專利名稱：編碼人乳頭瘤病毒11型l1蛋白的合成的hpv6/11雜交l1dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼純化的人乳頭瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。
附圖簡述

圖1圖解用合成寡核苷酸構(gòu)建HPV6/11雜交L1基因。
圖2顯示HPV6/11雜交體、發(fā)表的HPV6a和發(fā)表的HPV11 L1基因的核苷酸序列。
圖3顯示用于表達乳頭瘤病毒L1外殼蛋白的雙向酵母表達載體pGAL1-10。
圖4是酵母中HPV11 L1mRNA的Northern分析。
圖5顯示通過Western分析(免疫印跡)酵母中HPV11 L1蛋白的表達。
圖6顯示與HPV6/11雜交DNA相比，表達自野生型(wt)HPV11的HPV11L1 VLPs的ELISA反應(yīng)性。
圖7為在酵母中表達的HPV11L1 VLPs的電子顯微鏡圖片。
圖8顯示HPV6/11雜交基因的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
乳頭瘤病毒(PV)感染發(fā)生于多種動物，包括人、羊、狗、貓、兔、猴、蛇和牛。乳頭瘤病毒感染上皮細胞，通常在感染位點誘導(dǎo)良性上皮或纖維上皮瘤。PV為物種特異性感染物；人的乳頭瘤病毒不能感染非人類動物。
依據(jù)它們感染的宿主乳頭瘤病毒可分為不同的組。依據(jù)DNA序列同源性人乳頭瘤病毒(HPV)進一步分成70多個型。PV型似乎為型-特異性免疫原，因為對一型乳頭瘤病毒感染的中和免疫性沒有賦予對另一型乳頭瘤病毒的免疫性。
在人類，不同HPV型導(dǎo)致特征性的疾病。HPV1，2，3，4，7，10型和26-29型在正常和免疫受損(immunocompromised)個體中導(dǎo)致良性疣。HPV5，8，9，12，14，15，17，19-25，36型和46-50型在免疫折衷個體中導(dǎo)致扁平損傷。HPV6，11，34，39，41-44型和51-55型導(dǎo)致生殖或呼吸粘膜的非惡性濕疣。HPV16，18，31，33，35，45和58型導(dǎo)致生殖粘膜上皮發(fā)育不良并且與大多數(shù)子宮頸、陰道、外陰及肛道的原位和侵襲癌有關(guān)。
乳頭瘤病毒為小的(50-60nm)、沒有包被的二十面體DNA病毒，編碼達8個早期基因和兩個晚期基因。病毒基因組的開放閱讀框(ORFs)命名為E1至E8和L1及L2，其中“E”表示早期且“L”表示晚期。L1和L2編碼病毒外殼蛋白。早期(E)基因與如病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細胞轉(zhuǎn)化等功能有關(guān)。
L1蛋白是主要的外殼蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白為次要的外殼蛋白，預(yù)期分子量為55-60kDa且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測其表觀分子量為75-100kDa。免疫數(shù)據(jù)表明大多數(shù)L2蛋白位于病毒殼粒中的L1蛋白內(nèi)部。L1ORF在不同乳頭瘤病毒中高度保守。L2蛋白在不同乳頭瘤病毒中較少保守。
L1和L2基因被鑒定為免疫預(yù)防的良好目標。一些早期基因也被證明成為疫苗開發(fā)的潛在目標。在美洲產(chǎn)白尾棕色兔乳頭瘤病毒(CRPV)和牛乳頭瘤病毒(BPV)系統(tǒng)中研究顯示以重組L1和/或L2蛋白(在細菌中或通過疫苗載體制備)的免疫保護動物免受病毒感染。乳頭瘤病毒L1基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)或用疫苗載體的表達得到病毒樣顆粒(VLP)的裝配，VLP用于誘導(dǎo)與保護免受病毒攻擊有關(guān)的高滴度的中和病毒抗體反應(yīng)。此外，L1和L2基因用于產(chǎn)生防止和治療動物中乳頭瘤病毒感染的疫苗。
含有L1蛋白，L1+L2蛋白，或修飾的L1或L1+L2蛋白的預(yù)防和治療PV感染和疾病的疫苗的開發(fā)和商業(yè)化由于缺乏大量的純化病毒和純化蛋白而被延遲。因為PV在體外不易培養(yǎng)，所以通過PV的體外繁殖制備所需量的L1和L2蛋白是困難的。由此產(chǎn)生的供給問題使對PV和PV蛋白的特征描述變得困難。因而，開發(fā)一種粗PV蛋白，尤其PVL1和L2蛋白或修飾的L1和L2蛋白的可容易更新來源將是有用的。開發(fā)純化大量粗乳頭瘤病毒蛋白至適于免疫研究和疫苗開發(fā)純度水平的方法也將是有用的。制備大量具有天然蛋白免疫性-賦予特性，如天然蛋白構(gòu)型的乳頭瘤病毒蛋白也將是有用的。此外，開發(fā)分析PV蛋白的方法和測定該蛋白以及含該蛋白組合物相對純度的方法將是有用的。這種高度純化的蛋白在用于PV感染研究中各種試劑的制備中也將是有用的，這種試劑包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，和分析標準物。
HPV6和11是～90％良性生殖疣的原因所在且只很少與惡性生長有關(guān)(Gissmann等.，1983，美國國家科學(xué)院院報80，560-563)。HPV6a被認為是尖銳濕疣中最豐富的HPV6亞型(Brown，D.B.，等，臨床微生物學(xué)雜志，311667-1673)。生殖疣求醫(yī)(尖銳濕疣或平頭濕疣)在近年來呈上升趨勢。據(jù)估計～10％的普通人群(年齡15-49)具有生殖道HPV感染(Koutsky等，1988，流行病學(xué)綜述，10，122-163)。雖然大多數(shù)濕疣與HPV6有關(guān)，但在喉部乳頭瘤病的情況，HPV11是優(yōu)勢型。在呼吸道上皮細胞中HPV11的復(fù)制刺激了這些細胞的增殖，從而導(dǎo)致次要臨床相關(guān)性的分離損傷或多重擴散性損傷及復(fù)發(fā)病。復(fù)發(fā)的呼吸乳頭瘤病，一種更常折磨青少年人群的疾病，由于導(dǎo)致呼吸道的阻塞會成為威脅生命的疾病。最近，開發(fā)出一種允許感染性HPV11復(fù)制的動物模型(Kreider等，1985，自然317，639-640；Kreider等，1987，病毒學(xué)雜志，61，590-593)。該模型使用單克隆抗體對天然病毒顆粒和桿狀病毒表達的VLPs上構(gòu)型中和表位的鑒定成為可能(Christensen等1990，病毒學(xué)雜志，64，5678-5681；Christensen和Kreider 1991，病毒研究，21，169-179；Christensen和Kreider 1993，病毒研究，28，195-202；Christensen等1994，75，2271-2276)。
含有HPV11 L1蛋白的病毒樣顆粒既在昆蟲細胞系統(tǒng)又在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達。VLPs在酵母細胞中的表達具有價廉并易于在發(fā)酵罐中大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)勢。然而，HPV11 L1蛋白在酵母中表達水平低。經(jīng)觀察此現(xiàn)象是HPV11 L1mRNA截短的結(jié)果。相反，HPV6 L1基因轉(zhuǎn)錄為全長mRNA并高水平表達。通過修改HPV6 L1 DNA以編碼HPV11L1蛋白，促進全長mRNA的轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致HPV11 L1蛋白表達水平的升高是可能的。本發(fā)明提供了HPV6/11雜交L1基因序列以及用合成寡核苷酸構(gòu)建HPV6/11雜交L1基因的方法。雜交基因根據(jù)HPV6a L1序列(Hofmann，K.J.，等.，1995，病毒學(xué)，用于發(fā)表而被接受)而設(shè)計但含有最少數(shù)目對編碼HPV11 L1蛋白所必需的堿基變換。與野生型HPV11 L1基因不同的是，HPV6/11雜交基因不含有酵母識別的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄終止信號；由于產(chǎn)生的是得到的全長HPV6/11mRNA并且HPV11 L1蛋白的表達增加。
本發(fā)明是關(guān)于高度純化的PVL1蛋白。本發(fā)明也包括制備和純化具有天然乳頭瘤病毒蛋白免疫-賦予特性的重組乳頭瘤病毒蛋白的方法。本發(fā)明是關(guān)于用于乳頭瘤病毒感染的預(yù)防和治療疫苗的制備。電鏡圖片和結(jié)合構(gòu)型抗體證實本發(fā)明的重組蛋白能夠形成病毒樣顆粒。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼純化的人乳頭瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及編碼純化的人乳頭瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。本發(fā)明的各種實施方案包括但不限于重組HPVDNA分子，互補于重組HPV DNA分子的RNA，由重組DNA分子編碼的蛋白，抗重組DNA分子和有關(guān)蛋白的抗體，包括DNA，RNA，蛋白或抗體的組合物，使用DNA，RNA，蛋白或抗體以及其衍生物的方法。這樣的衍生物包括但不限于由該DNA編碼的肽和蛋白，該DNA的抗體或由該DNA編碼蛋白的抗體，包括該DNA的疫苗或包括由該DNA編碼蛋白的疫苗，包括該DNA或由該DNA編碼蛋白的免疫組合物，含有該DNA或源自該DNA的RNA或由該DNA編碼蛋白的試劑盒。
HPV6和11是～90％良性生殖疣的原因所在并且只很少與惡性生長有關(guān)(Gissmann等.，1983，美國國家科學(xué)院院報80，560-563)。生殖疣(尖銳或扁頭濕疣)門診近年來呈上升趨勢并且據(jù)估計～10％的普通人群(年齡15-49)具有生殖道HPV感染(Koutsky等.1988，流行病學(xué)，綜述，10，122-163)。雖然大多數(shù)濕疣與HPV6有關(guān)，但在喉部乳頭瘤病中，HPV11是優(yōu)勢型。HPV11在呼吸道上皮細胞中的復(fù)制刺激了這些細胞的增殖，從而能導(dǎo)致分離的次要臨床相關(guān)性的損傷或多重擴散損傷及復(fù)發(fā)病。復(fù)發(fā)呼吸乳頭瘤病(papillomatosis)，為一種更常折磨青少年人群的疾病，由于導(dǎo)致呼吸道的阻塞可成為威脅生命的疾病。最近，開發(fā)出一種允許感染性HPV11復(fù)制的動物模型(Kreider等，1895，自然317，639-640；Kreider等，1987，病毒學(xué)雜志，61，590-593)。該模型使用單克隆抗體鑒定天然病毒顆?；驐U狀病毒表達的VLPs上的構(gòu)型中和表位成為可能(Christensen等.1990，病毒學(xué)雜志64，5678-5681；Christensen和Kreider 1991，病毒研究，21，169-179；Christensen和Kreider1993，病毒研究，28，195-202；Christensen等.1994，75，2271-2276)。
含有L1蛋白，L1+L2蛋白，或修飾的L1或L1+L2蛋白用于PV感染和疾病的預(yù)防和治療疫苗的開發(fā)和商業(yè)化由于缺少大量純化病毒及純化蛋白而被延遲。因為PV不易在體外培養(yǎng)，所以通過PV的體外繁殖制備所需量的L1和L2蛋白是困難的。與PV體外培養(yǎng)有關(guān)的困難也導(dǎo)致對PV及PV蛋白化學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)特征描述的困難。因此，開發(fā)一種粗PV蛋白，尤其PV L1和L2蛋白或修飾的L1和L2蛋白的易可更新來源將是有用的。開發(fā)純化大量粗乳頭瘤病毒蛋白至適于免疫研究和疫苗開發(fā)純度水平的方法也將是有用的。制備大量具有天然蛋白免疫性-賦予特性，如天然蛋白構(gòu)型的乳頭瘤病毒蛋白也將是有用的。此外，開發(fā)分析PV蛋白的方法和測定該蛋白以及含該蛋白組合物相對純度的方法將是有用的。這種高度純化的蛋白在用于PV感染研究中各種試劑的制備中也將是有用的；這種試劑包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，和分析標準物。
含有HPV11 L1蛋白的病毒樣顆粒既在昆蟲細胞系統(tǒng)又在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達。VLPs在酵母細胞中的表達具有價廉且易在發(fā)酵罐中大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)勢。然而，HPV11 L1蛋白在酵母細胞中以低水平表達。經(jīng)觀察此現(xiàn)象是HPV11 L1mRNA截短的結(jié)果。相反，HPV6 L1基因轉(zhuǎn)錄成全長mRNA并高水平表達。通過修改HPV6L1 DNA以編碼HPV11 L1蛋白，促進全長mRNA的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致HPV11 L1蛋白表達的增加是可能的。本發(fā)明提供了HPV6/11雜交L1基因以及用合成寡核苷酸構(gòu)建HPV6/11雜交L1基因的方法。雜交基因根據(jù)HPV6a L1序列設(shè)計但含有最少數(shù)目的對編碼HPV11 L1蛋白所必需的堿基變換。與野生型HPV11 L1基因不同的是，HPV6/11雜交基因不含有酵母識別的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄終止信號，導(dǎo)致更高水平的mRNA且因而增加HPV11 L1蛋白的表達。
包括該DNA或由該DNA編碼蛋白的藥用組合物可按照已知的方法如通過混合藥學(xué)上可接受的載體而制備。這種載體及配制方法的實例可在《Remington’s藥物科學(xué)》中找到。為了形成適于有效施用的藥學(xué)上可接受的組合物，這種組合物將含有有效量的該蛋白或VLP。這種組合物可以含有源自不止一種的HPV的蛋白或VLP。
本發(fā)明的治療或診斷組合物以足以治療或診斷PV感染的量施用于個體。該有效量可根據(jù)各種因素如個體狀況、體重、性別和年齡而改變。一般地，組合物將以約1mcg至約1mg的劑量施用。
藥物組合物可通過各種途徑如皮下、局部、口腔、粘膜、靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)提供給個體。
本發(fā)明的疫苗包括DNA、RNA或由該DNA編碼的含有對誘導(dǎo)宿主中中和抗體形成所必需的抗原決定簇的蛋白。這種疫苗也足夠安全地施用而沒有臨床感染的危險；不具有毒副作用；可通過有效途徑施用；穩(wěn)定；并與疫苗載體相容。
疫苗可通過各種途徑，如口腔，腸道外，皮下，粘膜，靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用。施用的劑量可依據(jù)個體的狀態(tài)、性別、體重，和年齡；施用途徑；和疫苗的PV型而改變。疫苗可以如膠囊、懸浮劑、酏劑、或液體溶液的劑量形式使用。疫苗可與免疫學(xué)上可接受的載體混合。
疫苗以治療上有效的量施用，即，以足以產(chǎn)生免疫學(xué)上保護反應(yīng)的量。治療上有效的量可根據(jù)PV型而改變。疫苗可以單劑量或多劑量施用。
本發(fā)明的純化蛋白可用于免疫原性組合物的制劑中。這種制劑，當(dāng)導(dǎo)入合適的宿主，能在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的純化蛋白或其衍生物可用于產(chǎn)生抗體。這里使用的術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體，以及例如能結(jié)合抗原或半抗原的Fv、Fab及F(ab)2片段的片段。
本發(fā)明的蛋白和蛋白衍生物可用于血清型HPV感染及HPV篩選。純化的蛋白、VLP和抗體使它們形成適于對HPV檢測和血清型鑒定的試劑盒。這種試劑盒將包括適于以密閉方式容納至少一個容器的分隔承載體。載體可進一步包括試劑如L1或L2蛋白或源自重組HPV6/11或其它重組HPV型DNA分子的VLPs或抗這些蛋白的抗體。載體也可含有檢測的手段如標記抗原或酶底物等。
純化的蛋白也可用作免疫學(xué)標準物、分子量標記及分子大小標記。
已知在編碼特異氨基酸的各種密碼子中存在基本量的豐余。因此，本發(fā)明也涉及含有其它密碼子的那些DNA序列，這些密碼子編碼最終翻譯的相同氨基酸。為了本說明的目的，具有一個或更多個替代密碼子的序列將被定義為簡并變異。DNA序列的突變或基本不改變表達蛋白最終物理特性的翻譯蛋白的突變也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，以纈氨酸代替亮氨酸，精氨酸代替賴氨酸，或天冬氨酸代替谷氨酸不會導(dǎo)致該多肽功能性的改變。
已知編碼肽的DNA序列可被改變成編碼具有不同于天然產(chǎn)生肽特性的肽。改變DNA序列的方法包括，但不限于定點誘變。
正如這里所使用的，HPV6/11雜交基因的“功能衍生物”是具有與HPV6/11生物活性基本類似的生物活性(或功能或結(jié)構(gòu))的化合物。術(shù)語“功能衍生物”意在包括HPV6/11的“片段”，“變異體”，“簡并變異體”，“類似物”和“同源物”或指其“化學(xué)衍生物”。
術(shù)語“類似物”指在功能上或者與整個HPV6/11分子或者與其片段基本類似的分子。
通過這里所述的方法獲得的克隆HPV6/11DNA或其片段可通過分子克隆入含有適當(dāng)啟動子和其它合適轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達載體，并轉(zhuǎn)化入原核或真核宿主細胞以制備出重組HPV11而重組表達。這種操作技術(shù)在Sambrook，J.，等，見上文，中有詳盡描述，并在本領(lǐng)域中為已知的。
表達載體這里定義為對在適當(dāng)宿主中克隆的拷貝基因轉(zhuǎn)錄和它們的mRNAs翻譯所需的DNA序列。這種載體可用于在各種宿主如細菌、藍綠藻、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和動物細胞中表達真核基因。特異設(shè)計的載體允許DNA在宿主之間，如細菌-酵母或細菌-動物細胞或細菌-真菌細胞或細菌-無脊椎細胞之間穿梭。一個適當(dāng)構(gòu)建的表達載體應(yīng)該含有用于宿主細胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點，可選擇標記，有限數(shù)目的有用限制酶位點，高拷貝數(shù)能力，和活動的啟動子。啟動子定義為引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合到DNA上并起始RNA合成的DNA序列。強啟動子是使mRNAs高頻起始的啟動子。表達載體可包括但不限于，克隆載體，修飾的克隆載體，特異設(shè)計的質(zhì)?；虿《?。
多種哺乳動物表達載體可用于在哺乳動物細胞中表達HPV6/11 DNA或其片段?？蛇m于重組HPV6/11DNA表達的商業(yè)上可得到的哺乳動物表達載體包括但不限于，pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)pBPV1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRS-Vgpt(ATCC 37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，和λZD35(ATCC 37565)。
多種細菌表達載體可用于在細菌細胞中表達HPV6/11 DNA或其片段?？蛇m于重組HPV6/11 DNA表達的商業(yè)上可得到的細菌表達載體包括，但不限于pET11a(Novagen)，λgt11(Invitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(發(fā)瑪西亞)。
多種真菌細胞表達載體可用于在真菌細胞中表達HPV6/11或其片段?？蛇m用于重組HPV6/11 DNA表達的商業(yè)上可得到的真菌細胞表達載體包括但不限于pYES2(Invitrogen)，畢赤酵母屬表達載體(Invitrogen)和漢遜酵母屬表達載體(Rhein Biotech，Dusseldorf，Germany)。
多種昆蟲細胞表達載體可用于在昆蟲細胞中表達HPV6/11DNA或其片段。可適用于HPV6/11 DNA重組表達的商業(yè)上可得到的昆蟲細胞表達載體包括但不限于pBlue Bac III(Invitrogen)。
含有HPV6/11 DNA或其片段的表達載體可用于HPV11蛋白或HPV11蛋白片段在細胞、組織、器官、或動物中的表達。這里使用的動物包括人類。宿主細胞可以是原核或真核的，包括但不限于細菌如大腸桿菌，真菌細胞如酵母，哺乳動物細胞包括但不限于人、牛、豬、猴和嚙齒來源的細胞系，和昆蟲細胞包括但不限于果蠅和蠶來源的細胞系。商業(yè)上可得到的可適用的源自哺乳動物的細胞系包括但不限于L細胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L細胞L-M(ATCC CCL1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL86)，CV-1(ATCC CCL70)，COS-1(ATCC CRL1650)，COS-7(ATCC CRL1651)，CHO-K1(ATCCCCL61)，3T3(ATCC CCL92)，NIH/3T3(ATCC CRL1658)，HeLa(ATCC CCL2)，C127I(ATCC CRL1616)，BS-C-1(ATCC CCL26)和MRC-5(ATCC CCL171)。
表達載體可通過許多技術(shù)中的任何一個導(dǎo)入宿主細胞，包括但不限于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)，原生質(zhì)融合和電穿孔。含表達載體的細胞被克隆式擴增并單獨分析以測定其是否產(chǎn)生HPV11蛋白。HPV11表達宿主細胞克隆的鑒定可通過幾種途徑完成，包括但不限于與抗-HPV11抗體的免疫反應(yīng)。
HPV DNA片段的表達也可用體外制備的合成mRNA或天然mRNA而完成。合成mRNA或分離自表達HPV6/11雜交DNA細胞的mRNA可在各種無細胞系統(tǒng)，包括但不限于小麥精子提取物和網(wǎng)織紅細胞提取物中有效翻譯，以及在細胞基礎(chǔ)的系統(tǒng)，包括但不限于顯微注射進蛙卵母細胞中，優(yōu)選顯微注射進蛙卵母細胞中有效地翻譯。
HPV11蛋白在宿主細胞中表達以后，可回收HPV11蛋白以提供純化形式的HPV11蛋白。幾種HPV11純化方法是可得到并可適用的。如這里所述，重組HPV11蛋白可通過鹽析，離子交換層析、大小排阻層析，羥磷石灰吸附層析和疏水相互作用層析的各種組合或單獨應(yīng)用從細胞裂解液和提取物中得到純化。
此外，重組HPV11蛋白可通過使用以對全長新生HPV11或HPV11的多肽片段特異的單克隆或多克隆抗體制備的免疫吸附柱從其它細胞蛋白中得到分離。單克隆和多克隆抗體可根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這里使用的單克隆或單特異性抗體定義為單個抗體種類或具有對HPV11相同結(jié)合特征的多種抗體種類。這里使用的相同結(jié)合指抗體種類結(jié)合特異抗原或表位的能力。
對本領(lǐng)域的技術(shù)人員很明顯用于制備單特異抗體的方法可用于制備對HPV多肽片段，或全長新生HPV多肽特異的抗體。具體地，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員很明顯可制備對完全功能的HPV蛋白或其片段特異的單特異抗體。
本發(fā)明也涉及用于篩選調(diào)節(jié)編碼HPV的DNA或RNA表達以及體內(nèi)HPV11蛋白功能的化合物的方法。調(diào)節(jié)這些活性的化合物可以是DNA，RNA，肽，蛋白，或非-蛋白有機分子。化合物可通過增加或減弱編碼HPV11 DNA或RNA的表達，或HPV11蛋白功能而調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)編碼HPV11 DNA或RNA表達或HPV11蛋白功能的化合物可通過各種分析加以檢測。分析可以是簡單的“是/否”分析以測定是否有表達或功能的改變。分析可通過比較測試樣品表達或功能與標準樣品表達或功能水平而定量。
可制備含有HPV6/11雜交DNA、HPV6/11雜交DNA的片段、HPV6/11 DNA或HPV11蛋白的抗體、HPV6/11雜交RNA或HPV11蛋白的試劑盒。這種試劑盒用于檢測與HPV6/11DNA雜交的DNA或檢測樣品中HPV11蛋白或肽片段的存在。這種特征描述用于多種目的包括但不限于法庭分析和流行病學(xué)研究。
可以合成互補于HPV6/11 DNA序列的核苷酸序列用于反義治療。這些反義分子可以是DNA，DNA的穩(wěn)定衍生物如硫代磷酸酯類或甲基磷酸酯類，RNA，RNA的穩(wěn)定衍生物如2′-O-烷基RNA，或其它HPV6/11反義寡核苷酸類似物。HPV6/11反義分子可通過顯微注射，脂質(zhì)體包裹或通過帶有反義序列載體的表達而導(dǎo)入細胞。HPV6/11反義治療可對其利于降低HPV11活性疾病的治療尤其有用。
術(shù)語“化學(xué)衍生物”描述了含有額外的在正常狀態(tài)下不是基本分子一部分化學(xué)成分的分子。這種成分可以提高基本分子的溶解性、半衰期、吸附性等。或者該成分可減弱基本分子非必要的副作用或降低基本分子的毒性。這種成分的實例在多種教科書，如《Remington’s藥物科學(xué)》中有描述。
根據(jù)這里公開的方法鑒定的化合物可以常規(guī)測試規(guī)定的合適的劑量單獨使用以獲得對HPV11或其活性的最佳抑制同時最大限度地減少可能的毒性。此外，聯(lián)合施用或隨后施用其它藥劑可能是必要的。
優(yōu)先地，本發(fā)明的化合物可以單劑量施用，或總劑量可以分成幾份劑量施用。此外，用于本發(fā)明的化合物可通過各種途徑包括但不限于鼻內(nèi)、經(jīng)皮、通過栓劑、口腔等施用。
對于用一個以上活性劑的聯(lián)合治療，其中的活性劑是分離的劑量形式，活性劑可同時施用，或者它們可以單獨的交錯時間施用。
根據(jù)各種因素選擇使用本發(fā)明化合物的劑量服方，包括病人的類型、種類、年齡、體重、性別和醫(yī)療條件；待治療狀態(tài)的嚴重性；施用途徑；病人的腎臟和肝臟功能；及其使用的特定化合物。一名普通的醫(yī)師可容易地決定并開出對預(yù)防，抵消或抑制病情發(fā)展所需的有效藥量的處方。在產(chǎn)生效應(yīng)而設(shè)有毒性范圍內(nèi)獲得藥物濃度的最佳準確度需要依據(jù)藥物對靶位點利用率動力學(xué)的服方。這包括要考慮藥物的擴散、平衡、和排除。
在本發(fā)明的方法中，這里詳細描述的化合物可形成活性成份，并且可與適當(dāng)?shù)乃幬锵♂寗①x形劑或根據(jù)意施用的形式，即，口服片劑、膠囊、酏劑、糖劑、栓劑、凝膠等適當(dāng)選擇的載體(這里共同指“載體”材料)混合施用，并與傳統(tǒng)藥物實踐相一致。
例如，對于以片劑或膠囊形式的口腔施用，活性藥物成份可與口腔、非毒性藥物上可接受的惰性載體如乙醇、甘油、水等聯(lián)合。此外，當(dāng)必要或必需，也可向混合物中加入適當(dāng)?shù)恼澈蟿?、滑潤劑、崩解劑和著色劑。適當(dāng)?shù)恼澈蟿┌ǖ幌抻?，淀粉，明膠，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，谷物增甜劑，天然及合成樹膠如金合歡樹膠、黃蓍膠、藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟等。這些劑量形式中使用的滑潤劑包括，但不限于油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，醋酯鈉，氯化鈉等。崩解劑包括，但不限于淀粉，甲基纖維素，瓊脂，斑脫土，黃蓍膠，樹膠等。
對于液體形式活性藥物成份可在適當(dāng)調(diào)制的懸浮劑或擴散劑如合成及天然樹膠中，例如，黃蓍膠，金合歡樹膠，甲基纖維素等聯(lián)合。其它可用的擴散劑包括甘油等。對于腸道外施用，無菌的懸浮劑及溶液是必需的。當(dāng)需要靜脈內(nèi)施用時使用一般含有適當(dāng)防腐劑的等滲制品。
含有活性藥物成份的局部制品可與本領(lǐng)域眾所周知的載體材料，如，乙醇，維拉木膠，尿囊素，甘油，維生素A和E，油類，礦物油，PPG2十四烷基丙酸酯等混合以形成如，乙醇溶液，局部清潔劑，清潔乳脂，皮膚膠，皮膚洗液，以及乳脂或凝膠形式的香波。
本發(fā)明的化合物也可以脂質(zhì)體運輸系統(tǒng)的形式施用，如小單室囊泡，大單室囊泡及多室囊泡。脂質(zhì)體可從各種磷脂，如膽固醇，硬脂酰胺或磷脂酰膽堿中形成。
本發(fā)明的化合物也可通過使用與該化合物分子偶聯(lián)的單克隆抗體作為單獨的載體而運輸。本發(fā)明的化合物也可與可作為定向藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這樣的聚合物可能包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羥乙基天門冬酰胺苯酚、或以棕櫚?；〈木垩跻蚁┚圪嚢彼帷４送?，本發(fā)明的化合物可以偶聯(lián)到一類在完成藥物的控制釋放中有用的生物可降解的聚合物上，例如，聚乳酸，聚-ε-己內(nèi)酯，聚羥基丁酸，聚原酸酯，聚縮醛類，聚二氫吡喃類，聚氰基丙烯酸酯類以及交聯(lián)或雙親性的水凝膠嵌段共聚物。
下面的實施例說明了本發(fā)明，然而沒有將本發(fā)明限制在那里相同之處。
實施例1合成L1基因的構(gòu)建1.5kbp的HPV11 L1開放閱讀框用從Midland試劑公司定購的合成DNA寡聚體構(gòu)建。提供的這些寡聚體含有5′末端磷酸鹽。需要總共24個寡聚體并列表如下#241-15′GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT3′(SEQ IDNO1)#24125′ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT3′(SEQ ID NO2)#241-35′ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGG 3′(SEQ ID NO3)#241-45′GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTACACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC 3′(SEQ ID NO4)#241-55′CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA 3′(SEQ ID NO5)#241-65′TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATGGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3′(SEQ ID NO6)#241-75′GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTAAGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGTTCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA 3′(SEQ ID NO7)#241-85′ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3′(SEQ ID NO8)#241-95′CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3′(SEQ ID NO9)#241-105′ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACACTCGAGCGG 3′(SEQ ID NO10)#241-115′CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCTATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3′(SEQ ID NO11)#241-125′GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGACCTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCTCTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAGATCTTC 3′(SEQ ID NO12)#241-135′GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGCAGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACGAGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTGCGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC 3′(SEQ ID NO13)#241-145′ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATGTCCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTGACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCGAGCGG 3′(SEQ ID NO14)#241-155′CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA 3′(SEQ ID NO15)#241-165′TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTTATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCACATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3′(SEQ ID NO16)#241-175′GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATACCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATTAAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA3′ (SEQ ID NO17)#241-185′AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGACGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACAGGTTCCCCCACGGTACCCC 3′(SEQ ID NO18)#241-195′GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGTTCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTGCAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACATATGTCAA 3′(SEQ ID NO19)#241-205′GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCATAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAACACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3′(SEQ ID NO20)#241-215′ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGCCCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTTATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3′(SEQ ID NO21)#241-225′TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATTTAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCCCGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3′(SEQ ID NO22)#241-235′ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAAGAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACACCACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAACAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC 3′(SEQ ID NO23)#241-245′ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTGGTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAGGGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCACATTTTGTTTTGTGAGATCTTC 3′(SEQ ID NO24)形成互補寡聚對的寡聚體(#241-1與#241-24，#241-2與241-23，#241-3與#241-22，#241-4與#241-21，#241-5與#241-20，#241-6與#241-19，#241-7與#241-18，#241-8與#241-17，#241-9與#241-16，#241-10與#241-15，#241-11與#241-14，#241-12與#241-13，圖1)在含有2.5mM Tris，pH7.5，0.25mM的EDTA的分離管中退火。管加熱至98℃4分鐘并且然后置于250ml燒杯中200ml 98℃的水中以緩慢冷卻。當(dāng)水冷卻至室溫時，退火的寡聚對按指定加入管中；片段A(寡聚對#241-1與24，和-2與23)；片段B(#241-3與22，-4與21，-5與20，和-6與19)；片段C(#241-7與18，-8與17，-9與16和-10與15)及片段D(#241-11與14和-12與13)。這些寡聚對混合物加熱至62℃2分鐘并且然后按以前緩慢冷卻。每管中的內(nèi)容物用制造商提供的T4 DNA連接酶(寶靈曼公司)和試劑在23℃連接過夜。
連接以后，片段B需要PCR擴增以增加全長產(chǎn)物的含量。該擴增需要用寶靈曼Taq聚合酶和下面的寡聚引物在應(yīng)用系統(tǒng)熱循環(huán)儀中94℃1分鐘；48℃，1分鐘；72℃，1分鐘10個循環(huán)接著在72℃10分鐘5′GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG3′(SEQ ID NO25)和5′GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3′(SEQ ID NO26)。
連接產(chǎn)物和片段B PCR產(chǎn)物以限制酶(寶靈曼公司)按如下進行酶切片段A以BglII和SphI酶切；片段B，以SphI和KpnI；片段C，以KpnI和XhoI；且片段D，以XhoI與BglII。酶切的片段在低熔點瓊脂糖(FMC Bio Products)凝膠中分離且正確大小的片段按供應(yīng)商的建議切下該條帶并用AgaraseTM(寶靈曼公司)消化瓊脂糖而分離。用乙醇沉淀回收片段A、B和D并且然后分別連接到以限制酶同樣酶切從而和待連接的每個片段相匹配的載體pSP72(Promega公司)中。
KpnI XhoI酶切的片段C首先連接到退火的寡聚體。5′TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC3′；(SEQ ID NO27)和5′TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT3′(SEQ ID NO28)。
片段C然后以XhoI重新酶切且450bp的KpnI XhoI片段與KpnI，XhoI-酶切的pSP72載體相連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5菌珠感受態(tài)細胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。通過菌落雜交(J.Sambrook等.，《分子克隆實驗指南》第2版，冷泉港實驗室出版社，1989)篩選轉(zhuǎn)化子中含插入子的克隆。用Wizard微量制備(miniprep)試劑盒(promega公司)從陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA且然后用應(yīng)用系統(tǒng)373A DNA測序儀測序。含有4個片段中每個正確DNA序列的克隆按照以前酶切以從pSP72載體中釋放出該片段。KpnI，XhoI酶切的片段C與XhoI，BglII酶切的片段D和KpnI，BglII酶切的pSP72進行三徑(three way)連接。連接產(chǎn)物然后用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將得到的轉(zhuǎn)化子測序并獲得正確序列的克隆(命名為CD)。CD中的750bp BglIIKpnI插入子從pSP72載體中重新切出并與BglII、SphI酶切的片段A和SphI、KpnI酶切的片段B除了加入BglII以減少無需的連接產(chǎn)物外按前述進行三維連接。連接產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中分離，分離出1.5kbp的片段，并命名為D361-1。
實施例2序列比較HPV6/11雜交體、HPV6a和HPV11 L1 DNA序列的核苷酸序列比較顯示于圖2。HPV6骨架序列中總共造成55個核苷酸替代以將其轉(zhuǎn)變成編碼HPV11的翻譯框架。此外，在#411-413bp處添加了堿基對的插入以編碼發(fā)現(xiàn)于HPV11中但未發(fā)現(xiàn)于HPV6中的額外氨基酸(酪氨酸132)?？傊?，這些變化允許11-型特異的、構(gòu)型依賴性的中和單克隆抗體(Chemicon 8740MA6)結(jié)合HPV6/11 L1DNA在酵母中表達的L1蛋白。這表明來自HPV6/11雜交基因的蛋白似乎與天然HPV11在免疫學(xué)上難以區(qū)分。
HPV6/11雜交DNA序列與發(fā)表的HPV11 L1序列的比較顯示出194個堿基對的替代。野生11型L1序列有相當(dāng)多數(shù)目的替代，任何替代的組合或總體上所有的改變可能與酵母細胞中11型L1蛋白表達增加有關(guān)。
實施例3L1基因的DNA測序按制造商(ABI，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)定義以染色終止子測序反應(yīng)(PRIZMTM測序試劑盒)用應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA測序儀#373A對HPV6/11L1基因進行測序。
實施例4HPV6/11 L1、HPV11 L1和HPV6 L1酵母表達載體的構(gòu)建通過從含有來自質(zhì)粒pBM272中的啤酒糖酵母背離式GAL1-GAL10啟動子的PUC18/雙向GAL啟動子質(zhì)粒(Mark Johnston，Washington University，St.Louis，MO提供)中分離1.4kbp的SphI片段構(gòu)建pGAL 1-10酵母表達載體。雙向啟動子兩側(cè)有一拷貝的酵母ADH1轉(zhuǎn)錄終止子(Bennetzen，J.L和Hall.B.D.，1982，生物化學(xué)雜志.2573018-3025)，位于GAL1啟動子和第1拷貝ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間的BamHI克隆位點和位于GAL10啟動子與第二拷貝ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間的SmaI克隆位點。以SphI酶切由pBR322、酵母LEU2d基因組成的酵母穿梭載體(Erhart，E.and Hollenberg，C.P.，1983，細菌學(xué)雜志，156625-635)和酵母2u質(zhì)粒(Benjamin Hall，University ofWashington，Seattle，WA惠贈)(Broach，J.R.and Volkert，F(xiàn).C.，1991，酵母環(huán)狀DNA質(zhì)粒，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)并與1.4kbp的SphI雙向GAL啟動子片段連接得到pGAL 1-10(圖3)。
編碼HPV11 L1蛋白(實施例1中樣品D361-1)的HPV6/11雜交L1 DNA在緊接著HPV6/11 L1起始甲硫氨酸密碼子的上游含有一個酵母非翻譯的前導(dǎo)序列(Kniskem，P.J等.，1986，基因46135-141)。pGAL1-10質(zhì)粒以BamH I在GAL1啟動子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間以BamHI酶切而線性化且與1.5kbp的HPV6/11 L1基因片段(樣品D361-1)連接。篩選大腸桿菌DH5(Gibco BRL.Inc)轉(zhuǎn)化子并且分離含HPV6/11 L1基因的pGAL1-10質(zhì)粒且命名為D362-1。
從尖銳濕疣損傷(Darron Brown博士惠贈)中克隆野生型HPV11(wt-HPV11)DNA。提取人基因組總DNA并以限制性核酸內(nèi)切酶酶切。含wt-HPV11 DNA的部分連接到待用作PCR模板的大腸桿菌克隆載體。用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，10個循環(huán)的擴增(94℃1分鐘，48℃1分鐘，72℃1分鐘45秒)，和下面的含側(cè)翼BglII位點(下劃線)的寡核苷酸引物通過PCR擴增wtHPV11 L1基因有義引物5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGCCTA GCG ACA GCA CAG-3′(SEQ ID NO29)反義引物5′-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTTCG-3′(SEQ ID NO30)。
有義引物在緊接著wt-HPV11L1起始甲硫氨酸密碼子(以黑體印刷突出顯示)的上游導(dǎo)入酵母非-翻譯前導(dǎo)序列(Kniskern，P.J.等.，1986，基因46135-141)。1.5kbp的wt-HPV11 L1 PCR產(chǎn)物以BglII酶切，凝膠純化并與BamHI酶切的pGAL1-10質(zhì)粒連接以得到質(zhì)粒，p329-1。
從HPV6a-陽性，尖銳濕疣損傷中(Darron Brown博士惠贈)提取總基因組DNA。用活檢樣品DNA作為模板，Vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Inc.)、35個擴增循環(huán)(94℃1分鐘，48℃1分鐘，72℃1分鐘45秒)的PCR擴增HPV6a L1基因，使用的是上面列出的用于wt-HPV11 L1 PCR的有義引物和具有下面序列的反義引物。
5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3′(SEQ ID NO31)1.5kbp的HPV6a L1 PCR產(chǎn)物以BglII酶切，凝膠純化并與BamHI酶切的pGAL1-10質(zhì)粒連接以得到質(zhì)粒D128。
實施例5菌株1558的制備步驟a酵母菌株U9的制備酵母菌株2150-2-3(MATα，leu2-04，adel，cir°)獲自LelandHartwell博士(華盛頓大學(xué)，西雅圖，WA)。菌株2150-2-3細胞在5ml YEHD培養(yǎng)基(Carty等，J.Ind Micro 2(1987)117-121)中30℃培養(yǎng)過夜。細胞以無菌蒸餾水洗3次，重懸于2mL無菌蒸餾水，并且為了篩選ura3突變子，將0.1mL的細胞懸液置于6個5-氟代-乳清酸(FOA)平板的每個平板上(冷泉港實驗室酵母遺傳學(xué)手冊)。該平板在30℃孵育。培養(yǎng)基每250mL蒸餾水中含有3.5g無氨基酸和硫酸銨的Difco Yeast Nitrogen Base；0.5g 5-氟代乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g右旋糖。
培養(yǎng)基經(jīng)0.2μM膜過濾除菌并且然后與維持在50℃的250mL 4％Bacto-Agar(Difco)，10mL 1.2mg/mL的腺嘌呤溶液，和5mL L-亮氨酸溶液(180mg/50mL)混合。得到的培養(yǎng)基以每個培養(yǎng)皿20mL進行分配。
孵育5天以后，出現(xiàn)眾多的菌落。通過重劃最初FOA平板的菌落至新鮮的FOA平板且然后在30℃孵育而分離單個菌落。通過重復(fù)劃盤至YEHD平板和尿嘧啶缺陷平板以測試第二套FOA平板中許多菌落中ura3突變的存在。所需的結(jié)果是在YEHD上生長良好且在尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基中沒有生長。得到一個表現(xiàn)這些特性的分離子(U9)。其在-70℃作為冷凍甘油貯存菌株(菌株#325)貯存?zhèn)溆?。步驟b用于酵母MNN9基因破裂載體的制備為了制備用于MNN9基因破裂的載體，首先從酵母基因組DNA中克隆MNN9基因是必需的。這通過標準的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)完成。根據(jù)發(fā)表的酵母MNN9基因序列(ZymogeneticsEPO專利申請?zhí)?88117834.7，
發(fā)明者K·J·霍夫曼, K·U·雅森, M·P·尼佩爾, J·G·喬克, H·A·格奧格, E·D·勒曼 申請人:麥克公司