專利名稱：β－內(nèi)酰胺酶的底物及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明總的來說涉及化學(xué)和生物領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及測定基因表達(dá)所使用的組合物和方法。
報告基因測試可測定基因啟動子的活性，該測定吸取分子生物技術(shù)之優(yōu)點，該技術(shù)使人們可將異源基因置于任何啟動子控制之下，并將該構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的基因組中[參見Gorman，C.M.等人，Mol.Cell Biol.21044-1051(1982)；Alam，J.和Cook，J.L.，Anal.Biochem.188245-254(1990)]。啟動子激活還誘導(dǎo)報告基因，或者代替內(nèi)源基因。通過設(shè)計，報告基因編碼容易檢測和測量的蛋白，一般是一種能將市售底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶。此種轉(zhuǎn)換便于接著進(jìn)行色譜測量或直接光學(xué)測定，并可定量分析所產(chǎn)生的酶量。
報告基因在許多研究不同生物體基因調(diào)節(jié)的各種質(zhì)粒上，可從市場購得[Alam和Cook上述文獻(xiàn)]。所研究的啟動子可以插入質(zhì)粒上報告基因前為此目的所提供的多克隆位點上[Rosenthal，N.，Methods Enzymol152704-720(1987)；Shiau，A.和Smith，J.M.，Gene 67295-299(1988)]。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這些基因?qū)爰?xì)胞型或整個生物體中(例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.克隆基因在培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，見《分子克隆》，Nolan，C.編輯，New YorkCold Spring Harbor Laboratory出版社出版，1989)。然后可用質(zhì)粒上提供的抗性標(biāo)志挑選成功地被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
因容易使用，且大量信號擴(kuò)增，使得該技術(shù)在基因調(diào)節(jié)研究中頗為流行。DNA→RNA→酶→產(chǎn)物→信號這一連串步驟的每一步均使該序列在下一步擴(kuò)增。越往下測量這一連串步驟的下一步，則獲得的信號越多。
在理想的報告基因測試中，所研究的啟動子控制下的報告基因，被暫時地，或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。受體激活作用導(dǎo)致通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯活動而改變酶的水平。通過底物上的酶促作用，可以測量存在的酶量。當(dāng)加入到胞外溶液中時，該底物是小型不帶電分子，可以穿透漿膜與酶相遇。也可以采用帶電分子，但該電荷需用基團(tuán)掩蔽，而所述基團(tuán)將被內(nèi)源細(xì)胞酶裂解(例如可由胞質(zhì)酯酶裂解的酯類)。
因為很多原因，對于與酶相互作用時其熒光光譜顯示變化的底物之應(yīng)用，特別令人青睞。某些測試中，產(chǎn)生熒光的底物被轉(zhuǎn)換成發(fā)熒光產(chǎn)物。另外，隨報告基因酶中的轉(zhuǎn)換作用，發(fā)熒光底物改變其熒光性質(zhì)。該產(chǎn)物應(yīng)是獲得極大信號的真正發(fā)熒光的，并是真正極性的，能陷入細(xì)胞內(nèi)。
為了使報告基因檢測中達(dá)到可能的最高敏感度，不得不使單個報告基因酶所產(chǎn)生的信號量達(dá)極大值。最佳酶在飽和條件下每秒鐘能轉(zhuǎn)換105個底物分子[Stryer，L.，Introduction to enzymes.InBiochemistry，New TorkW.H.Freeman and company，1981，pp.103-134]。β-內(nèi)酰胺酶每秒鐘能裂解其適意之底物約103個分子[Chang，Y.H.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 872823-2827(1990)]。使用一種產(chǎn)生熒光的底物，當(dāng)以適當(dāng)波長的光激發(fā)時，取決于所用染料類型，每產(chǎn)生一個發(fā)熒光產(chǎn)物，可獲得至多106個光子。該信號隨熒光團(tuán)的退色而終止[Tsien，R.Y.and Waggoner，A.S.Fluorophores forconfocal microscopyPhotophysics and photochemistry.InHandbook of Biological Confocal Microscopy，edited byPawley，J.B Plenum Publishing Corporation，1990，pp.169-178]。這些數(shù)值說明此類測量中可獲取信號的理論值。在實踐中，將檢測出所產(chǎn)生光子的精確分?jǐn)?shù)，但這實際包括熒光、生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光。一種報告基因酶的良好產(chǎn)生熒光底物，除了良好的光學(xué)特性，例如高消光和高熒光量子產(chǎn)率外，還必需具有對酶的高轉(zhuǎn)換作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供β-內(nèi)酰胺酶底物化合物。本發(fā)明的另一目的是提供透膜化合物。該透膜化合物可以轉(zhuǎn)化為基本上不透膜的化合物。
本發(fā)明的又一目的是提供β-內(nèi)酰胺酶報告基因。本發(fā)明的另一目的是創(chuàng)建含功能性連接于啟動子上的β-內(nèi)酰胺酶報告基因的細(xì)胞，以便當(dāng)啟動子啟動時，該報告基因得以表達(dá)。用β-內(nèi)酰胺酶水解之后能發(fā)光的β-內(nèi)酰胺酶底物來測量β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。
本發(fā)明還有一個目的是利用細(xì)胞中的β-內(nèi)酰胺酶報告基因及本發(fā)明β-內(nèi)酰胺酶底物化合物篩選生物化學(xué)活性。
根據(jù)本發(fā)明，提供的產(chǎn)生熒光的底物具有通式I結(jié)構(gòu)，
其中X和Y之一是發(fā)熒光的供體部份，或其透膜衍生物，而另一個是猝滅體部份、受體熒光團(tuán)部份或其透膜衍生物；R′選自H、低級烷基、(CH2)nOH、(CH2)nCOOR″和＝NOJ，(其中n是0或1-5的整數(shù)，而J是H、Me、CH2COOH、CHMeCOOH及CMe2COOH)；R″選自H、生理學(xué)上可接受的金屬和銨陽離子、-CHR2OCO(CH2)nCH3、-CHR2OCOC(CH3)3、酰硫甲基、酰氧基-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲基亞磺酰甲基、β-嗎啉代乙基、二烷氨基乙基、二烷氨基羰氧甲基，其中R2選自H和低級烷基；A選自S、O、SO、SO2和CH2；Z′是X的接頭；Z″是Y的接頭。
另一方面，本發(fā)明提供測定樣品中是否具β-內(nèi)酰胺酶活性的方法。該方法包括將樣品與本發(fā)明化合物底物接觸(當(dāng)化合物被激發(fā)時它表現(xiàn)出熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；激發(fā)化合物；和測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度。熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度若低于預(yù)期值，則表明存在β-內(nèi)酰胺酶活性。該方法的一個實施方案是測定樣品中的酶量。根據(jù)該方法，測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度包括測定樣品與底物接觸后第一次和第二次的轉(zhuǎn)移程度，并測定該熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度之差，該差值反映出該樣品中的酶量。
另一方面，本發(fā)明提供重組核酸分子，該分子包含適宜于在脊椎動物細(xì)胞中起作用的表達(dá)控制序列，該表達(dá)控制序列按人工操作方式(operably)連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上。也提供包含適宜于在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，且按人工操作方式連接于編碼胞液β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列的重組核酸分子。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及用這些重組核酸分子轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供測定細(xì)胞中β-內(nèi)酰胺酶活性量的方法。該方法包括提供以重組核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述重組核酸分子包含按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列；將含細(xì)胞或細(xì)胞提取物的樣品與β-內(nèi)酰胺酶底物接觸；以及測定裂解底物之量，而裂解底物之量與β-內(nèi)酰胺酶活性量有關(guān)。
再一個方面，本發(fā)明提供監(jiān)測按人工操作方式連接于一套表達(dá)控制序列的基因的表達(dá)的方法。該方法包括提供以重組核酸分子(該分子含按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列，除了真核細(xì)胞是真菌的情況例外，其中所述β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；將含細(xì)胞或細(xì)胞提取物，或其條件培養(yǎng)基之樣品與β-內(nèi)酰胺酶底物相接觸；并測定裂解的底物之量。所述裂解底物之量與β-內(nèi)酰胺酶活性量相關(guān)。
再一個方面，本發(fā)明提供測定是否一種試驗化合物能改變按人工操作方式連接于一套表達(dá)控制序列的基因之表達(dá)的方法。該方法包括提供由重組核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(所述構(gòu)建體含有按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列，除了真核細(xì)胞是真菌的情況例外，其中β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶)；將該細(xì)胞與試驗化合物接觸；將含細(xì)胞或細(xì)胞提取物之樣品與β-內(nèi)酰胺酶底物接觸；并測定裂解的底物之量，而所裂解的底物量與β-內(nèi)酰胺酶活性量相關(guān)。該方法的一個實施方案中，底物是本發(fā)明化合物。測定裂解的底物量之步驟包括激發(fā)化合物；并測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度。若熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度低于預(yù)期值，則表明存在β-內(nèi)酰胺酶活性。
還有一個方面，本發(fā)明提供克隆選擇的方法，該方法包括提供用重組核酸分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(所述重組核酸分子含有按人工操作方式連接于編碼胞液β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列)；將該細(xì)胞與激活或抑制表達(dá)控制序列活化作用的底物接觸；將該細(xì)胞與轉(zhuǎn)換成底物的權(quán)利要求9的化合物接觸；測定在各個體細(xì)胞中是否底物被裂解，而裂解反映β-內(nèi)酰胺酶活性；選擇及繁殖挑選出的具β-內(nèi)酰胺酶活性水平的那些細(xì)胞。在另一實施方案中，該方法還包括將挑選出的細(xì)胞在不存在激活劑的條件下培養(yǎng)足夠長時間，使裂解的底物從細(xì)胞中基本上消失，且使β-內(nèi)酰胺酶水平回復(fù)到未激活水平；將挑選出的細(xì)胞與轉(zhuǎn)換成底物的權(quán)利要求9的化合物一起保溫；并挑選基本上不裂解該底物的細(xì)胞。
有關(guān)附圖的簡單描述

圖1(a)和1(b)表示β-內(nèi)酰胺環(huán)在經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后，化合物11(實施例1)的熒光素(a)和若丹明(b)成份之發(fā)射光譜；圖2表示β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后化合物17的發(fā)射光譜；圖3表示β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后化合物22的發(fā)射光譜；圖4表示β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后化合物25的發(fā)射光譜；圖5表示β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后化合物CCF2的發(fā)射光譜；圖6表示β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶裂解前后化合物CCF1的發(fā)射光譜；圖7A列出介紹本發(fā)明所用各種核苷酸和氨基酸序列的表；圖7B-C描繪序列1，即如Kadonaga等人(1984)所改性的大腸桿菌RTEM的核苷酸序列，及其推斷的氨基酸序列；圖7D-E描繪序列2，即帶有Ser→Arg、Ala23→Gly的野生型分泌RTEM酶的核苷酸及其推斷的氨基酸序列；圖7F-G描繪序列3，即帶有β-球蛋白上游前導(dǎo)序列、哺乳動物Kozak序列、由Met Gly代替信號序列的RTEM酶的核苷酸及推斷的氨基酸序列；圖7H-I描繪序列4，即帶有哺乳動物Kozak序列和由Met Asp代替信號序列的RTEM β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸及推斷的氨基酸序列；圖7J-K描繪序列5、即帶有置換信號序列的地衣桿菌β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸及推斷的氨基酸序列。
發(fā)明描述定義根據(jù)本發(fā)明，及如本文中所采用的，除非另有說明，下面的術(shù)語定義為下面之含義所謂“發(fā)熒光的供體部份”指能吸收能量，并能將能量轉(zhuǎn)移到另一產(chǎn)生熒光的分子或化合物之部份的產(chǎn)生熒光的化合物基團(tuán)。適宜的供體產(chǎn)生熒光的分子包括(但不限于)香豆素類及相關(guān)染料、呫噸染料(例如熒光素類、對甲氨基酚類、和若丹明類)、試鹵靈類、花青染料、雙雙鬃類(bimane)、吖啶類、異吲哚類、丹酰染料、氨基鄰苯二甲酸酰肼類(例如魯米諾及異魯米諾衍生物)、氨基鄰苯二甲酰亞胺類、氨基萘二甲酰亞胺類、氨基苯并呋喃類、氨基喹啉類、二氰基氫醌類，和銪及鋱配合物，以及相關(guān)化合物。
所謂“猝滅體”，指當(dāng)其連接于供體上時，能減低發(fā)熒光的供體發(fā)射作用的生色團(tuán)分子或化合物之部份。猝滅可以通過幾種機(jī)理之任何一種發(fā)生，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移、體系間交叉的順磁增漲、Dexter交換偶合、激發(fā)子偶合(例如形成黑色復(fù)合物)。所謂“受體”指通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移操作的“猝滅體”。許多受體可以使轉(zhuǎn)移的能量作為熒光再發(fā)射。例子包括香豆素類及相關(guān)熒光團(tuán)、呫噸類(例如熒光素類、對甲氨基酚類和若丹明類)、試鹵靈類、花青類、二氟硼二氮吲丹參類(difluoroboradiazaindacene)和酞菁類。其它化學(xué)受體類一般不再發(fā)射轉(zhuǎn)移能量，例子包括靛蘭類苯并醌類、蒽醌類、偶氮化合物、硝基化合物、茚苯胺類、二和三苯基甲烷類。
所謂“染料”指吸收特定頻率光的分子或化合物之部份，包括(但不限于)吸收紫外光。所謂“染料”和“生色團(tuán)”意思相同。
所謂“熒光團(tuán)”指熒光的生色團(tuán)。
所謂“透膜衍生物”意指上述通式化合物的化學(xué)衍生物，所述通式中X和Y中至少一個含至少一個?；姆剂u基，酰化胺，或烷基化的芳羥基，其中?；?-5個碳原子，而烷基選自-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)Oalk、低級酰氧-α-芐基、和δ-丁內(nèi)酯基；其中alk是1-4碳低級烷基。這些衍生物的特點是能穿過細(xì)胞膜，即透膜性，因為其親水基團(tuán)被掩蔽而產(chǎn)生了疏水性較強(qiáng)的衍生物。同時，掩蔽基團(tuán)被設(shè)計為能從細(xì)胞中的產(chǎn)生熒光的底物上裂解掉，從而在胞內(nèi)產(chǎn)生衍生底物。因該底物比透膜衍生物親水性更強(qiáng)，因此這時會陷入細(xì)胞內(nèi)。
所謂“烷基”指1-8碳直鏈、支鏈、和環(huán)狀脂肪基，優(yōu)選1-6碳、更優(yōu)選1-4碳。所謂“低級烷基”指1-4碳直鏈和支鏈烷基。
所謂“脂肪基”指1-10碳飽和和不飽和烷基，優(yōu)選1-6碳，更優(yōu)選1-4碳。底物就其最大可能具β-內(nèi)酰胺水解的擴(kuò)散控制催化作用而言，β-內(nèi)酰胺酶幾乎是最佳酶[Christensen，H.等人，Biochem.J.266853-861(1990)]。當(dāng)對該類酶的其它特性進(jìn)行審試時，確定它們適宜于起胞內(nèi)報告基因酶之作用。它們裂解β-內(nèi)酰胺抗生素，如青霉素和頭孢菌素等的β-內(nèi)酰胺環(huán)，在該過程中產(chǎn)生新的帶電部份[O′Callaghan，C.H.等人，Antimicrob.Agents.Chemother.857-63(1968)；Stratton，C.W.，J.Antimicrob.Chemother.22 Suppl.A23-35(1988)]。第一代頭孢菌素如下式左邊，其箭頭指向β-內(nèi)酰胺酶裂解部位。如此產(chǎn)生的游離氨基(下式中間結(jié)構(gòu))通過乙烯基供給電子密度，促使離核基R2從3′位不可逆地裂解。因此R2容易從R1-頭孢菌素共軛體(下式右邊結(jié)構(gòu))中擴(kuò)散出。
β-內(nèi)酰胺酶因其在臨床上使細(xì)菌產(chǎn)生對β-內(nèi)酰胺抗生素的抗性，故這類酶屬已被很好鑒定過[Waley，S.G.，Sci.Prog.72579-597(1988)；Richmond，M.H.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci182243-257(1971)]。大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶已被克隆，其氨基酸序列被測定過[見例如Ambler，R.P.，Phil.Trans.R.Soc.Lond(Ser.B.)289321-331(1980)]。
編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因被分子生物學(xué)家稱之為氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，并普遍用來篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)之細(xì)菌[Castagnoli，L.等人，Genet.Res.40217-231(1982)]，其克隆幾乎隨處可得。該酶催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解，并不接受肽或蛋白底物[Pratt，R.F.和Govardhan，C.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811302-1306(1984)；Murphy，B.P.和Pratt，R.F.，Biochemistry 303640-3649(1991)]。該反應(yīng)動力學(xué)已充分了解，且無產(chǎn)物抑制作用[Bush，K.和Sykes，R.B.，Antimicrob.Agents.Chemother.306-10(1986)；Christensen等人(1990)，文獻(xiàn)同上]。該酶底物極性小于產(chǎn)物之極性。
該底物中的羧基可采用乙酰氧甲基酯的方式很容易加以隱蔽[Jansen，A.B.A.和Russell，T.J.，J.Chem.Soc.2127-2132，(1965)；Daehne，W.等人，J.Med.Chem.13607-612(1970)]，該保護(hù)基易于借助哺乳動物內(nèi)源胞內(nèi)酯酶裂解掉。經(jīng)這些酯酶轉(zhuǎn)化，再由β-內(nèi)酰胺酶裂解β-內(nèi)酰胺，產(chǎn)生兩個負(fù)電荷和質(zhì)子化的叔胺。到目前為止，尚無有關(guān)具適當(dāng)特性的產(chǎn)生熒光的底物的報道，但不同設(shè)計的多生色底物已有報道，且推入市場[Jones，R.N.等人，J.Clin.Microbiol.15677-683(1982)；Jones，R.N.等人，J.Clin Microbiol.15954-958(1982)；O′Callaghan，C.H.等人，Antimicrob.AgentsChemother.1283-288(1972)]。
已分離和鑒定出大量β-內(nèi)酰胺酶，它們?nèi)m用于本發(fā)明。一開始，根據(jù)其底物和抑制劑特征以及其分子量，將β-內(nèi)酰胺酶分成不同類(I類至V類)[Richmond，M.H.和Sykes，R.B.Adv.Microb.Physiol.931-88(1973)]。最近，引入了基于氨基酸和核苷酸序列的分類法[Ambler.R.P.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.(Ser.B.)289321-331(1980)]。A類β-內(nèi)酰胺酶在活性位點具有絲氨酸，其分子量約為29kd。該類包括質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM β-內(nèi)酰胺酶，例如pBR 322的RTEM酶。B類β-內(nèi)酰胺酶有活性位點，鋅結(jié)合于胱氨酸殘基。C類酶有活性位點絲氨酸，且分子量約為39kd，但沒有氨基酸同源于A類酶。
用于本文中所述報告基因檢測的典型β-內(nèi)酰胺酶的編碼區(qū)示于SEQ ID NO1(核酸序列)和SEQ ID NO2(氨基酸序列)。含有該序列的pTG2dell已有人介紹過[Kadonaga，J.T.等人，J.BiolChem.2592149-2154(1984)]。野生型pBR322 β-內(nèi)酰胺酶的完整編碼序列已公開過[Sutcliffe，J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753737-3741(1978)]。這些序列和其它相似的具有β-內(nèi)酰胺酶活性的肽序列，應(yīng)同樣適宜于本發(fā)明使用，這對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。β-內(nèi)酰胺酶報告基因，按本身已知的報告基因應(yīng)用方式用于檢測系統(tǒng)中(例如以適宜的質(zhì)粒載體形式)。
與適宜的β-內(nèi)酰胺酶一起，通式I的產(chǎn)生熒光的底物也應(yīng)用于本發(fā)明中，
其中X和Y之一是發(fā)熒光的供體部份，而另一個是猝滅體(它可以再發(fā)射，或不可再發(fā)射)；R′選自H、低級烷基、(CH2)nOH、(CH2)nCOOR″、和＝NOJ，其中n是0或1-5的整數(shù)，J是H、Me、CH2COOH、CHMeCOOH、和CMe2COOH；R″選自H、生理學(xué)上可接受的金屬及銨陽離子、-CHR2OCO(CH2)nCH3、CHR2OCOC(CH3)3、酰硫甲基、酰氧-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲亞磺酰甲基、β-嗎啉代乙基、二烷基氨乙基、及二烷基氨羰氧甲基，其中R2選自H和低級烷基；A選自S、O、SO、SO2和CH2；而Z′和Z″是發(fā)熒光的供體和猝滅部份的接頭。
接頭Z′和Z″用于將發(fā)熒光的供體與猝滅體部份連接于頭孢菌素衍生骨架上，并能方便通式I化合物的合成。通式I中，Z′可以代表一個直接連于骨架上的鍵，此外，作為Z′使用的適宜之接頭包括(但不限于)下述結(jié)構(gòu)-(CH2)nCONR2(CH2)m-，-(CH2)nNR2CO(CH2)m-，-(CH2)n-NR3CONR2(CH2)m-，-(CH2)nNR3CSNR2(CH2)m-，-(CH2)nCONR3(CH2)pCONR2(CH2)m-，-(CH2)n-，-(CH2)nNR3CO(CH2)pS(CH2)m-，-(CH2)nS(CH2)m-，-(CH2)nO(CH2)m-，-(CH2)nNR2(CH2)m-，-(CH2)nSO2NR2(CH2)m-，-(CH2)nCO2(CH2)m-，
其中R2和n同上面定義同；R3選自氫和低級烷基；m和p各自獨立地選自0和1-4的整數(shù)。對于Z′來說特別優(yōu)選其中n和m是0，也優(yōu)選其中R2是H的Z′。
用于Y部份的適宜接頭Z″包括(但不限于)直接連于染料生色團(tuán)雜原子(如O，N，或S)上的鍵，或下述結(jié)構(gòu)-O(CH2)n-，-S(CH2)n-，-NR2(CH2)n-，-N+R22(CH2)n-，-OCONR2(CH2)n-，-O2C(CH2)n-，-SCSNR2(CH2)n-，-SCSO(CH2)n-，-S(CH2)nCONR2(CH2)m，-S(CH2)nNR2CO(CH2)m，和
其中R2，n和m定義同上，且m是0-4的整數(shù)。特別優(yōu)選的Z″是S(CH2)n，尤其優(yōu)選H。
優(yōu)選R′包括H和甲基，特別優(yōu)選H。優(yōu)選R″包括H和乙酰氧甲基。優(yōu)選R2是H。優(yōu)選A是-S-。
優(yōu)選情況下，本發(fā)明化合物是透膜的。特別優(yōu)選的是其中X和Y中至少一個含至少一個?；姆枷懔u基、?；贰⒒蛲榛剂u基(其中?；?-5個碳原子，而烷基選自-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)Oalk、低級酰氧-α-芐基、及δ-丁內(nèi)酯基，其中alk是1-4碳低級烷基)的化合物。特別優(yōu)選X和Y中至少一個含至少一個?；姆剂u基(其中?；且阴；?、正丙?；蛘□；?的化合物。也特別優(yōu)選X和Y中至少一個在芳羥基上含乙酰氧甲基的化合物。
另一優(yōu)選情況下，猝滅體或受體是式VIII-XII的熒光素、對甲氨基酚、或若丹明。優(yōu)選的是其中供體是式VIII熒光素，而猝滅體或受體是式VIII-XII對甲氨基酚或若丹明的化合物。還優(yōu)選的是其中供體是式VIII熒光素，而猝滅體或受體是式VIII四鹵熒光素(其中Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立地是Br或Cl)的化合物。還優(yōu)選的是其中猝滅體或受體是式VIII、IX和XI對甲氨基酚的化合物。另一組優(yōu)選的該化合物是其中猝滅體或受體是式VIII、X和XII若丹明的化合物。
又一優(yōu)選情況下，供體是式II-VII香豆素，而猝滅體或受體是式VIII-XII、XLVII、或VLVII熒光素、對甲氨基酚或若丹明，和其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。特別優(yōu)選的是帶有式VIII熒光素猝滅體/受體的化合物。尤其優(yōu)選的是其中香豆素是7-羥基香豆素或7-羥基-6-氯香豆素，而熒光素受體是熒光素或二氯熒光素的化合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率，取決于供體熒光團(tuán)的熒光量子產(chǎn)率、供體-受體之距離，以及供體熒光發(fā)射和受體吸收的疊合積分。當(dāng)帶有高熒光量子產(chǎn)率(優(yōu)選接近100％)的供體熒光團(tuán)，與同供體發(fā)射相一致波長處具大消光系數(shù)的受體相匹配時，能量轉(zhuǎn)移效率最高。有關(guān)熒光能量轉(zhuǎn)移由上述參數(shù)決定的問題，已有文獻(xiàn)報道過[Forster，T.(1948)Ann.Physik255-75；Lakowicz，JR.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，New YorkPlenumPress(1983)；Herman，B.，Resonance energy transfer microscopy，inFluorescence Microscopy of Living Cells in Culture，PartB，Methods in Cell Biology，Vol 30，ed.Taylor，D.L.& Wang，Y.-L.，San DiegoAcademic Press(1989)，pp.219-243；Turro，N.J.，Modern Molecular Photochemistry，Menlo Part；Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.(1978)，pp.296-361]，且光譜疊合積分表對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說很易獲得[例如Berlman，I.B.Energy transfer parameters of aromatic compounds，AcademicPress，New York and London(1973)]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率為50％時的供體熒光團(tuán)和受體染料之間的距離稱之為Ro，并可從光譜疊合積分計算出。常被用于蛋白中距離測量的供體-受體對，熒光素-四甲基若丹明，其距離Ro是約50-70[dos Remedios，C.G.等人，(1987)J.Muscle Research and Cell Motility 897-117]。該對中、能量轉(zhuǎn)移超過90％時的距離約為45。當(dāng)連接于頭孢菌素骨架上時，供體和受體之間的距離在10-20范圍內(nèi)，取決于所用的接頭和生色團(tuán)的大小。對于20距離而言，若要使供體轉(zhuǎn)移其90％能量至受體，生色團(tuán)對不得不有30以上的計算Ro值，結(jié)果比供體熒光90％猝滅要好。由β-內(nèi)酰胺酶裂解此種頭孢菌素可減緩猝滅，并使得供體熒光效率提高10倍以上。因此，很明顯，按照本發(fā)明于本文中之指導(dǎo)，為使用適當(dāng)?shù)墓w-受體對而進(jìn)行鑒定，是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員的基本日常工作。
為測量活細(xì)胞胞質(zhì)中的β-內(nèi)酰胺酶活性，當(dāng)對于較大化合物來說，底物傳送成為問題時，下文所述較小分子量的生色團(tuán)，一般來說優(yōu)于較大分子量者。大分子，尤其是約1200 dalton以上的分子，也比小分子更傾向于與細(xì)胞成份結(jié)合，由此從β-內(nèi)酰胺酶接觸及裂解，至少能除去某些大分子。
適宜于應(yīng)用的生色團(tuán)，其X和Y對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是已知的。宜于使用的特定類生色團(tuán)的一般結(jié)構(gòu)，其X和Y在下面介紹，通式II-XXXIV化合物，是通式I化合物中，作為特別適宜的供體部份之基礎(chǔ)的熒光團(tuán)典型例。該通式化合物中作為受體部份基礎(chǔ)所用的適宜生色團(tuán)包括(但不限于)通式II-LIV化合物。通式XXXV-LIV生色團(tuán)通常不會有效地再發(fā)射。
香豆素類及相關(guān)染料
呫噸染料(包括熒光素類對甲氨基酚類若丹明類)
試鹵靈類
花青染料
三氟硼二氮吲丹參染料 雙鬃類
吖啶類
異吲哚類
丹酰染料
氨基鄰苯二甲酰肼類(魯米諾和異魯米諾衍生物)
氨基鄰苯二甲酸亞胺類
氨基萘二甲酰亞胺類 氨基苯并呋喃類
氨基喹啉類 二氰基氫醌類
靛蘭染料 蒽醌染料
多次甲基染料
硝基染料及氰基衍生物
醌染料
呫噸染料
二氰乙烯基及三氰乙烯基染料
茚苯胺染料(茚三酮衍生物) 二和三苯基甲烷染料
通式II-LVI化合物優(yōu)選實施方案中a和a′各自獨立地是H或一個連接點(即染料部份連接于通式I核心結(jié)構(gòu)之處)；E選自H、OH、ORk和NRgRh；G選自O(shè)和N+Rg′Rh′；L和L′各自獨立地選自CH和N；M選自H、Mg、Al、Si、Zn、和Cu；Q選自O(shè)、S、C(CH3)2和NRg；Q′選自O(shè)、CH2、C(CH3)2、NRk和SO2；T選自O(shè)和NRk；W和W′各自獨立地選自O(shè)、S、Se和NH；Ra、Rb、Rc和Rd各自獨立地選自一個連接點、H、鹵素和低級烷基；Re選自一個連接點、H、低級烷基、(CH2)nCO2H、(CH2)nCHaCO2H、CHa(CH2)nCO2H、(CH2)nCOa、CH＝CHCOa、
Rf、Rg、Rg′、Rh、Rh′和Rk各自獨立地選自一個連接點、H、低級烷基和CH2(CH2)na；Ri選自一個連接點、H、鹵素、低級烷基、CN、CF3、苯基、CO2H和CONRg′Rh′；Rj選自一個連接點、H、鹵素、低級烷基、CN、CF3、苯基、CH2CO2H、CH2CONRg′Rh′；Rl和Rr各自獨立地選自一個連接點、H、低級烷基，
Rm、Rn、Rp和Rq各自獨立地選自一個連接點、H、低級烷基和苯基；Ro選自一個連接點、H和低級烷基；Rs和Rt各自獨立地選自一個連接點、H、鹵素、低級烷基和ORf；Ru和Rv各自獨立地選自一個連接點、H、鹵素、CN、和NO2；各Rw獨立地選自一個連接點、H、COO-、SO3-和PO32-；Ln選自Eu3+，Ln3+和Sm3+；Chel是至少有6個，優(yōu)選8-10個供體原子，可以面對4-6直徑的空洞的多齒螯合體，它可以是或不是大環(huán)，包括一個吸收300-400nm波長的生色團(tuán)，包括一個連接點，由此Chel可以與Z′或Z″共軛。一種適宜Chel部份是銪三(聯(lián)吡啶)穴狀配體。在通式XXXIX蒽醌生色團(tuán)中，1-8各位可以攜帶取代基H或E，或作為一個連接點。
銪三(聯(lián)吡啶)穴狀配體供體適宜于與式XV-XVII、XXXVI、XLVI-XLVII、LIV和LVI的受體配對。鋱三(聯(lián)吡啶)穴狀配體供體則適宜于與式VIII-XVIII、XXXVI-XLI、XLV-LIV和LVI受體配對。
銪三(聯(lián)吡啶)穴狀配體/酞菁之供體/受體對，對于期望通過靠近遠(yuǎn)紅外區(qū)的能量發(fā)射來測定β-內(nèi)酰胺酶活性時，是特別有意義的。
許多應(yīng)用中，希望式I化合物衍生化，使之屬疏水性，且能透過細(xì)胞膜。該衍生基應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行水解，再產(chǎn)生通式I化合物，并使之陷入細(xì)胞內(nèi)。為此目的，優(yōu)選該染料結(jié)構(gòu)中的酚羥基或游離胺以C1-C4?；?如甲酰基，乙?；□；??；?，或轉(zhuǎn)換成各種其它酯和碳酸酯[例如Bundgaard，H.，在Desigh of Prodrugs，ElsevierScience Publishers(1985)，Chapter I，page 3 et seq.中所述]。也可以用1-(酰氧)烷基，酰硫甲基，酰氧-α-芐基，δ-丁內(nèi)酯基，或甲氧羰氧甲基使酚類烷基化。對于熒光素類對甲氨基酚類及若丹明類來說，該處理是特別有用的，因為該處理結(jié)果使這些染料中的酸部份轉(zhuǎn)換成螺甾內(nèi)酯。為促進(jìn)膜滲透性，頭孢菌素4位上的羧基應(yīng)以1-(酰氧)烷基、酰硫甲基、乙酰氧基-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲亞磺酰甲基、β-嗎啉代乙基、2-(二甲氨基)乙基、2(二乙氨基)乙基、或二烷氨基羰氧甲基酯化，正如Ferres，H.(1980)Chem.Ind.1980435-440所介紹的。羧基的最優(yōu)選酯化基團(tuán)是乙酰氧甲基。
合成式I化合物的一般方法在下面敘述。正如本領(lǐng)域普通專業(yè)人員所意識到的，下面的方法可用于各種各樣衍生物，同時其它合成方法也是可能的。
這些化合物中，RG是親核反應(yīng)基(例如碘乙酰胺、異氰酸酯、異硫代氰酸酯等等)；Nu是親核基(例如-SH，-NH2，-OH等)；Ro是氫或酯基(如二苯甲酯，叔丁酯等)；Nuo是二齒親核試劑(如HS-，HSCH2CH2NH2、黃原酸酯等)；Hal是鹵素(例如氯、溴、或碘)。
頭孢菌素初始原料，是市售頭孢菌素衍生物7-氨基頭孢烷酸，或7-氨基-3_氯頭孢烷酸，以其二苯甲酯或叔丁酯(Ro)的形式購得。在偶合攜帶親核反應(yīng)基(RG)的染料A和B之前，有時將其酚和游離胺殘基酯化或烷基化是有益的。連接染料A和染料B的次序取決于所選擇的反應(yīng)試劑。借助烷基酰胺接頭，染料A連接于頭孢菌素上?？蓪в杏H核反應(yīng)基(RG)的染料A與雙官能團(tuán)脂肪酸(例如氨基-、巰基-或羥烷基酸)反應(yīng)，并使該酸與頭孢菌素7-胺偶合來完成該連接反應(yīng)(路線1)。此外，將攜帶親核基(如胺或硫醇)的染料A，與鹵代烷基酸反應(yīng)，且將該酸與頭孢菌素7-胺偶合(路線2)。該兩路線中，兩次反應(yīng)的次序可以顛倒。含脂肪酸的染料A可直接與頭孢菌素偶合(路線3)。通過直接置換離去基團(tuán)(LG)，攜帶親核取代基的染料B可以偶合于頭孢菌素的3′位(路線4)。攜帶親核反應(yīng)基的染料B可以與二齒親核試劑反應(yīng)，然后通過置換離去基團(tuán)(LG)而與頭孢菌素偶連(路線5)，該反應(yīng)次序可以顛倒。
某些情況下，可能必需將二齒親核基團(tuán)之一個掩蔽后，與之進(jìn)行第一步反應(yīng)。然后除去保護(hù)基后進(jìn)行第二步偶連反應(yīng)。兩種染料連接之后，將頭孢菌素酯裂解(Ro不是H的情況)。為制得透膜底物，然后將該酸再酯化成可在哺乳動物細(xì)胞的胞質(zhì)環(huán)境下脫保護(hù)基的酯。對于不涉及細(xì)胞胞質(zhì)的應(yīng)用來說應(yīng)將任何用于掩蔽染料上酚類和游離胺類的保留?；屯榛ァ?br> 適宜于本發(fā)明使用的供體類及受體類優(yōu)選組合示于表1。使用這些組合的式I化合物實施方案中，出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。當(dāng)然，正如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員很容易理解的，許多其它的供體和受體/猝滅體(包括再發(fā)射的及無再發(fā)射的)組合也適宜于本發(fā)明使用。一般來說，適宜的供體和受體對，是供體的發(fā)射光譜明顯與受體的消光光譜疊合者。
表1供體II-VIII，XIX VII-XIV，XV-XVI，LV受體 -XXI，XXIII-XVII，XXIIXXXIVII-VIII，XIX FRET-XXI，XXIII-XXXIVVII-XIV， FRET FRETXVII，XXIIXV-XVII FRET FRET FRETXL-XLV， FRET FRETXLVII-LIIXXXV-XXXIX， FRET FRET FRETXLVI-XLVII，LIII-LIV，LVI特別有意義的發(fā)熒光的供體部份包括香豆素類和熒光素類。特別有意義的猝滅體包括熒光素類、對甲氨基酚類和若丹明類。有意義的組合包括使用香豆素供體與熒光素，對甲氨基酚或若丹明猝滅劑，以及熒光素供體與對甲氨基酚或若丹明猝滅體。有意義的特別組合包括下面情況香豆素(例如7-羥基香豆素)或其氯代衍生物與熒光素或其二氯代衍生物；熒光素與四溴熒光素或四氯熒光素；熒光素與對甲氨基酚衍生物；以及若丹明與熒光素。
銪螯合供體適宜與式XV-XVII、XXXVI、XLVI-XLVII、LIV和LVI的受體配對。鋱螯合供體適宜與式VIII-XVIII、XXXVI-XLI、XLV-LIV和LVI受體配對。因其很窄的發(fā)射峰，和其微秒至毫秒級激發(fā)態(tài)壽命，銪和鋱螯合供體可能特別有用，這種情況下，可以很容易與本底熒光區(qū)別開，并且以毫微秒或更短的激發(fā)態(tài)壽命發(fā)散。
許多應(yīng)用中，期望式I化合物衍生化，而使其更具疏水性和穿過細(xì)胞膜的滲透性。衍生基團(tuán)應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行水解，再生成式I化合物，并陷入細(xì)胞之內(nèi)。為此目的，優(yōu)選染料結(jié)構(gòu)中的任何酚羥基或游離胺以C1-C4酰基如(甲?；阴；?，正丁?；?酰基化，或轉(zhuǎn)換成各種其它酯和碳酸酯[例如，Bundgaard，H.，Design of Prodrugs，ElsevierScience Publishers(1985)，Chapter 1，page 3 et seq.所述]。酚也可以用1-(酰氧)烷基、酰硫甲基、乙酰氧-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、或甲氧羰氧甲基進(jìn)行烷基化處理。在熒光素類、對甲氨基酚類和若丹明類的情況下，游離酚基酰基化或烷基化是特別有用的，因為該處理結(jié)果使這些染料的酸部份轉(zhuǎn)化成螺甾內(nèi)酯。為促進(jìn)膜滲透性，頭孢菌素4位上的羧基應(yīng)以1-(酰氧)烷基、酰硫甲基、酰氧-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲亞磺酰甲基、β-嗎啉代乙基、2-(二甲氨基)乙基、2-(二乙氨基)乙基、或二烷氨基羰氧甲基酯化。這正如Ferres，H.(1980)Chem.Ind.1980435-440所介紹的。羧基的最優(yōu)選酯化基團(tuán)是乙酰氧甲基。
頭孢菌素骨架作為兩種染料之間的可裂解接頭。裂解之后它提供保持兩染料之一在細(xì)胞內(nèi)所需的電荷。染料的選擇方式是一種染料以某波長吸收光(猝滅體或受體熒光團(tuán))，則另一染料以該波長發(fā)射光(供體熒光團(tuán))。在完整的頭孢菌素中，兩染料相互靠近。當(dāng)激發(fā)供體熒光團(tuán)時，可以觀察到熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)從供體到受體，而不是供體熒光[Forster，T.，Ann.Physik 255-75(1948)]。如果受體是非發(fā)熒光染料，則能量被給與溶劑，供體熒光猝滅。若受體本身是發(fā)熒光染料，則以受體的發(fā)射波長再發(fā)射熒光。在水之類的極性溶劑中，疏水供體和受體熒光團(tuán)，當(dāng)由短的彈性接頭分開時，可以疊合在一起。由于基態(tài)時的此種共生，形成“黑色復(fù)合物”[Yaron，A.等人，AnalBiochem.95228-235(1979)]。該復(fù)合物情況下，兩種熒光團(tuán)均不發(fā)射光，使兩種染料的熒光均猝滅[Bojarski，C.和Sienicki，K.Energy transfer and migration in fluorescent solutions.見Photochemistry and Photophysics，edited by Rabek，J.F.BocaRatonCRC Press，Inc.，1990，pp.1-57]。無論那種情況下，熒光的很大變化隨β-內(nèi)酰胺裂解而出現(xiàn)，這一現(xiàn)象可用來測定β-內(nèi)酰胺酶活性。當(dāng)兩種染料擴(kuò)散開時，疊合和能量轉(zhuǎn)移則停止。攜帶發(fā)熒光的供體和受體的頭孢菌素本文中稱為FRET-頭孢菌素。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移被用作測量蛋白和肽的光譜尺度，因其在10-100范圍內(nèi)有效。該能量轉(zhuǎn)移與供體和受體之間距離的6次方倒數(shù)成正比。其效率越高，供體發(fā)射和受體吸收疊合越好，并且供體的熒光壽命越長(不存在受體時)。在10-20距離范圍，F(xiàn)RET可能非常有效。
頭孢菌素中，供體和受體的連接距離大于10，且最小為10個鍵長(假如該距離包括7位和3位間的最小間隔)。如果正確選擇供體受體對，超過該距離是很有效的。有利的是FRET-頭孢菌素中，連接染料的7-氨基保持與頭孢菌素裂解的極性水解產(chǎn)物相連，使其陷于細(xì)胞胞質(zhì)中。雖然在某些例子中受體可以出現(xiàn)在該位置，但該位最好由供體熒光團(tuán)占據(jù)。一旦裂解，由于失去猝滅體染料而熒光增強(qiáng)。
受體熒光團(tuán)一般由賦予底物對親核攻擊保持最大穩(wěn)定性的接頭連接。優(yōu)選接頭是硫醚鍵(-S-)，它很穩(wěn)定，且由于誘導(dǎo)效應(yīng)，降低了β-內(nèi)酰胺環(huán)對親核試劑的反應(yīng)活性[Page，M.I.，Adv.Phys.OrgChem.23165-270(1987)]。此外，水解所釋放的游離硫醇或硫醇鹽通常能猝滅所連接的熒光團(tuán)，增加了隨水解出現(xiàn)的所希望的熒光較大變化。
本發(fā)明的產(chǎn)生熒光的底物最初是無色的，且在細(xì)胞外不發(fā)熒光。設(shè)計容易穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中的底物，在胞質(zhì)中，它們由內(nèi)源非特異性酯酶轉(zhuǎn)換成發(fā)熒光化合物，并因其電荷而保持陷入細(xì)胞中。在完整的分子中，當(dāng)?shù)孜锉患ぐl(fā)時，出現(xiàn)熒光能量轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致特定波長的熒光。β-內(nèi)酰胺環(huán)經(jīng)內(nèi)酰胺酶裂解后，接著隨熒光能量轉(zhuǎn)移的消失熒光素部份排出。激發(fā)經(jīng)過修飾的底物，便產(chǎn)生不同波長之熒光。
本發(fā)明的檢測體系還提供分離和克隆選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的便利而快速之方法，所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系含報告基因，并且具有可賦予轉(zhuǎn)染作用的所需特性，例如，轉(zhuǎn)染受體激活之后，帶有來自高比較分離細(xì)胞的高信號-噪聲比的熒光信號應(yīng)答。目前，為克隆選擇來自原始群體經(jīng)滿意轉(zhuǎn)染的基因工程細(xì)胞的方法，主要做法如下菌落平皿接種復(fù)制，對一組菌落進(jìn)行試驗，以視覺選擇較好克隆，用移液管手工分離優(yōu)選的克隆復(fù)制品，并繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。該方法耗時又耗力，為得到一種適宜于藥物篩選檢測有用克隆，往往需要幾月時間。并且，手工選擇及保留超過幾百個克隆是很困難的。使用本發(fā)明檢測，來自細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報告基因系統(tǒng)的所需信號可以保留在活的及可存活細(xì)胞中。因為單個細(xì)胞可以被檢測和保持存活以進(jìn)一步復(fù)制，所以并不需要平皿接種復(fù)制。因此，從原始轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體，使用熒光激活細(xì)胞分類器(例如Becton DickinsonFACS Vantage TM)之類的自動化儀器，我們可以很快挑選出帶有最好熒光信號的幾個個體活細(xì)胞。然后將挑選出的細(xì)胞匯集起來培養(yǎng)和繁殖，產(chǎn)生對檢測和藥物篩選具所需性質(zhì)的克隆細(xì)胞系。
正如對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說顯而易見的，根據(jù)本發(fā)明的新型底物組合及適宜的β-內(nèi)酰胺酶，可以應(yīng)用于很廣泛的不同檢測系統(tǒng)(例如US專利4740459所述)。尤其是本發(fā)明的產(chǎn)生熒光底物能在廣泛地不同生物學(xué)重要環(huán)境下，例如人血清，細(xì)胞胞質(zhì)和胞內(nèi)空間中，鑒定β-內(nèi)酰胺酶活性，這有利于胞質(zhì)或分泌β-內(nèi)酰胺酶的測定。
此外，任何目標(biāo)蛋白的表達(dá)，可以通過將編碼該目標(biāo)蛋白的基因與β-內(nèi)酰胺酶基因融合來進(jìn)行鑒定，可通過免疫染色，熒光或電子顯微鏡來對其定位。例如，通過使用本發(fā)明底物，可以在細(xì)胞器腔內(nèi)檢測β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白；僅僅是含融合蛋白的亞細(xì)胞腔以裂解底物的特征波長發(fā)熒光，而所有其它的均以完整分子之特征波長發(fā)熒光。
無需采用特殊手段，例如冷卻，完整底物及裂解底物均很好地保留在細(xì)胞中。通過熒光顯微鏡，使用正常色彩觀察或照相膠片，可見其色彩變化(即使在個別小哺乳動物細(xì)胞內(nèi))采用常規(guī)數(shù)字成像處理技術(shù)，該熒光信號可以被定量和進(jìn)一步擴(kuò)大。而且，因為基因激活不是通過信號強(qiáng)度變化，而是通過色彩改變，或不同波長的兩強(qiáng)度之比的變化來檢測，因此本發(fā)明的測試相對地與許多人為因素?zé)o關(guān)，例如細(xì)胞泄漏的可變性，底物之量，發(fā)光強(qiáng)度，檢測的絕對靈敏度，以及染料的漂白作用等。
已制備出各種不同底物(例如通式17、22和25化合物)，并獲得其β-內(nèi)酰胺酶裂解前后的發(fā)射光譜。因其與血清和細(xì)胞蛋白很強(qiáng)地相結(jié)合，這些底物最初用于體外β-內(nèi)酰胺酶檢測。由于其疏水性，熒光團(tuán)疊合，導(dǎo)致完整底物中的熒光消失。β-內(nèi)酰胺酶裂解底物，并緩解疊合作用，則發(fā)出熒光。頭孢菌素上供體和受體熒光團(tuán)位置顛倒的化合物(如化合物11、實施例1)表現(xiàn)出相似的熒光特性。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通式I化合物與通式2化合物偶合形成通式3化合物。使用二環(huán)己基碳化二亞胺將市售化合物4與化合物3偶合，該產(chǎn)物再與式5化合物反應(yīng)，得到式6化合物。將式6化合物脫保護(hù)基，便得到式7化合物。將例舉的實施方案中，?；且阴；?、RX是Me和RYH(a)，或?；嵌□；?，RX是H和RYCl(b)，RZ是三甲基甲硅烷基或芐基。
通式6化合物被加以修飾后獲得透膜衍生物，該透膜衍生物在完整細(xì)胞中，由于內(nèi)源非特異性酯酶作用，被轉(zhuǎn)換為相應(yīng)發(fā)熒光的通式7化合物。當(dāng)該化合物于約400nm波長處被激發(fā)時這些分子中，出現(xiàn)從7-羥基香豆素部份到熒光素部份的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生綠色熒光。β-內(nèi)酰胺環(huán)裂解之后，7-羥基香豆素部份的激發(fā)產(chǎn)生蘭色熒光。在例舉的實施方案中，觀察到約450nm波長處熒光增強(qiáng)25倍，而515nm波長處卻減弱3-4倍。監(jiān)測基因表達(dá)本發(fā)明的底物可使用β-內(nèi)酰胺酶作為報告基因，來監(jiān)測一組表達(dá)控制序列的表達(dá)。一方面，本發(fā)明通過使用β-內(nèi)酰胺酶作為報告基因，提供監(jiān)測從一組表達(dá)控制序列進(jìn)行的基因表達(dá)的方法。提供以重組核酸分子轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，所述核酸分子含有按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列。重組核酸本文中所使用的“核酸分子”一詞既包括DNA也包括RNA分子。應(yīng)明確，當(dāng)說一個核酸分子有一種DNA序列時，這也包括有相應(yīng)RNA序列(其中“U”取代“T”)的RNA分子。所謂“重組核酸分子”意指非天然產(chǎn)生的核酸分子，且包括非天然連接在一起的兩個核苷酸序列。重組核酸分子由人工組合產(chǎn)生，例如采用基因工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)。
編碼β-內(nèi)酰胺酶的核酸，可通過本領(lǐng)域已知方法獲得，例如使用基于圖1 DNA序列的引物，進(jìn)行cDNA聚合酶鏈反應(yīng)。該PCR法例如在US專利4683195；Mullis等人(1987)Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51263；和Erlish ed.PCR Technology(Stockton Press，NY 1989)等文獻(xiàn)中均有介紹。
構(gòu)建表達(dá)載體，和在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因表達(dá)涉及也屬本領(lǐng)域已知的分子克隆技術(shù)之應(yīng)用。見Sambrook等人，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Iaboratory，ColdSpring Harbor，NY，(1989)and Current Protocols in MolecularBiology，F(xiàn).M.Ausubel等人，eds.，(Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and JohnWiley & Sons，Inc.，(most recent Supplement))。
用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，帶有編碼所研究的多肽表達(dá)之序列的核酸，一般是表達(dá)載體的形成，該表達(dá)載體包括按人工操作方式連接于編碼多肽表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列。本文中所謂“編碼多肽表達(dá)”的核苷酸序列意指一種序列，當(dāng)mRNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯時便產(chǎn)生多肽。如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知，該序列也包括編碼相同氨基酸序列的所有簡并核酸序列。這可以包括含內(nèi)含子之類的序列。本文中所謂“表達(dá)控制序列”指按人工操作方式連接于調(diào)節(jié)核酸表達(dá)序列上的核酸序列。表達(dá)控制序列被“按人工操作方式連接”于核酸序列上，此時該表達(dá)控制序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄，以及適宜情況下的核酸轉(zhuǎn)譯。因此，該表達(dá)控制序列可以包括適當(dāng)?shù)膯幼印⒃鰪?qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即ATG于編碼蛋白的基因之前)、內(nèi)含子的拼接信號、維持基因正確閱讀框架允許mRNA適當(dāng)轉(zhuǎn)譯的元件，以及終止密碼子等。
該重組核酸可以合并入含按人工操作方式連接于該重組核酸上的表達(dá)控制序列的表達(dá)載體內(nèi)。該表達(dá)載體適宜于在摻入適當(dāng)啟動子，復(fù)制序列，標(biāo)志等的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中發(fā)揮作用。
該重組核酸用于轉(zhuǎn)染含按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列之細(xì)胞。編碼的β-內(nèi)酰胺酶可以是本領(lǐng)域已知的或本文所介紹的任何β-內(nèi)酰胺酶。例如包括圖7所示酶。
本發(fā)明提供包含表達(dá)控制序列的新型重組核酸分子，所述表達(dá)控制序列適宜于在非哺乳動物真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，按人工操作方式連接于編碼胞質(zhì)β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上。本文中所謂“胞質(zhì)β-內(nèi)酰胺酶”指缺失從細(xì)胞膜產(chǎn)生分泌作用的氨基酸序列的β-內(nèi)酰胺酶，例如缺失信號序列。比如在圖7序列1的多肽中，該信號序列由氨基酸Met-Ser置換。因此，一旦表達(dá)，該β-內(nèi)酰胺酶保留在細(xì)胞中。
本發(fā)明提供包括表達(dá)控制序列的重組體核酸分子，所述表達(dá)控制序列適宜于在哺乳動物真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上。
進(jìn)一步優(yōu)選核糖體結(jié)合位點和編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列含有由哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選的序列，此種序列可改善哺乳動物細(xì)胞中β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)選序列，例如由Kozak，M.，J.Cell Biol.108229-241(1989)所述序列，本文稱其為“Kozak序列”。圖7序列3中，胞質(zhì)β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列含有核苷酸-9至4(GGTACCACCATGA)Kozak序列。
當(dāng)應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞中時，該表達(dá)控制序列適宜于在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮作用。本發(fā)明的方法，對于試驗從任何所需的表達(dá)控制序列組所進(jìn)行的表達(dá)很有用。特別是，本發(fā)明對于試驗從可誘導(dǎo)表達(dá)控制序列所進(jìn)行的表達(dá)有用。本文中所謂“可誘導(dǎo)表達(dá)控制序列”，意指通過提高或降低其按可操作方式連接之序列的表達(dá)來應(yīng)答生物化學(xué)信號的表達(dá)控制序列。例如，對于由類固醇激素誘導(dǎo)的基因來說，該表達(dá)控制序列包括激素應(yīng)答元件。類固醇激素受體結(jié)合該應(yīng)答元件上，誘導(dǎo)按人工操作方式連接于這些表達(dá)控制序列上的基因之轉(zhuǎn)錄。具體地說，許多基因和可誘導(dǎo)基因的表達(dá)控制序列已被分離出，在本領(lǐng)域?qū)僖阎?。帶有組成型活性表達(dá)控制序列，于本發(fā)明也是很有用的。
將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于能使β-內(nèi)酰胺酶從表達(dá)控制序列表達(dá)的試驗條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞或細(xì)胞提取物，在選擇試驗條件下與本發(fā)明β-內(nèi)酰胺酶底物接觸，并維持一段時間，使得通過任何β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)而產(chǎn)生底物催化作用。然后該樣品的供體部份以適當(dāng)?shù)淖贤夤饣蚩梢姽獠ㄩL激發(fā)。測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度。
如果該細(xì)胞不表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶，則被裂解的底物很少，F(xiàn)RET在該細(xì)胞中的效能很高，細(xì)胞或來自細(xì)胞的樣品之熒光特性將反映該效能。假如該細(xì)胞中表達(dá)了大量β-內(nèi)酰胺酶，那么大部份底物被裂解，該情況下，TRET的效能很低，反映了與串連的發(fā)熒光蛋白構(gòu)件合成速度有關(guān)的酶裂解量大或效率高。一方面，該方法可用來比較突變細(xì)胞，鑒定哪種處理具較大、或較小的酶促活性。此種細(xì)胞可以由熒光細(xì)胞分類器根據(jù)熒光來分揀。
同時，在使用基于報告基因的檢測，篩選樣品，或匯集樣品[例如化合物(組合的或合成的)，天然產(chǎn)物提取物，或海生動物提取物]，以鑒定作為細(xì)胞給與信號或激活的激動劑、逆激動劑或拮抗劑等有效候選藥物之領(lǐng)域中，于不同調(diào)節(jié)元件/啟動子控制下的基因工程表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動物)組合，以及本發(fā)明的新型β-內(nèi)酰胺酶底物化合物之應(yīng)用，將提供超過已知報告基因(包括，但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒火蟲熒光素酶、細(xì)胞熒光素酶、Vargula熒光素酶、多管水母素、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶)及其所需底物的明顯優(yōu)點，這對于該領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。
通過選擇適當(dāng)調(diào)節(jié)元件和啟動子，控制β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，可以構(gòu)建檢測或測定試驗化合物引起或抑制胞內(nèi)激素受體功能性應(yīng)答之能力的測試手段。這些包括應(yīng)答由鹽皮質(zhì)激素、包括地塞米松[J.SteroidBiochem.Molec.Biol.Vol.49，No.1 1994 pp 31-3]、糖皮質(zhì)激素、和甲狀腺激素受體[如US專利5071773]等引起誘導(dǎo)的表達(dá)控制序列。其它此種胞內(nèi)受體包括視網(wǎng)膜狀物、維生素D3和維生素A[Leukemiavol 8，Supp.3，1994 ppS1-S10；Nature Vol.374，1995，p.118-119；Seminars in Cell Biol.，Vol.5，1994，p.95-103]。借助使用適當(dāng)?shù)膯幼?增強(qiáng)子元件能賦予特異性。此外，通過選擇其它調(diào)節(jié)元件或特異性啟動子，可以鑒定影響特異基因表達(dá)的藥物。此類藥物可以作用于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等分子，或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物及轉(zhuǎn)錄激活物之類的分子[Science Vol.264，1994，p1415-1421；Mol.Cell Biol.，Vol.16，1996，p369-375]。屬于有效藥物靶的特異性微生物或病毒啟動子，也可在此種試驗體系中被檢測。
也可通過選擇c-fos或c-jun之類的啟動子[US專利5436128；Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.88，1991，pp 5665-5669]，或含應(yīng)答第二信使基因的調(diào)節(jié)元件[Oncogene，6745-751(1991)](包括環(huán)AMP應(yīng)答元件，應(yīng)答蛋白激酶C激活作用的佛波醇酯應(yīng)答元件、應(yīng)答蛋白激酶C-依賴性及非依賴性途徑的血清應(yīng)答元件，和應(yīng)答鈣的激活T-細(xì)胞應(yīng)答元件的核心因子)，控制β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的啟動子構(gòu)件，來構(gòu)建為檢測或測定調(diào)整細(xì)胞表面受體的物質(zhì)或物質(zhì)混合物的測試體系，所述受體包括(但不限于)下述類別促紅細(xì)胞生長素、生長激素、干擾素、和白細(xì)胞介素(除IL-8)及菌落刺激因子之類的細(xì)胞因子總科受體；降鈣素、腎上腺素或促胃液激素之類的對激素的G-蛋白偶合受體[US專利5436128]；Stomatostatm或前列腺素之類的Pancrine或autocrine介體；降腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、或乙酰膽堿之類的神經(jīng)遞質(zhì)；胰島素生長因子，神經(jīng)生長因子[US專利5436128]之類的酪氨酸激酶受體。并且，可以構(gòu)建鑒定調(diào)整電壓開啟或配位體開啟離子通道的物質(zhì)之測試法，該調(diào)整改變第二信使，尤其是鈣的細(xì)胞濃度(US5436128)。使用固有表達(dá)所研究的啟動子、受體或離子通道的細(xì)胞，或者引入經(jīng)基因工程處理的適當(dāng)?shù)鞍字?xì)胞也可構(gòu)建該檢測法。
表達(dá)控制序列也可以是應(yīng)答調(diào)整細(xì)胞表面受體的物質(zhì)或調(diào)整胞內(nèi)受體之物質(zhì)的表達(dá)控制序列。
為測定是否某物質(zhì)或物質(zhì)混合物能激活胞外或胞內(nèi)受體，或其它細(xì)胞應(yīng)答，將含有由所需啟動子/增強(qiáng)子元件控制的β-內(nèi)酰胺酶之細(xì)胞與一種或多種試驗物質(zhì)一起培養(yǎng)，然后加入底物，一定時間之后，測定對本發(fā)明所選擇化合物專用的一個或二個激發(fā)-發(fā)射對波長處的熒光信號(例如化合物CCF2相應(yīng)波長對為接近405nm和接近450nm，以及接近405nm和近510nm)。該熒光測定結(jié)果與非藥物處理的對照樣品進(jìn)行比較，若可能的話，再與帶有已知抑制劑及已知活化劑的對照樣品進(jìn)行比較。使用該試驗孔所測得熒光信號與非藥品處理孔測得之信號的比值，來確定任意活性藥物的影響。該測試在含96或更多孔的微滴平板上，或在不帶分隔空間，例如膠狀基質(zhì)或濕性膜環(huán)境的測試體系中進(jìn)行。該檢測可以例如通過微滴平板熒光計(如Millipore Cytofluor)或在能分析一定表面積上的一個或多個孔，或者一個或多個測試點的成像裝置(如由Astromed提供的)上進(jìn)行。維持底物在活細(xì)胞胞質(zhì)中的能力是有益的，因為它可使得來自測試介質(zhì)中生色或猝滅物質(zhì)的信號干擾降低。而且，從本發(fā)明化合物例如CCF2產(chǎn)生的熒光信號，可以很容易地在單個細(xì)胞中檢測出，這樣使得測試小型化，且每個表面增加了試驗次數(shù)。小型化測試也提高了成像檢測體系的生產(chǎn)量，因為在成像面可以有更多的樣品。
本發(fā)明的測試系統(tǒng)還提供分離和克隆選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的有利且快速的方法，所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞系含有報告基因，且具有轉(zhuǎn)染作用欲賦予的所需特性，例如轉(zhuǎn)染受體激活之后，來自高比例分離細(xì)胞的高信噪比(至少10∶1)熒光信號應(yīng)答。目前從最初以所研究載體轉(zhuǎn)染的群體中，克隆選擇滿意的轉(zhuǎn)染基因工程細(xì)胞的方法，主要由手工方式進(jìn)行，包括幾個回合的顯微分析、視覺挑選較好克隆、手工以移液管分離出克隆、并延長細(xì)胞培養(yǎng)。該方法費力又費時，為得到適宜于藥品篩選測試的有用克隆，可能需要幾個月時間。而且，要手工選擇和保留幾百個以上的克隆是很困難的。使用本發(fā)明測試法，來自細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報告基因系統(tǒng)的所需信號可以保留在活的及能存活的細(xì)胞中。這樣，我們可以使用熒光激活細(xì)胞分類器(如Becton Dickinson FACS Vantage)之類的自動儀器，從最初轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體中，很快挑選出這幾個具有最佳熒光信號的活細(xì)胞。然后，將挑選出的細(xì)胞匯集起來加以培養(yǎng)和繁殖，產(chǎn)生帶有測試和藥品篩選所需特性的克隆細(xì)胞系。
另外，使用本發(fā)明底物，可以很容易地檢測出對β-內(nèi)酰胺抗生素的細(xì)菌抗性的存在(例如在人血清、膿、或尿中)。只有當(dāng)存在活性β-內(nèi)酰胺酶時，才有從完整分子的熒光光譜到裂解產(chǎn)物的熒光光譜的特征改變。就其對人血清的穩(wěn)定性而言，本發(fā)明的底物超過現(xiàn)有技術(shù)的生色底物Nitrocephin和PADAC。新的底物比生色底物CENTA也更為靈敏，因為其經(jīng)受來自人血清的小得多的本底光譜信號，以及較低的熒光對吸收的檢測限制。
本發(fā)明參考所附實施例可以較好地理解，所述實施例僅僅為舉例說明之目的，正如所附權(quán)利要求所定義的，實施例不能構(gòu)成對本發(fā)明范圍的任何意義上的限制。測定通過激發(fā)的構(gòu)建體的任何光譜或熒光壽命特征，可以測定FRET的質(zhì)量，例如，測定來自供體的熒光信號強(qiáng)度、來自受體的熒光信號強(qiáng)度、靠近受體的發(fā)射極大值的熒光振幅與靠近供體的發(fā)射極大值的熒光振幅之比值、或供體的激發(fā)態(tài)壽命。比如，接頭的裂解提高了來自供體的熒光強(qiáng)度，而降低了來自受體的熒光強(qiáng)度，降低了來自受體對來自供體的熒光振幅之比，還降低了供體的激發(fā)態(tài)壽命。
優(yōu)選情況下，F(xiàn)RET程度的改變作為來自供體和受體部分熒光量比值之變化的函數(shù)來測定，即稱之為“求出比值法”。底物絕對量的變化，激發(fā)強(qiáng)度，及樣品中激發(fā)波長處的濁度或其它本底吸收，幾乎平行地影響來自供體和受體的熒光強(qiáng)度。因此，測兩種發(fā)射強(qiáng)度之比更為實用，是優(yōu)選的裂解測量法，而不是單獨測定任意一種。
同樣，供體部份的激發(fā)態(tài)壽命與底物的絕對量、激發(fā)強(qiáng)度、或濁度或者其它本底吸收無關(guān)。此種測定要求具毫微秒時間分辨力的裝置，而鑭系元素配合物的特殊情況下有所不同，該情況下以微秒至毫秒分辨力足夠了。
其它適宜的螯合部分如下述文獻(xiàn)所介紹的，Wallarino，L.M.，&Leif，R.C.，US Pat.5,373,093；Sabbatini，N.等人，Pure andApplied Chem.67135-140(1995)；Mathis，G.，ClinicalChem.411391-1397(1995)；Horiguchi，D.，Chem.Pharm.Bull.42972-975(1994)；Takalo，H.等人，BioconjugateChem.5278-282(1994)；Saha，A.K.等人，J.Amer.Chem.Soc.11511032(1993)；Li，M.&Selvin，P.R.，J.Amer.Chem.Soc.1178132-8138(1995)。
使用熒光計測定樣品的熒光。一般情況下，激發(fā)射線來自帶有原始波長的激發(fā)光源，通過激發(fā)鏡片。該激發(fā)鏡片使激發(fā)射線激發(fā)樣品。作為回應(yīng)，樣品中的發(fā)熒光蛋白發(fā)射不同于激發(fā)波長的射線。然后收集鏡片聚集來自樣品的發(fā)射。該裝置可以包括溫度控制器，當(dāng)掃描時使樣品維持于特定溫度之中。根據(jù)一個實施方案，一種多軸移動平臺使盛有多份樣品的微滴平板移動，以便使不同的孔固定于曝光位置。該移動平臺、溫度控制器、自動聚焦裝置、以及配合成像和數(shù)據(jù)收集的電子元件可由專用的程序數(shù)字計算機(jī)操縱。該計算機(jī)也可將測試中收集的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為另一種形式顯示出來。
以熒光物質(zhì)進(jìn)行的測試法是本領(lǐng)域已知的，在下述文獻(xiàn)中有所介紹例如，Lakowicz，J.R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，New YorkPlenum Press(1983)；Herman，B.，Resonanceenergy transfer microscopy，見Fluorescence Mioroscopy ofLiving Cells in Culture，Part B，Methods in Cell Biology，vol.30，ed.Taylor，D.L.& Wang，Y.-L.，San DiegoAcademic Press(1989)，pp.219-243；Turro，N.J，ModernMolecular Photochemistry，Menlo ParkBenjamin/CummingsPublishing Col，Inc(1978)，pp 296-361。
實施例所有的硅膠色譜均采用購自Aldrin的硅膠(Merck，grade 60，230-400目，60)操作。購自J.T.Baker和Bakerbond Octadecyl用于C18反相色譜。溶劑為高壓液體色譜級，用于色譜分析是公認(rèn)的，或用于合成時以活性分子篩(3)加以干燥。
熒光激發(fā)和發(fā)射光譜在Spex Fluorolog 111或K2熒光計上(ISSChampaigne，IL)，用若丹明B量子計數(shù)器，以測量其比例的方式來加以測定。熒光能量轉(zhuǎn)移的效率，由以β-內(nèi)酰胺酶處理時，在供體發(fā)射波長處，熒光發(fā)射積分之變化來確定。對于熒光顯微鏡成像法來說，可使用兩種不同的成像裝置。一種帶有匹配于硅增強(qiáng)靶(SIT)相機(jī)(Dage-MTI，Michigan City，IN)的倒向熒光顯微鏡，Zeiss IM-35(Thornwood，NY)，Tsien，R.Y.(1986)在有關(guān)胞質(zhì)游離鈣濃度熒光測定和光化學(xué)處理的新型四羧化螯合物[Optical Methods inCell Physiology，ed.de Weer，P.&Salzberg，B.，New YorkWiley，pp.327-345；Tsien and Harootunian(1990)CellCalcium 1193-109]的文獻(xiàn)中有詳細(xì)介紹。另一種則由連接于倒向熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert)的冷色電荷匹配裝置(CCD)相機(jī)(Photometrics，Tucson，AZ)組成。
使用市售濾光片(Omega Optical)，通過監(jiān)測供體和受體發(fā)射波長處熒光強(qiáng)度之比，來測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
激發(fā)360 DF 40二色性鏡390 DCLP或405 DF 15二色性鏡420 DRLPO2發(fā)射450 DF 65(供體發(fā)射)515 EFLP(受體發(fā)射)435 EFLP(同時觀察供體和受體熒光)實施例1(化合物11)合成帶有連接于下述模型的兩個染料分子的頭孢菌素，以試驗其光學(xué)特性。
合成第一步是將7-氨基頭孢烷酸轉(zhuǎn)換成在3′位帶有硫羥基，而7位為氨基的雙官能團(tuán)頭孢菌素[Van Heyningen，E.和Brown，C.N.，J.Med.Chem.8174-181(1965)；日本專利，Kokai 75/18494，CA85，97320d]。然后使該頭孢菌素選擇性地與硫醇反應(yīng)活性染料反應(yīng)，接著再與胺反應(yīng)活性染料反應(yīng)。硫醇反應(yīng)活性染料5，(6)-碘乙酰氨基熒光素和胺反應(yīng)活性染料5，(6)-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明-琥珀酰亞胺于pH8的二甲基甲酰胺水溶液中與頭孢菌素偶聯(lián)。該產(chǎn)物稱為RCF。
在pH 7的磷酸鹽緩沖液中，RCF實際上是不發(fā)熒光的；而經(jīng)激發(fā)處于它們各自的極大激發(fā)狀態(tài)時，出現(xiàn)生色團(tuán)疊合作用(即“黑色復(fù)合現(xiàn)象”)，熒光素和若丹明均不顯示明顯熒光，用β-內(nèi)酰胺酶長時間處理之后，β-內(nèi)酰胺環(huán)裂解，便引起兩染料熒光再現(xiàn)(圖1(a)和1(b))。該實驗確證，使用適當(dāng)?shù)墓w-受體對，通過熒光猝滅的消失，人們可以測定能催化水解頭孢菌素中β-內(nèi)酰胺的β-內(nèi)酰胺酶。
實施例2借助重氮化反應(yīng)將5-熒光素胺轉(zhuǎn)化成5-巰基熒光素而引入硫代甲基接頭，轉(zhuǎn)化成乙基黃原酸酯，再用酸水溶液使該黃原酸酯分解成游離巰基化合物。熒光素的巰基親核取代溴而與7-溴代乙酰氨基頭孢烷酸偶聯(lián)，而7-溴代乙酰氨基-頭孢烷酸由7-氨基頭孢烷酸和溴代乙酰溴反應(yīng)制備，見[Bunnell，C.A.et al.Industrial manufacture ofcephalosporins.InBeta-Lactam Antibiotics for Clinical Use.SeriesClinical Pharmacology Vol.4，edited by Queener，S.F.，Webber，J.A.和Queener，S.W.New YorkM.Dekker，1986，p.255-283]。
為制備7β-[(5-二乙酰基熒光素)硫基]乙酰氨-3-(乙酰氧甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸(14)，通氮氣下，將130mg(0.29mmol)二乙酸5-熒光素硫醇酯溶于10ml二甲基甲酰胺中，將其加入到120mg(0.31mmol)7β-溴代乙酰氨基-3-(乙酰氧甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸在10ml 1M磷酸鉀緩沖液中調(diào)節(jié)pH為8.0的溶液中。于室溫下將該溶液攪拌8小時，然后真空除去溶劑。將殘留物溶于10ml水中，并用稀磷酸將該溶液pH值小心地調(diào)到5。在該點非極性的副產(chǎn)物沉淀出，以離心除去。再酸化至pH 2.7，使標(biāo)題化合物沉淀出，再離心收集之。用2ml乙醚-四氯甲烷(1∶2)洗滌三次，并真空干燥。1H NMR(CDCl3)δ2.08ppm(s，3H，乙酸酯)，δ3.36ppm，3.53ppm(2d，2H，J＝17.3Hz，C-2)，δ3.87ppm(s，2H，側(cè)鏈亞甲基)，δ4.88ppm，5.16ppm(2d，2H，J＝13.6Hz，C-3′)，δ4.96ppm(d，1H，J＝4.9Hz，C-6)，δ5.81ppm(dd，1H，J1＝8.2Hz，J2＝4.9Hz，C-7)，δ6.85ppm(m，4H，呫噸)，δ7.10(s，2H，呫噸)，δ7.15ppm(d，1H，J＝8.2Hz，酰胺)，δ7.69ppm(d，1H，J＝8.2Hz，苯二甲酸)，δ7.91ppm(d，1H，J＝8.2Hz，苯二甲酸)，δ7.91ppm(d，1H，J＝8.2Hz，苯二甲酸)，δ8.11ppm(s，1H，苯二甲酸)。
將5-熒光素胺溴化得到5-四溴熒光素胺，再用轉(zhuǎn)化成5-巰基熒光素相似之方法，將其轉(zhuǎn)化成5-巰基四溴熒光素。用二乙酸5-巰基四溴熒光素酯對乙酸頭孢菌素酯進(jìn)行親核置換反應(yīng)，產(chǎn)生FRET-頭孢菌素，系加以保護(hù)的四乙?；苌铩?
為制備5-四溴熒光素胺，將1.74g(5mmol)5-熒光素胺在30ml冰醋酸中配成懸浮液，加入2.06ml(40mmol，過剩100％)溴。隨著溴的加入，該熒光素胺變成溶液，將該溶液于90℃加熱6小時，此時開始形成白色沉淀。將一個冰冷卻的阱接于燒瓶，以避免溴逸出大氣中。過剩的溴蒸餾進(jìn)液氮冷卻的收集燒瓶中回收。將相當(dāng)于該乙酸溶液體積的水加入該溶液中，沉淀出保留于該溶液中的所有產(chǎn)物。過濾收集沉淀，并溶于1N氫氧化鈉水溶液中。加入冰醋酸，5-四溴熒光素胺作為游離胺化合物沉淀出來。將四溴熒光素胺溶于少量氯仿中，并加入甲醇。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮該溶液，得到2.56g(3.85mmol，77％)四溴熒光素胺，為白色細(xì)粉(四溴熒光素胺-螺內(nèi)酯)。
為制備二乙酸5-四溴熒光素-乙基黃原酸酯，將670mg(1mmol)5-四溴熒光素胺在2ml濃硫酸和2ml冰醋酸中攪拌，該懸浮液于冰鹽浴中冷卻至零下幾度(C)，使其轉(zhuǎn)變成難于攪拌的稠漿狀。在1小時期間，將1ml水中的200mg(2.9mmol)亞硝酸鈉滴加進(jìn)去。再過2小時之后(0℃)慢慢加入20g冰。將燒瓶放于冰冷卻的高真空泵上，除去過剩之亞硝氣(需小心)。加入飽和的冰冷卻碳酸氫鈉水溶液，直至固體物溶解變成暗紅色溶液為止。加入200mg(1.2mmol)乙基黃原酸鉀，形成粉色沉淀(黃原酸5-四溴熒光素重氮鹽)。少量氯化鎳晶體可催化該重氮鹽的轉(zhuǎn)化，隨著放出氮。一旦氮的釋放停止，則用1N鹽酸沉淀出產(chǎn)物。過濾收集該沉淀并真空干燥。于40℃將其用乙酸酐-吡啶(1∶1)處理1小時。真空除去反應(yīng)劑后，將殘留物用硅膠色譜處理，以乙酸乙酯-己烷(1∶4)作洗脫液。所希望之產(chǎn)物首先洗脫出來。得到標(biāo)題化合物110mg(0.13mmol，13％)，為白色粉末。
為制備二乙酸5-四溴熒光素硫醇酯的二硫化物二聚體(即化合物15的二聚體)，將110mg(0.13mmol)二乙酸5-四溴熒光素-乙基黃原酸酯在10ml濃(30％)氨水中攪拌，并將該溶液加熱至70℃。將空氣慢慢鼓泡通入該溶液中，使硫醇于原位氧化成二硫化物。二小時后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中于40℃除去溶劑，用乙酸酐-吡啶(1∶1)處理殘留物。真空除去反應(yīng)劑后，將殘留物用硅膠色譜提純，以乙酸乙酯-己烷(1∶4)作洗脫液。得到90mg(60μmol，91％)標(biāo)題化合物，為白色粉末。將該化合物溶于甲醇中同時加入乙酸鈉、并加入20當(dāng)量巰基乙醇，該化合物便還原成單體(即化合物15)。2小時之后，將該甲醇溶液傾入3倍體積的5％乙酸水溶液中，離心處理從中收集沉淀出的5-熒光素硫醇單體。將該固體物用水洗滌直至不再有巰基乙醇之氣味為止。
二乙酰基5-四溴熒光素硫醇(15)與7β-[(5-二乙?；鶡晒馑?硫基]乙酰氨基-3-(乙酰氧甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸(14)偶合，并以乙酰酯酶除酰基，其操作如下將10mg(13μmol)7β-[(5-二乙酰基熒光素)硫基]乙酰氨基-3-(乙酰氧甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸，和10mg(13μmol)二乙?；?5 四溴熒光素硫醇溶于200μl無水乙腈中，將該溶液充氬氣下密封于玻璃管中。將該管置于84℃(±2℃)油浴中維持16小時。然后切開管子，將溶液移入燒瓶中，真空除去溶劑。該殘留物經(jīng)硅膠閃蒸色譜處理，以乙酸乙酯-甲醇-乙酸(100∶1∶1)作洗脫液。將該產(chǎn)物在50mM磷酸鹽緩沖液中(pH7)與橙皮乙酰酯酶，于37℃保溫24小時，可去除乙酸酯保護(hù)基。用C18反相色譜提純該脫?；a(chǎn)物，所用洗脫液是25mM磷酸鹽水緩沖液(pH7)和甲醇的階式梯度液。熒光素副產(chǎn)物用含33％和50％甲醇的洗脫液洗脫，此后所需產(chǎn)物用66％甲醇洗脫。
因為兩疏水染料的疊合，該去保護(hù)基化合物在磷酸鹽緩沖液中顯示很小熒光。所保留的熒光是由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。該化合物是RTEM β-內(nèi)酰胺酶的良好底物，稱之為FCE。
化合物的裂解增加515nm波長處的熒光約70倍(圖2)。該化合物的熒光特性可能歸因于一旦甲醇加入溶液時FRET急劇增加使二聚體染料形成的緣故，甲醇破壞了引起熒光團(tuán)疊合的疏水性相互作用。
實施例3(化合物22)
7-氨基頭孢烷酸的3′-乙酸酯被乙基黃原酸酯置換[VanHeyningen and Brown(1965)，前述文獻(xiàn)]，當(dāng)其用乙?；滤芤悍磻?yīng)則水解成游離巰基化合物[日本專利Kokai 75/18494，CA 85，97320d]。在二甲基甲酰胺水溶液中，該巰基與5-溴代乙酰氨基-對甲氨基酚-X反應(yīng)。該頭孢菌素7-胺在二噁烷水溶液中與溴代乙酰溴反應(yīng)，接著由5-熒光素硫醇取代溴，得到在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)實際上不產(chǎn)生熒光的FRET-頭孢菌素。該化合物稱之為FCRX。
制備5-對甲氨基酚-X-溴代乙酰胺的第一步是合成9-(2′-羧基-4′(5′)硝基-苯甲?；?-8-羥基久洛尼定和分離其異構(gòu)體。將10.1g(48mmol，92％純)4-硝基鄰苯二甲酸酐溶于20ml甲苯中(70℃)。加入9.76g(50mmol，97％純)8-羥基久洛尼定的20ml乙酸乙酯液，將該溶液置于70℃30分鐘。將該反應(yīng)混合物通過硅膠短柱，再用乙酸乙酯洗脫。真空蒸出溶劑，該固體物再溶解于回流最小量的乙酸乙酯中。該苯甲酸間位帶有硝基的異構(gòu)體過夜后從該溶液中結(jié)晶出，為橙色晶體(3.47g于第一級份中)。再一次分級結(jié)晶后得到純的該異構(gòu)體。結(jié)晶異構(gòu)體的1H NMR(CDCl3)δ1.91ppm(m，4H，脂族亞甲基)，δ2.73ppm，2.46ppm(2m，4H，苯胺亞甲基)，δ3.26ppm(m，4H，芐亞甲基)，δ6.32ppm(s，1H，久洛尼定)，δ7.53ppm(d，1H，J＝8.4Hz，苯二甲酸)，δ8.43ppm(dd，J1＝8.4Hz，J2＝2.2Hz，苯二甲酸)，δ8.90ppm(d，1H，J＝2.2Hz，苯二甲酸)。
為制備5-對甲氨基酚-X-胺鹽酸鹽(由相似的若丹明-X命名)，將1.91g(5.0mmol)9-(2′-羧基-4′-硝基-苯甲?；?-8-羥基久洛尼定在5ml濃(96％)硫酸中攪拌。冷卻下在15分鐘時間內(nèi)，將700mg(6.4mmol，1.25當(dāng)量)間苯二酚加入。室溫下將該懸浮液攪拌1.5小時，然后激烈攪拌下將其傾入200ml水中。過濾收集紫色沉淀，并借助5.3g(22mmol)非水合硫化鈉，將其再溶解于75ml水中。加入2.5g(44.6mmol)無水二硫化鈉，并將該溶液回流24小時。冷至室溫之后，加入冰醋酸沉淀出產(chǎn)物。過濾收集該固體物，并與100ml半飽和鹽酸水溶液一起煮沸。將該溶液通過燒結(jié)玻璃過濾，除去硫。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，將該溶液體積濃縮至10ml，加入1體積飽和鹽水，再過濾收集沉淀。從回流鹽酸中結(jié)晶，得到1.78g(3.85mmol，77％)暗紅色5-對甲氨基酚-X-胺鹽酸鹽晶體。5-硝基-對甲氨基酚-X的1H NMR(dDMSO)δ1.90ppm，2.05ppm(2m，4H，脂族亞甲基)，δ2.72ppm，3.03ppm(2m，4H，苯胺亞甲基)，δ3.66ppm(m，4H，芐亞甲基)，δ6.90ppm(s，1H，呫噸)，δ6.96ppm(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.1Hz，呫噸)，δ7.11ppm(d，1H，J＝9.0Hz，呫噸)，δ7.22ppm(d，1H，J＝2.1Hz，呫噸)，δ7.78ppm(d，1H，J＝8.4Hz，苯二甲酸)，δ8.70ppm(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝2.4Hz，苯二甲酸)，δ8.91ppm(d，1H，J＝2.4Hz，苯二甲酸)。5-對甲氨基酚-X-胺鹽酸鹽的1H NMR(CD3OD)δ2.00ppm，2.14ppm(2m，4H，脂族亞甲基)，δ2.75ppm，3.11ppm(2m，4H，苯胺亞甲基)，δ3.67ppm(m，4H，芐亞甲基)，δ6.85ppm(s，1H，呫噸)，δ6.94ppm(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝2.1Hz，呫噸)，δ7.13ppm(d，1H，J＝9.0Hz，呫噸)，δ7.16ppm(d，1H，J＝2.1Hz，呫噸)，δ7.55ppm(d，1H，J＝8.1Hz，苯二甲酸)，δ7.82ppm(dd，1H，J1＝8.1Hz，J2＝1.9Hz，苯二甲酸)，δ8.28ppm(d，1H，J＝1.9Hz，苯二甲酸)。
5-對甲氨基酚-X-溴代乙酰胺(18)的制備如下將115mg(0.25mmol)5-對甲氨基酚-X-胺鹽酸鹽與180mg(2.1mmol)碳酸氫鈉一起溶于2ml水-二噁烷(1∶1)中。將該溶液用冰冷卻并攪拌下于20分鐘時間內(nèi)加入175μl(2mmol)溴代乙酰溴。該溶液于室溫放置1.5小時，然后加入5倍體積水。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去二噁烷。加入乙酸，產(chǎn)物從保留的水溶液中沉淀出來。濾出沉淀并溶于少量氯仿-甲醇(1∶1)中。溶液中加入硅膠并真空除去溶劑。將該固體物加于硅膠柱上，以甲醇-乙酸乙酯(1∶4)洗脫產(chǎn)物。該洗脫液溶有一些保留于洗脫產(chǎn)物中的硅膠。1H NMR(CD3OD，10％dDMSO)δ1.98ppm，2.12ppm(2m，4H，脂族亞甲基)，δ2.72ppm，3.06ppm(2m，4H，苯胺亞甲基)，δ3.56ppm(m，4H，芐亞甲基)，δ4.08ppm(s，2H，呫噸)，δ6.79ppm(dd，1H，J1＝9.2Hz，J2＝2.1Hz，呫噸)，δ6.83ppm(s，1H，呫噸)，δ6.90ppm(d，1H，J＝2.1Hz，呫噸)，δ7.19ppm(d，1H，J＝9.2Hz，呫噸)，δ7.24ppm(d，1H，J＝8.4Hz，苯二甲酸)，δ8.02ppm(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1Hz，苯二甲酸)，δ8.30ppm(d，1H，J＝1Hz，苯二甲酸)。
為制備7β-(溴代乙酰氨基)-3-[[[(5-對甲氨基酚-X-酰氨基)甲基]硫基]甲基]-3-頭孢烯-4-羧酸(20)，將4.5mg(10μmol)5-對甲氨基酚-X-溴代乙酰胺(18)溶于調(diào)至pH7.7的0.5ml250mM磷酸鹽緩沖液中。將該溶液經(jīng)脫氧化處理，加入100μl磷酸鹽緩沖液中的根據(jù)文獻(xiàn)制備的10mg(40μmol)7β-氨基-3-(硫代甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸(8)。將該溶液于30℃放置2小時，然后真空蒸出溶劑，并將殘留物溶于1ml水中，加入乙酸，產(chǎn)物從該水溶液中沉淀出。收集沉淀，用C18反相色譜提純產(chǎn)物，用加有0.1％三氟乙酸的35％甲醇/水作洗脫液。
將上述產(chǎn)物(19)溶于含20mg碳酸氫鈉的1ml二噁烷-水(1∶1)中。將10μl溴代乙酸溴加入到置于冰上的該溶液中。室溫下該溶液再放置1.5小時。冰冷卻下加入20mg碳酸氫鈉和10μl溴代乙酰溴到該溶液中。室溫下再放置1.5小時之后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去二噁烷，用1M磷酸從水溶液中沉淀出產(chǎn)物，并離心收集。將該固體物于稀碳酸氫鹽水溶液中配成懸浮液，離心除去不溶顆粒并棄之。用1M磷酸沉淀出產(chǎn)物，并以硅膠閃蒸色譜提純，用氯仿-甲醇-乙酸-水(55∶15∶4∶2)作洗脫液，該處理中溶有少量硅膠。
二乙?；?-熒光素硫醇(21)與7β-(溴代乙酰氨基)-3-[[[(5-對甲氨基酚-X-酰氨基)甲基]硫基]甲基]-3-頭孢烯-4-羧酸(20)的偶合反應(yīng)如下進(jìn)行將7β-(溴代乙酰氨基)-3-[[[(5-對甲氨基酚-X-酰氨基)甲基]硫基]甲基]-3-頭孢烯-4-羧酸在通氬氣下與50％過剩的5-熒光素硫醇反應(yīng)，用二甲基甲酰胺-250mM磷酸鹽緩沖水溶液pH 7.7(1∶1)作溶劑。通過反復(fù)將產(chǎn)物溶于甲醇，再用乙酸乙酯沉淀的方法，使之從過剩熒光素硫醇中提純。
圖3表示用β-內(nèi)酰胺酶處理前和處理后，該FRET-頭孢菌素在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)中的熒光發(fā)射光譜。原始熒光很弱，是由于熒光團(tuán)疊合，形成不發(fā)熒光的基礎(chǔ)態(tài)復(fù)合物的緣故。當(dāng)加入甲醇到溶液中時，該疊合作用被破壞，則出現(xiàn)有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
實施例4(化合物25)N-[試鹵靈-4-羰基]-N′-碘乙?；?哌嗪(BoehringerMannheim)連接于頭孢菌素作為熒光素的FRET-受體。優(yōu)選作為FCRE的受體。
攜帶熒光素作為供體，而試鹵靈作為猝滅體的FRET-頭孢菌素FCRE(25)，其制備方法同攜帶對甲氨基酚-X-受體的該化合物一樣。將N-[試鹵靈-4-羰基]-N′-碘乙?；?哌嗪(BoehringerMannheim)與頭孢菌素的游離3′-硫羥基偶合，接著進(jìn)行溴代乙?；磻?yīng)并加入5-熒光素硫醇。與該方法不同的是，加入三當(dāng)量5-熒光素硫醇，而第一當(dāng)量瞬間將試鹵靈還原，并形成非活性二熒光素-二硫化物，將其曝露于空氣，試鹵靈再氧化為原來的染料。
β-內(nèi)酰胺酶催化水解該化合物產(chǎn)生兩個發(fā)熒光的片斷。試鹵靈激發(fā)和發(fā)射光譜的波長比對甲氨基酚光譜長且窄?？墒刮戳呀馊玖吓c酶裂解產(chǎn)物之間有較好光譜分離。但在對甲氨基酚作為受體的情況下，在磷酸鹽水緩沖液中該兩染料疊合，形成黑色復(fù)合物。β-內(nèi)酰胺酶處理破壞了疊合作用，并增加了供體熒光(圖4)。實施例5(化合物7b)
為合成2，4-二羥基-5-氯代苯甲醛，將21.7g(0.15Mol)4-氯代間苯二酚溶于150ml無水乙醚中，并將27g氰化鋅(II)細(xì)粉末和0.5g氯化鉀攪拌下加入。用冰冷卻該懸浮液。激烈攪拌下將氯化氫強(qiáng)氣流吹入該溶液中。約30分鐘之后，反應(yīng)劑溶解。繼續(xù)通入HCl氣體，直至其在醚液中停止被吸收為止(約1小時)，該期間沉淀形成。將該懸浮液在冰上再攪拌1小時，然后使固體沉下。從固體中傾出醚溶液。將固體用100g冰處理，并在水浴中加熱至100℃。當(dāng)冷卻時，該產(chǎn)物以光亮片狀物從溶液中結(jié)晶出來。過濾移出，并以無水氫氧化鉀干燥。產(chǎn)量為15.9g(0.092mol，61％)。1H NMR(CDCl3)δ6.23ppm(s，1H，苯酚)，δ6.62ppm(s，1H，苯基)，δ7.52ppm(s，1H，苯基)，δ9.69ppm(s，1H，甲?；?，δ11.25ppm(s，1H，苯酚)。
為制備3-羧基-6-氯代-7-羥基香豆素，將5.76g(0.033mol)2，4-二羥基-5-氯代苯甲醛和7.2g(0.069mol)丙二酸溶解于溫?zé)岬倪拎ぶ小?5μl苯胺攪拌下加入該溶液中，于室溫下將該反應(yīng)物靜置3天。形成的黃色固體碎成小片，并加入50ml乙醇。用燒結(jié)玻璃過濾該乳液狀懸浮液，用1N鹽酸，洗固體三次，然后用水洗滌。隨后將該固體與100ml乙酸乙酯、150ml乙醇、和10ml半濃縮鹽酸一起攪拌。真空濃縮減少溶劑體積，并過濾回收沉淀，用乙醚洗滌并用五氧化二磷干燥。獲得白色粉末產(chǎn)物4.97g(0.021mol，63％)。1H NMR(dDMSO)δ6.95ppm(s，1H)，δ8.02ppm(s，1H)，δ8.67ppm(s，1H)。
為制備7-丁酰氧-3-羧基-6-氯代香豆素，將3.1g(12.9mmol)3-羧基-6-氯-7-羥基香豆素溶于100ml二噁烷中，并于室溫下用5ml丁酸酐、8ml吡啶和20mg二甲氨基吡啶處理2小時。將該反應(yīng)溶液攪拌下加入到300ml庚烷中，它使白色沉淀形成。過濾回收，并溶于150ml乙酸乙酯中。過濾除去不溶物，并用50ml 1N鹽酸/鹽水(1∶1)提取濾液兩次，隨后用鹽水提取。用無水硫酸鈉干燥溶液，真空蒸發(fā)，得到2.63g(8.47mmol，66％)產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ1.08ppm(t，3H，J＝7.4Hz，丁酸的甲基)，δ1.85ppm(m，2H，J1≈J2＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ2.68ppm(t，2H，J＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ7.37ppm(s，1H，香豆素)，δ7.84ppm(s，1H，香豆素)，δ8.86ppm(s，1H，香豆素)。
7-丁酰氧-3-芐氧羰基甲氨羰基-6-氯代香豆素制備如下將2.5g(8.06mmol)7-丁酰氧-3-羧基-6-氯代香豆素，2.36g羥基苯并三唑水合物(16mmol)和1.67g(8.1mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺溶解于30ml二噁烷中。將O-芐基甘氨酸[用乙酸乙酯-甲苯-飽和碳酸氫鹽水溶液-水(1∶1∶1∶1，250ml)提取3.4g(10mmol)芐基甘氨酸甲苯磺酸鹽，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，并將溶劑體積濃縮至5ml制備的]的甲苯溶液滴加入該香豆素溶液中。該反應(yīng)于室溫下維持20小時，然后過濾除去沉淀，并用乙酸乙酯和丙酮徹底洗滌。用旋轉(zhuǎn)蒸餾器將該混合溶劑餾份濃縮至50ml，此時加入1體積甲苯，再將體積減至30ml。過濾移出沉淀產(chǎn)物，并溶于200ml氯仿-絕對乙醇(1∶1)中。在旋轉(zhuǎn)蒸餾器中將該溶液濃縮至50ml，濾出產(chǎn)物，真空干燥，得到1.29g標(biāo)題產(chǎn)物。進(jìn)一步再將濾出的溶劑濃縮，得到第二批產(chǎn)物(0.64g)，總產(chǎn)量1.93g(4.22mmol，52％)。1H NMR(CDCl3)δ1.08ppm(t，3H，J＝7.4Hz，丁酸的甲基)，δ1.84ppm(m，2H，J1≈J2＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ2.66ppm(t，2H，J＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ4.29ppm(d，2H，J＝5.5Hz，甘氨酸的亞甲基)，δ5.24ppm(s，2H，芐基)，δ7.36ppm(s，1H，香豆素)，δ7.38ppm(s，5H，苯基)，δ7.77ppm(s，1H，香豆素)，δ8.83ppm(s，1H，香豆素)，δ9.15ppm(t，1H，J＝5.5Hz，酰胺)。
7-丁酰氧-3-羧甲氨羰基-6-氯代香豆素制法如下將920mg(2mmol)7-丁酰氧-3-芐氧羰基甲氨羰基-6-氯代香豆素溶于50ml二噁烷中，該溶液中加入100mg碳載鈀(10％)和100μl乙酸，于常壓氫氣氛中劇烈攪拌該懸浮液。氫氣被利用吸收后，過濾該懸浮液。用煮沸的二噁烷將該含碳產(chǎn)物提取5次。合并二噁烷溶液，使其冷卻，冷卻后即沉淀出產(chǎn)物，為白色粉末。再將溶劑濃縮至20ml，沉淀得到更多產(chǎn)物。再將保留的二噁烷溶液加熱至沸，并加入庚烷直至該溶液變得混濁。三次所得干燥粉末量分別為245mg，389mg和58mg，白色產(chǎn)物總重692mg(1.88mmol，94％)。1H NMR(dDMSO)δ1.02ppm(t，3H，J＝7.4Hz，丁酸的甲基)，δ1.73ppm(m，2H，J1≈J2＝7.3Hz，丁酸的亞甲基)，δ2.70ppm(t，2H，J＝7.2Hz，丁酸的亞甲基)，δ4.07ppm(d，2H，J＝5.6Hz，甘氨酸的亞甲基)，δ7.67ppm(s，1H，香豆素)，δ8.35ppm(s，1H，香豆素)，δ8.90ppm(s，1H，香豆素)，δ9.00ppm(t，1H，J＝5.6Hz，酰胺)。
7-丁酰氧-3-羧甲基氨羰基-6-氯代香豆素與7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲基酯的偶合進(jìn)行如下將7-丁酰氧-3-羧甲基氨羰基-6-氯代香豆素368mg(1mmol)，270mg羥基苯并三唑水合物，和415mg(1mmol)7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲基酯在40ml二噁烷-乙腈(1∶1)中配成懸浮液。加入260mg(1.25mmol)二環(huán)己基碳化二亞胺的5ml乙腈液，并將該懸浮液激烈、攪拌36小時。過濾移出沉淀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將溶液體積濃縮至20ml。加入50ml甲苯并濃縮至30ml。攪拌下加入50ml庚烷并用冰冷卻該懸浮液，過濾回收沉淀。將其再溶解于10ml氯仿中，并將不溶固體物濾出。加入2體積庚烷沉淀標(biāo)題產(chǎn)物，收集并真空干燥，得到468mg(0.64mmol，64％)灰白色粉末。1H NMR(CDCl3)δ1.08ppm(t，3H，J＝7.4Hz，丁酸的甲基)，δ1.84ppm(m，2H，J1≈J2＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ2.66ppm(t，2H，J＝7.4Hz，丁酸的亞甲基)，δ3.54ppm(2d，2H，J＝18.3Hz，頭孢菌素C-2)，δ4.24ppm(2d，2H，J＝5.8Hz，頭孢菌素3亞甲基)，δ4.37ppm(d，2H，J＝3.8Hz，甘氨酸的亞甲基)，δ5.02ppm(d，1H，J＝4.9Hz，頭孢菌素C-6)，δ5.89ppm(dd，1H，J1＝9.0Hz，J2＝5.0Hz，頭孢菌素C-7)，δ6.96ppm(s，1H，二苯甲基)，δ7.30-7.45ppm(m，12H，苯基，香豆素，酰胺)，δ7.79ppm(s，1H，香豆素)，δ8.84ppm(s，1H，香豆素)，δ9.28ppm(t，1H，J＝3.7Hz，酰胺)。
上述產(chǎn)物與5-熒光素硫醇的偶合進(jìn)行如下將90mg(0.2mmol)5-巰基熒光素二乙酸酯二硫水物二聚體溶于10ml氯仿中，并在氬氣氛下與25μl三丁基膦及25μl水反應(yīng)。該溶液在室溫下放置2小時，然后加入到20mg碳酸氫鈉、25mg碘化鈉和上述產(chǎn)物110mg(0.15mmol)在10ml二甲基甲酰胺的溶液中。4小時之后真空除去溶劑，并用乙醚研制該殘留物。再將該固體溶于乙酸乙酯 乙腈(1∶1)中。除去溶劑后，該殘留物再用乙醚研制一次，得到157mg(0.13mmol，88％)奶油色粉末產(chǎn)物。
將上述化合物樣品在室溫下，大量過剩三氟乙酸-苯甲醚(1∶1)反應(yīng)20分鐘。真空除去反應(yīng)試劑，用乙醚研制殘留物。將該固體在45％乙腈水溶液(含0.5％乙酸)中進(jìn)行高壓液體色譜處理，得到丁酸酯和二苯甲基酯被裂解的產(chǎn)物，在反相C18柱上，用含5％乙酸的45％乙腈水溶液作洗脫液進(jìn)行高壓液體色譜提純。
用碳酸氫鈉的甲醇液將化合物27的熒光素二乙酸酯保護(hù)基除去(室溫，處理30分鐘)，得到發(fā)熒光的酶底物CCF2。在反相C18柱上，用含0.5％乙酸的35％乙腈水溶液作洗脫液，進(jìn)行高壓液體色譜提純。
將化合物27與過剩乙酰氧甲基溴在無水二甲基吡啶中攪拌，得到底物的透膜衍生物(CCF2/ac2AM2)。在反相C18柱上，使用含0.5％乙酸的65％乙腈水溶液作洗脫液，高壓液體色譜提純。在細(xì)胞胞質(zhì)中CCF2/ac2AM2很容易轉(zhuǎn)化為CCF2。
不像實施例1-4的情況，底物CCF2的供體和受體染料不疊合。該底物在磷酸鹽緩沖液中是完全發(fā)熒光的，不形成“黑色復(fù)合物”(即加入甲醇除了有稀釋效果外，并不改變CCF2的熒光光譜)。這是由于與例1-4的呫噸染料(四溴熒光素、若丹明，對甲氨基酚及試鹵靈)相比，7-羥基香豆素要小得多且極性更大的緣故。
圖5表示在β-內(nèi)酰胺酶裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)之前和之后，化合物CCF2在50mmolar磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的發(fā)射光譜。在完整底物的情況下，出現(xiàn)從7-羥基香豆素部份到熒光素部份的有效能量轉(zhuǎn)移。底物在405nm波長處激發(fā)，結(jié)果從受體染料熒光素產(chǎn)生515nm波長(綠色)的熒光發(fā)射。當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)時，配量轉(zhuǎn)移受到破壞，由此切斷了兩個染料之間的連接。產(chǎn)物在405nm波長處激發(fā)，完全產(chǎn)生448nm波長(蘭色)的供體熒光發(fā)射。當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶裂解時，供體部份的熒光發(fā)射提高25倍。515nm處的熒光減低3.5倍，源自7-羥基香豆素作為其發(fā)射光譜的全部保留熒光拉長至綠色。該底物中供體25倍猝滅相當(dāng)于熒光能量轉(zhuǎn)移效率為96％。此種β-內(nèi)酰胺裂解引起的巨大熒光變化，可以很容易地應(yīng)用來檢測哺乳動物活細(xì)胞胞質(zhì)中的β-內(nèi)酰胺酶，正如實施例6和7所介紹的。
頭孢菌素的7-羥基香豆素部份被測定在不存在受體時其熒光量子效率為98-100％。該值由該染料的經(jīng)校正過的熒光發(fā)射光譜積分與9-氨基吖啶鹽酸鹽水溶液的所述積分(與激發(fā)波長處的吸收率相匹配)相比較確定。表明7-羥基香豆素是理想的供體染料，因?qū)嶋H上由染料吸收的每個光子均進(jìn)行向受體的熒光能量轉(zhuǎn)移。
實施例6將T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat懸浮于每ml含約1012個β-內(nèi)酰胺酶分子(約1.7nM；青霉素酶205 TEM R+，購自Sigma)的等滲鹽溶液(Hank氏平衡鹽溶液)中，并以1mg/ml與葡聚糖(40 kd)共軛的若丹明作為負(fù)荷標(biāo)志。將該懸浮液四次通過注射針頭(30號針)，這引起細(xì)胞漿膜暫時的可存活性破裂，并使得標(biāo)記葡聚糖和β-內(nèi)酰胺酶可進(jìn)入其中。該被成功地穿透的細(xì)胞含β-內(nèi)酰胺酶，在熒光顯微鏡上以若丹明激發(fā)波長照射時發(fā)紅色熒光。于室溫下，該細(xì)胞與5μM產(chǎn)生熒光的β-內(nèi)酰胺酶底物CCF2/ac2AM2一起保溫30分鐘。以紫光(405nm)照射顯示蘭色熒光和綠色熒光細(xì)胞。所有吸收標(biāo)志若丹明-葡聚糖的細(xì)胞呈現(xiàn)熒光蘭，而沒有酶的細(xì)胞呈熒光綠色。
實施例7將來自各種哺乳動物的細(xì)胞系細(xì)胞，在哺乳動物啟動子控制下，用含RTEM β-內(nèi)酰胺酶基因的質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染。該基因編碼胞液β-內(nèi)酰胺酶，缺失所有信號序列，作為SEQ.ID.1列入表中。轉(zhuǎn)染后10-48小時，將該細(xì)胞曝露于5μmol CCF2/ac2AM21-6小時。在以熒光顯微鏡觀察時，所有情況下均檢測出發(fā)蘭色熒光之細(xì)胞，而在未轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞中，則沒有一個發(fā)蘭色熒光的細(xì)胞被檢出。為進(jìn)行定量熒光測定，將該細(xì)胞首先通過香豆素(450 DF 65)發(fā)射濾光鏡觀測，然后通過熒光素(515 EFLP)發(fā)射濾光鏡觀測，并用電荷匹配裝置相機(jī)記錄下圖像。在COS-7(表2)和CHO(表3)細(xì)胞中，于香豆素和熒光素波長處，載負(fù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(蘭色)和對照細(xì)胞(綠色)的CCF2之平均象素強(qiáng)度歸納于表中；每個群體給出4個有代表性的細(xì)胞測定值。由此，底物CCF2揭示了單個哺乳動物活細(xì)胞中的基因表達(dá)。
表2COS-7(來源SV40轉(zhuǎn)化非洲綠猴腎細(xì)胞)象素強(qiáng)度表香豆素發(fā)射濾光鏡熒光素發(fā)射濾光鏡蘭細(xì)胞1#27 202#34 233#31 314#32 33綠細(xì)胞1#4 432#4 423#5 204#3 24表3CHO(來源中國倉鼠卵巢細(xì)胞)象素強(qiáng)度表香豆素發(fā)射濾光鏡熒光素發(fā)射濾光鏡蘭細(xì)胞1#98 1122#70 1133#76 924#56 67綠細(xì)胞1#9 1802#9 1023#7 1014#9 83實施例8
為制備7-乙酰氧-3-(N-羧甲基-N-甲氨羰基)香豆素，將400mg(1.6mmol)3-羧基-7-乙酰香豆素與亞硫酰氯一起回流20分鐘。蒸餾除去過剩的亞硫酰氯，殘留的7-乙酰氧-3-氯羰基香豆素在填有氫氧化鉀顆粒的真空容器中貯存過夜。在另外一個反應(yīng)瓶中，將142.5mg(1.6mmol)肌氨酸溶于1.05ml(5.4mmol)N-甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)中，室溫下放置16小時。加入2ml無水乙腈和187μl(1.7mmol)N-甲基嗎啉，將該溶液傾入冰冷卻下的固體7-乙酰氧-3-氯代羰基香豆素中。在冰中攪拌20分鐘后，將該溶液升至室溫。4小時之后真空除去溶劑。將殘留物溶于甲醇中，使酸去除保護(hù)基，然后真空除去溶劑。將固體溶于30ml乙酸乙酯-乙腈(2∶1)中，用等體積1N鹽酸提取該溶液兩次，再用鹽水提取。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，真空除去溶劑，隨著己烷的加入從煮沸的乙酸乙酯中固體結(jié)晶出來。白色結(jié)晶固體物的產(chǎn)量是316mg(1.0mmol，63％)。
7-乙酰氧-3-(N-羧甲基-N-甲氨羰基)香豆素與7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲酯的偶合進(jìn)行如下將62mg(0.2mmol)7-乙酰氧-3-(N-羧甲基-N-甲氨羰基)香豆素與1ml無水二氯甲烷一起攪拌，然后加入27mg(0.2mmol)羥基苯并三唑和41mg二環(huán)己基碳化二亞胺。在5分鐘時間內(nèi)將82.6mg(0.2mmol)7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲酯的1ml二氯甲烷溶液滴加進(jìn)去。室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌20小時，然后過濾移出沉淀。真空蒸發(fā)濾液，用二氯甲烷提取產(chǎn)物。多次除去溶劑，并將殘留物溶于1ml乙酸乙酯中。加入三體積己烷沉淀出產(chǎn)物，離心回收之。白色粉末產(chǎn)物產(chǎn)量為49.9mg(70μmol，35％)。
按下面所述，將上面產(chǎn)物的頭孢菌素3′-氯取代基轉(zhuǎn)換成3′-碘取代基。于室溫下，將上述產(chǎn)物49.9mg(70μmol)與52.5mg碘化鈉(5當(dāng)量)在1.2ml無水甲乙酮中攪拌2小時。真空除去溶劑，并將殘留物溶于2ml乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)中，用冷的2％硫代硫酸鈉水溶液提取，接著再用鹽水提取二次。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)層。無需提純該成橙色粉末(32mg，40μmol，57％)可用于下步反應(yīng)。
上述產(chǎn)物與5-巰基熒光素二乙酸酯(產(chǎn)物CCF1ac3二苯甲基酯)偶合進(jìn)行如下將32mg(40μmol)碘衍生物溶于0.4ml二甲基甲酰胺中，加入3.4mg碳酸氫鈉。將22mg(50μmol)5-巰基熒光素二乙酸酯溶于0.3ml脫氧處理的二甲基甲酰胺中，并于氬氣下加入到碘化合物中。2小時后真空除去溶劑，殘留物于二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1)中配成懸浮液。用水洗滌該有機(jī)溶液，并用無水硫酸鈉干燥，除去溶劑用乙醚-己烷(1∶1)研制該殘留物。以60目硅膠，乙酸乙酯-甲苯(2∶1)進(jìn)行閃蒸色譜處理，得到4.2mg(4μmol，10％)無色產(chǎn)物。
按如下程序使二苯甲酯裂解，得到CCF1ac3于冰上，將4mg(4μmol)CCF1ac3二苯甲酯用200μl三氟乙酸-苯甲醚-二氯甲烷(10∶1∶10)處理15分鐘。真空除去反應(yīng)劑并將殘留物溶于0.5ml乙酸乙酯中，真空蒸出溶劑。用乙醚研制該固體，然后溶于0.5ml甲醇中。該甲醇溶液加入到2ml水中沉淀出產(chǎn)物。離心回收該產(chǎn)物并真空干燥。得到2mg(2μmol，50％)白色固體物。使用含0.5％乙酸的55％乙腈水溶液作洗脫液，將該化合物在反相C18柱上進(jìn)一步高壓液體色譜提純。
通過用50mM磷酸鹽pH7水緩沖液中的橙皮乙酰酯酶處理，使CCF1ac3樣品轉(zhuǎn)化為CCF1，獲得β-內(nèi)酰胺酶裂解前和裂解后的CCF1熒光發(fā)射光譜(圖6)。
底物CCF1與例5的底物CCF2有相似熒光特性。在完整底物中，出現(xiàn)由7-羥基香豆素部份到熒光素部份的有效能量轉(zhuǎn)移。底物于390nm波長處激發(fā)，結(jié)果產(chǎn)生受體染料熒光素515nm(綠色)波長的熒光發(fā)射。當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)時，該能量轉(zhuǎn)移被破壞，由此切斷了兩染料間的連接。而在390nm波長處該產(chǎn)物被激發(fā)時，則完全產(chǎn)生460nm(蘭色)波長的供體熒光發(fā)射。當(dāng)β-內(nèi)酰胺裂解時，來自供體部份的熒光發(fā)射提高25倍。515nm熒光降低3倍，源自7-羥基香豆素的作為其發(fā)射光譜的所有保留熒光伸長至綠色。底物中供體的25倍猝滅相當(dāng)于熒光能量轉(zhuǎn)移效率為96％，β-內(nèi)酰胺裂解所引起的巨大熒光變化，可很容易地應(yīng)用來檢測活哺乳動物細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的β-內(nèi)酰胺酶，如實施例9所述。
實施例9將T-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat懸浮于每毫升含約1012β-內(nèi)酰胺酶分子(約1.7nM；青霉素酶205TEM R+，購自Sigma)，和1mg/ml與葡聚糖(40kd)共軛的若丹明作為負(fù)荷標(biāo)志的等滲鹽溶液(Hank氏平衡鹽溶液)中。將該懸浮液通過注射針頭(30號針)四次，這使得細(xì)胞胞質(zhì)膜產(chǎn)生暫時的，可存活性破裂，并使標(biāo)記葡聚糖和β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)入其中。被成功地滲透的細(xì)胞含β-內(nèi)酰胺酶，當(dāng)在熒光顯微鏡上以若丹明激發(fā)波長照射時產(chǎn)生紅色熒光。于室溫下，該細(xì)胞與30μM產(chǎn)生熒光的β-內(nèi)酰胺酶底物CCF1ac3一起保溫30分鐘。用紫外光(360nm)照射，發(fā)現(xiàn)有發(fā)蘭色熒光和綠色熒光細(xì)胞。所有吸收標(biāo)志若丹明-葡聚糖的細(xì)胞發(fā)蘭色熒光，而無酶的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。
實施例10優(yōu)選的透膜CCF2酯制備如下
5-熒光素硫醇二乙酸酯(5)與7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲酯的偶合進(jìn)行如下將450mg(1mmol)5-巰基熒光素二乙酸酯二硫化物二聚體溶于30ml氯仿中，并用50μl水和125μl三丁基膦在通氮下加以處理，產(chǎn)生游離5-熒光素硫醇。將450mg(1mmol)7-氨基-3′-氯代頭孢烷酸二苯甲酯鹽酸鹽，借助220μl(2mmol)N-甲基嗎啉溶解于10ml乙腈中。30分鐘后將兩溶液合并。1小時后將溶劑體積濃縮至5ml，并加入50ml四氯化碳。再將溶劑體積濃縮至15ml，并攪拌下加入己烷。過濾除去主要由N-甲基嗎啉組成的最初橙色沉淀。進(jìn)一步加入二體積己烷，沉淀出630mg(0.76mmol，76％)白色產(chǎn)物，收集之。
將上述產(chǎn)物與7-丁酰氧-3-羧甲基氨羰基-6-氯代香豆素偶合，將325mg(0.88mmol)7-丁酰氧-3-羧甲基氨羰基-6-氯代香豆素溶解于15ml熱的無水二噁烷中。快速冷卻下，將1ml二噁烷中的110μl(1mmol)N-甲基嗎啉，和8ml二氯甲烷中的115μl(0.9mmol)氯甲酸異丁酯加進(jìn)去。將該反應(yīng)物于0℃放置30分鐘，此后將上述熒光素-頭孢菌素加成產(chǎn)物661mg(0.8mmol)的7ml無水二氯甲烷液加入。將該溶液升至室溫，3小時后真空除去溶劑。再將殘留物溶于30ml二氯甲烷中，并用1體積10％乙酸水溶液提取二次，再用水提取一次。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。加入150ml無水乙醇，將溶劑體積濃縮至50ml并冷卻至-20℃使產(chǎn)物沉淀出(粗產(chǎn)物，850mg)。用硅膠柱、以25％乙酸乙酯甲苯溶液為洗脫液進(jìn)行色譜提純。收集到250mg(0.21mmol，26％)白色粉末產(chǎn)物。
用三氟乙酸處理使頭孢菌素二苯甲酯裂解。用三氟乙酸/二氯甲烷/苯甲醚(10∶10∶1)于0℃處理145mg(0.12mmol)上述產(chǎn)物20分鐘。真空除去反應(yīng)劑，殘留物用異丙醚研制。將固體物溶于1ml二甲基亞砜，加入到25ml水中則產(chǎn)物沉淀出。進(jìn)一步用反相C18樹脂，40-60％含0.5％乙酸的乙腈水溶液階式梯度液洗脫，色譜提純，得到74mg(73μmol，60％)白色粉末。
對頭孢菌素酸進(jìn)行保護(hù)，使成為透膜乙酰氧甲酯，其方法如下將15mg(15μmol)上述產(chǎn)物溶于250μl二氯甲烷中，該溶液中加入25μl乙酸溴代甲酯和50μl二甲基吡啶。該反應(yīng)于室溫維持7小時，然后真空除去反應(yīng)劑。殘留物用硅膠，乙酸乙酯作洗脫液閃蒸色譜提純，獲得15mg(14μmol，92％)白色產(chǎn)物。該化合物稱之為CCF2/btAMac2，用作β-內(nèi)酰胺酶活性的胞內(nèi)檢測。
實施例11胞內(nèi)受體激活的測定胞內(nèi)糖腎上腺皮質(zhì)激素受體的激活，由其在鼠乳腺腫瘤病毒啟動子中能上調(diào)糖腎上腺皮質(zhì)激素應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄活性之能力來測定。當(dāng)提高胞內(nèi)β-內(nèi)酰胺酶對底物CCF2的活性，引起熒光信號發(fā)生適當(dāng)?shù)淖兓朔N對類固醇的應(yīng)答被檢測。
編碼埃希式大腸桿菌RTEM β-內(nèi)酰胺酶不帶信號序列的質(zhì)?；?圖7序列1)被置于鼠乳腺腫瘤病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下，并被導(dǎo)入哺乳動物表達(dá)載體內(nèi)。該載體也攜帶有對質(zhì)粒在細(xì)菌中擴(kuò)增的氯霉素抗性標(biāo)志，和為哺乳動物選擇的新霉素抗性標(biāo)志。使用磷酸鈣沉淀技術(shù)，將它導(dǎo)入培養(yǎng)基中的幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞中。使用抗生素G418，使細(xì)胞經(jīng)受選擇，以使質(zhì)粒穩(wěn)定地整合入細(xì)胞的基因組。曝露于類固醇類似物地塞米松之后，20個克隆之一因其標(biāo)志著能提高β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)而被挑選出。
下面描述加入激動劑地塞米松之后，該克隆中提高β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)的測定。將在糖腎上腺皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)性啟動子控制下表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定BHK細(xì)胞克隆G941細(xì)胞，分別在存在或不存在激動劑的情況下放置于37℃保溫箱中。在加入激動劑后不同的時間間隔，將裝有細(xì)胞的燒瓶從保溫箱中移出，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)含10μmolar CCF2/btAMac2的Hank氏平衡鹽溶液中。由于內(nèi)源胞質(zhì)酯酶的作用，該化合物轉(zhuǎn)化為β-內(nèi)酰胺酶可接近的發(fā)熒光底物CCF2。10分鐘后，移出含CCF2/btAMac2的細(xì)胞上清液。30分鐘后用安裝于熒光顯微鏡上的冷色CCD相機(jī)將細(xì)胞照相。進(jìn)行帶有紫色激發(fā)光(濾光片400DF15)和蘭色(濾光片450DF65)，及綠色(濾光片535DF45)發(fā)射濾光片的熒光測定。測定蘭色發(fā)射強(qiáng)度與綠色發(fā)射強(qiáng)度之比。該比值是有多少底物已被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的度量。使用40X物鏡，在每個時間點，使每一個帶有約60個細(xì)胞的4個視場成像。該結(jié)果表明反映β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)和生產(chǎn)提高的熒光強(qiáng)度之比明顯增加。
實施例12通過第二信使應(yīng)答元件的細(xì)胞表面受體激活作用和胞內(nèi)信號的測定細(xì)胞表面受體的激活，導(dǎo)致胞內(nèi)信使?jié)舛鹊淖兓M(jìn)而調(diào)整胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性。在淋巴細(xì)胞中，信使離子鈣胞內(nèi)濃度增加導(dǎo)致激活T-淋巴細(xì)胞的核因子(NFAT)激活。該情況增加含NFAT識別位點的啟動子中的轉(zhuǎn)錄。只是鈣水平的提高，足以明顯提高調(diào)節(jié)β-內(nèi)酰胺酶之類的報告基因(當(dāng)其置于含NFAT位點三聚體的啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下)之轉(zhuǎn)錄。
將鼠T-淋巴細(xì)胞系B3Z用兩質(zhì)粒瞬間共轉(zhuǎn)染。一種質(zhì)粒含β-腎上腺素功能的受體，它位于細(xì)胞表面，在強(qiáng)的、具組成型活性的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。另一種質(zhì)粒含有來自埃希氏大腸桿菌、經(jīng)促進(jìn)哺乳動物表達(dá)修飾(序列ID#3，帶有最佳哺乳動物Kozak序列，β-球蛋白前導(dǎo)序列，除去在前序列)，在含NFAT位點三聚體的啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下的細(xì)菌RTEM β-內(nèi)酰胺酶基因。該兩種質(zhì)粒使用電穿孔法導(dǎo)入細(xì)胞中。使用Biorad基因脈沖發(fā)生器(250V，960μF，16μsec)，在兩種質(zhì)粒各存在10μg的條件下，將0.5ml電穿孔緩沖液中的5×106細(xì)胞電穿孔。轉(zhuǎn)染后24小時，將細(xì)胞分別在存在或不存在β-腎上腺功能激動劑異丙基腎上腺素(10μmolar)的情況下保溫5小時。除去上清液，代之以含μmolar CCF2/btAMac2的Hank氏平衡鹽溶液。室溫下放置20分鐘之后，用新鮮的緩沖液洗滌細(xì)胞，并用熒光顯微鏡觀測。有4％異丙基腎上腺素處理的細(xì)胞發(fā)蘭色熒光(激發(fā)濾光片400DF15，發(fā)射濾光片435nm長濾過)，而在對照群體(不存在激動劑)中檢出非發(fā)蘭色熒光細(xì)胞。用2μM離子霉素(ionomycin)和50ng/ml佛波醇酯最大刺激5小時，結(jié)果該群體有20％發(fā)蘭色熒光細(xì)胞。
實施例13將來自不同微生物的β-內(nèi)酰胺酶加以修飾，使之作為真核細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動物)中的報告基因酶使用。這些酶的細(xì)菌基因包括使酶瞄準(zhǔn)胞外空間的N-末端在前序列(圖7序列的開始23個氨基酸)。經(jīng)易位后，在前序列肽酶裂解該23氨基酸在前序列，釋放出成熟的β-內(nèi)酰胺酶。包括其細(xì)菌在前序列的來自埃希氏大腸桿菌的RTEM β-內(nèi)酰胺酶(圖7序列2)被放入鼠乳房瘤病毒啟動子控制下的哺乳動物表達(dá)載體中。使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣沉淀技術(shù)，將該構(gòu)件導(dǎo)入幼倉鼠腎細(xì)胞中。在細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶活性，而細(xì)胞球中未檢出活性。培養(yǎng)基中，β-內(nèi)酰胺酶活性物量取決于類固醇。測定以前，在1μM地塞米松存在下培養(yǎng)36小時的細(xì)胞，比對照物產(chǎn)生多3倍的酶。這使得可將帶有其細(xì)菌在前序列的β-內(nèi)酰胺酶(圖7序列2)用于胞外檢測哺乳動物報告基因活性。
β-內(nèi)酰胺酶報告基因優(yōu)選用于酶產(chǎn)生和維持在細(xì)胞胞質(zhì)中的情況下。因此在三種經(jīng)修飾的RTEM β-內(nèi)酰胺酶基因(圖7的序列1、3、4)中，細(xì)菌信號序列被除去，由ATG(蛋氨酸)代替作為新的轉(zhuǎn)譯起始位點。為提高該β-內(nèi)酰胺酶在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，以優(yōu)化哺乳動物表達(dá)的改變過的核糖體連接位點來構(gòu)建圖7序列3和4的RTEM β-內(nèi)酰胺酶[Kozak，M.，J.Cell Biol.108229-241(1989)]。為提高與哺乳動物轉(zhuǎn)譯手段的相容性。將序列ID#3的β-內(nèi)酰胺酶插在未轉(zhuǎn)譯哺乳動物β-球蛋白前導(dǎo)序列的末端。所有這些編碼新的β-內(nèi)酰胺酶的新DNA序列，被插入帶有控制共轉(zhuǎn)錄的巨細(xì)胞病毒啟動子的哺乳動物表述載體中。組織培養(yǎng)物中的哺乳動物細(xì)胞(Hela，COS7、CHO、BHK)，使用標(biāo)準(zhǔn)lipofectin技術(shù)以質(zhì)粒進(jìn)行瞬間轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后2-5天，將該細(xì)胞與發(fā)熒光底物CCF2的透膜衍生物CCF2/btAMac2一起保溫，以測試該酶的功能性表達(dá)。5-20％用含cDNA序列2、3和4(圖7)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之細(xì)胞顯示綠到蘭色熒光變化，表明由表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶裂解了胞內(nèi)陷入的底物。相反地，在未轉(zhuǎn)染和假轉(zhuǎn)染對照物中，所有細(xì)胞顯示未裂解的CCF2的綠色熒光，未發(fā)現(xiàn)蘭色熒光細(xì)胞，確信無任何內(nèi)源β-內(nèi)酰胺酶活性存在。
地衣形桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因，使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，從完整地衣形桿菌DNA中分離出。將寡核苷酸引物除去β-內(nèi)酰胺酶分泌序列，產(chǎn)生DNA序列ID#5。該基因被插入在組成型活性巨細(xì)胞病毒啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的pCDNA3哺乳動物表達(dá)載體中。使用lipofectin，用每個25cm2培養(yǎng)皿10μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5天，通過將其在100μmolarCCF2/btAMac2存在下保溫，并用表熒光顯微鏡觀察，試驗該細(xì)胞的β-內(nèi)酰胺酶功能性表達(dá)。30-40％的細(xì)胞顯示蘭色熒光，而在未轉(zhuǎn)染對照物中，只有綠色熒光細(xì)胞，無蘭色熒光細(xì)胞檢出。在瞬間轉(zhuǎn)染中，一般有＜50％的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。
實施例14用序列ID3(圖7)的β-內(nèi)酰胺酶在酵母拉長因子EF-1α增強(qiáng)子和啟動子控制下構(gòu)建質(zhì)粒。該質(zhì)粒與底物CCF2(化合物7b)的鉀鹽一起共注入單細(xì)胞階段的斑馬魚胚胎中。以只注射底物CCF2鉀鹽的胚胎作為對照物。3個小時后，這些胚胎被用表熒光顯微鏡觀測，采用紫色激發(fā)光(濾光片400DF15)和435nm長濾過發(fā)射濾光片。攜有質(zhì)粒DNA的胚胎發(fā)蘭色熒光，而對照物發(fā)綠色熒光。
實施例15在玻璃啟動子控制下，將序列ID3的β-內(nèi)酰胺酶基因克隆進(jìn)果蠅轉(zhuǎn)化載體中，并注射入野生型果蠅胚胎中。作為對照，將β-內(nèi)酰胺酶基因插入錯誤的方向。使用P元件介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將果蠅胚胎進(jìn)行胚系轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化及所有其后的蠅處理均按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行[Karess，R.E.和Rubin，G.M.，Cell 38，135(1984)]。將轉(zhuǎn)化蛹的后階段的Omatidia轉(zhuǎn)染，并分裂成單個細(xì)胞。將該細(xì)胞在加有40μmolar CCF2/btAMac2(化合物34)的緩沖液中保溫20分鐘，洗滌并用表熒光顯微鏡(激發(fā)濾光片400DF15，發(fā)射濾光片435nm長濾過)觀測。用處于正確方向的β-內(nèi)酰胺酶基因轉(zhuǎn)化的蠅Omatidia細(xì)胞發(fā)蘭色熒光，而含處于錯誤方向的基因之Omatidia細(xì)胞發(fā)綠色熒光。
實施例16某些實施方案中，本發(fā)明化合物可以是下述任何化合物
其中RY選自H、Cl、和Br；RX選自H，和甲基；
RZ和RZ1各自獨立地選自-C(O)alk、-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)Oalk、低級酰氧-α-芐基、和δ-丁內(nèi)酯基(其中alk是1-4碳低級烷基和其透膜性產(chǎn)生熒光的衍生物)；R″是1-(酰氧)烷基。
另一化合物例子是
其中RZ和RZ1各自獨立地選自-C(O)alk、-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)alk、低級酰氧-α-芐基、和δ-丁內(nèi)酯基(其中alk是1-4碳低級烷基)。
另一化合物例子是
最后的化合物例子是
摘引在本申請中的所有出版物和專利文獻(xiàn)全部引入本文作為參考，所有情況下，就好像各出版物或?qū)＠墨I(xiàn)被單獨介紹一樣有同等之意義。
本發(fā)明提供β-內(nèi)酰胺酶的新型底物及其使用的β-內(nèi)酰胺酶和使用方法。雖提供了具體的實施例，但以上的具體描述只為舉例說明之用，而非加以限制。在閱讀本說明書的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的許多變化對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說將是顯而易見的。因此本發(fā)明的范圍并不能由上面的描述來決定，而應(yīng)參考所附權(quán)利要求書及其相應(yīng)之完整范圍來決定。
摘引在本申請中的所有出版物和專利文獻(xiàn)全部引入本文作為參考，所有情況下，就好像各出版物或?qū)＠墨I(xiàn)被單獨介紹一樣有同等之意義。
權(quán)利要求
1.式I化合物
其中X和Y之一是發(fā)熒光的供體部份，或其透膜衍生物，而另一個是猝滅體部份、受體熒光團(tuán)部份或其透膜衍生物；R′選自H、低級烷基、(CH2)nOH、(CH2)nCOOR″和＝NOJ，其中n是0或1-5的整數(shù)，而J是H、Me、CH2OOH、CHMeCOOH及CMe2COOH；R″選自H、生理學(xué)上可接受的金屬和銨陽離子、-CHR2OCO(CH2)nCH3、-CHR2OCOC(CH3)3、酰硫甲基、酰氧基-α-芐基、δ-丁內(nèi)酯基、甲氧羰氧甲基、苯基、甲基亞磺酰甲基、β-嗎啉代乙基、二烷基氨基乙基、二烷基氨基羰氧甲基，其中R2選自H和低級烷基；A選自S、O、SO、SO2和CH2；Z′是X的接頭；Z″是Y的接頭。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中Z′選自直連鍵、-(CH2)nCONR2(CH2)m-，-(CH2)nNR2CO(CH2)m-，-(CH2)nNR3CONR2(CH2)m-，-(CH2)nNR3CSNR2(CH2)m，-(CH2)nCONR3(CH2)pCONR2(CH2)m-，-(CH2)n-，-(CH2)nNR3CO(CH2)pS(CH2)m-，-(CH2)nS(CH2)m-，-(CH2)nO(CH2)m-，-(CH2)nNR2(CH2)m-，-(CH2)nSO2NR2(CH2)m-，-(CH2)nCO2(CH2)m-，
其中R2和n與前面定義同；R3選自氫和低級烷基；m和p各自獨立地選自0-4的整數(shù)。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中Z″選自一條直接連于生色團(tuán)中選自O(shè)、N和S的雜原子上的鍵、-O(CH2)n-，-S(CH2)n-，-NR2(CH2)n-，-N+R22(CH2)n-，-OCONR2(CH2)n-，-O2C(CH2)n-，-SCSNR2(CH2)n-，SCSO(CH2)n-，-S(CH2)nCONR2(CH2)m，-S(CH2)nNR2CO(CH2)m，和
其中R2和n定義同前，而m是0-4的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R′選自H和甲基。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中R′是H。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R″選自H和乙酰氧甲基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是H。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中A是-S-。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中X和Y之一是發(fā)熒光的供體部份的透膜衍生物，或猝滅體部份或受體熒光團(tuán)部份的透膜衍生物，其中X和Y中至少一個含至少一個?；姆剂u基、?；?、或烷基化芳羥基，其中?；?-5個碳原子，而烷基選自-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)Oalk、低級酰氧基-α-芐基和δ-丁內(nèi)酯基，其中alk是1-4碳低級烷基。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中X和Y中至少一個含至少一個?；姆剂u基，其中酰基是乙?；?、正丙?；⒒蛘□；?。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中所述供體是式II-VII的香豆素，而所述猝滅體或受體選自式VIII-XII、XLVII和XLVII的熒光素類對甲氨基酚類及若丹明類。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中所述供體選自式II-VII的香豆素類和式VIII的熒光素類。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中所述猝滅體或受體選自式VIII-XII的熒光素類對甲氨基酚類和若丹明類。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中所述供體是式VIII的熒光素類，而所述猝滅體或受體選自式VIII-XII的對甲氨基酚類和若丹明類。
15.權(quán)利要求12的化合物，其中所述香豆素選自7-羥基香豆素和7-羥基-6-氯代香豆素，而所述熒光素選自熒光素和二氯代熒光素。
16.權(quán)利要求13的化合物，其中所述供體是熒光素，而猝滅體或受體選自式VIII四溴熒光素或四氯熒光素，其中Ra、Rb、Rc和Rd是Br或Cl。
17.權(quán)利要求13的化合物，其中所述猝滅體或受體是式VIII、IX或XI的對甲氨基酚。
18.權(quán)利要求13的化合物，其中所述猝滅體或受體是式VIII、X或XII的若丹明。
19.權(quán)利要求9的化合物，其是透膜衍生物，其中X和Y中至少一個含芳香羥基上的乙酰氧甲基。
20.權(quán)利要求2的化合物，其中Z′是-(CH2)nCONR2(CH2)m-。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中n和m是0。
22.權(quán)利要求20的化合物，其中R2是H。
23.權(quán)利要求3的化合物，其中Z″是-S(CH2)n-。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中n是0。
25.權(quán)利要求12的化合物，所述化合物結(jié)構(gòu)式如下
其中RY選自H、Cl、和Br；RX選自H和甲基；RZ和RZ1各自獨立選自-C(O)alk、-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)Oalk、低級酰氧-α-芐基和δ-丁內(nèi)酯基，其中alk是1-4碳低級烷基；及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物，R″是1-(酰氧)烷基。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中RZ和RZ1選自乙?；?，丁?；?、和乙酰氧甲基。
27.權(quán)利要求12的化合物，所述化合物結(jié)構(gòu)式如下
其中RY選自H、Cl、和Br；而RX選自H和甲基。
28.權(quán)利要求14的化合物，所述化合物具有如下式(11)結(jié)構(gòu)
及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。
29.權(quán)利要求16的化合物，所述化合物具有如下式(16)結(jié)構(gòu)
其中RZ和RZ1各自獨立地選自-C(O)alk、-CH2OC(O)alk、-CH2SC(O)alk、-CH2OC(O)alk、低級酰氧-α-芐基、和δ-丁內(nèi)酯基，其中alk是1-4碳低級烷基。
30.權(quán)利要求14的化合物，所述化合物具有如下式(22)結(jié)構(gòu)
及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。
31.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物具有如下式(25)結(jié)構(gòu)
及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。
32.權(quán)利要求27的化合物，其中RY是Cl，而RX是H(CCF2或76)。
33.權(quán)利要求15的化合物，其是
34.權(quán)利要求26的化合物，其中RZ和R″是乙酰氧甲基；RX是氫；而各RZ1是乙酰基。
35.權(quán)利要求27的化合物，其中RY是H；而RX是甲基(CCF17a)。
36.權(quán)利要求1的化合物，其中所述供體選自發(fā)熒光的銪和鋱配合物。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中所述供體選自銪和鋱的三(聯(lián)吡啶)穴狀配體及相關(guān)染料。
38.權(quán)利要求1的化合物，其中所述猝滅體或受體選自酞菁類及相關(guān)染料。
39.權(quán)利要求37的化合物，其中所述猝滅體或受體選自酞菁類及相關(guān)染料。
40.權(quán)利要求39的化合物，其是
41.權(quán)利要求10的化合物，其中所述香豆素是式(III)化合物及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物
其中E選自H、OH、ORk和NRgRh；T選自O(shè)和NRk；Ra和Rb各自獨立地選自一個連接點、H、鹵素、和低級烷基Rg、Rh和Rk各自獨立地選自一個連接點、H、低級烷基、和-CH2(CH2)na；Ri選自一個連接點、H、鹵素、低級烷基、CN、CF3、苯基、CO2H、和CONRgRh；a選自H和一個連接點。
42.權(quán)利要求11的化合物，其中所述受體或猝滅體是式(VIII)化合物及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物
其中E選自H、OH、ORk和RgRh；G選自O(shè)和N+RgRh；Q′選自O(shè)、CH2、C(CH3)2和NRg；Ra、Rb、Rc和Rd各自獨立地選自一個連接點、H、鹵素、和低級烷基；Re選自一個連接點、H、低級烷基、(CH2)nCO2H、(CH2)nCHaCO2H、CHa(CH2)nCO2H、(CH2)nCOa、CH＝CHCOa，
Rg、Rh、Rk各自獨立地選自一個連接點，H、低級烷基、和-CH2(CH2)na；n是0-5的整數(shù)；a和a′各自獨立地選自H或一個連接點。
43.權(quán)利要求42的化合物，其中所述供體選自式II-VII香豆素類，及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。
44.權(quán)利要求43的化合物，其中Q′是C(CMe2)2，而G是O；及其產(chǎn)生熒光的透膜衍生物。
45.權(quán)利要求43的化合物，選自下述分子式
46.測定一個樣品是否含β-內(nèi)酰胺酶活性的方法，包括將樣品與權(quán)利要求1的化合物接觸，當(dāng)該化合物被激發(fā)時，它能表現(xiàn)出熒光共振能量轉(zhuǎn)移；激發(fā)所述化合物；及測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度，如果其熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度低于預(yù)期值，則表明存在β-內(nèi)酰胺酶活性。
47.權(quán)利要求1的方法，用于測定樣品中的含酶量，其中測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度包括，在樣品與底物接觸之后，進(jìn)行第一次和第二次程度測定，并確定其熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度之差，該差值反映了樣品中的含酶量。
48.一種重組核酸分子，它包括適宜于在脊椎動物細(xì)胞中發(fā)揮功能，并按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列。
49.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中核苷酸序列編碼A類β內(nèi)酰胺酶。
50.權(quán)利要求49的重組核酸分子，還包括核糖體連接位點的哺乳動物Kozak序列。
51.權(quán)利要求50的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是圖7中的序列3或序列4。
52.權(quán)利要求49的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是圖7中序列1或序列5。
53.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列是可誘導(dǎo)表達(dá)控制序列。
54.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列是組成型活性表達(dá)控制序列。
55.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列包括c-fos啟動子或c-jun啟動子。
56.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列包括環(huán)AMP-應(yīng)答元件，佛波醇酯應(yīng)答元件，血清應(yīng)答元件，或激活的T-細(xì)胞核因素應(yīng)答元件。
57.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列對調(diào)整細(xì)胞表面受體之物質(zhì)有應(yīng)答。
58.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列對調(diào)整胞內(nèi)受體之物質(zhì)有應(yīng)答。
59.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中所述β-內(nèi)酰胺酶包括胞外分泌的信號序列。
60.權(quán)利要求59的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是圖7中序列2。
61.權(quán)利要求48的重組核酸分子，其中β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶。
62.權(quán)利要求61的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是圖7中序列1、序列3、序列4、或序列5。
63.一種重組核酸分子，包括適宜于在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能，并按人工操作方式連接于編碼胞液β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列。
64.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼A類β-內(nèi)酰胺酶。
65.權(quán)利要求64的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是圖7的序列1、序列3、序列4、或序列5。
66.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列是可誘導(dǎo)表達(dá)控制序列。
66.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列是組成型活性表達(dá)控制序列。
67.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列包括c-fos啟動子或c-jun啟動子。
68.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列包括環(huán)AMP-應(yīng)答元件，佛波醇酯應(yīng)答元件，血清應(yīng)答元件，或激活T-細(xì)胞核因子應(yīng)答元件。
69.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列對調(diào)整細(xì)胞表面受體之物質(zhì)有應(yīng)答。
70.權(quán)利要求63的重組核酸分子，其中所述表達(dá)控制序列對調(diào)整胞外受體之物質(zhì)有應(yīng)答。
71.用重組核酸分子轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主細(xì)胞，所述重組核酸分子還包括適宜于在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功能，并按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列。
72.測定細(xì)胞中β-內(nèi)酰胺酶活性量的方法，包括下述步驟提供用含有表達(dá)控制序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)控制序列以人工操作方式連接在編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)之核酸序列上；將含有該細(xì)胞，或該細(xì)胞提取物，或條件培養(yǎng)基的樣品與β-內(nèi)酰胺酶之底物接觸；測定所裂解的底物之量，而該裂解的底物量與β-內(nèi)酰胺酶活性量相關(guān)。
73.監(jiān)測按人工操作方式連接于一組表達(dá)控制序列上的基因的方法，包括提供用一種重組核酸分子轉(zhuǎn)染的真核宿主細(xì)胞，所述重組核酸分子包含按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶的核酸序列上的表達(dá)控制序列，除了真核細(xì)胞是真菌的情況外，其中β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶；將含該細(xì)胞，或該細(xì)胞提取物，或條件培養(yǎng)基的樣品與β-內(nèi)酰胺酶之底物接觸；測定底物裂解之量，而裂解的底物量與β-內(nèi)酰胺酶活性量相關(guān)。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述樣品包括來自所述細(xì)胞的提取物，帶有或不帶有條件培養(yǎng)基。
76.權(quán)利要求73的方法，其中所述樣品含有所述細(xì)胞。
77.權(quán)利要求73的方法，其中所述底物是權(quán)利要求1的化合物，底物裂解量的測定步驟包括激發(fā)化合物；測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度，若該熒光共振能量轉(zhuǎn)移程度低于預(yù)期之值，則表明存在β-內(nèi)酰胺酶活性。
78.權(quán)利要求73的方法，其中核苷酸序列編碼A類β-內(nèi)酰胺酶。
79.權(quán)利要求78的方法，其中核苷酸序列是圖7中序列1、序列2、序列3、序列4、或序列5。
80.權(quán)利要求73的方法，其中表達(dá)控制序列是可誘導(dǎo)的表達(dá)控制序列。
81.權(quán)利要求73的方法，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞，而β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶。
82.測定一種試驗化合物是否能改變按人工操作方式連接于一組表達(dá)控制序列上的基因之表達(dá)的方法，包括提供由一種重組核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述構(gòu)建體含按人工操作方式連接于編碼β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列，除真核細(xì)胞是真菌的情況外，其中β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶；將該細(xì)胞與試驗化合物接觸；將含該細(xì)胞或該細(xì)胞提取物的樣品，與β-內(nèi)酰胺酶底物接觸；和測定底物裂解之量，而底物裂解量與β-內(nèi)酰胺酶活性量相關(guān)。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述真核宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述樣品含細(xì)胞提取物。
85.權(quán)利要求82的方法，包括所述細(xì)胞。
86.權(quán)利要求82的方法，其中所述底物是權(quán)利要求1的化合物，而測定底物裂解量的步驟包括激發(fā)該化合物；測定樣品中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度，若所述程度低于預(yù)期值，則表達(dá)存在β-內(nèi)酰胺酶活性。
87.權(quán)利要求82的方法，其中核苷酸序列編碼A類β-內(nèi)酰胺酶。
88.權(quán)利要求87的方法，其中核苷酸序列是圖7的序列1、序列2、序列3、序列4或序列5。
89.權(quán)利要求85的方法，其中表達(dá)控制序列是可誘導(dǎo)的表達(dá)控制序列。
90.權(quán)利要求85的方法，其中所述細(xì)胞是動物細(xì)胞，而β-內(nèi)酰胺酶是胞液β-內(nèi)酰胺酶。
91.權(quán)利要求82的方法，其中β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)通過對胞內(nèi)受體、細(xì)胞表面受體、或胞內(nèi)細(xì)胞信號通道成份的激活作用、或激活抑制作用來按人工操作方式調(diào)節(jié)。
92.克隆篩擇的方法，包括提供用一種重組核酸分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述核酸分子包含按人工操作方式連接于編碼胞液β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的核酸序列上的表達(dá)控制序列；將所述細(xì)胞與能激活或抑制該表達(dá)控制序列的活化作用之物質(zhì)接觸；將所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)化成底物的權(quán)利要求9的化合物接觸；測定各個細(xì)胞中底物是否裂解，而此種裂解作用反映β-內(nèi)酰胺酶活性；篩選并繁殖所選擇的具有β-內(nèi)酰胺酶活性水平的細(xì)胞。
93.權(quán)利要求92的方法，還包括下述步驟不存在活化劑的條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)胞，其培養(yǎng)時間足以使裂解的底物從細(xì)胞中基本上消失，且β-內(nèi)酰胺酶水平回復(fù)到未激活水平；將所選擇的細(xì)胞與轉(zhuǎn)化為底物的權(quán)利要求9的化合物一起保溫；篩選基本上未裂解該底物的細(xì)胞。
全文摘要
通式Ⅰ的β－內(nèi)酰胺酶底物,其中X和Y之一個是發(fā)熒光的供體,而另一個是猝滅體(可以、或不可以再發(fā)射),R′選自H、低烷基(即1—5個碳原子)和(CH
文檔編號C12N5/02GK1184479SQ96193854
公開日1998年6月10日 申請日期1996年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月20日
發(fā)明者R·Y·齊恩, G·茨盧卡爾尼克 申請人:加州大學(xué)評議會