表達(dá)該多肽的組織中分離這種多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler與Milstein，1975，自然，256495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，4∶72)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體與癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)進(jìn)行修改從而生產(chǎn)出針對(duì)本發(fā)明免疫原性多肽制品的單鏈抗體。也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)表達(dá)針對(duì)本發(fā)明免疫原性多肽制品的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例進(jìn)一步加以說(shuō)明；但是，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利于理解以下的實(shí)施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)?！蓖ㄟ^(guò)一個(gè)在前的小寫p和/或跟隨幾個(gè)大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質(zhì)?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎(chǔ)上公眾可得到，或者可以根據(jù)已公開(kāi)的方法從可得到的質(zhì)粒中構(gòu)建出來(lái)。此外，對(duì)于與那些所述等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
DNA的“消化”是指用一種僅對(duì)DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過(guò)商業(yè)途徑得到，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其它使用要求對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質(zhì)?；駾NA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，通常在一個(gè)更大的體積內(nèi)用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對(duì)具體的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下約1小時(shí)的溫育時(shí)間，但是該時(shí)間可以根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)者的指示而變化。在消化后，反應(yīng)混合物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行裂解片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過(guò)化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個(gè)磷酸時(shí)，該寡核苷酸將不會(huì)連接到另一個(gè)寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)來(lái)實(shí)現(xiàn)連接。
除非另有說(shuō)明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1細(xì)菌表達(dá)和純化可溶性形式的TGFα-HI利用PCR寡核苷酸引物起始擴(kuò)增編碼TGFα-HI的DNA序列(ATCC#75698)，所說(shuō)的引物相當(dāng)于加工過(guò)的TGFα-HI蛋白質(zhì)的5’序列(減去信號(hào)肽序列)和TGFα-HI基因3’的載體序列。將相應(yīng)于TGFα-HI的附加核苷酸分別加入到5’和3’序列中。所說(shuō)的5’寡核苷酸引物具有序列5’CCCGGATCCGCACGAGACATACCTTGTCCG3’(SEQ ID NO3)，此引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(粗體)，接著由加工過(guò)的蛋白質(zhì)密碼子的假定的末端氨基酸開(kāi)始的TGFα-HI編碼序列的21個(gè)核苷酸。所說(shuō)的3’序列5’GGGAAGCTTTTAATACTGAAATCGTACAGGAC 3’(SEQ ID NO4)包含和Hind III位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，并接著TGFα-HI的23個(gè)核苷酸。所說(shuō)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用BamHI和HindIII消化pQE-9。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9中并將其插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記和RBS之序列的框架中。然后通過(guò)Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI阻遏物同時(shí)賦予卡那霉素抗性(Kanr’)。通過(guò)轉(zhuǎn)化體在LB平板上的生長(zhǎng)能力鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。通過(guò)限制分析分離并確認(rèn)質(zhì)粒DNA。將含有所需構(gòu)建體的菌落在補(bǔ)充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜(O/N)生長(zhǎng)。將O/N培養(yǎng)物以1∶100至1∶250的比率用于接種大體積培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)時(shí)。加入IPTG(異丙基-B-D-thiogalacto吡喃糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過(guò)失活lacI阻遏物，清除P/O，導(dǎo)致增加基因表達(dá)。將細(xì)胞再培養(yǎng)3至4小時(shí)。通過(guò)離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解在6M鹽酸胍離液劑中。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在鎳-螯合物柱中通過(guò)層析從溶液中純化溶解的TGFα-HI(Hochuli，E.等，色譜法雜志411177-184(1984))。將TGFα-HI(85％純度)以6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫下來(lái)，為了復(fù)性，調(diào)至3M鹽酸胍、100mM磷酸鹽鈉、10mM谷胱甘肽(還原型)、2mM谷胱甘肽(氧化型)。在溶液中溫育12小時(shí)后，將蛋白質(zhì)對(duì)10mM磷酸鈉透析。
實(shí)施例2利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)可溶性TGFα-HI利用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼TGFα-HI蛋白質(zhì)的DNA序列(ATCC#75698)，所說(shuō)引物相應(yīng)于表達(dá)圖1的第一個(gè)氨基酸至活性區(qū)的最后一個(gè)氨基酸的基因的5’和3’序列使用了三套引物第一套引物是5’CGCGGATCCGCCATCATGGGCGCCGCAGCCGC 3’(SEQ ID NO5)和5’GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC 3’(SEQ ID NO6)；第二套引物是5’CGCGGATCCAGTTTATATTGGAAACCACATGCC 3’(SEQ ID NO7)和5’GCGTCTAGACTAATAGAGAATACTAAAGTC 3’(SEQ D NO8)；這些引物用于表達(dá)推定的活性(可溶性)區(qū)。
所有5’引物都具有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(粗體)，接著類似真核細(xì)胞有效翻譯起始信號(hào)的核苷酸(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987))(翻譯起始密碼子是“ATG”)。
所說(shuō)的3’引物序列包含限制性核酸內(nèi)切酶XbaI的切割位點(diǎn)，并具有和TGFα-HI基因的3’TGFα可溶性區(qū)互補(bǔ)的核苷酸。用市售試劑盒(“Geneclean，”生物101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增的序列。將所說(shuō)的片段用核酸內(nèi)切酶BarnHI和XbaI消化，并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段命名為F2。
使用載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見(jiàn)下文討論)由桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TGFα-HI蛋白質(zhì)(綜述參見(jiàn)Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的方法手冊(cè)，得克薩斯農(nóng)業(yè)的試驗(yàn)站公報(bào)1555)。這種表達(dá)載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，其后面是限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動(dòng)子同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)。多角體蛋白序列的兩側(cè)是用于細(xì)胞介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列?？梢杂煤芏嗥渌臈U狀病毒載體代替pRG1，所說(shuō)的載體如pAc373、pVL941和pAcIMl(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
用限制酶BamHI和XbaI消化所說(shuō)的質(zhì)粒，然后由本領(lǐng)域已知的方法利用牛腸磷酸酶使質(zhì)粒去磷酸化。然后用市售試劑盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA命名為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說(shuō)的去磷酸化質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞(Stratagene克隆系統(tǒng)，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并利用酶BamHI和XbaI鑒別含有帶TGFα-HI基因的所說(shuō)質(zhì)粒(pBac TGFα-HI)的細(xì)菌。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)所克隆的片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，847413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBacTGFα-HI和1.0μg市售的線性桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBacTGFα-HI在含有50微升無(wú)血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無(wú)菌孔中混合。在添加10微升脂轉(zhuǎn)染試劑和90微升Grace’s培養(yǎng)基后，將混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細(xì)包(ATCC CRL1711)中，所說(shuō)細(xì)胞接種在具有1ml無(wú)血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上。來(lái)回?fù)u動(dòng)平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，添加1微升補(bǔ)充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進(jìn)行噬斑測(cè)定。一點(diǎn)改變是使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍(lán)的噬斑。(“噬斑測(cè)定”的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南9-10頁(yè)中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍(lán)的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。經(jīng)簡(jiǎn)短離心除去瓊脂，將含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
使Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在感染復(fù)數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-TGFα-HI感染細(xì)胞。6小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用SF900II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時(shí)后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經(jīng)離心收獲之前，將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)16小時(shí)，標(biāo)記蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實(shí)施例3在COS細(xì)胞中表達(dá)重組TGFα-HI質(zhì)粒TGFα-HIHA的表達(dá)來(lái)源于載體pcDNA3/Amp(Invitrogen)，其包含1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼完整的TGFα-HI前體的DNA片段和在讀框中融合進(jìn)3’末端的HA標(biāo)記克隆到所說(shuō)的載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子控制之下。HA標(biāo)記相應(yīng)于來(lái)自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(guò)(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，細(xì)胞37767，(1984))。HA和靶細(xì)胞蛋白的融合，使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易測(cè)定重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下用兩種引物在克隆的原始的EST上通過(guò)PCR方法構(gòu)建編碼TGFα-HI的DNA序列(ATCC#75698)，所說(shuō)的引物是5’引物5’CGCGGATCCGCCATCATGGTGCTGTGGGAGTCC 3’(SEQ IDNO12)，包含BamHI位點(diǎn)(粗體)，之后是由起始密碼子開(kāi)始的TGFα-HI編碼序列的18個(gè)核苷酸；3’引物5’GCGCTCGAGGTATAGAACACTGTAGTCC 3’(SEQ ID NO13)，包含互補(bǔ)于XhoI位點(diǎn)、TGFα區(qū)的最后19個(gè)核苷酸和XhoI位點(diǎn)的序列。pcDNA3/Amp載體包含BamHI/XhoI克隆位點(diǎn)，此位點(diǎn)可將PCR插入片段帶入后接終止密碼子的3’HA標(biāo)記讀框中。因此，PCR產(chǎn)物包含BamHI位點(diǎn)，936個(gè)堿基對(duì)編碼序列和XhoI位點(diǎn)。用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNA3/Amp并連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(可從Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA 92037得到)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組TGFα-HI，通過(guò)DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1989))。通過(guò)放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)TGFα-HIHA蛋白質(zhì)的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用15S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基并用去垢劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))裂解細(xì)胞。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)物培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質(zhì)沉淀。
實(shí)施例4經(jīng)由基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞是通過(guò)皮膚活組織檢查從一個(gè)研究對(duì)象中得到的。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基上并且分割成小塊。將小的組織塊放置在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，其中每個(gè)瓶中放置約10塊組織。將瓶顛倒放置，蓋緊并于室溫下保留過(guò)夜。在室溫下過(guò)24小時(shí)后反轉(zhuǎn)瓶，組織塊固定在瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如含有10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基)，然后于37℃下溫育大約1周。這時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞。該單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁側(cè)有Moloney鼠肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來(lái)用牛腸磷酸酶進(jìn)行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對(duì)應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，3’引物含有一個(gè)Hind III位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴(kuò)增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在適于兩個(gè)片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后為了證實(shí)該載體具有插入正確的感興趣的基因而將細(xì)菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂上。
將兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包裝細(xì)胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的組織培養(yǎng)板上進(jìn)行培育，直至達(dá)到匯合密度。然后將含有基因的MSV載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞隨即生產(chǎn)含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現(xiàn)在包裝細(xì)胞被稱作生產(chǎn)細(xì)胞)。
向轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來(lái)從一個(gè)鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過(guò)濾器過(guò)濾以除去脫附(detached)的生產(chǎn)細(xì)胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來(lái)自于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基并代之以新鮮的培養(yǎng)基。如果該病毒的滴度高的話，那么實(shí)質(zhì)上所有的成纖維細(xì)胞均被感染并且無(wú)需選擇。如果滴度非常低，那么就需要采用一個(gè)具有如neo或his這樣的可選擇性標(biāo)記物的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射入宿主，它或單獨(dú)注射或在一個(gè)cytodex 3微載體珠上已培育至鋪滿之后再注射。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化都是可能的，因此在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以另外的方式實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人MEISSNER，ET AL.
(ii)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子αHI(iii)序列數(shù)8個(gè)(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/468,846(B)申請(qǐng)日1995.6.6(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號(hào)36,134(C)卷號(hào)/文檔號(hào)325800-465(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1565個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGGGCGCGCG GCTGGATGCC CCCGGCCTGC GGCTCCCTGC GCTTCCCGCC GTGGAGGGGC60ACCAGTCATG GGCGCCGCAG CCGCTGAGGC GCCGCTCCGG CTGCCTGCCG CGCCTCCGCT 120CGCCTTCTGC TGCTACACGT CGGTGCTTCT GCTCTTCGCC TTCTCTCTGC CCGGGAGCCC 180CGCGTCCAAC CAGCCCCCGG GTGGTGGCGG CGGCAGCGGC GGGGACTGTC CCGGCGGCAA 240AGGCAAGAGC ATCAACTGCT CAGAATTAAA TGTGAGGGAG TCTGACGTAA GAGTTTGTGA 300TGAGTCATCA TGTAAATATG GAGGAGTCTG TAAAGAAGAT GGAGATGGTT TGAAATGTGC 360ATGCCAATTT CAGTGCCATA CAAATTATAT TCCTGTCTGT GGATCAAATG GGGACACTTA 420TCAAAATGAA TGCTTTCTCA GAAGGGCTGC TTGTAAGCAC CAGAAAGAGA TAACAGTAAT 480AGCAAGAGGA CCATGCTACT CTGATAATGG ATCTGGATCT GGAGAAGGAG AAGAGGAAGG 540GTCAGGGGCA GAAGTTCACA GAAAACACTC CAAGTGTGGA CCCTGCAAAT ATAAAGCTGA 600GTGTGATGAA GATGCAGAAA ATGTTGGGTG TGTATGTAAT ATAGATTGCA GTGGATACAG 660TTTTAATCCT GTGTGTGCTT CTGATGGGAG TTCCTATAAC AATCCCTGTT TTCTTCGAGA 720AGCATCTTGT ATAAAGCAAG AACAAATTGA TATAAGGCAT CTTGGTCATT GCACAGATAC 780AGATGACACT AGTTTGTTGG GAAAGAAAGA TGATGGACTA CAATATCGAC CAGATGTGAA 840AGATGCTAGT GATCAAAGAG AAGATGTTTA TATTGGAAAC CACATGCCTT GCCCTGAAAA 900CCTCAATGGT TACTGCATCC ATGGAAAATG TGAATTCATA TATTCTACTC AGAAGGCTTC 960TTGTAGATGT GAATCTGGCT ACACTGGACA GCACTGTGAA AAGACAGACT TTAGTATTCT 1020CTATGTAGTG CCAAGTAGGC AAAAGCTCAC TCATGTTCTT ATTGCAGCAA TTATTGGAGC 1080TGTACAGATT GCCATCATAG TAGCAATTGT AATGTGCATA ACAAGAAAAT GCCCCAAAAA 1140CAATAGAGGA CGTCGACAGA AGCAAAACCT AGGTCATTTT ACTTCAGATA CGTCATCCAG 1200AATGGTTTAA ACTGATGACT TTTATATGTA CACTGACCAT GTGATGTACA TTTATTATGT 1260CTTTTTTTAA AGAATGGAAA TATTTATTTC AGAGGCCTTA TTTTTGGACA TTTTTAGTGT 1320AGTACTGTTG GCTCGTATTT AGAATATTCA GCTACGACAG TTTTGGACTG TTTAGTAGTC 1380TTTGTTTTAT GTTTTTAAAT ACAGAAATTG CTTTCACAAA TTTGTACCAC ATGGTAATTC 1440TAAGACTTGT TCTTTACCCA TGGAATGTAA TATTTTTGCA AAGATGGACT ACTTCACAAA 1500TGGTTATAAA GTCATATCCA CTTCTTCCAC AATGACCACA GCAAATGACC AAGCATGAAC 1560TAAAG 1565(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度380個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gly Ala Ala Ala Ala Glu Ala Pro Leu Arg Leu Pro Ala Ala-35 -30 -25Pro Pro Leu Ala Phe Cys Cys Tyr Thr Ser Val Leu Leu Leu Phe-20 -15 -10Ala Phe Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ala Ser Asn Gln Pro Pro Gly-5 1 5Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Cys Pro Gly Gly Lys Gly Lys10 15 20Ser Ile Asn Cys Ser Glu Leu Asn Val Arg Glu Ser Asp Val Arg25 30 35Val Cys Asp Glu Ser Ser Cys Lys Tyr Gly Gly Val Cys Lys Glu40 45 50Asp Gly Asp Gly Leu Lys Cys Ala Cys Gln Phe Gln Cys His Thr55 60 65Asn Tyr Ile Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Gln Asn70 75 80Glu Cys Phe Leu Arg Arg Ala Ala Cys Lys His Gln Lys Glu Ile85 90 95Thr Val Ile Ala Arg Gly Pro Cys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Ser Gly Ala Glu Val His Arg115 120 125Lys His Ser Lys Cys Gly Pro Cys Lys Tyr Lys Ala Glu Cys Asp130 135 140Glu Asp Ala Glu Asn Val Gly Cys Val Cys Asn Ile Asp Cys Ser145 150 155Gly Tyr Ser Phe Asn Pro Val Cys Ala Ser Asp Gly Ser Ser Tyr160 165 170Asn Asn Pro Cys Phe Val Arg Glu Ala Ser Cys Ile Lys Gln Glu175 180 185Gln Ile Asp Ile Arg His Leu Gly His Cys Thr Asp Thr Asp Asp190 195 200Thr Ser Leu Leu Gly Lys Lys Asp Asp Gly Leu Gln Tyr Arg Pro205 210 215Asp Val Lys Asp Ala Ser Asp Gln Arg Glu Asp Val Tyr Ile Gly220 225 230Asn His Met Pro Cys Pro Glu Asn Leu Asn Gly Tyr Cys Ile His235 240 245Gly Lys Cys Glu Phe Ile Tyr Ser Thr Gln Lys Ala Ser Cys Arg250 255 260Cys Glu Ser Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Thr Asp Phe265 270 275Ser Ile Leu Tyr Val Val Pro Ser Arg Gln Lys Leu Thr His Val280 285 290Leu Ile Ala Ala Ile Ile Gly Ala Val Gln Ile Ala Ile Ile Val295 300 305Ala Ile Val Met Cys Ile Thr Arg Lys Cys Pro Lys Asn Ash Arg310 315 320Gly Arg Arg Gln Lys Gln Ash Leu Gly His Phe Thr Ser Asp Thr325 330 335Ser Ser Arg Met Val340(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCGGATCCG CACGAGACAT ACCTTGTCCG 30(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GGGAAGCTTT TAATACTGAA ATCGTACAGG AC 32(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CGCGGATCCG CCATCATGGG CGCCGCAGCC GC 32(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGCGGATCCA GTTTATATTG GAAACCACAT GCC33(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GCGTCTAGAC TAATAGAGAA TACTAAAGTC 30
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括選自由如下一組的成員(a)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如圖1所示的多肽；(b)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼包含圖1的1至380位氨基酸的多肽；(c)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼包含圖1的1至316位氨基酸的多肽；(d)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼包含圖1的267至316位氨基酸的多肽；(e)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼包含圖1的40至316位氨基酸的多肽；(f)一種多核苷酸，該多核苷酸能夠與(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸雜交，并且和它們具有至少70％的相同性；和(h)一種(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，該多核苷酸編碼包含如圖1所示的267至316位氨基酸的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括選自如下一組的成員(a)一種多核苷酸，該多核苷酸編碼一種成熟多肽，這種多肽具有由包含在ATCC保藏物75698號(hào)中的DNA表達(dá)的氨基酸序列；(b)一種多核苷酸，該多核苷酸能夠與(a)的多核苷酸雜交，并且和這一多核苷酸具有至少70％的相同性。(c)一種(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
5.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
6.一種由權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過(guò)的宿主細(xì)胞。
7.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說(shuō)的DNA編碼的多肽。
8.一種生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求5的載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
9.一種多肽，所說(shuō)多肽包括選自如下一組的成員(a)一種多肽，該多肽具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列；(b)一種多肽，該多肽包含如圖1所示的1至380位氨基酸；(c)一種多肽，該多肽包含如圖1所示的267至316位氨基酸；(d)一種多肽，該多肽包含如圖1所示的40至316位氨基酸；(e)一種多肽，該多肽包含如圖1所示的1至316位氨基酸；(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之多肽的片段、類似物以及衍生物；和(g)一種由ATCC保藏物75698號(hào)cDNA編碼的多肽，及所述多肽的片段、類似物和衍生物。
10.權(quán)利要求9的多肽，該多肽包含圖1的267位氨基酸至316位氨基酸。
11.一種權(quán)利要求9的多肽的抗體。
12.一種抑制權(quán)利要求9的多肽激活的化合物。
13.一種激活權(quán)利要求9的多肽的化合物。
14.一種治療需要TGFα-HI之患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求9的多肽。
15.一種治療需要抑制TGFα-HI之患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求12的化合物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的治療有效量的多肽是通過(guò)對(duì)患者提供編碼所說(shuō)多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)的多肽來(lái)施用的。
17.一種鑒定作為權(quán)利要求9的多肽的激動(dòng)劑有活性的化合物的方法，該方法包括使包含表達(dá)TGFα-HI受體的細(xì)胞類型的反應(yīng)混合物與待篩選的化合物接觸；和確定此化合物是否從所說(shuō)的受體產(chǎn)生信號(hào)，以便鑒定此化合物是否是有效的激動(dòng)劑。
18.一種鑒定作為權(quán)利要求9的多肽的拮抗劑有活性的化合物的方法，該方法包括使包含表達(dá)TGFα-HI受體的細(xì)胞類型的反應(yīng)混合物與待篩選的化合物接觸；和在和所說(shuō)的化合物結(jié)合后，確定是否不存在由所說(shuō)的受體產(chǎn)生的信號(hào)，以便鑒定此化合物是否是有效的拮抗劑。
19.一種診斷疾病或疾病的易感性的方法，該方法包括測(cè)定權(quán)利要求1的多核苷酸中的突變。
20.一種診斷方法，該方法包括分析來(lái)源于宿主細(xì)胞的樣品中是否存在權(quán)利要求9的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子αHI多肽和編碼這種多肽的多核苷酸。本發(fā)明也提供了通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法和這種多肽在治療方面的用途,這些治療包括刺激創(chuàng)傷愈合、治療神經(jīng)紊亂、治療視覺(jué)障礙、治療腎和肝臟機(jī)能障礙和刺激胚胎發(fā)生及血管形成。本發(fā)明也公開(kāi)了抗這種多肽的拮抗劑和其作為治療劑在治療瘤形成疾病上的用途。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)本發(fā)明多肽的改變的水平和編碼本發(fā)明多肽之核酸序列中的突變的診斷測(cè)定方法。
文檔編號(hào)C12R1/19GK1186515SQ96194461
公開(kāi)日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者保羅·S·邁斯納, 麗貝卡·A·富德納, 衛(wèi)穎飛, 馬克·D·亞當(dāng)斯 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司