檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性抗體IgG的方法。方法步驟為:1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和96孔聚苯乙烯反應板包被;2)采集待測豬只的血液,處理后獲得血清一抗;3)將血清一抗稀釋后,按編號加入抗原包被的反應板上,37℃飽和濕度反應1小時,洗滌;4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體稀釋后,按順序加入到反應板上,37℃飽和濕度避光反應2小時,洗滌;5)將TMB顯色劑,按順序加入到反應板上,避光反應25分鐘,加入終止液;6)放入酶標儀中,讀取OD650數據,判定結果。本發(fā)明適用于豬群大面積的豬流行性腹瀉IgG抗體調查。
【專利說明】檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】,尤其涉及一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法【背景技術】。
【背景技術】
[0002]豬流行性腹灣是由豬流行性腹灣病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的豬的一種急性腸道傳染病,以水瀉、嘔吐和脫水為特征。其病理特征表現為腸管擴張,內容物稀薄,呈黃色、泡沫狀,腸壁弛緩,缺乏彈性,變薄有透明感,腸粘膜絨毛嚴重萎縮,胃底粘膜潮紅充血或斑點狀出血,胃內容物呈鮮黃色并混有大量乳白色凝乳塊(或絮狀小片),對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。
[0003]豬流行性腹瀉病毒經口和鼻感染后進入小腸,可在豬群中持續(xù)存在,各種年齡的豬都易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達100%,尤其以哺乳仔豬最為嚴重且預后不良,多數不能耐過而死亡。育肥豬盡管發(fā)病率較高,但死亡率較低。母豬的發(fā)病率在15%?90%。本病主要在冬季多發(fā),夏季也可發(fā)生。該病具有傳染性強,發(fā)病迅速、仔豬死亡率高等特點。1973年首次在我國上海發(fā)生。2006先后多次在我國多地爆發(fā)流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經濟損失。
[0004]豬流行性腹瀉,僅憑臨床癥狀難以做出診斷,波及所有年齡豬(包括哺乳仔豬)的急性PED在臨診上不能與TGE相區(qū)分。實驗室內通過直接顯示PEDV或其抗原或抗體的檢測可做出病原學診斷。直接IF和免疫組化技術用于哺乳仔豬小腸切片中PEDV的檢測,但僅適于急性腹瀉初期,尤其是發(fā)病3天內捕殺的患病仔豬小腸切片檢測。對于自然死亡的仔豬由于其小腸絨毛嚴重萎縮,故對其檢測結果不可靠。對腹瀉仔豬糞便進行直接電鏡觀察可見PEDV粒子,但若病毒纖突喪失或不清晰,直接電鏡檢查較為困難。ELISA方法用于檢測血樣中的特異性抗體,既敏感、有可靠,且可檢測大量樣本,同時也適于母豬奶中免疫球蛋白的檢測。
[0005]目前,疫苗免疫依然是我國豬流行性腹瀉防控的最主要手段。采集免疫后豬血液樣本,分離血清,并檢測特異性的血清抗體,也是目前監(jiān)控豬流行性腹瀉主要的手段,對豬流行性腹瀉疫苗免疫效果評價、免疫程序制定、流行狀態(tài)監(jiān)測均具有重要意義。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足,提供一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法。
[0007]—種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,包括如下步驟:
1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板;
2)將待測動物保定,從其前腔靜脈處取血,將采集到的血液處理后獲得血清一抗,保存?zhèn)溆?
3)將血清一抗,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后,按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加100ul,37°C飽和濕度反應I小時,以PBST洗滌備用;
4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加10ul,37°C飽和濕度反應2小時,以PBST洗滌備用;
5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加10ul,避光反應25分鐘,隨后每個反應孔加入10ul IM濃硫酸,終止反應;
6)放入酶標儀中,讀取0D650數據,判定結果。
[0008]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板,并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉,獲得ELISA反應的抗原基質,置于4°C備用。
[0009]所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后,按編號以10ul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應I小時,以PBST洗滌備用;
所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后,按順序以10ul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應2小時,以PBST洗滌備用;
所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板,放入預熱的酶標儀中,讀取各反應孔的0D650數值,并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值< 0.4,而且已知陽性樣品的OD值> 1.0 ;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清或初乳樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P彡0.5,則判為陽性;否則判為陰性。
[0010]本發(fā)明提供的豬流行性腹瀉病毒血液IgG抗體采集和檢測方法,相對于傳統(tǒng)的豬流行性腹瀉病毒檢測方法,具有以下優(yōu)點:1)可以對整個豬群實行大面積采樣,避免豬群的屠宰采樣;2)血液樣品對溫度、環(huán)境、污染物的抵抗力更強,運輸和保存更方便;3)豬流行性腹瀉病毒血液IgG抗體檢測比抗原檢測更快速、敏感、可靠;4)量化豬群的豬流行性腹瀉免疫水平,所得數據更準確客觀全面;5)可監(jiān)控豬群的豬流行性腹瀉免疫動態(tài),預知豬群的免疫動向及管理。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒IgG特異性抗體的方法的過程示意圖。
【具體實施方式】
[0012]檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法包括如下步驟:
1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板;
2)將待測動物保定,從其前腔靜脈處取血,將采集到的血液處理后獲得血清一抗,保存?zhèn)溆?
3)將血清一抗,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后,按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加100ul,37°C飽和濕度反應I小時,以PBST洗滌備用; 4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加10ul,37°C飽和濕度反應2小時,以PBST洗滌備用;
5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加10ul,避光反應25分鐘,隨后每個反應孔加入10ul IM濃硫酸,終止反應;
6)放入酶標儀中,讀取0D650數據,判定結果。
[0013]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板,并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉,獲得ELISA反應的抗原基質,置于4°C備用。
[0014]所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后,按編號以10ul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應I小時,以PBST洗滌備用;
所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后,按順序以10ul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應2小時,以PBST洗滌備用;
所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板,放入預熱的酶標儀中,讀取各反應孔的0D650數值,并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值< 0.4,而且已知陽性樣品的OD值> 1.0 ;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P彡0.5,則判為陽性;否則判為陰性。
實施例
[0015]I)以商品化的豬流行性腹瀉病毒,17 TCID50/ml (半數細胞感染量/毫升)濃度,感染Vero細胞,培養(yǎng)72小時后,收集病毒液,4000g離心lOmin,取上清;35000g離心lh,獲得純化病毒,并滴定TCID50。將抗原以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至16 TCID50/ml,以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板,飽和濕度下,4°C孵育16h。隨后棄去包被液,拍干ELISA板,加入以PBST (pH7.3 PBS, 0.05% tween-20)稀釋的5%脫脂奶粉溶液(PBST溶)200ul/孔,于22-28°C封閉lh。棄去封閉液,拍干ELISA板,每孔加入350 ul洗液(PBST),洗滌I minX3次,拍干ELISA板,置于4°C備用,見圖1。
[0016]2)將豬進行保定,先用75%酒精棉球對前腔靜脈入針處進行局部消毒,再用干棉球擦干,用大拇指自始至終壓住前腔靜脈近心端,然后用消毒過的針頭急刺遠心端的前腔靜脈,血液流出第一、二滴棄去后,接血,使血液沿著瓶壁流入,采到7毫升血液后,松開大拇指,血液即停止流出,用5%碘酊棉球壓一下針孔即達到消毒止血。給采得血液注明號碼,立即靜置使其凝固,然后帶到實驗室,冬季于溫暖處,夏季置于冷暗處,使血清析出。經10-12小時,將析出的血清倒入另一只消毒空瓶中。將血清編碼,用于初步保存和運輸(常溫下、6小時內,或4°C下、72小時內運至實驗室)。將血清以3000g離心5min,取上清,獲得血清一抗,并與4°C (<7d)或-20°C (<60d)保存?zhèn)溆谩?br>
[0017]3)將處理備用的血清一抗,以3%脫脂奶粉溶液(PBST溶)1:50稀釋后,按編號加入抗原包被的反應板上,10ul/孔,每個樣品3個重復,同時設置陰性和血清陽性抗體對照各2孔。飽和濕度下,22-28°C孵育lh。隨后棄去包被液,拍干ELISA板,每孔加入PBST 350ul洗液(PBST),洗滌I minX4次,拍干ELISA板,備用,見圖1。
[0018]4)將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG-FC抗體,以3%脫脂奶粉溶液(PBST溶)為稀釋液,作1:10000倍稀釋后,按10ul/孔加入到上述一抗包被的反應孔中,22-280C /飽和濕度反應2h,隨后棄去包被液,拍干ELISA板,每孔加入PBST 350 ul洗液(PBST),洗滌I minX5次,拍干ELISA板,備用,見圖1。
[0019]5)將TMB顯色液按10ul/孔加入到上述反應孔中,室溫避光反應25min,隨后加入10ul/孔終止液(IM濃硫酸),終止反應,見圖1。
[0020]6)將終止后的反應板,放入預熱的酶標儀中,讀取各反應孔的0D650數值,并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值彡0.4,而且已知陽性樣品的OD值彡1.0 ;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P ^ 0.5,則判為陽性;否則判為陰性。
【權利要求】
1.一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,其特征在于包括如下步驟: 1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板; 2)將待測動物保定,從其前腔靜脈處取血,將采集到的血液處理后獲得血清一抗,保存?zhèn)溆? 3)將血清一抗,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后,按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加lOOul,37°C飽和濕度反應1小時,以PBST洗滌備用; 4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體,以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加lOOul,37°C飽和濕度避光反應2小時,以PBST洗滌備用; 5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,每個反應孔加lOOul,避光反應25分鐘,隨后每個反應孔加入lOOul 1M濃硫酸,終止反應; 6)放入酶標儀中,讀取0D650數據,判定結果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,其特征在于,所述的步驟1)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至106 TCID50/ml,以lOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板,并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉,獲得ELISA反應的抗原基質,置于4°C備用。
3.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,其特征在于,所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后,按編號以lOOul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應1小時,以PBST洗滌備用。
4.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,其特征在于,所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后,按順序以lOOul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中,37°C飽和濕度反應2小時,以PBST洗滌備用。
5.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法,其特征在于,所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板,放入預熱的酶標儀中,讀取各反應孔的0D650數值,并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的0D值< 0.4,而且已知陽性樣品的0D值彡1.0;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清樣品與已知陽性樣品0D值的比值S/P彡0.5,則判為陽性;否則判為陰性。
【文檔編號】G01N33/569GK104330559SQ201410531939
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權日:2014年10月11日
【發(fā)明者】李龍, 于少芳, 曹洋洋 申請人:杭州貝爾塔生物技術有限公司