梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法，涉及梅毒的檢測。試劑盒設有濃縮洗滌液瓶、陰陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶、包被有重組抗原微孔板。以梅毒螺旋體有傳染性標準株Nichol株和梅毒螺旋體無傳染性的標準株Reiter株，采用蛋白組學方法，通過雙向電泳分離梅毒螺旋體蛋白質(zhì)組，用不同病人或感染動物的血清鑒定出具有強免疫原性的蛋白質(zhì)，尋找抗原標志物。用于梅毒確認試驗，提高診斷靈敏度和特異性，縮短窗口期?？伸`敏檢測出梅毒螺旋體抗體并定量鑒定，價格便宜，操作簡單，結果準確。
【專利說明】梅毒螺旋體I gG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及 其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及梅毒的檢測，尤其是涉及梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫 檢測試劑盒及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 梅毒是梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內(nèi)的發(fā)病率居高不下，梅毒 的防控已成為我國公共衛(wèi)生服務的主要任務之一。
[0003] 梅毒的實驗室診斷方法主要有如下幾種（[1]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛 在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方法的選擇.中華醫(yī)院感染學雜志.2010,20(10): 1491-1494)：
[0004] (1)病原學檢測：梅毒螺旋體感染早期，當梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時，暗視 野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實驗室診斷方法，但易受取材技術、取材部位、樣本中梅毒 螺旋體含量、局部用藥及送檢時間等諸多因素影響，靈敏度較低。
[0005] (2)抗體檢測試驗：梅毒螺旋體不能進行體外培養(yǎng)，診斷主要依賴于實驗室檢查， 現(xiàn)有的血清學檢測靈敏度、特異性不高，任何一種檢測方法均存在缺陷，臨床漏診和誤診率 較聞。
[0006] 用于梅毒血清學檢驗的抗原主要以重組抗原TPN15、TPN17、TPN37、 TPN44. 5、TPN47 為主（[2]Lin，L.R.，Z.G.Fu，et al. "Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponema pallidum with TPN17and TPN47. "Diagnostic microbiology and infectious disease. 2010. 68 (3) : 193-200.)，這些抗原大多來源于梅毒螺旋體外膜，但不能區(qū)分是否 為致病性螺旋體所致。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑 盒及其制備方法。
[0008] 所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，設有：
[0009] 外包裝盒、濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特 異性片段Y鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、 反應終止液瓶、包被有重組抗原微孔板；
[0010] 濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段γ 鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液 瓶和包被有重組抗原微孔板裝在外包裝盒內(nèi)；
[0011] 濃縮洗滌液瓶內(nèi)裝有濃縮洗滌液，陰性對照品瓶內(nèi)裝有陰性對照品，陽性對照品 瓶內(nèi)裝有陽性對照品，生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體瓶內(nèi)裝有生物素標 記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記親和素瓶內(nèi)裝有辣根過氧化 物酶標記親和素，ΤΜΒ顯色液Α瓶內(nèi)裝有ΤΜΒ顯色液Α，顯色液Β瓶內(nèi)裝有顯色液Β，反應終 止液瓶內(nèi)裝有反應終止液；
[0012] 所述TMB顯色液A為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺 (3, 3,，5, 5, -Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液；
[0013] 所述顯色液B為3%的過氧化氫溶液。
[0014] 所述濃縮洗滌液可采用溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度 為0. 05%，使用時用蒸餾水進行20倍稀釋。
[0015] 所述陰性對照品為梅毒螺旋體總抗體陰性對照品，由非梅毒感染的健康人群血 清配制而成，使用本試劑盒進行檢測其0D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm為主波長， 450nm是測定的樣本顯色吸光值。
[0016] 所述陽性對照品為梅毒螺旋體總抗體陽性對照品，由梅毒患者的陽性血清配制而 成，用本試劑盒進行檢測其〇D450nm吸光值大于0. 5 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定 的樣本顯色吸光值。
[0017] 所述TMB顯色液A為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺 (3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，商品名叫TMB顯色液A，市售品可購自廈 門波生生物科技有限公司。
[0018] 所述顯色液B為3%的過氧化氫溶液，商品名叫顯色液B，市售品可購自廈門波生 生物科技有限公司。
[0019] 所述反應終止液可采用摩爾濃度2mmol/L的硫酸。
[0020] 所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0021] 所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，包括以 下步驟：
[0022] 1)提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝 酸纖維素膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白 點進行質(zhì)譜分析，分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出 Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；
[0023] 2)在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載 體。研究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大 量擴增目標蛋白，收集過表達的目標蛋白進行純化，純度高于90 %后，進行后續(xù)研究；
[0024] 3)將步驟2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫方法 測定抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性；
[0025] 4)采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使 其表達，得梅毒螺旋重組抗原；
[0026] 在步驟4)中，所述重組抗原為梅毒螺旋體致病株Nichol株高表達，而梅毒非致 病株Reiter株無表達；所述梅毒螺旋體致病株Nichol株為Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichol ;所述梅毒非致病株 Reiter 株為 Treponema pallidum ssp. pallidum strain Reiter。
[0027] 5)將步驟（4)中的梅毒螺旋重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔0. lmL 加入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，風干；用0. Olmmol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制的 1. 〇%脫脂奶粉，每孔〇. 2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒、 密封備用，得重組抗原包被微孔板；
[0028] 6)以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得 穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
[0029] 7)將抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去 除未結合的生物素，制備生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體；
[0030] 8)采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，得辣根過氧化物酶標記親和素；
[0031] 9)TMB顯色液A采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；
[0032] 10)顯色液B采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；
[0033] 11)配制溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0· 05%，得濃 縮洗滌液，使用時可用蒸餾水進行20倍稀釋；
[0034] 12)配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液；
[0035] 13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陰性對照品，使用本 試劑盒進行檢測其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本 顯色吸光值；
[0036] 14)由梅毒患者的陽性血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陽性對照品，使用本試劑盒 進行檢測其〇D450nm吸光值大于0· 5 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸 光值；
[0037] 15)將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記親 和素、TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽性對照品分別裝在 瓶中，再將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和 素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、濃縮洗滌液瓶、反應終止液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照 品瓶以及包被有重組抗原微孔板裝入外包裝盒中，得到梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0038] 本發(fā)明提供了一種梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，可用 于臨床標本中梅毒特異性抗體的檢測。能準確地檢測出致病性梅毒螺旋體抗體，為梅毒檢 測提供一種高效、簡便的技術手段。
[0039] 本發(fā)明以國際公認的梅毒螺旋體有傳染性標準株Nichol株和梅毒螺旋體無傳染 性的標準株Reiter株，采用蛋白組學的方法，通過雙向電泳分離梅毒螺旋體蛋白質(zhì)組，再 用不同病人（或感染動物）的血清鑒定出具有強免疫原性的蛋白質(zhì)，尋找抗原標志物。作為 梅毒螺旋體早期診斷的抗原標志物，建立一種靈敏、特異的梅毒螺旋體IgG抗體生物素-親 和素酶聯(lián)檢測技術，用于梅毒確認試驗，提高實驗診斷的靈敏度和特異性，縮短窗口期，對 梅毒防治具有重要意義。且本發(fā)明的產(chǎn)品不僅可以靈敏檢測出梅毒螺旋體抗體，并且可以 對其進行精確的定量鑒定，價格便宜，操作簡單，結果準確，環(huán)保無污染，具有長遠的好處。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒實施例的結構 組成示意圖。

【具體實施方式】
[0041] 以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0042] 參見圖1，所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒實施例，設 有：
[0043] 外包裝盒1、濃縮洗滌液瓶2、陰性對照品瓶3、陽性對照品瓶4、生物素標記抗人 IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體瓶5、辣根過氧化物酶標記親和素瓶6、TMB顯色液A瓶7、 顯色液B瓶8、反應終止液瓶9、包被有重組抗原微孔板10 ;濃縮洗滌液瓶2、陰性對照品瓶 3、陽性對照品瓶4、生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶5、辣根過氧化物酶 標記親和素瓶6、TMB顯色液A瓶7、顯色液B瓶8、反應終止液瓶9和包被有重組抗原微孔 板10裝在外包裝盒1內(nèi)。
[0044] 濃縮洗滌液瓶2內(nèi)裝有濃縮洗滌液，陰性對照品瓶3內(nèi)裝有陰性對照品，陽性對照 品瓶4內(nèi)裝有陽性對照品，生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶5內(nèi)裝有生 物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記親和素瓶6內(nèi)裝有辣 根過氧化物酶標記親和素，TMB顯色液A瓶7內(nèi)裝有TMB顯色液A，顯色液B瓶8內(nèi)裝有顯 色液B,反應終止液瓶9內(nèi)裝有反應終止液。
[0045] 所述TMB顯色液A為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺 (3, 3,，5, 5, -Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液。
[0046] 所述顯色液B為3%的過氧化氫溶液。
[0047] 所述濃縮洗滌液可采用溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度 為0. 05%，使用時用蒸餾水進行20倍稀釋。
[0048] 所述陰性對照品為梅毒螺旋體總抗體陰性對照品，由非梅毒感染的健康人群血 清配制而成，使用本試劑盒進行檢測其0D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm為主波長， 450nm是測定的樣本顯色吸光值。
[0049] 所述陽性對照品為梅毒螺旋體總抗體陽性對照品，由梅毒患者的陽性血清配制而 成，用本試劑盒進行檢測其〇D450nm吸光值大于0. 5 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定 的樣本顯色吸光值。
[0050] 所述TMB顯色液A為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺 (3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，商品名叫TMB顯色液A，市售品可購自廈 門波生生物科技有限公司。
[0051] 所述顯色液B為3%的過氧化氫溶液，商品名叫顯色液B，市售品可購自廈門波生 生物科技有限公司。
[0052] 所述反應終止液可采用摩爾濃度2mmol/L的硫酸。
[0053] 所述瓶可采用聚乙烯瓶。
[0054] 所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，包括以 下步驟：
[0055] 1)提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝 酸纖維素膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白 點進行質(zhì)譜分析，分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出 Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；
[0056] 2)在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載 體。研究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大 量擴增目標蛋白，收集過表達的目標蛋白進行純化，純度高于90 %后，進行后續(xù)研究；
[0057] 3)將步驟2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫方法 測定抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性；
[0058] 4)采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使 其表達，得梅毒螺旋重組抗原；所述重組抗原為梅毒螺旋體致病株Nichol株高表達，而梅 毒非致病株Reiter株無表達；所述梅毒螺旋體致病株Nichol株為Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichol ;所述梅毒非致病株 Reiter 株為 Treponema pallidum ssp. pallidum strain Reiter。
[0059] 5)將步驟（4)中的梅毒螺旋重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔0. lmL 加入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，風干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制的 1. 〇%脫脂奶粉，每孔〇. 2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒、 密封備用，得重組抗原包被微孔板；
[0060] 6)以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得 穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
[0061] 7)將抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去 除未結合的生物素，制備生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體；
[0062] 8)采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，得辣根過氧化物酶標記親和素；
[0063] 9)TMB顯色液A采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；
[0064] 10)顯色液B采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；
[0065] 11)配制溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0· 05%，得濃 縮洗滌液，使用時可用蒸餾水進行20倍稀釋；
[0066] 12)配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液；
[0067] 13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陰性對照品，使用本 試劑盒進行檢測其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本 顯色吸光值；
[0068] 14)由梅毒患者的陽性血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陽性對照品，使用本試劑盒 進行檢測其〇D450nm吸光值大于0· 5 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸 光值；
[0069] 15)將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記親 和素、TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽性對照品分別裝在 瓶中，再將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和 素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、濃縮洗滌液瓶、反應終止液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照 品瓶以及包被有重組抗原微孔板裝入外包裝盒中，得到梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0070] 以下給出具體實施例。
[0071] 實施例一
[0072] 參見圖1，本發(fā)明所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒設 有外包裝盒1、濃縮洗滌液2、陰性對照品3、陽性對照品4、生物素標記抗人IgG特異性片段 Y鏈單克隆抗體5、辣根過氧化物酶標記親和素6、TMB顯色液A 7、顯色液B 8、反應終止液 9、包被有重組抗原微孔板10。
[0073] 所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，包括以 下步驟：
[0074] (1)外膜蛋白的免疫蛋白質(zhì)組學研究：
[0075] 提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝酸纖 維素膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白點進 行質(zhì)譜分析。分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol 株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白。
[0076] (2)候選蛋白的克隆純化
[0077] 在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載 體。研究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大 量擴增目標蛋白。收集過表達的目標蛋白進行純化。純度高于90%后，進行后續(xù)研究。
[0078] (3)對候選蛋白的免疫原性進行檢測
[0079] 將步驟（2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體。采用酶聯(lián)免疫方法 測定抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性。
[0080] (4)制備重組抗原：
[0081] 采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達，得梅毒螺旋重組抗原；
[0082] (5)重組抗原包被微孔板
[0083] 將步驟（4)中的梅毒螺旋重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔(λ lmL 加入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，風干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制的 1. 〇%脫脂奶粉，每孔〇. 2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒、 密封備用。
[0084] (6)制備抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體
[0085] 以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩(wěn) 定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
[0086] (7)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體生物素標記
[0087] 將抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除 未結合的生物素，制備生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體；
[0088] (8)親和素辣根過氧化物酶標記
[0089] 采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記；
[0090] (9) TMB顯色液A為市售品，購自廈門波生生物科技有限公司；
[0091] (10)顯色液B為市售品，購自廈門波生生物科技有限公司；
[0092] (11)濃縮洗滌液
[0093] 濃縮洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0· 05%， 使用時用蒸餾水進行20倍稀釋。
[0094] (12)反應終止液
[0095] 配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液；
[0096] (13)對照品
[0097] 梅毒螺旋體IgG抗體陰性對照品：由非梅毒感染的健康人群血清配制而成，使用 本試劑盒進行檢測其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;
[0098] 梅毒螺旋體IgG抗體陽性對照品：梅毒患者的陽性血清配制而成，用本試劑盒進 行檢測其〇D450nm吸光值大于0· 5 ;
[0099] 所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸光值；
[0100] (14)制備梅毒螺旋體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
[0101] 包被有重組抗原微孔板、生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體、辣根 過氧化物酶標記親和素、TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽 性對照品和外包裝盒共同組成的梅毒螺旋體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0102] 步驟（14)所述生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物 酶標記親和素、TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品和陽性對照品 均裝在相應的聚乙烯瓶中。
[0103] 實施例二
[0104] 以下給出采用梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測患者 的臨床標本中的梅毒螺旋體抗體：
[0105] (1)標本處理：血清：靜脈血5mL,置37°C水浴30min，3000g離心lOmin，上清為檢 測樣品備用。
[0106] (2)加樣：加 lOOuL的標本和50uL生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆 抗體于反應孔中，同時作空白、陰性和陽性對照孔。37°C孵育lh。
[0107] (3)洗滌：用洗滌緩沖液洗五次后扣干。
[0108] (4)加酶：在每孔中加辣根過氧化物酶標記親和素各100μ L，置37°C孵育30min。
[0109] (5)洗滌：用洗滌緩沖液洗五次后扣干。
[0110] (6)顯色：于每反應孔中依次加入TMB顯色液A和顯色液B各50 μ L，置37°C孵育 15min〇
[0111] ⑵測定：每孔中加入反應終止液50 μ L，然后在450nm處讀取各孔的吸光度值。
[0112] (8)結果判斷：反應孔0D值/陰性對照孔0D值< 2. 1，則該標本應視為陰性，如果 反應孔0D值/陰性對照孔0D值均> 2. 1，可判斷為陽性，確診為梅毒。
[0113] 實施例三
[0114] 以下給出梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的性能檢定
[0115] ⑴陽性標本符合率
[0116] 用梅毒特異性抗體陽性參比血清50份檢定，計算陽性符合率。
[0117] ⑵陰性標本符合率
[0118] 用梅毒特異性抗體陰性參比血清50份檢定，計算陰性符合率。
[0119] (3)批內(nèi)差異
[0120] 同一批次試劑盒，用特征性血清檢測，要求CV彡10%。
[0121] (4)批間差異
[0122] 不同批次試劑盒，用特征性血清檢測，要求CV < 12%。
[0123] (5)干擾試驗
[0124] 用溶血、脂血和黃疸標本各50例進行的干擾實驗檢測。
[0125] (6)交叉反應
[0126] 采用本試劑盒，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡（η = 50)、類風濕?。é?= 50)、免疫性肝炎（η =50)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，觀察交叉反應。
[0127] (7)穩(wěn)定性檢測
[0128] 應用Arrhenius法則，將試劑盒放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化， 確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。
[0129] 以下給出梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的交叉反應測 定：
[0130] 采用本發(fā)明的試劑盒檢測梅毒螺旋體Nichol株的兔感染實驗血清標本，結果為 強陽性，而Reiter株的兔感染實驗血清標本結果為陰性。
【權利要求】
1. 梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于設有外包裝 盒、濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單 克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶、 包被有重組抗原微孔板； 濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單 克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶和 包被有重組抗原微孔板裝在外包裝盒內(nèi)； 濃縮洗滌液瓶內(nèi)裝有濃縮洗滌液，陰性對照品瓶內(nèi)裝有陰性對照品，陽性對照品瓶內(nèi) 裝有陽性對照品，生物素標記抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體瓶內(nèi)裝有生物素標記抗 人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記親和素瓶內(nèi)裝有辣根過氧化物酶 標記親和素，TMB顯色液A瓶內(nèi)裝有TMB顯色液A，顯色液B瓶內(nèi)裝有顯色液B，反應終止液 瓶內(nèi)裝有反應終止液； 所述 TMB 顯色液 A 為 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine, TMB)顯色液； 所述顯色液B為3%的過氧化氫溶液。
2. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特 征在于所述濃縮洗滌液可采用溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為 0· 05%。
3. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征 在于所述陰性對照品為梅毒螺旋體總抗體陰性對照品，由非梅毒感染的健康人群血清配制 而成。
4. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征 在于所述陽性對照品為梅毒螺旋體總抗體陽性對照品，由梅毒患者的陽性血清配制而成。
5. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征 在于所述反應終止液為摩爾濃度2mmol/L的硫酸。
6. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方 法，其特征在于包括以下步驟： 1) 提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝酸纖維 素膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白點進行 質(zhì)譜分析，分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol 株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白； 2) 在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載體。 研究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大量 擴增目標蛋白，收集過表達的目標蛋白進行純化，純度高于90 %后，進行后續(xù)研究； 3) 將步驟2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫方法測定 抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性； 4) 采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表 達，得梅毒螺旋重組抗原； 5) 將步驟（4)中的梅毒螺旋重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔0. lmL加 入微孔板中，4°C包被24h ;取出抗原板，風干；用0. Olmmol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制的 1. 〇%脫脂奶粉，每孔〇. 2mL，4°C封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒、 密封備用，得重組抗原包被微孔板； 6) 以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩(wěn)定 分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株； 7) 將抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未 結合的生物素，制備生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體； 8) 采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，得辣根過氧化物酶標記親和素； 9. TMB顯色液A采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司； 10) 顯色液B采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司； 11) 配制溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0· 05%，得濃縮洗 滌液，使用時可用蒸餾水進行20倍稀釋； 12) 配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液； 13) 由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陰性對照品，使用本試劑 盒進行檢測其〇D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色 吸光值； 14) 由梅毒患者的陽性血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陽性對照品，使用本試劑盒進行 檢測其0D450nm吸光值大于0· 5 ;所述0D450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸光值； 15) 將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記親和素、 TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽性對照品分別裝在瓶中， 再將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、 TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、濃縮洗滌液瓶、反應終止液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶以 及包被有重組抗原微孔板裝入外包裝盒中，得到梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免 疫檢測試劑盒。
7. 如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方 法，其特征在于在步驟4)中，所述重組抗原為梅毒螺旋體致病株Nichol株高表達，而梅毒 非致病株Reiter株無表達。
8. 如權利要求7所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備 方法，其特征在于所述梅毒螺旋體致病株Nichol株為Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichol ;所述梅毒非致病株 Reiter 株為 Treponema pallidum ssp. pallidum strain Reiter。
【文檔編號】G01N33/577GK104155450SQ201410410477
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權日:2014年8月20日
【發(fā)明者】張惠林, 林麗蓉, 童曼莉, 劉莉莉, 楊天賜, 張長弓 申請人:廈門大學附屬中山醫(yī)院