一種親和lb膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，屬于蛋白質(zhì)固定化領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣根過(guò)氧化物酶化orseradish Peroxidase，HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶 容易制備，所W最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棟色 的鐵化嘟結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18% dHRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40，000，等電點(diǎn) 為PH3~9,酶催化的最適PH因供氨體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58% W 下飽和度硫酸錠溶液。辣根過(guò)氧化物酶通常來(lái)源于辣根（因此稱辣根過(guò)氧化物酶），是臨床 檢驗(yàn)試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個(gè)生化檢測(cè)項(xiàng)目，也廣泛運(yùn)用于免疫類 化LISA)試劑盒。過(guò)氧化物酶作為多個(gè)試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對(duì)試劑盒的質(zhì)量有重要 影響。
[0003] 將具有生物活性的辣根過(guò)氧化物酶定向固定化，可W充分利用辣根過(guò)氧化物酶的 催化活性，在生物傳感器等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，傳統(tǒng)的酶固定化方法所獲得的 固定化酶結(jié)構(gòu)，酶是在任意位點(diǎn)和載體相連接，運(yùn)種方法主要不足之處在于常常導(dǎo)致固定 化酶的活性出現(xiàn)大幅度下降。二徑苯丙氨酸(多己)在過(guò)氧化氨存在下可W被辣根過(guò)氧化物 酶催化氧化，利用運(yùn)一特性，可W使在無(wú)過(guò)氧化氨的條件下使二徑苯丙氨酸與辣根過(guò)氧化 物酶形成穩(wěn)定的親和作用。辣根過(guò)氧化物酶定向共固定化，是利用酶底物分子與酶的親和 作用，將辣根過(guò)氧化物酶W有序的方向在載體上固定化，天然構(gòu)象基本保持不變，運(yùn)有助于 高效實(shí)現(xiàn)辣根過(guò)氧化物酶的生物功能，具有更重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的課題在于提供了一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，目的是 克服傳統(tǒng)酶固定化方法的種種不足，實(shí)現(xiàn)酶的定向固定化的條件優(yōu)化。
[0005] 為了解決上述課題，本發(fā)明采用如下技術(shù)：
[0006] -種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶的方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0007] 步驟一，步驟一，先將載體浸入緩沖溶液的液面下，注入改性底物分子，在溶液表 面形成單分子層膜，再將辣根過(guò)氧化物酶化RP)溶液注入液面下，使改性底物分子與辣根過(guò) 氧化物酶形成親和作用；
[000引步驟二，選擇合適表面壓，控制擋板W恒定速度壓至該表面壓并維持恒定，垂直向 上提拉載體出液面，將酶轉(zhuǎn)移至載體上。
[0009] 作為優(yōu)選，步驟一中所述的載體材料為氧化石墨締、石墨締、碳納米管、石墨、聚苯 乙締、聚丙締、聚乙締、或聚丙締臘中的至少一種。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟一中所述的改性底物分子為二徑苯丙氨酸十八烷基醋、二徑苯丙 氨酸十六烷基醋、或二徑苯丙氨酸二十烷基醋的至少一種。
[0011] 作為優(yōu)選，步驟二中所述的液面表面壓為25-35mN/m，擋板恒定速度為5-15mm/ min,垂直向上提拉載體速度為l-5mm/min。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟一中所述的緩沖溶液為憐酸、憐酸二氨鐘、憐酸氨二鋼、巧樣酸、巧 樣酸鋼、巧樣酸鐘、碳酸、醋酸、己比妥酸、或Ξ徑甲基氨基甲燒中的至少一種所配制的水溶 液，濃度范圍5-50mM/L。
[OOU] 有益效果：
[0014] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)及效果:采用將辣根過(guò)氧化物酶通過(guò)親和LB 膜定向固定化，可W高效保留固定化后辣根過(guò)氧化物酶的生物活性。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而 本發(fā)明并不局限于W下實(shí)施例。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 步驟一，先將聚苯乙締浸入憐酸溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸十八烷基 醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根過(guò)氧化物 酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[001引步驟二，液面表面壓為30mN/m，控制擋板WlOmm/min恒定速度壓至該表面壓并維 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[0019] 對(duì)比例
[0020] 皿P的吸附法固定:取HRP0.45mg/mL皿P 5mL，將聚苯乙締浸入液面下，靜置吸附 化后取出，用二次去離子水清洗3遍，除去未吸附疏松蛋白質(zhì)，自然干燥后用于活性測(cè)試。 [0021 ] HRP活性測(cè)試反應(yīng)如下：
[0022]
[0023] 過(guò)氧化氨存在下，HRP催化鄰苯二胺(0PD)得棟黃色產(chǎn)物二氨基酪嗦，該物質(zhì)在波 長(zhǎng)450nm處有最大紫外吸收峰。通過(guò)檢查該吸光度值來(lái)反應(yīng)酶的催化活性。本實(shí)驗(yàn)將一定量 自由HRP或固定化HRP加入10血5mM0PD，再加入0.2血30 %出化開始反應(yīng)，溫度控制30°C，反應(yīng) 15min，用可見紫外分光光度計(jì)測(cè)450nm處吸光度?？瞻讟悠窞椴患幼杂擅富蚬潭ɑ?。
[0024] HRP催化鄰苯二胺反應(yīng)，如下表：
[0025]
[00%] 實(shí)施例2
[0027]步驟一，先將氧化石墨締浸入憐酸二氨鐘溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸 十八烷基醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根 過(guò)氧化物酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[002引步驟二，液面表面壓為28mN/m，控制擋板W8mm/min恒定速度壓至該表面壓并維持 恒定，W2mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[0029] 實(shí)施例3
[0030] 步驟一，先將碳納米管浸入憐酸氨二鋼溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸二 十烷基醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根過(guò) 氧化物酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[0031] 步驟二，液面表面壓為35mN/m，控制擋板Wl2mm/min恒定速度壓至該表面壓并維 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[0032] 實(shí)施例4
[0033] 步驟一，先將聚丙締浸入己比妥酸溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸十六燒 基醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根過(guò)氧化 物酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[0034] 步驟二，液面表面壓為32mN/m，控制擋板Wllmm/min恒定速度壓至該表面壓并維 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[0035] 實(shí)施例5
[0036] 步驟一，先將聚丙締臘浸入巧樣酸鐘溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸十八 烷基醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根過(guò)氧 化物酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[0037] 步驟二，液面表面壓為32mN/m，控制擋板Wllmm/min恒定速度壓至該表面壓并維 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[003引實(shí)施例6
[0039] 步驟一，先將聚苯乙締浸入巧樣酸鋼溶液液面下，注入50化ImM二徑苯丙氨酸十六 烷基醋，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)lOmin后，再將50化Img/mL辣根過(guò)氧 化物酶化RP)溶液注入液面下，靜置化，使底物分子與酶形成親和作用；
[0040] 步驟二，液面表面壓為30mN/m，控制擋板WlOmm/min恒定速度壓至該表面壓并維 持恒定，W3mm/min垂直向上提拉轉(zhuǎn)載體，將酶移至聚苯乙締。
[0041] 上述實(shí)施例2-6所得到的結(jié)果也具有良好的效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一，先將載體浸入緩沖溶液的液面下，注入改性底物分子，在溶液表面形成單分子 層膜，再將辣根過(guò)氧化物酶溶液注入液面下，使改性底物分子與辣根過(guò)氧化物酶形成親和 作用； 步驟二，選擇合適表面壓，控制擋板以恒定速度壓至該表面壓并維持恒定，垂直向上提 拉載體出液面，將辣根過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)移至載體上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，其特征在 于，步驟一中所述的載體材料為氧化石墨稀、石墨稀、碳納米管、石墨、聚苯乙稀、聚丙稀、聚 乙烯、或聚丙烯腈中的至少一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，其特征在 于，步驟一中所述的改性底物分子為二羥苯丙氨酸十八烷基酯、二羥苯丙氨酸十六烷基酯、 或二羥苯丙氨酸二十烷基酯中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，其特征在 于，步驟二中所述的液面表面壓為25-35mN/m，擋板恒定速度為5-15mm/min，垂直向上提拉 載體速度為l-5mm/min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶方法，其特征在 于，步驟一中所述的緩沖溶液為磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸 鉀、碳酸、醋酸、巴比妥酸、或三羥甲基氨基甲烷中的至少一種所配制的水溶液，濃度范圍5-50mM/L〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種親和LB膜定向固定化辣根過(guò)氧化物酶的方法。本發(fā)明首先對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的底物分子進(jìn)行改性，接入疏水性分子鏈，使其具有兩親性。再利用辣根過(guò)氧化物酶的底物分子與酶分子活性中心間的生物親和作用，通過(guò)親和LB膜法將酶分子轉(zhuǎn)移固定化在載體上。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)主要在于：定向親和作用有利于保持酶的自然構(gòu)象，固定化酶比普通吸附法固定化酶活性顯著提高，極大地提高了催化效率，為進(jìn)一步構(gòu)建高效率、低成本的生物催化體系提供了一種可行的方法。
【IPC分類】C12N11/14, C12N11/08
【公開號(hào)】CN105543209
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610011617
【發(fā)明人】葉鵬, 韓祝平, 許永娟
【申請(qǐng)人】浙江理工大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月8日