專利名稱：曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶，另外，本發(fā)明涉及編碼這種酶的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一啟動子，該啟動子被用來控制編碼所述酶的所述核苷酸序列的表達。
具體地說，本發(fā)明所述的酶是一種具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶。
已知希望在生物體-如絲狀真菌(如黑色曲霉(AspergillusNiger))或者甚至一種農作物的一些組織中指導所感興趣的基因(“GOI”)的表達。產物蛋白質或者酶對于生物體本身可以是有用的。例如，可能希望產生有優(yōu)化的氨基酸組成的作物蛋白產物，以提高作物的營養(yǎng)價值。例如，這種作物可以制成更有用的飼料。
或者，可能希望分離產物蛋白質或酶，然后使用這種蛋白質或酶來制備，例如，食品組合物。從這一點來看，該產物蛋白質或酶可以是食品組合物的一個成分，或者它可以被用來制備食品組合物，包括改變食品組合物的性質或外觀。甚至可能希望使用生物體，如一種絲狀真菌或者一種農作物，為了相同的目的來表達非植物基因。
也可能希望使用一種生物體，如一種絲狀真菌或一種農作物，來表達哺乳動物基因。后者產物的例子包括干擾素，胰島素，血因子，和血纖蛋白溶酶原激活物。也希望使用微生物，如絲狀真菌，通過使用在該微生物中有活性的啟動子，由GOI制備產品。
水果和蔬菜細胞壁大多由多糖組成，主要成分是果膠，纖維素和木糖葡聚糖(R.R.Selvendran和J.A.Robertson，IFR報告(IFRReport)，1989)。已經(jīng)提出過多種細胞壁模型，努力加入強度和柔性基本性質(P.Albersheim，美國科學(Sci.Am.)，232，81-95，1975，P.Albersheim，植物生物化學(Plant Biochem.)第三版(Bonner和Varner)，Ac.Pross，1976；T Hayashi植物生理及植物分子生物學年度綜述(Ann.Rev.Plant Physiol & Plant Mol Biol，40，139-168，1989)。
植物細胞壁的組成復雜而多樣。發(fā)現(xiàn)多糖主要以長鏈纖維素(植物細胞壁的主要機構成分)，半纖維素(含有多種β-木聚糖鏈)和果膠物質(由半乳糖醛聚糖(galacturonan)和鼠李糖半乳糖醛聚糖(thamnogalacturonan)；阿拉伯聚糖；和半乳聚糖及阿拉伯半乳聚糖組成)的形式。從食品工業(yè)的角度出發(fā)，果膠物質，特別是阿拉伯聚糖，已變成植物細胞壁中最重要的成分(Whitaker，J.R.(1984)，酶微生物技術(Enzyme Microb.Technol.)，6，341)。
植物多糖的一種形式是阿拉伯聚糖。有關阿拉伯聚糖的敘述可以參見EP-A-0506190。根據(jù)該文獻報道，阿拉伯聚糖由一條與另一條連接的α-(1→5)基團的主鏈組成。支鏈是α-(1→3)或者某些情況下是α-(1→2)與主要的α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖主鏈連接的。例如在蘋果中，阿拉伯糖總量的三分之一存在于支鏈。阿拉伯聚糖的分子量一般是大約15kDa。
阿拉伯聚糖被總稱為阿拉伯糖酶的酶降解。從這一點上看，阿拉伯聚糖降解活性是一種酶從阿拉伯聚糖主鏈或從其它半纖維素主鏈結構如阿拉伯半乳聚糖的含阿拉伯聚糖支鏈上釋放阿拉伯糖殘基，單體或者寡聚物的能力，或者甚至是通過裂解單萜基α-L-阿拉伯呋喃糖基葡糖苷的末端阿拉伯呋喃糖基單元和中間葡糖基單元之間的1→6鍵而釋放阿拉伯糖單體的能力。
EP-A-0506190中阿拉伯聚糖降解酶之活性包括a)裂解(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷鍵的能力；b)裂解(1→3)-α-L-阿拉伯糖苷鍵的能力；c)裂解(1→5)-α-阿拉伯糖苷鍵的能力；d)裂解單萜基α-L-阿拉伯呋喃糖基葡糖苷的末端阿拉伯呋喃糖基單元和中間葡糖基單元之間1→6鍵的能力。
已知阿拉伯聚糖降解酶是通過各種植物和微生物而產生的。在這些微生物中，真菌如那些曲霉屬，伏革菌屬，紅酵母屬(Kaii A.(1984)碳水化合物化學生物化學進展(Adv Carbohydr.Chem.Biochem.)，42，383)，Dichotomitus(Brillouet等，1985，碳水化合物研究(Carbohydrate Research，144，113)，Ascomycetes和Basidomycetes(Sydow，G，(1977)DDR專利申請No.124812)。
另一種植物多糖是木聚糖，其主要單糖單元是木糖。木聚糖是半纖維素的豐富的成分。在單子葉植物中主要的半纖維素是一種阿拉伯木聚糖，其阿拉伯糖支鏈與木糖殘基主鏈連接。
阿拉伯木聚糖是在谷類細胞壁中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物。有關阿拉伯木聚糖和其酶降解的敘述可以參見Voragen等(1992，阿拉伯木聚糖，木聚糖和木聚糖酶的特征(Characterisation of Cereal Arabinoxylans，Xylans和Xylanases)，第51-67頁，J.Visser編著，Elsevier科學出版社出版)。
阿拉伯木聚糖一般含有通過β-1，4-鍵連接在一起的木糖主鏈。該木糖主鏈被L-阿拉伯糖殘基取代，該L-阿拉伯糖殘基通過α-1鍵與木糖殘基的2或3位連接。所述木糖殘基可以是單取代或雙取代。除用阿拉伯糖取代外，木糖殘基也可以被?；?，葡糖醛酸和各種其它碳水化合物取代。阿拉伯糖殘基可以進一步被酚酸如阿魏酸和香豆酸取代。取代的程度和種類取決于具體阿拉伯木聚糖的來源。
在谷類細胞壁中發(fā)現(xiàn)了阿拉伯木聚糖，它們是第二層細胞壁的一部分。阿拉伯木聚糖構成小麥面粉的大約3％-其中部分是水溶性的(WSP)，部分是水不溶性的(WIP)。
盡管事實上阿拉伯木聚糖的量只是小麥的大約3％，但阿拉伯木聚糖部分的重要性卻越來越大。這是因為谷類阿拉伯木聚糖起水膠體作用，因為它們與水形成類凝膠結構。例如，盡管事實上阿拉伯木聚糖只占面粉干重的3％，但面粉中的阿拉伯木聚糖最多組合揉好的面團中水的30％。當阿拉伯木聚糖組合水時，其增加磨細的谷物的粘度，粘度到了一定程度使谷物變得不容易吃。
可以用降解阿拉伯木聚糖的酶來操縱用于磨細谷物的幾種體系的流變學性質。在現(xiàn)代面包烘房中，為了減少加工揉好的面所需的能量，也為了使面包有更大體積，減小揉好的面的粘度是有好處的。這一點通常是通過使用能降解阿拉伯木聚糖的木糖主鏈的酶而實現(xiàn)的。
為本發(fā)明目的只從阿拉伯木聚糖的木聚糖主鏈裂解阿拉伯糖支鏈的酶統(tǒng)稱為阿拉伯木聚糖降解酶。
在以谷類為基礎的飼料中，在飼料被吸收后，谷類中的阿拉伯木聚糖能提高動物腸中液體的粘度。這是一個問題，因為這引起動物的不舒適感覺，如消化不良。也降低了飼料的營養(yǎng)價值。通過向飼料中加入降解阿拉伯木聚糖的酶(如木聚糖酶)可以避免這些問題，以避免消化不良，并提高飼料的營養(yǎng)價值。但是有些降解阿拉伯木聚糖的酶(特別是一些木聚糖酶)要求存在有未取代的主鏈，所以它們的活性受到限制。
有關阿拉伯木聚糖的進一步的討論可以參見《木聚糖和木聚糖酶》(Xylans and Xylanases)(1992，J.Visser編著，Elsevier科學出版社出版)。
根據(jù)Kormelink等，1991(Kormelink，F(xiàn).J.M.Searle-Van LeeuwenM.J.F.，Wood.T.M.，Voragen，A.G.J.(1991)，“自泡盛曲霉純化和表征(1，4)-β-D-阿拉伯木聚糖阿拉伯糖基呋喃糖水解酶”，《微生物、微生物技術應用)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.25753-758)所述，一種阿拉伯木聚糖降解酶是(1，4)-β-D-阿拉伯木聚糖阿拉伯糖基呋喃糖水解酶(AXH)。但是該篇文獻沒有提供這種酶的序列測定數(shù)據(jù)或者編碼這種酶的核苷酸序列，或者是用于這種酶的啟動子的序列測定數(shù)據(jù)。
很明顯，優(yōu)選通過用重組DNA技術能降解阿拉伯木聚糖這一點是有用的。
本發(fā)明試圖提供一種具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶；優(yōu)選其中這種酶能在一些或特定細胞或組織中制得，例如僅在一種生物體，一般為一絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中制得。
本發(fā)明也試圖提供一種編碼這種酶的GOI，這種GOI能優(yōu)選在特定細胞或組織中表達，如在一種生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的一些或特定細胞或組織中表達。
此外，本發(fā)明試圖提供一種能指導GOI表達的啟動子，例如優(yōu)選在某些特定細胞或組織，例如僅在一種生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。優(yōu)選在曲霉屬中使用這種啟動子，其中由GOI編碼的產物從宿主生物體分泌到周圍基質中。
而且，本發(fā)明試圖提供包含所述GOI和/或啟動子的構建，載體，質粒，細胞，組織，器官和生物體，以及優(yōu)選在特定細胞或組織中的表達方法，例如僅在一種生物體，一般是絲狀真菌，優(yōu)選在曲霉屬，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中表達。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種從曲霉屬得到的酶，其中該酶具有如下特征MW是33,270D±50D；pI值大約為3.7；阿拉伯木聚糖降解活性；最適pH自大約2.5至大約7.0(更具體的是大約3.3至大約4.6，更具體的是大約為4)；最適溫度為大約40℃至大約60℃(更具體的是大約45℃至大約55℃，更具體的是大約為50℃)；而且其中這種酶能將阿拉伯糖從阿拉伯木聚糖的木糖骨架上裂解下來。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供具有如SEQ.I.D.No.1所示序列的酶，或者其變體，同系物，或片段。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供由SEQ.I.D No.2所示核苷酸序列或其變體，同系物，或片段，或與其互補的序列編碼的酶。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供編碼本發(fā)明所述酶的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供具有SEQ.I.D.No.2所示的序列的核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供具有SEQ.I.D.No.3所示序列的啟動子，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列的終止子，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供具有SEQ.I.D.No.14所示核苷酸序列的信號序列，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供通過使用一種啟動子表達GOI的方法，其中所述啟動子是本發(fā)明啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供本發(fā)明酶降解阿拉伯木聚糖的應用。
根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供降解阿拉伯木聚糖的酶的組合物(combination)，該組合物由本發(fā)明酶和木聚糖酶組成。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供用于表達能降解阿拉伯木聚糖的酶，或者用于控制其表達，或用于控制另一GOI表達的質粒NCIMB40703，或可從此獲得的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，提供具有SEQ.I.D.No15所示序列的信號序列，或其變體，同系物或片段。
根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供本發(fā)明酶在制備減緩或防止消化不良和/或提高吸收性和/或增加營養(yǎng)攝入的藥物或食物的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，是提供具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidase)，其具有與抗具有SEQ.I.D.No1所示序列的純化的阿拉伯呋喃糖苷酶抗體的免疫反應性。
根據(jù)本發(fā)明的第十六方面，提供阿拉伯呋喃糖苷酶啟動子，其中該啟動子是被木糖代謝的中間產物誘導的。
根據(jù)本發(fā)明的第十七方面，提供降低支化的底物粘度的方法，其中酶降解底物的支鏈而不降解底物的主鏈。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明酶作為粘度調節(jié)劑的用途。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明酶降低果膠粘度的用途。
本發(fā)明的其它方面包括由本發(fā)明前述方面構成的構建物，載體，質粒，細胞，組織，器官和轉基因生物體。
本發(fā)明的其它方面包括表達或使表達或轉化任一核苷酸序列，構建物，質粒，載體，細胞，組織，器官或生物體，以及其產物的方法。
本發(fā)明的另外方面包括使用所述啟動子在培養(yǎng)基如肉湯或者在轉基因生物體中表達GOI。
本發(fā)明的再一方面包括用所述酶制備或處理食物，包括動物飼料。
優(yōu)選所述酶由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者與其互補的序列編碼。
優(yōu)選所述核苷酸序列具有SEQ.I.D.No.2所示序列，或是其變體，同系物或其片段或與其互補的序列。
優(yōu)選所述核苷酸序列與啟動子操作連接。
優(yōu)選所述啟動子包含序列CCAAT。
優(yōu)選所述啟動子是具有SEQ.I.D.No.3所示序列，或是其變體，同系物或片段，或者是與其互補的序列的啟動子。
優(yōu)選所述啟動子包含自Xma111至BamH1位點的100bps序列。
優(yōu)選本發(fā)明啟動子與GOI操作連接。
優(yōu)選所述GOI包含本發(fā)明核苷酸序列。
優(yōu)選轉基因生物體是真菌。
優(yōu)選轉基因生物體是絲狀真菌，更優(yōu)選是曲霉屬。
優(yōu)選轉基因生物體是一種植物。
優(yōu)選在應用中，所述酶與木聚糖酶，優(yōu)選內切木聚糖酶(endoxylanase)組合使用。
本發(fā)明各方面最為優(yōu)選的實施方案不包括自然環(huán)境中的任何一種天然酶，天然啟動子或天然核苷酸序列。
優(yōu)選的是，在任一質粒，載體，如表達載體或轉化載體，細胞，組織，器官，生物體或轉基因生物體中，所述啟動子與至少一種GOI組合存在。
優(yōu)選所述啟動子和GOI被穩(wěn)定地插入到轉基因生物體的基因組中。
優(yōu)選轉基因生物體是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選是黑色曲霉。轉基因生物體甚至可以是一種植物，如單子葉或雙子葉植物。
最為優(yōu)選的實施方案是一種自曲霉得到的酶，其中該酶具有下述特征，MW為33,270D±50D；pI值大約為3.7；阿拉伯糖基木聚酶降解活性；最適pH自大約2.5至大約7.0(更特別的是大約3.3至大約4.6，更具體為大約4)；最適溫度是大約40℃至大約60℃(更特別是大約45℃至大約55℃，更具體為大約為50℃)；其中所述酶能從阿拉伯木聚糖的木糖主鏈上裂解阿拉伯糖；其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或是其變體，同系物或片段。
另一最為優(yōu)選的實施方案是自曲霉得到的一種酶，其中該酶具有如下特征MW為33,270D±50D；pI值大約為3.7；阿拉伯糖基木聚酶降解活性；最適pH自大約2.5至大約7.0(更特別的是大約3.3至大約4.6，更具體為大約4)；最適溫度是大約40℃至大約60℃(更特別是大約45℃至大約55℃，更具體為大約為50℃)；其中所述酶能從阿拉伯木聚糖的木糖主鏈上裂解阿拉伯糖；其中所述酶有SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其變體，同系物或片段編碼，或由與其互補的序列編碼。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，它提供了一種制備具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶，以及編碼這種酶的核苷酸序列的方法。另外，本發(fā)明提供了能控制那個或其他的核苷酸序列表達的啟動子。
其它的優(yōu)點是本發(fā)明酶能影響磨細的谷物，如揉好的面團的粘度，使其易于加工，如例如得到較大的面包體積。
本發(fā)明酶用于飼料也是有優(yōu)點的，因為其降解阿拉伯木聚糖，從而提高了飼料的營養(yǎng)價值。另外，其減小了動物腸中阿拉伯木聚糖的粘度，從而減緩或防止了消化不良。
本發(fā)明酶與木聚糖酶組合使用是特別有益的，因為本發(fā)明酶和木聚糖彼此有驚奇的出人意料的協(xié)同效果。
從這點上說，本發(fā)明酶提高了木聚糖酶的降解效果，而木聚糖酶提高了本發(fā)明酶的降解效果，而木聚糖酶提高了本發(fā)明酶的降解效果。相信木聚糖酶的活性被提高了，因為本發(fā)明酶提供了具有較少取代基的多糖底物。
因此，本發(fā)明提供一種具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶，其中該酶可以在一些或特定細胞或組織中制得，例如只在生物體的特定細胞或組織中制備，該生物體一般為絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉該酶甚至可以在一種植物中制備。
更特別地，本發(fā)明酶能從阿拉伯木聚糖的木糖主鏈上特異性地裂解阿拉伯糖。
本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶不同于現(xiàn)有技術中的阿拉伯呋喃糖苷酶。從這點上說，現(xiàn)有技術描述的阿拉伯呋喃糖苷酶-例如EP-A-0506190公開的那些酶-其特征在于它們降解未支化阿拉伯聚糖的能力，而且使用對-硝基苯基阿拉伯糖苷測定。
本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶不降解未支化的阿拉伯聚糖，且對于硝基苯基阿拉伯糖苷只有極小活性。相反，本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶用于降解阿拉伯木聚糖。因此說本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶與現(xiàn)有技術分離的阿拉伯呋喃糖苷酶是完全不同的。
本發(fā)明也提供編碼所述酶的GOI，該GOI可以優(yōu)選在特定細胞或組織中表達，如在生物體的某些或特定細胞或組織中表達，該生物體一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉。該GOI甚至可以在一種植物中表達。
另外，本發(fā)明提供一種能指導GOI表達的啟動子，如編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，優(yōu)選只在生物體某些特定細胞或組織中表達，一般該生物體為絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中表達，優(yōu)選在曲霉中使用所述啟動子，其中GOI編碼的產物從宿主生物體分泌到周圍基質中。甚至可以裁制啟動子(如果需要的話)以在植物中表達GOI。
本發(fā)明也提供了包含所述GOI和/或啟動子的構建物，載體，質粒，細胞，組織，器官和生物體，表達GOI的方法，優(yōu)選只在生物體的特定細胞或組織中表達，例如，該生物體一般為絲狀真菌，優(yōu)選在曲霉屬中，或者甚至是植物的特定細胞或組織中表達。
與酶有關系的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)氨基酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得氨基酸序列具有阿拉伯木聚糖降解活性，優(yōu)選至少具有序列表(SEQ.I.D.No.1或12)所示酶的相同活性，具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得酶具有阿拉伯木聚糖降解活性。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表所示SEQ.I.D.No.1至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表中所示SEQ.I.D.No.1至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。
與編碼所述酶的核苷酸序列有關系的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶，優(yōu)選至少具有序列表(SEQ.I.D.No.2或12)所示酶的相同活性，具體地講，術語“同系物”包括關于結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列編碼具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶。有關序列的同源性，優(yōu)選與序列表中所示的SEQ.I.D.No.2至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表中所示SEQ.I.D.No.2至少95％更優(yōu)選至少98％同源性。
與啟動子相關的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明轉化的細胞或者轉基因生物體中具有作為啟動子而起作用的能力。具體地講，術語“同系物”包括與結構和/或功能有關的同源性，條件是所得核苷酸序列具有作為啟動子而起作用的能力。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表所示SEQ.I.D.No.3至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表所示SEQ.I.D.No.3至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。
與終止子或信號核苷酸序列有關的術語“變體”，“同系物”或“片段”包括一個(或幾個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列，在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明轉化的細胞或轉基因生物體中分別具有作為終止子而起作用或者編碼具有作為信號序列而起作用的能力的氨基酸序列的能力。具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列具有各作為或編碼終止子或信號序列的能力。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分別地)至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選的是與序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分別地)至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。
與信號氨基酸序列有關的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)氨基酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得序列在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明的轉化細胞或者轉基因生物體中具有作為信號序列而起作用的能力。具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列分別具有作為或編碼一個信號的能力。關于序列同源性，優(yōu)選于序列表所示SEQ.I.D.No.15至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選的是與序列表所示SEQ.I.D.No.15至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。
上述術語是序列等位變異的同義詞。
術語“互補”指本發(fā)明也包括能分別與編碼序列或啟動子序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
與本發(fā)明有關的術語“核苷酸”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。優(yōu)選其指DNA，更優(yōu)選指用于本發(fā)明編碼序列的cDNA。
術語“構建物”-其與術語如“綴合物”，“彈夾”和“雜種”是同義詞-包括與啟動子直接或間接相連的GOI。一個間接連接的例子是有一合適的間隔基團，例如一內含子序列，例如ShI內含子或ADH內含子，在啟動子和GOI之間起中介作用。對于包括直接或間接連接的與本發(fā)明有關的術語“融合”也是一樣。在每種情況下最為優(yōu)選的是這些術語不包括編碼酶的基因正常地與野生型基因啟動子相聯(lián)的，且兩者都在其自然環(huán)境下的情況的天然組合。最為優(yōu)選的實施方案是與一種或所述啟動子操作連接所述或一種GOI。
所述構建物甚至可以包含或表達一標記物，該標記物使選擇已被轉移到例如絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉，或者植物，優(yōu)選谷類，例如玉米，稻，大麥等中選擇所要的基因構建物成為可能。存在可以使用的多種標記物，例如那些編碼甘露糖-6-磷酸異構酶的標記物(尤其是用于植物)或者提供抗生素抗性的那些標記物-例如G418抗性，潮霉素，博來霉素，卡那霉素和慶大霉素抗性。
術語“載體”包括表達載體和轉化載體。
術語“表達載體”指能體內或體外表達的構建物。
術語“轉化載體”指能從一個物種轉移到另一個物種的構建物-例如從大腸桿菌(E.coli)質粒轉移到絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬。其也可以是能從E.coli質粒轉移到土壤桿菌轉移到一種植物的構建物。
術語“組織”包括組織本身和器官。
與本發(fā)明有關的術語“生物體”包括可能包含本發(fā)明啟動子和/或編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或從其中得到的產物的任何生物體，其中所述啟動子能使表達GOI和/或其中本發(fā)明核苷酸序列當在生物體中存在時能被表達。
優(yōu)選生物體是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑色曲霉。
與本發(fā)明有關的術語“轉基因生物體”包括包含本發(fā)明啟動子和/或編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或從其中得到的產物的任何生物體，其中在生物體內所述啟動子能使GOI表達和/或其中本發(fā)明核苷酸序列在能被表達。優(yōu)選啟動子和/或核苷酸序列被插入到生物體的基因組中。
優(yōu)選的轉基因生物體是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑色曲霉。
因此，本發(fā)明轉基因生物體包括包含有任一本發(fā)明啟動子，編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，本發(fā)明構建物，本發(fā)明載體，本發(fā)明質粒，本發(fā)明細胞，本發(fā)明組織或其產物，或者包含它們的組合的一種生物體。例如，轉基因生物體可以包含本發(fā)明啟動子控制下的GOI，優(yōu)選外源核苷酸序列。轉基因生物體也可以包含啟動子控制下的編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，所述啟動子可以是本發(fā)明啟動子。
在高度優(yōu)選的實施方案中，轉基因生物體不包含本發(fā)明啟動子和編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的組合，其中所述啟動子和核苷酸序列兩者對于該生物體是天然的，且處于它們的天然環(huán)境。因此在高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明不包括處于其也處于其天然環(huán)境下的天然啟動子的控制之下時處于其天然環(huán)境的根據(jù)本發(fā)明的天然的核苷酸編碼序列。另外，在高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明不包括處于其天然環(huán)境和由也處于自然環(huán)境的、其處于也處于其天然環(huán)境下的天然啟動子的控制下的天然核苷酸編碼序列表達的據(jù)本發(fā)明的天然的酶。
術語“啟動子”是本領域通常的意義，例如-Jacob-Mond基因表達理論中的RNA聚合酶組合位點。
一方面，本發(fā)明啟動子能表達GOI，其可以是編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列處于使核苷酸序列表達的啟動子控制之下。從這一點上來說，啟動子不一定要是與本發(fā)明啟動子相同的啟動子。從這方面來說，啟動子可以是一種細胞或組織特異性啟動子。例如，如果生物體是一種植物，則啟動子可以是在莖，苗，根和葉組織的一種或幾種中影響核苷酸序列表達的啟動子。
例如，本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy 1啟動子(另外也稱作Amy 1啟動子，Amy 637啟動子或α-Amy 637啟動子)，參見1994年10月21日申請的共同未決的UK專利申請No.9421292.5。所述啟動子包含

圖1所示的序列。
或者本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy 3啟動子(另外也稱為Amy 3啟動子，Amy 351啟動子或α-Amy 351啟動子)，參見1994年10月21日申請的審而未決的UK專利申請No.9421286.7。所述啟動子包含圖2所示序列。
優(yōu)選啟動子是本發(fā)明啟動子。
除上述核苷酸序列外，啟動子，特別是本發(fā)明啟動子可以另外包括確?；蛟黾釉诤线m宿主中表達的性質。例如所述性質可以是保守區(qū)，如Pribnow Box或TATA匣。所述啟動子也可以包含影響(例如保持，增強，提高)GOI表達水平的其它序列。例如合適的其它序列包括Sh 1-內含子或ADH內含子。其它序列包括可誘導元件-例如溫度，化合物，光或應激反應可誘導元件。
也可以存在增強轉錄或翻譯的合適的元件。后者元件的一個例子是TMV 5′信號序列，參見Sleat基因217，217-225；和Dawson植物分子生物學(Dawson Plant Mol，Biol)2397)。
另外，本發(fā)明也涉及啟動子和/或編碼蛋白質或酶的核苷酸序列和/或元件的組合。例如，本發(fā)明涉及與可能是根據(jù)本發(fā)明的一個核苷酸序列的GOI操作連接的根據(jù)本發(fā)明的啟動子的組合，和另外一個啟動子，如與相同或不同GOI操作連接的一種組織特異性啟動子的組合。
本發(fā)明也涉及用啟動子來表達編碼根據(jù)本發(fā)明酶的核苷酸序列用途，其中啟動子的一部分是失活的，但其中該啟動子仍能起啟動子的作用。啟動子的部分失活在某些情況下是有好處的。
具體地說，對于早些時候提到的Amy 351啟動子，能夠失活啟動子的一部分，從而部分失活的啟動子以更專一的方式如只在一種特定組織類型或器官中表達GOI。
術語“失活的”指部分失活，意義在于啟動子的表達模式被修飾，但其中部分失活的啟動子仍起啟動子作用。但是，如上所述，修飾過的啟動子能在至少一種(但不是全部)原啟動子的特定組織中表達GOI。一種這樣的啟動子是如上所述的Amy 351啟動子。
部分失活的例子包括改變啟動子序列的折疊模式，或者改變其與核苷酸序列部分組合，這樣，核苷酸序列的一部分不被例如RNA聚合酶識別。另一優(yōu)選的部分失活啟動子的方法是將其截短成其片段。另一種方法是使該序列的至少一部分突變，從而RNA聚合酶不能組合這一部分或另一部分。
另一種修飾作用是突變調節(jié)蛋白質的結合位點，例如已知來自絲狀真菌的施加碳分解產物的阻遏作用CreA蛋白質，從而解除天然啟動子的分解代謝產物的阻遏作用。
術語“GOI”參照本發(fā)明是指所感興趣的任何基因。GOI可以是對于所研究生物體(例如絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，或一種植物)是外來的或本身的任何核苷酸。GOI典型的例子包括修飾代謝和分解代謝過程中的蛋白質和酶的編碼基因。GOI可以編碼引入或提高病原抗性的一種試劑。GOI還可以是修飾相關組織中存在的天然轉錄本的表達的反義構建物。GOI還可以編碼絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬的非天然蛋白質，或者編碼對動物或人有好處的一種化合物。
例如，GOI可以編碼藥學活性蛋白質或酶，例如，治療化合物胰島素，干擾素，人血清白蛋白，人生長因子和凝血因子之任何一種。從這點上來說，轉化的細胞或生物體可以制備可接受量的所期化合物，而這種化合物容易自該細胞或生物體得到。GOI也可以是給予一種食品或作物營養(yǎng)價值的一種蛋白質。典型的例子包括能抑制抗營養(yǎng)因子生成的植物蛋白和具有更加期望的氨基酸組成(例如比非轉基因植物有更高的賴氨酸含量)的植物蛋白。GOI還可以編碼可以用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇異果甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是任何一種有害毒素的編碼基因，可以是一反義轉錄本，如對于馬鈴薯蛋白(patatin)或α-淀粉酶，ADP-葡糖焦磷酸酶(例如參見EP-A-0455316)的反義轉錄本，一種蛋白水解酶反義或葡聚糖酶的反義轉錄本。
GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年7月4日申請的共同未決UK專利申請9413439.2的主題，序列在圖3中給出。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年10月21日申請的共同未決UK專利申請9421290.9的主題，序列在圖4中給出。GOI可以是編碼ADP-葡糖焦磷酸酶的核苷酸序列，這是我們于1994年4月7日申請的審而未決PCT專利申請PCT/EP94/01082的主題，其序列在圖5和圖6中給出。GOI可以是編碼α-葡聚糖水解酶的任何核苷酸序列，這在我們于1994年10月15日申請的審而未決PCT專利申請PCT/EP94/03397中有說明，其序列在圖7-10中給出。
在一個優(yōu)選的實施方案中，GOI是編碼根據(jù)本發(fā)明酶的核苷酸序列。
如上所述，一種優(yōu)選的宿主生物是曲霉屬，如黑色曲霉。本發(fā)明轉基因曲霉可以根據(jù)下列文獻的說明而制得Rambosek，J，和Leach，J.1987(絲狀真菌中的重組DNA改進和探索，CRC生物技術評論綜述(Recombinant DNA in filamentous FungiProgress and Bospects CRCCrit.Rev Biotechnol.)6357-393)，Davis R.W.1994(MartinelliS.D.，Kinghorn J.R.(編著)《曲霉50年工業(yè)微生物進展》(Aspergillus50 years on Progress in industrial microbiology)，vol 29，Elsevier Amsterdam 1994，第525-560，“曲霉中異源基因表達和蛋白質分泌(Heterologous gene expression and protein secretion inAspergillus))，Ballance，D.J.1991(Leong，S.A.Berka R，M.(編著)《分子工業(yè)真菌學，絲狀真菌的系統(tǒng)和應用》(Molecular IndustrialMycology，Systems and Application for Filamentous Fungi.)Marcel DekkerInc NewYork 1991.pp1-29，“絲狀真菌的轉化系統(tǒng)和真菌基因結構的總結”(Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview ofFungal Gene Structure)，和Turner G.1994(Martinelli S D.，Kinghorn J.R.(編著)《曲霉50年工業(yè)微生物進展》，vol 29，Elsevier Amster-dam 1994，pp641-666，“基因操作的載體”(Vectors for genetic manipulation))，而且，下面的說明總結了產生根據(jù)本發(fā)明的轉基因曲霉的那些說明。
在近乎一個世紀里，工業(yè)上已廣泛使用絲狀真菌來生產有機化合物和酶。傳統(tǒng)的日本Koji和大豆發(fā)酵已使用了曲霉屬幾百年。在本世紀已使用黑色曲霉生產有機酸，特別是檸檬酸，和生產各種用于工業(yè)的酶。
絲狀真菌被廣泛用于工業(yè)有兩個主要原因。首先，絲狀真菌可以產生大量胞外產物，例如酶和有機化合物，例如抗生素或有機酸。其次，絲狀真菌可以在便宜的底物上生長，例如谷類，糠，甜菜肉質部分等。相同原因使絲狀真菌成為根據(jù)本發(fā)明的異源表達的令人感興趣的生物體。
為了制得轉基因曲霉，通過將GOI(例如一種淀粉酶或SEQ.I.D.No.2)插入到為在絲狀真菌中表達而設計的構建物而制備表達構建物。
已經(jīng)研究出幾種類型用于異源表達的構建物。這些構建物包含根據(jù)本發(fā)明的在真菌中有活性的啟動子(或者如果GOI編碼根據(jù)本發(fā)明的酶而需要的另一啟動子)。除本發(fā)明外的啟動子的例子包括用于高度表達胞外酶的真菌啟動子，例如，葡糖淀粉酶啟動子或α-淀粉酶啟動子。該GOI可以與指導該GOI編碼的蛋白質分泌的信號序列(例如本發(fā)明信號序列或另一個合適的序列)融合。通常使用真菌源信號序列，例如本發(fā)明的信號序列。在真菌中有活性的終止子終止表達體系，例如本發(fā)明的終止子。
已經(jīng)研究出另外一種類型的真菌中的表達系統(tǒng)，其中GOI與編碼穩(wěn)定蛋白質的真菌基因的較小或較大部分融合。這可以穩(wěn)定GOI編碼的蛋白。在這樣的體系中，被特異蛋白水解酶識別的一個切割位點可以被插入到真菌蛋白和GOI編碼的蛋白之間，這樣，產生的融合蛋白可以在該位點被特異蛋白水解酶切割，從而釋放GOI編碼的蛋白質(“POI”)。作為例子，可以插入至少在一些曲霉中發(fā)現(xiàn)的象肽酶一樣的KEX-2識別的位點。這樣的融合導致體內切割，從而保護POI并產生POI，而不產生較大融合蛋白。
已經(jīng)報道過在曲霉中異源表達編碼細菌，真菌，脊椎動物和植物蛋白質的幾種基因。如果GOI不與信號序列融合，則蛋白質可以胞內沉積。蛋白質將在細胞質中蓄集，而且通常不被糖基化，這對于一些細菌蛋白是有益的。如果GOI裝配有一信號序列，則蛋白質將在胞外蓄集。
就產生穩(wěn)定性和宿主菌株修飾作用而言，當一些異源蛋白分泌到真菌培養(yǎng)液中時，它們不是非常穩(wěn)定的，大多數(shù)真菌產生降解異源蛋白的幾種胞外蛋白水解酶。為了避免這一問題，已經(jīng)使用了具有降低的蛋白水解酶產量的一些特殊的真菌菌株作為異源生產的宿主。
為轉化絲狀真菌，對于很多絲狀真菌已經(jīng)研究出一些轉化方案(Ballance 1991，上文)。其中很多方案的基礎是制備原生質體并用PEG和Ca2+離子將DNA插入到原生質體內。然后轉化的原生質體再生，并用各種選擇性標記物選擇轉化的真菌。用于轉化作用的標記物是一些營養(yǎng)缺陷型標記物，例如argB，trpC，niaD，和pyrG，抗生素抗性標記物，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一種很常用的轉化標記物是構巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，高拷貝數(shù)的該基因用丙烯酰胺作為唯一氮源使真菌生長。
盡管EP-B-0470145和CA-A-2006454中沒有公開本發(fā)明所述的酶，編碼該酶的核苷酸序列和本發(fā)明的啟動子，但這兩篇文獻對這些類型的技術提供了一些有用的背景注釋，可以應用到制備本發(fā)明轉基因植物。一些這樣的背景說明包括在下面的注釋中。
基因工程改變的植物的構建的基本原理是在植物基因組中插入遺傳信息，從而獲得插入物質的穩(wěn)定保持。
插入遺傳信息有幾種技術，兩個主要的原理是直接引入遺傳信息和使用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。一般性技術的綜述可以參見Potrykus(植物生理和植物分子生物學年度綜述(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol)42205-225)和Christou(農業(yè)-食品-工業(yè)(Agro-Food-Industry)Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)的文章。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，其攜有本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建物，而且能將該啟動子或核苷酸序列或構建物插入到一生物體，例如一種植物，的基因組中。
所述載體系統(tǒng)可以包含一個載體，但也可以包含兩個載體。在有兩個載體的情況下，通常認為該載體系統(tǒng)是二元載體系統(tǒng)(binary vectorsystem)。二元載體系統(tǒng)進一步詳細描述于Gynheung An等(1980)，二元載體，植物分子生物學手冊A3，1-19(Binary Vectors，PlantMolecular Biology Manual A3，1-19)。
用一種給定的啟動子或核苷酸序列或構建物轉化植物細胞的一種被廣泛應用的系統(tǒng)的基礎是使用來自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質?；騺碜园l(fā)根病土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri質粒，An等，(1986)，植物生理(Plant Physiol)81，301-305，和Butcher D.N.等，(1980)，植物病理學家的組織培養(yǎng)方法(Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，編著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。
已經(jīng)構建出適用于構建上述植物或植物細胞構建物的幾種不同的Ti和Ri質粒。一個非限制性的這樣的Ti質粒的例子是pGV3850。
本發(fā)明的啟動子，或核苷酸序列或構建物應該優(yōu)選插入到T-DNA或相鄰T-DNA序列的末端序列之間的Ti質粒中，從而避免這些緊鄰T-DNA邊界的序列破碎，因為這些區(qū)中的至少一個顯示出對于將修飾的T-DNA插入植物基因組是必需的。
從上面的解釋應該理解，如果所述生物體是一種植物，則本發(fā)明載體系統(tǒng)優(yōu)選是包含感染植物所必需的序列(例如Vir區(qū))和T-DNA序列的邊界部分之至少一個的載體系統(tǒng)，其中所述邊界部分位于與遺傳構建物同的載體上。
而且，所述載體系統(tǒng)優(yōu)選是根癌土壤桿菌Ti-質粒或發(fā)根病土壤桿菌Ri-質?；蛘咂溲苌?，因為這些質粒是公知的，而且廣泛應用于轉基因植物構建。存在很多載體系統(tǒng)，它們以這些質?；蚱溲苌餅榛A。
在轉基因植物構建中，本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建物可以首先構建在一種微生物中，在該微生物中載體可以復制，而且其容易操作，一種有用的微生物的例子是E.coli，但也可以使用具有上述性質的其它微生物。當在E.coli中構建了如上定義的載體系統(tǒng)中的載體后，如果需要，將其轉移到合適的土壤桿菌菌株中，例如轉移到根癌土壤桿菌中。因此，優(yōu)選將載有本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建的Ti-質粒轉移到合適的土壤桿菌菌株，如A.tumefaciens(根癌土壤桿菌)中，從而得到載有本發(fā)明啟動子，核苷酸序列或構建的土壤桿菌細胞，其中DNA接著被轉移到要修飾的植物細胞中。
在CA-A-2006454中報道了可以獲得包含E.coli復制系統(tǒng)和使選擇轉化細胞成為可能的標記物的大量克隆載體。這些載體包含例如pBR 322，pUC系列，M13 mp系列，pA CYC 184等。
用這種方法，本發(fā)明核苷酸或構建或啟動子可以被插入到載體中合適的限制性位點。包含的質粒用于在E.coli中轉化。E.coli細胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后收獲，并裂解。然后回收質粒。通常使用的分析方法是序列測定分析，限制性酶切分析，電泳，還有生物化學和分子生物學方法。每步操作后，使用的DNA序列可以限制性酶切并與下一個DNA序列連接。每一序列可以在相同或不同質粒中克隆。
在植物中本發(fā)明所期望啟動子或構建物或核苷酸序列的每一插入方法之后，可能需要存在和/或插入另一些DNA序列。如果例如為了轉化而使用了植物細胞中的Ti-或Ri-質粒，則該Ti-和Ri-質粒T-DNA的至少右邊界，而常常是右邊界和左邊界(作為插入基因的側翼區(qū))可以被連接。為轉化植物細胞而使用T-DNA已經(jīng)被深入研究，而且在EP-A-120516中有描述；Hoekema，于The Binary Plant VectorSystem offset drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，植物科學評論(Crit Rev，Plant Sci.)，41-46；和An等，EMBOJ(1985)4277-284。
用土壤桿菌直接感染植物組織是一項簡單的技術，已經(jīng)被廣泛應用，且在Butcher D.N.等(1980)的《植物病理學家的組織培養(yǎng)方法》，編著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中有描述。該技術的進一步說明參見Potrykus(植物生理植物分子生物學年度綜述)(Annu RevPlant Mol Biol)42205-225)和Christou(農業(yè)-食品-工業(yè)，Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)。用這項技術，可以在植物的某些部分或組織，即在植物的葉，根，莖，或其它部位的一部分上感染植物。
一般對于用攜有所述啟動子和/或所述GOI的土壤桿菌直接感染植物組織，要將要被感染的植物切出刀口，例如用剃刀切割植物，或者用針將植物刺孔，或者用砂紙磨擦植物。然后用土壤桿菌接種傷口，之后，接種后的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長，使其生長成成熟植物。
當植物細胞被構建后，這些細胞可以根據(jù)公知的組織培養(yǎng)方法生長和保持，例如在補加有必需生長因素例如氨基酸，植物激素，維生素等之合適的培養(yǎng)基質中培養(yǎng)細胞。
轉化的細胞再生成基因工程修飾的植物可以用植物自細胞或組織培養(yǎng)物再生的公知方法進行，例如通過用抗生素選擇轉化的枝，和通過在含有合適營養(yǎng)成分，植物激素等的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)枝而進行。
對于植物轉化的進一步說明參見EP-A-0449375。
總之，本發(fā)明提供了具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶和編碼這種酶的核苷酸序列。另外，提供了能控制那個，或另一個核苷酸序列表達的啟動子。另外其包括對于相同核苷酸序列表達的終止子和信號序列。
下面的樣品根據(jù)布達佩斯條約保藏在認可的保藏單位The NationalCollections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)，大不列顛和北愛爾蘭聯(lián)合王國，蘇格蘭，Aberdeen，Machar Drive 23號，AB21RY，1995年1月16日包含質粒pB53.1的E.coli{即E.coli DH 5α-pB53.1}保藏號是NCIMB 40703。
現(xiàn)在通過實施例的方式說明本發(fā)明。
下面的實施例參考附圖進行，其中；圖1-10是早期專利申請的啟動子和GOI序列，對于本發(fā)明的各方面是有用的。
圖11是保藏物NCIMB 40703的主體，質粒pB53.1的質粒圖；圖12是對本發(fā)明啟動子進行缺失的綱要圖解；圖13是pXP-AMY質粒圖；圖14是pXP-XssAMY質粒圖；圖15是圖解；圖16是HP-TLC曲線；圖17是HP-TLC曲線；圖18是HPLC圖譜；圖19是粘度圖示；圖20是活性圖示；圖21是活性圖示；圖22是活性圖示；下面的敘述討論特別是重組DNA技術的應用。重組DNA技術的一般性說明可以參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.Maniatis T(編著)《分子克隆，實驗室手冊》(Molecular Cloning A laboratory manual.)第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press New York 1989。
在這些實施例中，本發(fā)明酶有時稱作AbfC，另外，本發(fā)明啟動子有時稱作AbfC啟動子。阿拉伯呋喃糖苷酶的純化黑色曲霉3M43在含有麥糠和甜菜肉質部分的培養(yǎng)基中生長。發(fā)酵肉湯從肉湯經(jīng)過濾的固體部分制備，濃縮的發(fā)酵肉湯裝載到用20mM Tris，HCl pH7.5平衡過的25×100mm Q-SEPHAROSE(Pharmacia)高效柱上，線性梯度是O′-500Mm NaCl，收集洗脫液級分。阿拉伯呋喃糖苷酶在130-150Mm NaCl處洗脫出來。
合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的級分，用50×200mm G-25 SEPHAROSE Superfine(Pharmacia)脫鹽。用蒸餾水洗脫柱子。
脫鹽后用High-Trap旋轉柱濃縮酶，接著將濃縮的脫鹽的級分在50×600mm SUPERPEX 50柱上進行凝膠過濾。裝載樣品，用0.2M磷酸鹽緩沖pH7.0加0.2M NaCl洗脫柱子，收集洗脫液級分。
合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的級分并脫鹽，并且如上所述濃縮。合并的級分裝載到用50mM含有1.5M(NH4)2SO4的磷酸鹽緩沖液pH6.0平衡過的16×100mm Phenylsepharose高效柱(Pharmacia)上。使用(NH4)2SO4濃度自1.5-0M變化的濃度，并分級分收集洗脫液。合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的級分。使用phast系統(tǒng)凝膠(Pharmacia)通過SDS-PAGE評價阿拉伯呋喃糖苷酶的純度。表征通過使用激光解吸技術的質譜測定純化的阿拉伯呋喃糖苷酶的分子量，發(fā)現(xiàn)阿拉伯呋喃糖苷酶的MW是33,270D±50D。
使用廣譜pI試劑盒(Pharmacia)測定pI值。阿拉伯呋喃糖苷酶的pI值大約為3.7。
SDS-PAGE分析后，處理PAS試劑顯示出阿拉伯呋喃糖苷酶是糖基化的。根據(jù)I.Van Seuningen和M.Davril(1992)《電泳》(Electrophoresis)13，pp97-99的方法進行PAS染色。
測定AbfC活性對于水溶性戊聚糖(WSP)濃度(mg/ml)的函數(shù)。結果在圖21中給出。結果表明在底物濃度為8mg/ml WSP時，AbfC活性達到最大。pH活性研究用來自小麥的水溶性戊聚糖10mg/ml作為50mM檸檬酸磷酸鈉緩沖液中的底物研究pH對本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影響。溫育時間為15分鐘。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶有自大約2.5至大約7.0的寬pH最佳范圍(參見圖20)，更特別的是自大約3.3至大約4.6，更特別的是大約4。溫度活性研究用來自小麥的水溶性戊聚糖10mg/ml作為pH5.0之50mM乙酸鈉中的底物研究溫度對本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影響。溫育時間為15分鐘。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶在大約40℃至大約60℃，更優(yōu)選在大約45℃至大約55℃，更優(yōu)選大約50℃的溫度時有最佳活性(圖22)。該酶在大約10℃仍有活性，并在70℃和80℃顯示出殘留活性。阿拉伯呋喃糖苷酶的氨基酸序列分析用Stone & Williams 1993說明的方法的改良方法，用購自BoehringerMannheim的Lys-C序列測定級內切蛋白酶消化所述的酶(Stone，K.L.和Williams，K.R.(1993)“蛋白質的酶消化和HPLC肽分離”，Matsudaira P.(編著)，《用于微量測序的蛋白質和肽純化的實驗指南》，第二版，科學出版社，San Diego，1993，pp.45-73(Enzymaticdigestion of Protein and HPLC Peptide Isolation、InMatsudaira P.(Editor).A Practical Guide to Protein and Peptide Purification forMicrosequencing.)。
冷凍干燥的β-阿拉伯呋喃糖苷酶(0.4mg)溶解于50μl之8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。上面充滿N2后加入5μl 45MmDTT，蛋白質在50℃ N2下變性并還原15分鐘。冷卻至RT后，加入5μl100Mm碘代乙酰胺以使半胱氨酸衍生物化15分鐘，條件是RT，黑暗，N2。接著加入90μl水和5μg內切蛋白酶Lys-C的50μl 50Mm Tricine和10mM EDTA，pH8.0的溶液，消化作用在37℃ N2下進行24小時。所得肽在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The SeparationsGroup；California)上用反相HPLC分離，使用溶劑A0.1％TFA水溶液，溶劑B0.1％TFA乙腈溶液。在使用脈沖液體快循環(huán)于AppliedBiosystems 476A測序儀上測定序列之前，用相同的溶劑體系將選擇的肽再在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm)上進行色譜。發(fā)現(xiàn)下面的肽序列SEQ I.D.No.4SEQ I.D.No.5SEQ I.D.No.6SEQ I.D.No.7SEQ I.D.No.8基因片段PCR克隆的分離用Applied Biosystem DNA合成儀392型合成PCR引物。在這一方面，從發(fā)現(xiàn)的肽序列之一，即SEQ.I.D.No.5合成PCR引物。該引物是來自EMTAQA的一個引物(反向)SEQ ID NO.9GCY TGN GCN GTC ATY TC17mer64mix來自MIVEAIG的一個引物SEQ ID NO.10 ATG ATH GTN GAR GCN ATH GG20mer288mixPCR擴增用100pmol這些引物中的每一種在使用Amplitaq聚合酶的100μl反應液(PERKIN ELMER)進行。接下來的程序是步驟溫度時間1 94℃2min2 94℃1min3 55℃2min4 72℃2min5 72℃5min6 5℃ SOAK步驟2-4重復40個循環(huán)。PCR反應在PERKIN ELMER DNA Thermal循環(huán)儀上進行。
根據(jù)廠商說明(Novagen)，將100bp擴增的片段分離并克隆到pT7-Blue T一載體上。分離黑色曲霉(A.niger)基因組DNA1g冷凍的A.niger菌絲體在研缽中在液氮中研磨。氮氣蒸發(fā)后，研磨的菌絲體用含有1ml 20％十二烷基硫酸鈉的提取緩沖液(100mM TrisHCl，pH8.0，0.50mM EDTA，500mM NaCl，10mM β-巰基乙醇)15ml提取。在65℃保溫10分鐘后加入5ml 5M KAc，pH5.0，混合后將混合物接著在冰上保溫20分鐘。提取后，將混合物離心20分鐘，上清液與0.6體積異丙醇混合以沉淀出提取的DNA。進一步離心15分鐘后，將DNA沉淀溶解于0.7ml TE(10mM Tris，HCl，pH8.0，1mMEDTA)，并用75μl 3M NaAc，pH8.0，和500μl異丙醇沉淀。
離心后，沉積物用70％ETOH沖洗并真空下干燥。DNA溶解于200μl TE并在-20℃下貯存。庫的構建用Tsp 509 I部分消化20μg基因組DNA，給出與EcoRI末端相容的末端。消化的DNA在1％瓊脂糖凝膠上分離并純化4-10kb片段。使用λZAPII EcoRI/CIAP試劑盒(購自Stratagene)根據(jù)廠商說明構建庫。2μl接頭(總計5μl)與來自Stratagene的Gigapack Gold II填充提取物一起裝柱。該庫包含650,000個獨立的克隆。庫的篩選在NZY平板上平板接種2×50000pfu，并在Hybond N薄膜(Sheet)(Amersham)上進行噬斑吸取(plaquelift)。一式兩份進行噬斑吸取。薄膜用購自pharmacia的Ready-to-go標記盒與用32PdCTP(Amersham)標記的PCR克隆雜交。只有當在兩薄膜上都檢測到雜交時才被看做正克隆。對基因進行序列測定，發(fā)現(xiàn)的序列表明所有進行測序的肽都被所發(fā)現(xiàn)的序列編碼。序列信息SEQ.I.D.No.12代表啟動子序列，酶編碼序列，終止子序列和信號序列，和本發(fā)明酶的氨基酸序列。阿拉伯呋喃糖苷酶分析來自小麥粉的兩個不同的阿拉伯木聚糖制品，小麥不溶性戊聚糖(WIP)和小麥可溶性戊聚糖(WSP)用本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶單獨降解，或者組合自A.niger純化的內切木聚糖酶降解。檢測用50Mm 50Mm乙酸鈉緩沖液pH5.0中的1％底物進行。反應在30℃進行32.5小時。反應通過加入3體積乙醇而終止，乙醇沉淀高分子量物質。樣品離心并收集上清液，真空下干燥，并再懸浮于0.5Ml蒸餾水中。樣品以1∶1在水中稀釋，在Chromopack Carbohydrate pb柱(300×7.8mm，cat29010)上分析，應用Shimadzu C-R4A Chromatopac HPLC系統(tǒng)，使用Shimadzu RI D-6A折射率檢測器，根據(jù)廠商說明進行。
柱子用由0.48mg/ml木三糖，0.48mg/ml木二糖，0.60mg/ml木糖和0.58mg/ml L-阿拉伯糖組成的標準樣校準。用設備提供的軟件鑒定和定量各峰值。結果-從小麥不溶性戊聚糖釋放的糖底物是50Mm乙酸鈉緩沖液pH5.0中的1％WIP。
AbfC指本發(fā)明酶；xyl指上文所述的木聚糖酶。結果-從小麥可溶性戊聚糖釋放的糖底物是50Mm乙酸鈉緩沖液pH5.0中的1％WIP。數(shù)值以mg/ml表示。
AbfC指本發(fā)明酶；xyC指上文所述的木聚糖酶。
圖17給出AbfC酶與木聚糖酶A協(xié)同作用的HP-TLC曲線。在該圖中使用了下面的縮寫水溶性戊聚糖(WSP)；水不溶性戊聚糖(WIP)；燕麥木聚糖為底物。標準樣是x-木糖；x2-木二糖；x3-木三糖；A-阿拉伯糖。
圖18給出用1％燕麥斯佩耳特小麥木聚糖為底物的水解產物的HPLC分析。圖18(a)和圖18(b)顯示出當分別單獨使用AbfC酶和木聚糖酶時的產物。圖18(c)顯示出當AbfC酶和木聚糖酶組合使用時的產物。
這些實驗結果提供了兩個重要發(fā)現(xiàn)。
第一，本發(fā)明酶從阿拉伯木聚糖釋放阿拉伯糖，特別是L-阿拉伯糖。
第二，本發(fā)明酶與內切木聚糖酶組合作用明顯高于其各自作用的加合。因此，這兩種酶以協(xié)同方式互相影響酶活性。誘導AbfC基因鑒定誘導物用包含AbfC啟動子與E.coli的β-葡糖醛酸酶編碼基因(uid A)的融合體研究黑色曲霉AbfC編碼基因轉錄的調節(jié)。
GUS產生的轉化產物在不同碳源上生長，并定性定量測定對水解對一硝基苯酚葡糖醛的能力。結果如下碳源 誘導24小時后的GUS活性(1％) (單位/mg)木糖 12.37木糖醇 1.49阿拉伯糖 6.66阿拉伯糖醇 5.30葡萄糖 0.70纖維素二糖 0.95木糖-寡聚物7017.26吡喃葡萄糖苷 0.40甲基-吡喃木糖苷 24.2木葡聚糖(xyloglucan) 1.00果膠 0.27阿拉伯半乳聚糖 2.60阿拉伯糖醇+葡萄糖2.20結果表明AbfC啟動子當在木糖，木糖-寡聚物70，甲基-吡喃木糖苷，阿拉伯糖和阿拉伯糖醇存在下培養(yǎng)24小時后接通。這些研究也表明甲基-木糖吡喃糖苷是所述啟動子的天然的和最強的誘導子。
AbfC啟動子強烈地被葡萄糖阻抑，因此處碳分解代謝物阻抑作用下。但是與所公開的由阿拉伯糖和阿拉伯糖醇誘導的呋喃阿拉伯糖苷酶的啟動子不一樣，本發(fā)明AbfC啟動子由木糖代謝中的中間體強烈調節(jié)。因此，本發(fā)明也涉及一種呋喃阿拉伯糖苷酶啟動子，其中所述啟動子是木糖代謝中間體可誘導的。不同啟動子缺失對AbfC基因表達之調節(jié)的影響為了研究分子水平調節(jié)作用，進行實驗來檢測AbfC基因表達所需要的可能的上游調節(jié)序列。構建在該基因5′上游區(qū)有缺失的一系列質粒(參見圖12)。E coli uid A基因被用作報道基因，并進行定性GUS分析。
結果表明截短的590bp AbfC啟動子包含AbfC基因的可誘導性和其調節(jié)作用所需的足夠的信息。啟動子的100bps序列BamH1位點缺失從Xma111使得減小了該啟動子的活性。因此該100bps區(qū)對于基因表達良好的水平是重要的。ATG之前的290bps缺失鑒定了該區(qū)對于取消該啟動子的活性是重要的但不充分。包含該啟動子構建的分析的所有轉化產物在試驗時顯現(xiàn)非常淺的藍色(+GUS)。這個區(qū)是-170 TCATCCAATAT如所見到的，該區(qū)包含CCAAT元件，而且是推定的常見轉錄激活子的靶物。該序列與在兩種淀粉可誘導啟動子中發(fā)現(xiàn)的核蛋白組合位點相似，所述兩種淀粉可誘導啟動子是黑色曲霉葡糖淀粉酶基因和米曲霉(Aspergillus oryzae)淀粉酶基因，以及構巢曲霉(Aspergillusnidulans)amdS基因。使用用AbfC啟動子和AbfC信號序列轉化的黑色曲霉生產異源蛋白黑色曲霉的轉化黑色曲霉(A.niger)的轉化方案以下述文獻的公開為基礎Buxton，F(xiàn).P.，Gwynne D.I.，Davis，R.W.1985(“用構巢曲霉的argB基因轉化黑色曲霉”(Transformation of Aspergillus niger using the arg Bgene of Aspergillus nidulans)，《基因》(Gene)，37207-214)，Daboussi，M.J.，Djeballi，A.，Gerlinger，C.，Blaiseau，P.L.，Cassan，M.，Lebrun，M.H.，Parisot，D.，Brygoo，Y.1989(“使用構巢曲霉的硝酸鹽還原酶基因轉化幾種有絲真菌”(Transformation ofseven species of filamentous fungi nsing the nitrate Neductose gene ofAspergillus nidulans)，Curr.Genet.15453-456)和Punt，P.J.，van den Hondel，C.A.M.J.J.1992(“以潮霉素B和腐草霉素抗性標記物為基礎轉化有絲真菌”(Transformation of filamentous fungi based onhygromycin B and Phlemycin resistance markers)，《酶學方法》(Meth、Enzym.)216447-457)。
關于原生質體的純化，在5-10ml水中從孢子新形成的N400(CBS 120.49，Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn)(生長了7天)的-PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar)-fromDifco Lab.Detroit)板上沖洗下孢子。用該孢子懸浮液接種盛有200mlPDC(馬鈴薯葡萄糖肉湯，Difco 0549-17-9，Difco Lab、Detroit)的震蕩瓶，并在30℃下震蕩(250rpm)16-20小時。
使用Miracloth紙收獲菌絲體，并將3-4g濕的菌絲體轉移到盛有含75Mg裂解酶(Sigma L-2265)和4500個單位溶細胞酶(Sigma L-8012)的10ml STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris HCl pH7.5，50Mm CaCl2)的無菌陪替氏皿中。
用酶培養(yǎng)菌絲體直至菌絲體降解并釋放出原生質體。然后通過一無菌60μm目過濾器過濾降解的菌絲體。在一甩平式轉頭中以2000rpm的速度離心10分鐘收獲原生質體。棄去上清液，并將沉積物溶解于8ml1.5M MgSO4中后，以3000rpm離心10分鐘。
用移液管將含有原生質體的上層條帶轉移到另一試管中，并加入2ml0.6M KCl。在頂部小心加入5ml 30％蔗糖，試管以3000rpm離心15分鐘。
處于界面帶的原生質體轉移到新的試管中并用1vol.STC稀釋。溶液以3000rpm離心10分鐘。沉積物用STC沖洗兩次，最后溶解于1ml STC中。計數(shù)原生質體，并在轉化前還要濃縮。
關于轉化，將100μl原生質體溶液(106-107原生質體)與含有5-10μg DNA的10μl DNA溶液混合，并在室溫下溫育25分鐘。然后以200μl，200μl和800μl分批小心加入60％PEG-4000。該混合物在室溫下溫育20分鐘。向混合物中加入3ml STC，并小心混合。該混合物以3000rpm離心10分鐘。
去除上清液，并將原生質體增溶于殘留的上清液中，加入3-5ml頂層瓊脂糖，并將原生質體快速涂布于選擇板上。AbfC啟動子和異源基因表達表達載體pXP-Amy(圖13)包含克隆在AbfC啟動子(2.1kb)下游和木聚糖酶A終止子上游的來自Thermomyces lanuginosus的2.1kbα-淀粉酶編碼基因。該載體與潮霉素基因一起作為選擇標記用于共轉化實驗，試驗AbfC啟動子的功能性。
最好的轉化產物聚集在以培養(yǎng)基中至少1克/升α-淀粉酶的震蕩燒瓶中。然后在48小時內檢測淀粉降解活性，并在于糖甜菜肉質部分和小麥糠上生長4天時發(fā)現(xiàn)酶活性峰(圖15)。蛋白質分泌中的AbfC信號序列功能制備包含與來自T.lanuginosus的成熟α-淀粉酶翻譯融合的AbfC基因信號肽的表達構建物，并發(fā)現(xiàn)該構建物在生產菌株中表達。關于這一點，翻譯融合構建物pXPXss-Amy(圖14)置于AbfC啟動子和木聚糖酶A終止信號的轉錄控制下。內源信號肽的插入導致表達淀粉酶的潮霉素抗性標記兩者的共轉化物之提高的可檢測性。該內源信號肽指導細胞外淀粉酶分泌。AbfC蛋白的底物特異性用包含阿拉伯糖的半纖維素測定純化的AbfC的底物特異性來自小麥，燕麥和落葉松的阿拉伯木聚糖，支化的和脫支的阿拉伯糖，阿拉伯半乳聚糖，糖甜菜果膠，和木葡聚糖。
HPLC和HP-TLC結果見圖16，其中使用了下面的縮寫WSP-水溶性戊聚糖，WIP-水不溶性戊聚糖，AG-阿拉伯半乳聚糖，脫B-A-脫支阿拉伯聚糖(de B-A-debranched arabinan)。使用的標準物是A-阿拉伯糖，X-木糖。
結果表明阿拉伯糖是阿拉伯糖基木聚糖的水解產物。沒有水解產物從阿拉伯半乳聚糖，脫支的阿拉伯聚糖或木葡聚糖上釋放出來。阿拉伯糖作為支化阿拉伯聚糖的水解產物而釋放。因此AbfC是一種1，2/1，2脫支酶，而且其對在脫支阿拉伯聚糖和阿拉伯糖基半乳聚糖中發(fā)現(xiàn)的線性1，5α-鍵連的L-阿拉伯糖基呋喃糖殘基沒有活性。該酶在果膠用作底物時也釋放一種產物，相信該產物是包含阿魏酸或阿拉伯二糖的阿拉伯糖。通過AbfC減小粘度關于底物特異性的研究結果也表明本發(fā)明酶可以用來減小飼料的粘度。關于這一點，該酶可以通過去除支化部分而不去除底物的主鏈而減小支化底物的粘度。這與已知的降解底物主鏈的粘度調節(jié)劑相反。
因此，本發(fā)明涉及一種減小支化底物粘度的方法，其中酶降解底物的支化部分但不降解底物的主鏈。
特別是，本發(fā)明涉及用本發(fā)明酶作為粘度調節(jié)劑。
關于這一點，進行實驗研究通過呋喃阿拉伯糖苷酶減小來自小麥粉的水溶性戊聚糖成分的粘度。在該實驗中，6ml水溶性戊聚糖與100μlAbfC一起在20℃，pH5.5條件下溫育20小時。
結果表明(參見圖19)，本發(fā)明酶可以用來減小果膠的粘度，特別是在飲料中-例如在果汁中使用的果膠的粘度。
因此，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明酶來減小果膠粘度。產生抗體通過給兔注射純化的酶，并根據(jù)N Harboe和A Ingild(“免疫，分離免疫球蛋白，估算抗體滴度”(Immunization，Isolation ofImmunoglobulins，Estimation of Antibody Titre)，《定量免疫電泳，方法和應用手冊》(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Methods and Applications)，NH Axelsen等編著，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化學工具”(The Tools ofBiochemistry)，John Wiley & Sons，New York，1977)描述的方法從抗血清中分離免疫球蛋白來產生抗本發(fā)明酶的抗體。總結盡管已知黑色曲霉產生呋喃阿拉伯糖苷酶，但本發(fā)明提供了一種新的有創(chuàng)造性的呋喃阿拉伯糖苷酶，以及編碼該酶的序列，和該序列的啟動子。本發(fā)明一個重要的優(yōu)點在于這種酶能高量生產。
另外，本發(fā)明啟動子和調節(jié)序列(例如信號序列和終止子)可以用來表達或者可以用于生物體中GOI的表達，例如在黑色曲霉中表達。
本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶不同于先前已知的呋喃阿拉伯糖苷酶。關于這一點，先前描述的呋喃阿拉伯糖苷酶-例如EP-A-0506190中的那些酶-其特征在于它們能降解阿拉伯聚糖，并用對硝基苯基阿拉伯糖苷分析測定。
本發(fā)明呋喃阿拉伯糖苷酶不降解阿拉伯聚糖，而且在對硝基苯基阿拉伯糖苷上只可見到極小活性。
相反，本發(fā)明阿拉伯呋喃糖苷酶用于降解阿拉伯木聚糖。因此，本發(fā)明呋喃阿拉伯糖苷酶與現(xiàn)有分離的呋喃阿拉伯糖苷酶相當不同。
更具體的是，本發(fā)明酶能從阿拉伯木聚糖的木糖主鏈上特異性地裂解阿拉伯糖。
本發(fā)明酶是有用的，因為其能改進制備食品和飼料的方法以及改良食品和飼料本身。例如，可以將本發(fā)明酶加到富含阿拉伯木聚糖的動物飼料中。當加入到單胃動物(例如家禽或豬)的含有谷物例如大麥，小麥，玉米，黑麥或燕麥或谷物副產物例如小麥糠或玉米糠的飼料(包括青貯飼料)時，這種酶能明顯提高植物細胞壁的破碎，使動物更好地利用植物養(yǎng)分。結果提高了生長速率和/或飼料轉化。而且，阿拉伯木聚糖降解酶可以用來減小含阿拉伯聚糖的飼料的粘度。如果優(yōu)選預先浸泡或濕的食物，則可以在處理飼料或青貯飼料之前加入本發(fā)明阿拉伯木聚糖降解酶。
特別的優(yōu)點在于本發(fā)明酶能組合木聚糖酶，尤其是內切木聚糖酶使用。
本發(fā)明酶另一個可能的應用在于紙漿和造紙工業(yè)。經(jīng)常報道使用木聚糖酶在從半纖維素主鏈的纖維素和半纖維素殘基上去除木質素和萜類是有好處的，這是造紙中加工木料，木漿或木料衍生產物的一個基本步驟。向木聚糖酶處理步驟中加入根據(jù)本發(fā)明生產的阿拉伯木聚糖降解酶會有助于含阿拉伯聚糖半纖維素主鏈的降解，因此有利于改進并更有效地去除木質素和萜類兩者。應用阿拉伯木聚糖降解酶在其中半纖維素主鏈中包含葡糖醛酸的軟木加工中特別有好處。
本發(fā)明酶也是有用的，因為其以與內切木聚糖酶的協(xié)同方式作用(見上述結果)。
本發(fā)明的其它改變在不超出本發(fā)明范圍情況下對本領域技術人員來說是顯而易見的。序列表SEQ ID NO1酶序列(i)序列特征(A)長度296個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Cys Ser Leu Pro Ser1 5Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly10 15 20Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His25 30 35Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met40 45 50Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Lys55 60 65 70Thr Ala Thr Pro Tyr Asn Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys75 80 85Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe90 95 100Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser105 110 115Glu Lys Ala Leu Phe Thr Gly Lys Leu Ser Asp Ser Ser Thr Gly Ala120 125 130Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe135 140 145 150Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu155 160 165Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala170 175 180Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly185 190 195Glu Gly Asn Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr200 205 210Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu215 220 225 230Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Lys Pro Phe Ala Ala Lys Pro235 240 245Thr Val Ala Pro Pro Gly Pro Lys Thr Leu Ala Met Val Thr Trp Phe250 255 260Ala Thr Thr Leu Ile Lys Pro *265 270SEQ ID NO2核苷酸編碼序列AAA TGC TCT CTT CCA TCG TCC TAT AGT TGG AGT TCA ACC GAT GCT CTCGCA ACT CCT AAG TCA GGA TGG ACC GCA CTG AAG GAC TTT ACT GAT GTTGTC TCT GAC GGC AAA CAT ATC GTC TAT GCG TCC ACT ACT GAT GAA GCGGGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC TTT GGC GCT TTC TCA GAG TGG TCG AACATG GCA TCT GCT AGC AAG ACA GCC ACC CCC TAC AAT GCC GTG GCT CCTACC CTG TTC TAC TTC AAG CCG AAA AGC ATC TGG GTT CTG GCC TAC CAATGG GGC TCC AGC ACA TTC ACC TAC CGC ACC TCC CAA GAT CCC ACC AATGTC AAC GGC TGG TCG TCG GAG AAG GCG CTT TTC ACC GGA AAA CTC AGCGAC TCA AGC ACC GGT GCC ATT GAC CAG ACG GTG ATT GGC GAC GAT ACGAAT ATG TAT CTC TTC TTT GCT GGC GAC AAC GGC AAG ATC TAC CGA TCCAGC ATG TCC ATC GAT GAA TTT CCC GGA AGC TTC GGC AGC CAG TAC GAGGAA ATT CTG AGT GGT GCC ACC AAC GAC CTA TTC GAG GCG GTC CAA GTGTAC ACG GTT GAC GGC GGC GAG GGC AAC AGC AAG TAC CTC ATG ATC GTTGAG GCG ATC GGG TCC ACT GGA CAT CGT TAT TTC CGC TCC TTC ACG GCCAGC AGT CTC GGT GGA GAG TGG ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAG GAT AAACCC TTC GCA GCA AAG CCA ACA GTG GCG CCA CCT GGA CCG AAG ACA TTAGCC ATG GTG ACT TGG TTC GCA ACA ACC CTG ATC AAA CCA TGASEQ ID NO3啟動子序列CTGCAGAAGA TGGCAGTCGC CACAGCCGAT CACCCGATCC ATACTGGATG TTGTAACTTG 60GAGACAGCCT GCAGATGCTC TGATGAAGGT CTGCAAATAG TTCCTGGACC TCGATAGTGA 120AGTATACCGA TTCGTCAATG TTGTATATCC AGCCACTTTG AAAGTACCAA CTTTTAGTTC 180GATTGATCAG AATACTTTTG GTGTGTAACA TTGACAAGCC AAATTATCAA TCTCTTCTAC 240CGGTAAGGTG TCAACTACCC GGCCGAAAGT ACCGGAAGGT CGTGGTGTTT TAAGGTGAAA 300CAACTATCAG GGCGGCAATG TGTCAAAGTA GAACCAGTTT GCTTAGCGCC ATTAGGATCC 360ACGCCTAGAC CCTTGATGCC CGGGAGTTAT CCGTCCTGTC ACAGCAATTA TTTCCCCGAG 420TCTACTGCCG AAGAACAGCC ATTGTGGCGT ACTCACGGAA TTACCCACTG TGTAGGGTAG 480TCTTGAACGC CGTTCTAGAC ACGGCAACGC TCCGGTGGAC GATCGTTTCT GGCTAATGTA 540CTCCGTAGTT TAGGCAGCAT GCTGATCATC TTCCCCCTAG GGAAAGGCCC CTGAATAGTG 600CGCCAAAATG AGCTTGAGCA AAGGAATGTT CTTTCTAAGC CAAAGTGAGG GAAATAACCA 660AGCAGCCCAC TTTTATCCGA AACGTTTCTG GTGTCATCCA ATATGGATAA ATCCCGATTG 720TTCTTCTGCA CATATCTCTA TTGTCATAAG TGCAACTACA TATATTTGAA CATGGTTTGG 780TCCTCTTTCC AAGTTATTCG TTCTCCGTGA CCAGCGATTT CAGCCATTGA TTCTTTTGTT 840TCTTTCCCCG CGGATAAACT CATACGAAGSEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Cys Ser Leu Pro Ser Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu1 5 10 15Ala Thr Pro Lys20SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度41氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型分子內(xi)序列描述SEQ ID NO5Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe1 5 10 15Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu Met Thr Ala Gln Ala20 25 30Ala Ser Glu Asp Lys Pro Phe Xaa Gly35 40SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型分子內(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe Thr Tyr1 5 10 15Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val20 25SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型分子內(xi)序列描述SEQ ID NO7Asp Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser1 5 10 15Met Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Xaa Ser Asn Met Ala Ser20 25 30SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長度41個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型分子內(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Iyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu Phe Pro Gly Ser Phe Gly1 5 10 15Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala Thr Asn Asp Leu Phe Glu20 25 30Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly35 40SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE”(xi)序列描述SEQ ID NO6GCYTGNGCNG TCATYTC17SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE”(xi)序列描述SEQ ID NO10ATG ATH GTN GAR GCN ATH GG 20SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度89個堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“PCR fragment”(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGATTGTGG AGGCGATCGG GTCCACTGGA CATCGTTATT TCCGCTCCTT CACGGCCAGC60AGTCTCGGTG GAGAGATGAC CGCACAGGC 89SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度2555個堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體黑色曲霉(B)菌株3M43(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置870..1757(ix)特征
(A)名稱/關鍵詞sig_peptide(B)位置870..947(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat_peptide(B)位置948..1754(xi)序列描述SEQ ID NO12CGGTAAGGTG TCAACTACCC GGCCGAAAGT ACCGGAAGGT CGTGGTGTTT TAAGGTGAAA300CAACTATCAG GGCGGCAATG TGTCAAAGTA GAACCAGTTT GCTTAGCGCC ATTAGGATCC360ACGCCTAGAC CCTTGATGCC CGGGAGTTAT CCGTCCTGTC ACAGCAATTA TTTCCCCGAG420TCTACTGCCG AAGAACAGCC ATTGTGGCGT ACTCACGGAA TTACCCACTG TGTAGGGTAG480TCTTGAACGC CGTTCTAGAC ACGGCAACGC TCCGGTGGAC GATCGTTTCT GGCTAATGTA540CTCCGTAGTT TAGGCAGCAT GCTGATCATC TTCCCCCTAG GGAAAGGCCC CTGAATAGTG600CGCCAAAATG AGCTTGAGCA AAGGAATGTT CTTTCTAAGC CAAAGTGAGG GAAATAACCA660AGCAGCCCAC TTTTATCCGA AACGTTTCTG GTGTCATCCA ATATGGATAA ATCCCGATTG720TTCTTCTGCA CATATCTCTA TTGTCATAAG TGCAACTACA TATATTTGAA CATGGTTTGG780TCCTCTTTCC AAGTTATTCG TTCTCCGTGA CCAGCGATTT CAGCCATTGA TTCTTTTGTT840TCTTTCCCCG CGGATAAACT CATACGAAG ATG AAG TTC TTC AAT GCC AAA GGC 893Met Lys Phe Phe Asn Ala Lys Gly-26 -25 -20AGC TTG CTG TCA TCA GGA ATC TAC CTC ATT GCA TTA ACC CCC TTT GTT 941Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Leu Thr Pro Phe Val-15 -10 -5AAC GCC AAA TGC TCT CTT CCA TCG TCC TAT AGT TGG AGT TCA ACC GAT 989Asn Ala Lys Cys Ser Leu Pro Ser Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp1 5 10GCT CTC GCA ACT CCT AAG TCA GGA TGG ACC GCA CTG AAG GAC TTT ACT 1037Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr15 20 25 30GAT GTT GTC TCT GAC GGC AAA CAT ATC GTC TAT GCG TCC ACT ACT GAT 1085Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp35 40 45GAA GCG GGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC TTT GGC GCT TTC TCA GAG TGG 1133Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp50 55 60TCG AAC ATG GCA TCT GCT AGC AAG ACA GCC ACC CCC TAC AAT GCC GTG 1181Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Lys Thr Ala Thr Pro Tyr Asn Ala Val65 70 75GCT CCT ACC CTG TTC TAC TTC AAG CCG AAA AGC ATC TGG GTT CTG GCC 1229Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala80 85 90TAC CAA TGG GGC TCC AGC ACA TTC ACC TAC CGC ACC TCC CAA GAT CCC 1277Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro95 100 105 110ACC AAT GTC AAC GGC TGG TCG TCG GAG AAG GCG CTT TTC ACC GGA AAA 1325Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser Glu Lys Ala Leu Phe Thr Gly Lys115 120 125CTC AGC GAC TCA AGC ACC GGT GCC ATT GAC CAG ACG GTG ATT GGC GAC 1373Leu Ser Asp Ser Ser Thr Gly Ala Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp130 135 140GAT ACG AAT ATG TAT CTC TTC TTT GCT GGC GAC AAC GGC AAG ATC TAC 1421Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr145 150 155CGA TCC AGC ATG TCC ATC GAT GAA TTT CCC GGA AGC TTC GGC AGC CAG 1469Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln160 165 170TAC GAG GAA ATT CTG AGT GGT GCC ACC AAC GAC CTA TTC GAG GCG GTC 1517Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val175 180 185 190CAA GTG TAC ACG GTT GAC GGC GGC GAG GGC AAC AGC AAG TAC CTC ATG 1565Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly Glu Gly Asn Ser Lys Tyr Leu Met195 200 205ATC GTT GAG GCG ATC GGG TCC ACT GGA CAT CGT TAT TTC CGC TCC TTC 1613Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe210 215 220ACG GCC AGC AGT CTC GGT GGA GAG TGG ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAG 1661Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu225 230 235GAT AAA CCC TTC GCA GCA AAG CCA ACA GTG GCG CCA CCT GGA CCG AAG 1709Asp Lys Pro Phe Ala Ala Lys Pro Thr Val Ala Pro Pro Gly Pro Lys240 245 250ACA TTA GCC ATG GTG ACT TGG TTC GCA ACA ACC CTG ATC AAA CCA TGA 1757Thr Leu Ala Met Val Thr Trp Phe Ala Thr Thr Leu Ile Lys Pro *255 260 265 270CTGTCGATCC TTGCAACCTC CAGTTGCTCT ATCAGGGCCA TGACCCCCAA CAGCAGTGGC 1817GACTACAACC TCTTGCCATG GAAGCCGGGC GTCCTTACCT TGAAGCAGTG ACGAGCTTAT 1877CTTTAGTTGC AGATCGTGTT TCTCCTTTCT TCTTCAAGTA GTTTTAGTGG TGGAAGACAG 1937CAGAAGGTGG TCATCATCTT AGGCTCAGTT GGGGTGGGCT CCTGCCACGT TTTGTCCATA 1997GGCTAGTAAT TTGCACGGAA TTCAGTTCAT TGGCAAGGAG TGCGGTACGA ATACCTGTTT 2057TCACAATAGC AATTAGGCCC AGTAGTTATA CTACGTACTG GAATTGAGTA CTCGTAGTAG 2117CAAGATTGTT TGCCTCAGAG GGAATGGCCG ACACGTGAGC AAGTCACCTT CATCAGCTAG 2177TCGCGTTCCA CATAGACAAT GGTCCAGCTC CAGAGTGGAA TTTGGGCTAC TTTGAACGAT 2237GGCCGATTGA ATCGCGCGTC TCCTCAATTG TATTTAACCA CAATAGGCCA GGTATTGGCA 2297TTCACTCTCC GCCTTTGCGG GTGCCGGCAC GAGATGTCTC CTGAAGAAAC TAGGCAACGA 2357GCAGACTGTG GATATGGGAG ATGGTTGACG ATGTGCTTCT TGGTAAATTT GAAGCCTCCA 2417GGGCCTCTAG AAAGGCGGGA ATTTAAATCT CAAGTGCCCT AACGTGTCCG ACCACGGTGT 2477TGATCATCAT TCATTGAATC GGATAACAGT CTTGGTTCGG AAACTGAACA GGCGGCTCTT 2537GAATGACACT CTGGATCC 2555SEQ ID NO13的信息終止子序列CTGTCGATCC TTGCAACCTC CAGTTGCTCT ATCAGGGCCA TGACCCCCAA CAGCAGTGGC 60GACTACAACC TCTTGCCATG GAAGCCGGGC GTCCTTACCT TGAAGCAGTG ACGAGCTTAT120CTTTAGTTGC AGATCGTGTT TCTCCTTTCT TCTTCAAGTA GTTTTAGTGG TGGAAGACAG180CAGAAGGTGG TCATCATCTT AGGCTCAGTT GGGGTGGGCT CCTGCCACGT TTTGTCCATA240GGCTAGTAAT TTGCACGGAA TTCAGTTCAT TGGCAAGGAG TGCGGTACGA ATACCTGTTT300TCACAATAGC AATTAGGCCC AGTAGTTATA CTACGTACTG GAATTGAGTA CTCGTAGTAG360CAAGATTGTT TGCCTCAGAG GGAATGGCCG ACACGTGAGC AAGTCACCTT CATCAGCTAG420TCGCGTTCCA CATAGACAAT GGTCCAGCTC CAGAGTGGAA TTTGGGCTAC TTTGAACGAT480GGCCGATTGA ATCGCGCGTC TCCTCAATTG TATTTAACCA CAATAGGCCA GGTATTGGCA540TTCACTCTCC GCCTTTGCGG GTGCCGGCAC GAGATGTCTC CTGAAGAAAC TAGGCAACGA600GCAGACTGTG GATATGGGAG ATGGTTGACG ATGTGCTTCT TGGTAAATTT GAAGCCTCCA660GGGCCTCTAG AAAGGCGGGA ATTTAAATCT CAAGTGCCCT AACGTGTCCG ACCACGGTGT720TGATCATCAT TCATTGAATC GGATAACAGT CTTGGTTCGG AAACTGAACA GGCGGCTCTT780GAATGACACT CTGGATCC 798SEQ ID NO14的信息信號序列ATG AAG TTC TTC AAT GCC AAA GGC AGC TTG CTG TCA TCA GGA ATC TAC 48CTC ATT GCA TTA ACC CCC TTT GTT AAC GCC 78SEQ ID NO15信號序列(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Lys Phe Phe Asn Ala Lys Gly Ser Leu 10Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Leu 20Thr Pro Phe Val Asn Ala 2權利要求
1.一種從曲霉屬獲得的酶，其中該酶具有下面的特征a.MW是33,270D±50Db.pI值大約是3.7c.阿拉伯木聚糖降解活性d.最適pH為從大約2.5至大約7.0(更優(yōu)選從大約3.3至大約4.6，更優(yōu)選大約4)e.最適溫度為從大約40℃至大約60℃(更優(yōu)選自大約45℃至大約55℃，更優(yōu)選大約50℃)；其中這種酶能從阿拉伯木聚糖的木糖主鏈上裂解阿拉伯糖。
2.一種具有SEQ.I.D.No.1所示序列，其變體，同系物或片段的酶。
3.一種由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其變體，同系物或片段，或者與其互補的序列編碼的酶。
4.編碼權利要求1的酶的核苷酸序列。
5.編碼權利要求2的酶的核苷酸序列。
6.具有SEQ.I.D.No.2所示序列，其變體，同系物或片段，或者其互補序列的核苷酸序列。
7.與一啟動子操作連接的任一權利要求4至6的核苷酸序列。
8.權利要求7的核苷酸序列，其中啟動子是具有如SEQ.I.D.No.3所示序列或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的啟動子。
9.具有SEQ.I.D.No.3所示序列或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的啟動子。
10.與GOI操作連接的權利要求9的啟動子。
11.權利要求10的啟動子，其中啟動子GOI操作連接，其中GOI包含任一項權利要求4-6的核苷酸序列。
12.具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的終止子。
13.具有SEQ.I.D.No.14所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的信號序列。
14.包含或表達權利要求1至13之任一的本發(fā)明的構建物。
15.包含或表達權利要求1至14之任一的本發(fā)明的載體。
16.包含或表達權利要求1至15之任一的本發(fā)明的質粒。
17.包含或表達權利要求1至16之任一的本發(fā)明的轉基因生物體。
18.權利要求17的轉基因生物體，其中生物體是一種真菌。
19.權利要求18的轉基因生物體，其中生物體是一種絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬。
20.權利要求17的轉基因生物體，其中生物體是一種植物。
21.制備項權利要求1至3之任一的酶的方法，包括表達權利要求4至8之任一的核苷酸序列。
22.權利要求21的方法，其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或者是其變體，同系物或片段，所述核苷酸序列具有SEQ.I.D.No.2所示序列，或者是其變體，同系物或片段，或者是其互補序列。
23.權利要求21或22的方法，其中通過用權利要求9的啟動子控制(部分或全部)表達。
24.一種通過使用一啟動子表達GOI的方法，其中啟動子是權利要求9的啟動子。
25.權利要求1至3之任一的酶或通過權利要求21至24之任一的方法制備的酶降解阿拉伯木聚糖的用途。
26.權利要求24的用途，其中酶與木聚糖酶，優(yōu)選內切木聚糖酶(endoxylanase)組合使用。
27.降解阿拉伯木聚糖的酶的組合物，該組合物包括權利要求1至3之任一的酶或通過權利要求21至24之任一的方法制備的酶；和木聚糖酶。
28.質粒NCIMB 40703，或從中獲得的核苷酸序列，所述序列用來表達能降解阿拉伯木聚糖的酶，或控制其表達，或控制另一GOI的表達。
29.具有SEQ.I.D.No.15所示序列或其變體，同系物或其片段的信號序列。
30.權利要求1至3之任一的酶或權利要求21至24之任一的方法制備的酶在制藥或食物生產中防止消化不良和/或提高營養(yǎng)吸收的用途。
31.一種具有阿拉伯木聚糖降解活性的呋喃阿拉伯糖苷酶，其與抗純化的具有SEQ.I.D.No.1所示序列的呋喃阿拉伯糖苷酶抗體起免疫反應。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能降解阿拉伯木聚糖的酶。另外公開了編碼這種酶的核苷酸序列和控制這種酶表達的啟動子。
文檔編號C12N15/00GK1198778SQ96193916
公開日1998年11月11日 申請日期1996年3月11日 優(yōu)先權日1995年3月17日
發(fā)明者S·M·馬德里, P·拉斯慕森, A·巴魯赫 申請人:丹尼斯科有限公司