專利名稱：一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于酶傳感的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的電化學(xué)檢測方法，特別是涉及一 種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的檢測方法，屬于生物傳 感和細(xì)胞電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞在代謝過程中不斷產(chǎn)生各種活性氧(reactive oxygen species，R0S)，例如 超氧陰離子自由基(02_‘)、羥自由基(·0Η)、脂自由基(R00·)、過氧化氫(H2O2)等。過氧 化氫是其中最為穩(wěn)定的一種，并且其濃度和0廠、· OH等其他ROS分子密切相關(guān)，最新的研 究發(fā)現(xiàn)過氧化氫在生命體系的細(xì)胞代謝過程中扮演著重要的調(diào)節(jié)作用。過氧化氫可作為信 號分子或第二信使參與多種因子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動，但同時也可與細(xì)胞內(nèi)的生物大分 子反應(yīng)，從而直接引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶類變性、核酸DNA損傷等，最 終導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織損傷、心血管疾病、腫瘤及神經(jīng)元退變等多種疾病的發(fā)生。因此，發(fā)展 一種可靠的、靈敏的檢測細(xì)胞中過氧化氫的方法在生理學(xué)和病理生理學(xué)領(lǐng)域有著極其重要 的意義。目前檢測過氧化氫的方法主要有熒光法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法、電子順磁 共振法和基于酶傳感的電化學(xué)方法等。然而，細(xì)胞水平的H2O2檢測仍然受到較多因素制約， 如細(xì)胞尺度小、胞內(nèi)超氧自由基的半衰期非常短、穩(wěn)態(tài)濃度極低以及缺少對H2A有效捕獲 的探針等，而且一些傳統(tǒng)的分析方法存在取樣體積大、質(zhì)量檢測限高、分析時間長、儀器價 格昂貴等不足。在眾多的檢測方法中，基于酶傳感的電化學(xué)方法由于其具有靈敏度高、響應(yīng) 快、樣品消耗量小、專一性強、易于制備和小型化等優(yōu)點而倍受人們關(guān)注?；诿競鞲械碾娀瘜W(xué)方法是將具有氧化還原特性的蛋白質(zhì)(酶)固載到某種材料 上并將其修飾到電極表面構(gòu)建成電化學(xué)傳感器，通過蛋白質(zhì)(酶)的電催化性能對底物過氧 化氫進行檢測。辣根過氧化物酶由于其結(jié)構(gòu)已知、來源廣泛而成為研究催化H2A氧化還原 反應(yīng)的重要模型酶分子之一。然而，目前所選用的蛋白質(zhì)載體大都為各類碳材料(如石墨、 碳納米管、碳納米纖維、有序碳介孔材料以及石墨烯等)、金屬氧化物(多孔氧化鋁、氧化鋯、 四氧化三鐵等)、高分子(如殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、聚苯乙烯、聚乙烯及甲基丙烯酸甲酯 MMA)等。這些固定載體都存在一些不足之處，如雖然碳材料具有良好的導(dǎo)電性能、較強的吸 附能力等優(yōu)點，但其是否對生物大分子會產(chǎn)生毒害作用從而影響到生物大分子的生物活性 目前仍不是太清楚；而金屬氧化物雖具有穩(wěn)定性好、機械強度高、成本低等優(yōu)點，但是生物 大分子在其表面已失去原有構(gòu)象，產(chǎn)生變性，導(dǎo)致固定在其表面的蛋白質(zhì)(酶)失去生物活 性；天然高分子載體最大的特點是無毒性作用，但是它們存在強度較低、導(dǎo)電性能差、在厭 氧條件下易被微生物分解及使用壽命低等缺點；合成的有機高分子材料由于其化學(xué)、物理 性能都有很大的可變性，理論上可以擔(dān)當(dāng)任何一種酶的載體，而且比天然高分子化合物的 強度高，但是卻存在導(dǎo)電性能差的缺點，這是電化學(xué)研究的最大不利因素之一。
凹土 (全稱凹凸棒石粘土)是一種納米尺寸的天然化合物，具有表面吸附效應(yīng)、 濃集效應(yīng)、吸附定向效應(yīng)和化學(xué)活潑性效應(yīng)等；凹土表面含有大量能和蛋白質(zhì)(酶)反應(yīng) 的-OH基團，可以大大提高和蛋白質(zhì)(酶)之間的結(jié)合力；由于凹土的“沸石型的孔道”結(jié) 構(gòu)，凹土具有大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，易于和蛋白質(zhì)(酶)交聯(lián)提高固定的穩(wěn)定性；凹土具 有良好的生物相容性與電化學(xué)穩(wěn)定性、良好的機械強度、熱穩(wěn)定性、耐生物降解性以及對蛋 白質(zhì)(酶)的高度親和性等特性，這些都是凹土作為蛋白質(zhì)(酶)的載體并研究它們的電化學(xué) 特性的有利條件。以凹土為載體固定辣根過氧化物酶制備辣根過氧化物酶-凹土復(fù)合納米材料，能 保持辣根過氧化物酶的天然結(jié)構(gòu)和生物活性，將所得到的納米復(fù)合材料修飾到玻碳電極表 面得到生物傳感器，對過氧化氫有良好的電催化活性；本發(fā)明建立了一種基于辣根過氧化 物酶-凹土復(fù)合材料的檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2的新方法，在生物電分析化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生理病理
學(xué)等領(lǐng)域有著重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi) H2O2的檢測方法，以克服現(xiàn)有細(xì)胞水平H2O2檢測方法存在的缺陷；通過對純化凹土進行功能 化處理，得到具有生物傳感功能的辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料，并將其構(gòu)建成生 物傳感器應(yīng)用于過氧化氫的檢測，建立一種基于酶傳感的電化學(xué)檢測巨噬細(xì)胞中的H2O2的 新方法。完成上述發(fā)明任務(wù)的技術(shù)方案是
一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi)H2O2的檢測方法，包括以下步
驟
1)制備辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料將純化的凹土超聲分散，控制分散液的 PH值使其表面帶負(fù)電荷，將凹土分散液與辣根過氧化物酶(HRP)混合，利用靜電作用將表 面帶正電荷的辣根過氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù) 合材料(HRP -Attapulgite)；
2)制備生物傳感器將步驟1)制得的納米復(fù)合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修飾 到玻碳電極表面，制備成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器；
3)以所述的傳感器為工作電極，使用計時電流法檢測細(xì)胞中H202。所述的步驟1)中，辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的制備方法包括以下步 驟
1)將提純過后的凹土加入到0.1 mol/LPBS (磷酸鹽緩沖液)溶液中，控制pH值范圍在 7 - 7. 5間，超聲分散0. 5 - 2小時，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；
2)將凹土分散液與1- 10 mg/mL辣根過氧化物酶PBS溶液(pH 7-7.5)混合，在4 ° C連續(xù)攪拌0. 5 - 2小時，通過正負(fù)電荷的靜電吸引作用，辣根過氧化物酶吸附到凹土表 面，形成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的懸濁液；
3)將辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料懸濁液離心處理15-30分鐘，并用去離子 水洗滌，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根過氧化物酶-凹土納米 復(fù)合材料(HRP - Attapulgite)。
所述的步驟2)中，辣根過氧化物酶-凹土復(fù)合材料生物傳感器的制備方法是將 玻碳電極拋光至鏡面，然后在超純水中超聲清洗后晾干；將所述的辣根過氧化物酶-凹土 納米復(fù)合材料放入0.1 mol/L的PBS溶液中(pH 7-7. 5)，得到1 mg HRP-Attapulgite / mL均相分散液，將2-10 μ L的該分散液滴加到玻碳電極表面，待溶劑揮發(fā)后即得到基于 辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器，標(biāo)記為HRP-Attapulgite/GC電極。所 得到的電極不用時在4° C下保存。按照以上方法制得的辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料，經(jīng)紅外光譜(FTIR)、 紫外光譜(Uv-vis)和圓二色譜(CD)表征證明，吸附后的酶分子仍能保持其天然的二級結(jié) 構(gòu)和生物活性。在辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的紅外光譜上(圖1)，可以觀察到固 定在凹土表面的辣根過氧化物酶，其特征峰酰胺I (1653 cnf1)和酰胺II (1640 cnf1)的 形狀和位置與純的辣根過氧化物酶(酰胺I 1653 cnf1和酰胺II 1640 cnf1)—致，說明辣 根過氧化物酶在吸附過程中沒有變性，仍很好的維持了其天然的空間構(gòu)象和酶催化活性。采用循環(huán)伏安法考察所述的生物傳感器即HRP-Attapulgite/GC電極的電化學(xué) 性能，實驗結(jié)果表明，基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的傳感器具有良好的電化 學(xué)特性、電催化性能及穩(wěn)定性。將HRP - Attapulgite/GC電極作為工作電極浸入0. 1 mol/L 的PBS溶液(pH 7. 4)中，以飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，螺旋Pt絲作為對電極，進行 循環(huán)伏安掃描，研究HRP分子在凹土表面的直接電化學(xué)特性及電極的穩(wěn)定性。在掃描得到 的循環(huán)伏安曲線上，出現(xiàn)了一對峰形良好的可逆的氧化還原峰，說明負(fù)載在凹土表面的HRP 能夠?qū)崿F(xiàn)其直接電子轉(zhuǎn)移；將HRP - attapulgite/GC電極在上述條件下連續(xù)掃描，氧化還 原峰的形狀保持不變，該電極在4° C下保存至少二個星期后，峰電流大小幾乎沒有變化， 說明HRP - attapulgite/GC電極具有較好的穩(wěn)定性。采用循環(huán)伏安掃描考察所述傳感器對H2A的響應(yīng)，將該電極放入含有0. 2 mmol/L H2O2的PBS溶液中(0. 1 mol/L, pH 7. 4)作為工作電極，以飽和甘汞電極(SCE)作為參比電 極，螺旋Pt絲作為對電極進行循環(huán)伏安掃描，出現(xiàn)明顯的電催化還原峰，說明辣根過氧化 物酶-凹土納米復(fù)合材料對H2O2的電化學(xué)還原具備良好的電催化性能，基于所述納米復(fù)合 材料的傳感器可有效的應(yīng)用于H2A的電化學(xué)傳感。細(xì)胞內(nèi)H2A檢測可采用計時電流法，以HRP - attapulgite/GC電極為工作電極， 首先建立辣根過氧化物酶-凹土復(fù)合材料生物傳感器檢測H2A濃度的工作曲線；再檢測細(xì) 胞內(nèi)的過氧化氫含量將細(xì)胞溶解，利用計時電流法(I -1)進行檢測，根據(jù)建立的工作曲 線，得到細(xì)胞中H2O2含量。本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明的基于酶傳感的電化學(xué)檢測細(xì)胞內(nèi)H2A的方法，所 采用的基于辣根過氧化物酶-凹土復(fù)合材料的生物傳感器具有良好的電化學(xué)特性、電催 化性能及穩(wěn)定性，酶分子能保持其天然的二級結(jié)構(gòu)和生物活性，對過氧化氫有良好的電催 化活性，能有效檢測溶液中的H2O2，并且具備響應(yīng)快、檢測限低、線性范圍寬、重現(xiàn)性好和穩(wěn) 定性高等優(yōu)點；該傳感器能應(yīng)用于細(xì)胞中H2A的檢測。本發(fā)明建立了檢測細(xì)胞中H2A的一 種新的基于酶傳感電化學(xué)方法，在生理學(xué)、病理學(xué)的研究中具有重要意義。


圖1 辣根過氧化物酶(曲線a)、凹土(曲線b)和辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材 料(曲線c)的紅外光譜圖。
圖2 辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料對H2O2的電催化圖HRP-attapulgite/GC電極在不含有H2A的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖(曲線a) ；HRP -attapulgite/GC電極在含有H2O2 (0. 2 mmol/L)的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖(曲線b);PBS 溶液(0.1 mol/L, pH 7. 4)，掃描速率100 mV/s。圖3基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器檢測H2O2的I_t 工作曲線。圖4由Ι-t工作曲線得到的電流i與H2O2濃度c的線性關(guān)系。圖5 基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器(HRP-Attapulgite/GC電極)檢測細(xì)胞中H2O2濃度的I - t曲線，曲線a 無細(xì)胞時的電流信號；曲 線b 有細(xì)胞時的電流響應(yīng)。
具體實施例方式實施例一
將10 g凹土在研磨機中研磨2小時，轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分；稱取Ig研磨過的凹土，將其 放入100 mL超純水中超聲分散2小時后用高速離心機離心(5000轉(zhuǎn)/分)，用去離子水洗 凈沉降的凹土；重復(fù)超聲分散、離心操作三次，將洗滌干凈的凹土在80 ° C烘干12 h，得 到提純的凹土。將0.5 mg提純過的凹土加入到1 mL 0.1 mo 1/LPBS (pH 7. 4)溶液中，超聲分散 0.5-2小時，得到0. 5 mg/mL的凹土分散液；將該凹土懸浮液與等體積的HRP的PBS溶液 (1 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4° C連續(xù)攪拌0.5小時。將混合液在18000 rpm下離心30 min,并用二次水徹底洗滌3次，除去吸附不牢固的HRP分子，將該物質(zhì)在真空干燥器中晾干 得到 HRP - Attapulgite 復(fù)合物。將玻碳電極(GC，直徑為3 mm)分別用6號砂紙、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3拋 光至鏡面，然后在超純水中超聲清洗30秒，晾干待用。稱取Img HRP-Attapulgite復(fù)合 物分散于1 mL 0.1 mol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量進樣器取2 μ L分散液滴涂 在預(yù)處理過的玻碳電極表面，將電極放入干燥器中干燥，待電極表面的溶劑揮發(fā)后即得到 HRP - Attapulgite/GC 電極。實施例二
凹土純化方法同實施例一。將2 mg提純過的凹土加入1 mL 0.1 mol/LPBS(pH 7. 4)溶 液中，超聲分散0. 5 - 2小時，得到ang/mL的凹土分散液；將該凹土懸浮液與等體積的HRP 的PBS溶液(5 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4° C連續(xù)攪拌1小時。將混合液在10000 rpm下 離心20 min,并用二次水徹底洗滌3次，除去吸附不牢固的HRP分子，將該物質(zhì)在真空干燥 器中晾干得到HRP - Attapulgite復(fù)合物。將玻碳電極(GC，直徑為3 mm)分別用6號砂紙、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3拋 光至鏡面，然后在超純水中超聲清洗30秒，晾干待用。稱取Img HRP-Attapulgite復(fù)合 物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量進樣器取2 μ L分散液滴涂在 預(yù)處理過的玻碳電極表面，將電極放入干燥器中干燥，待電極表面的溶劑揮發(fā)后即得到 HRP - Attapulgite/GC 電極。實施例三凹土純化方法同實施例一。將5 mg提純過的凹土加入1 mL 0. 1 mol/L PBSCpH 7.4) 溶液中，超聲分散0. 5 - 2小時，得到5mg/mL的凹土分散液；將該凹土懸浮液與等體積的 HRP的PBS溶液(10 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4 ° C連續(xù)攪拌1小時。將混合液在5000 rpm下離心15 min，并用二次水徹底洗滌3次，除去吸附不牢固的HRP分子，將該物質(zhì)在真 空干燥器中晾干得到HRP - Attapulgite復(fù)合物。將玻碳電極(GC，直徑為3 mm)分別用6號砂紙、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3拋 光至鏡面，然后在超純水中超聲清洗30秒，晾干待用。稱取Img HRP-Attapulgite復(fù)合 物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量進樣器取2 μ L分散液滴涂在 預(yù)處理過的玻碳電極表面，將電極放入干燥器中干燥，待電極表面的溶劑揮發(fā)后即得到 HRP - Attapulgite/GC 電極。實施例四
實施例四中，除用微量進樣器取5 μ L分散液滴涂在預(yù)處理過的玻碳電極表面，其他操 作均與實例一相同。實施例五
實施例五中，除用微量進樣器取10 μ L分散液滴涂在預(yù)處理過的玻碳電極表面，其他 操作均與實例三相同。實施例六
實施例六中，除用微量進樣器取5 μ L分散液滴涂在預(yù)處理過的玻碳電極表面，其他操 作均與實例二相同。實施例七
將實施例六制備的HRP - Attapulgite/GC電極放入0. 1 mol/L的PBS溶液中(pH 7.4) 進行循環(huán)伏安掃描，參比電極為飽和甘汞電極，對電極為螺旋Pt絲，掃描得到循環(huán)伏安曲 線。圖2中曲線a出現(xiàn)了一對峰形良好的可逆的氧化還原峰，其氧化峰和還原峰電位分 別為-300和-350 mV，這是由HRP分子活性中心的血紅素的鐵卟啉發(fā)生氧化還原反應(yīng) 引起的，說明負(fù)載在凹土表面的HRP能夠?qū)崿F(xiàn)其直接電子轉(zhuǎn)移；將HRP-attapulgite/GC 電極在上述條件下連續(xù)掃描(10 mV/s) 50圈，考察其穩(wěn)定性，實驗結(jié)果表明氧化還原峰的 形狀保持不變，并且該電極在4° C下保存二個星期后，峰電流大小幾乎沒有變化，說明 HRP - attapulgite/GC電極具有較好的穩(wěn)定性。同樣，實施例1-5中制備得到的電極進行循環(huán)伏安掃描，在各自的循環(huán)伏安圖上 都出現(xiàn)了對應(yīng)于HRP分子直接電子轉(zhuǎn)移的氧化還原峰，考察其穩(wěn)定性也基本相似。實施例八
用0. 1 mol/L的PBS溶液(pH 7. 4)稀釋30 %的H2A并用標(biāo)準(zhǔn)KMNO4溶液標(biāo)定濃度為 0. 2 mmol/L ；將實施例六制備的HRP - Attapulgite/GC電極浸入到H2A溶液中作為工作電 極，以飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，螺旋Pt絲作為對電極，在CHI 660B工作站上進 行循環(huán)伏安掃描考察該傳感器對H2A的響應(yīng)。掃描得到的循環(huán)伏安曲線發(fā)生巨大變化，圖2中曲線b在-400 mV處出現(xiàn)了一個 大的還原峰，且氧化峰完全消失，這是典型的電催化反應(yīng)特征，說明辣根過氧化物酶-凹 土復(fù)合材料對H2A的電化學(xué)還原具備良好的電催化性能，基于此復(fù)合物制備的傳感器可有 效的應(yīng)用于H2A的電化學(xué)傳感。
實施例九
使用HRP - Attapulgite/GC電極通過計時電流法定量檢測溶液中H2A的濃度。將實施 例六制備的HRP - Attapulgite/GC電極作為工作電極，以飽和甘汞電極(SCE)作為參比電 極，螺旋Pt絲作為對電極，在CHI 660B工作站上采集電流-時間(I-t)數(shù)據(jù)。分別將工作 電位設(shè)定為0、-100、- 200、- 300、- 400和-500 mV進行I_t掃描，實驗結(jié)果表明隨電位 的負(fù)移，催化電流逐漸增大，在-400 mV處出現(xiàn)最大值，之后噪聲明顯增大，信噪比降低，因 此選擇-400 mV作為工作電位。在-400 mV下，連續(xù)向溶液中加入H2O2，得到I_t曲線(圖 3)，以電流數(shù)值為縱坐標(biāo)，H2O2濃度為橫坐標(biāo)，建立電流和濃度的線性關(guān)系圖(圖4)，實驗結(jié) 果表明該傳感器具有響應(yīng)靈敏(2秒)、檢測范圍寬(0. 2到150 ymol/L)、檢測限低((0. 10 士 0. 05) μ mol/L)和重現(xiàn)性好(2. 1%)等優(yōu)點。實施例十
采用實施例六制備的HRP - Attapulgite/GC電極通過計時電流法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi) 的H2O2，工作電位設(shè)為-400 mV。將IXlO6個RAW.沈4. 7細(xì)胞分散在溶液中并用100 μ L0. 2mol/L的NaOH溶液對細(xì)胞進行溶解，將傳感器貼近細(xì)胞分散液液面進行檢測，I --t 圖(圖5)上出現(xiàn)一個明顯的還原電流，根據(jù)實施例九建立的工作曲線，得到細(xì)胞中的H2O2含 量約為4 X KTmol/cell，與文獻報道的其他方法檢測到的數(shù)值一致。
權(quán)利要求
1.一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi)H2A的檢測方法，包括以下 步驟1)制備辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料將純化的凹土超聲分散，控制分散液的 PH值使其表面帶負(fù)電荷，將凹土分散液與辣根過氧化物酶混合，表面帶正電荷的辣根過氧 化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料；2)制備生物傳感器將步驟1)制得的納米復(fù)合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修飾 到玻碳電極表面，制備成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器；3)以所述的傳感器為工作電極，使用計時電流法檢測細(xì)胞中H202。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞內(nèi)H2A的檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中，辣根 過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料按以下方法制備1)將提純過后的凹土加入到0.1 mol/L PBS溶液中，控制pH值范圍在7-7.5間，超 聲分散0. 5 - 2小時，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；2)將凹土分散液與pH值7- 7. 5的1 - 10 mg/mL辣根過氧化物酶PBS溶液混合，在4 ° C連續(xù)攪拌0. 5 - 2小時，通過正負(fù)電荷的靜電吸引作用，辣根過氧化物酶吸附到凹土表 面，形成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的懸濁液；3)將辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料懸濁液離心處理15-30分鐘，并用去離子水 洗滌，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合 材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞內(nèi)H2A的檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中，辣根 過氧化物酶-凹土復(fù)合材料生物傳感器的制備方法是將玻碳電極拋光至鏡面，在超純水 中超聲清洗后晾干；將所述的辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料加入0.1 mol/L pH值 7 - 7. 5的PBS溶液中，得到1 mg /mL均相分散液，將2 - 10 μ L的該分散液滴加到玻碳電 極表面，待溶劑揮發(fā)后即得到基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞內(nèi)H2A的檢測方法，其特征在于所述的步驟3)中，首先 建立辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器檢測H2A濃度的工作曲線；再利用計 時電流法采集樣品的Ι-t數(shù)據(jù)，根據(jù)建立的工作曲線，得到細(xì)胞中H2O2含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞內(nèi)H2A的檢測方法，其特征在于所述計時電流法的工作 電位為-400 mVo
全文摘要
一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的檢測方法，將辣根過氧化物酶吸附在純化凹土表面，制備成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料；利用滴涂法將該復(fù)合材料修飾到玻碳電極表面，構(gòu)建成辣根過氧化物酶-凹土納米復(fù)合材料生物傳感器；以所述的傳感器為工作電極，使用計時電流法檢測細(xì)胞中H2O2。本發(fā)明所采用的生物傳感器對過氧化氫有良好的電催化活性，能應(yīng)用于細(xì)胞中H2O2的檢測，且具有響應(yīng)快、線性范圍寬、檢測限低及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，建立了檢測細(xì)胞中H2O2的一種新的基于酶傳感的電化學(xué)方法。
文檔編號G01N27/26GK102147389SQ20111006405
公開日2011年8月10日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者吳萍, 屠蘊秋, 張卉, 蔡稱心 申請人:南京師范大學(xué)