專利名稱：γ分泌酶的可溶性NOTCH－型底物和使用所述底物的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及γ-分泌酶的新型可溶性底物。更具體地講，本發(fā)明提供了具有Notch片段的可溶性融合多肽，其中含有與NusA蛋白融合的γ-分泌酶依賴性切割位點(diǎn)(γ和ε)。還披露了制備和使用所述融合蛋白的方法和組合物。
背景阿爾茨海默病(AD)能導(dǎo)致漸進(jìn)的癡呆，其后果是形成淀粉樣斑，神經(jīng)纖維纏結(jié)，神經(jīng)膠質(zhì)過(guò)多癥和神經(jīng)元減少。這種疾病有遺傳學(xué)形式和偶發(fā)性形式兩種，二者的臨床過(guò)程和病理學(xué)特征是相當(dāng)類似的。迄今為止業(yè)已發(fā)現(xiàn)了三個(gè)基因，在這些基因突變時(shí)導(dǎo)致AD的常染色體顯性形式。這些突變基因編碼淀粉樣蛋白前體(APP)和兩種蛋白—早老素-1(presenilin-1，PS1)和早老素-2(PS2)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上是相關(guān)的。業(yè)已觀察到在這三種蛋白中任意一種中的突變會(huì)通過(guò)產(chǎn)生淀粉樣β肽(Aβ肽，有時(shí)稱之為Aβ)的細(xì)胞內(nèi)途徑增強(qiáng)APP的蛋白水解加工，該Aβ肽是具有40-42個(gè)氨基酸的肽，是AD淀粉樣斑的主要成分(Younkin，Brain Pathol.1(4)253-62，1991；Haass，J.Neurosci.11(12)3783-93，1991)。
蛋白水解的細(xì)胞內(nèi)途徑的失調(diào)可能對(duì)AD的病理學(xué)起著重要作用。對(duì)于斑塊形成來(lái)說(shuō)，APP，PS1或PS2中的突變都能一致性地改變APP的蛋白水解加工，以便增強(qiáng)Aβ 1-42的形成(它是Aβ肽的一種形式，似乎特別是淀粉生成性的，并因此在AD中非常重要)。APP位于分泌膜結(jié)構(gòu)上，包括細(xì)胞表面，并且靠近C-末端有跨膜結(jié)構(gòu)域(

圖1)。目前已知存在于人體內(nèi)的APP的具體同種型的例子包括Kang等(1987)，Nature 325733-736披露的695個(gè)氨基酸的多肽，它被命名為“正常”APP；由Ponte等(1988)，Nature，331525-527(1988)和Tanzi等(1988)，Nature，331528-530中披露的751個(gè)氨基酸的多肽；和Kitaguchi等，Nature，331530-532(1988)中披露的770個(gè)氨基酸的多肽。
所述Aβ肽來(lái)自APP的靠近所述跨膜結(jié)構(gòu)域并且包括它的一部分的區(qū)域(參見(jiàn)圖1)。通常，在所述α-分泌酶位點(diǎn)上的APP加工能切割靠近所述膜的Aβ序列的中部，并且從所述細(xì)胞表面上釋放APP的可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。這種α-分泌酶APP加工產(chǎn)生了可溶性APP-α，它不被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致AD。不過(guò)，在β-和γ-分泌酶位點(diǎn)(位于α-分泌酶位點(diǎn)的N-末端和C-末端)處的APP的病理學(xué)加工釋放出所述Aβ肽。所述β-分泌酶切割位點(diǎn)位于距離所述質(zhì)膜腔表面28個(gè)殘基處，而所述APPγ-分泌酶切割位點(diǎn)位于所述跨膜區(qū)內(nèi)。在β-和γ-分泌酶位點(diǎn)處的加工可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(在神經(jīng)元中)和在細(xì)胞表面APP重新內(nèi)在化之后在內(nèi)涵體/溶酶體途徑中進(jìn)行(在所有細(xì)胞中)。
因此，β-和γ-分泌酶的酶促活性是藥物開(kāi)發(fā)的靶目標(biāo)(Olson等，Curr.Opin.Drug Discovery & Develop.4390-401，2001)。這兩種酶協(xié)調(diào)作用而切割A(yù)PP，最初是通過(guò)β-分泌酶切割，產(chǎn)生被稱為CT-100的膜結(jié)合型C-末端(CT)片段，該片段又被用作膜相關(guān)型γ-分泌酶的底物。早老素1(PS)依賴性γ-分泌酶對(duì)CT-100的膜內(nèi)切割導(dǎo)致了Aβ1-40和1-42的產(chǎn)生。另外，存在另一種切割事件(被稱為γ-樣或ε-分泌酶切割)，它在細(xì)胞質(zhì)膜邊界內(nèi)大約2-5個(gè)殘基處切割A(yù)PP的附近殘基721，以便產(chǎn)生一系列穩(wěn)定的C-末端APP片段(圖1)。
Notch-1屬于細(xì)胞表面受體的Notch家族，它在決定細(xì)胞命運(yùn)方面起著廣泛作用。近幾年中，業(yè)已提出了APP加工與細(xì)胞表面受體Notch 1的加工類似(Wolfe等，J.Biol.Chem.2765413-5416，2001)。實(shí)際上，業(yè)已證實(shí)APP和Notch-1是推測(cè)的內(nèi)源γ-分泌酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物。Notch-1是膜內(nèi)在蛋白，在配體-介導(dǎo)的激活作用之后，它能在它的胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行蛋白水解加工。在配體結(jié)合之后，Notch-1會(huì)發(fā)生早老素依賴性膜內(nèi)γ-分泌酶切割(Okochi，EMBO J.25408-5416，2002)。首先是在1731/1732位點(diǎn)(它與Aβ-樣γ分泌酶切割類似)，其次是在1743/1744位點(diǎn)(它是與產(chǎn)生APP的ε切割類似，并且有時(shí)被稱為Notch的S3-切割；在圖1中被表示為″ε″切割)。正是在Notch的1743/1744接合部分處的ε-切割是朝向所述跨膜結(jié)構(gòu)域的末端進(jìn)行的，釋放出Notch 1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)。釋放的NICD轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，在這里它與被稱為CSL的DNA結(jié)合蛋白相互作用(這種只取首字母的縮寫詞表示在不同系統(tǒng)中賦予該蛋白的三種獨(dú)立的名稱在哺乳動(dòng)物中為CBF1/RBP-J；在果蠅和爪蟾中的無(wú)毛抑制劑[Su(H)]；和C.Elegans中的Lag-1)。NICD和CSL之間形成的混合物改變了靶基因的轉(zhuǎn)錄。NICD是在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑所必須的(Schroeter1998；Hupert 2000)。
早老素依賴性γ-分泌酶活性是將Notch受體加工成NICD所必須的(De Stropper等，Nature 398518-522，1999)。業(yè)已報(bào)道了，在細(xì)胞中，Notch 1和APP是PS1依賴性γ-分泌酶酶切割的競(jìng)爭(zhēng)性底物(Berezovska等，J.Biol.Chem.27630018-30023，2001)。因此，被設(shè)計(jì)成抑制致病性Aβ產(chǎn)生的γ-分泌酶抑制劑還能抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)。它在γ-分泌酶抑制劑用作治療AD的藥物的潛在用途方面具有重要價(jià)值。在成年人體內(nèi)對(duì)Notch-1加工的抑制會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷和貧血，因?yàn)镹otch-1在造血中起著重要作用。因此，有必要鑒定能特異性抑制APP CT-100切割但不會(huì)抑制Notch切割的化合物。這種化合物可以起著干預(yù)AD、但又不產(chǎn)生抑制NICD產(chǎn)生的有害作用的治療劑的作用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于鑒定不會(huì)抑制γ-分泌酶介導(dǎo)的Notch切割的化合物的方法和組合物。上述方法和組合物克服了NICD生產(chǎn)抑制的問(wèn)題，這種抑制會(huì)導(dǎo)致對(duì)γ-分泌酶抑制作用的非特異性抑制。
因此，本發(fā)明能夠鑒定用于干預(yù)AD而又不會(huì)引起抑制NICD產(chǎn)生的有害作用的治療劑。
本發(fā)明的第一方面提供了可溶性融合蛋白，其中包括與NusA蛋白序列的C-末端融合的重組Notch蛋白。所述Notch蛋白優(yōu)選包括Notch蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。不過(guò)，所述Notch蛋白可以包括全長(zhǎng)Notch蛋白中比所述跨膜結(jié)構(gòu)域更多或更少的部分，只要所述Notch蛋白包括Notch的S3切割位點(diǎn)就行。用于特定實(shí)施方案的所述Notch蛋白包括SEQ IDNO4的序列，并且是由SEQ ID NO3的核酸序列編碼的。所述重組Notch蛋白應(yīng)當(dāng)是包括Notch的S3切割位點(diǎn)(即ε切割位點(diǎn))的蛋白。所述重組Notch蛋白可以是脊椎動(dòng)物Notch蛋白或無(wú)脊椎動(dòng)物Notch蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述重組Notch蛋白來(lái)自小鼠Notch蛋白，其具有SEQ ID NO5的序列[Gen Bank錄入號(hào)Z11886]。更具體的實(shí)施方案涉及包括小鼠Notch蛋白的1703-1860位氨基酸的重組Notch蛋白的用途。本發(fā)明的任一種可溶性融合蛋白還可以包括C-末端His-標(biāo)記和/或C-末端Flag-標(biāo)記。當(dāng)然，還可以使用人Notch序列的全部或一部分，例如，SEQ ID NO6的序列[Genbank錄入號(hào)M73980]。
本發(fā)明還涉及包括編碼本文所披露的融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。編碼所述融合蛋白的一種代表性多核苷酸序列是包括SEQ IDNO1所示序列的序列。這種多核苷酸序列編碼SEQ ID NO2的融合蛋白。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體優(yōu)選是這樣的表達(dá)載體，其中，所述多核苷酸可操作地與啟動(dòng)子連接，以便促進(jìn)由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明還涉及用本文所披露的多核苷酸或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于γ-分泌酶測(cè)定的底物的方法，包括以允許所述融合蛋白表達(dá)的方式培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞。該方法還可以包括純化所述多肽。在所述方法中，所述宿主細(xì)胞可以是任何能夠用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，細(xì)菌宿主細(xì)胞和酵母宿主細(xì)胞。在典型實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是Hela細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞系，293細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)可溶性Notch蛋白的方法，該方法包括制備融合蛋白，其中所述Notch蛋白與NusA蛋白的C-末端融合。更具體地講，該方法包括所述融合蛋白的重組生產(chǎn)，其中包括制備表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包括含有Notch的S3切割位點(diǎn)的氨基酸、與NusA蛋白的C-末端連接的Notch蛋白；在有利于所述融合蛋白表達(dá)的條件下用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該方法還可以包括從培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中分離所述融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)化學(xué)蛋白合成生產(chǎn)所述融合蛋白。在這種方法中，所述Notch蛋白優(yōu)選包括小鼠Notch蛋白的1703-1860號(hào)氨基酸。
本發(fā)明還涉及測(cè)定Notch蛋白的γ-分泌酶介導(dǎo)的切割(1743/1744)的體外方法，其中包括使含有哺乳動(dòng)物γ-分泌酶復(fù)合物或其生物活性片段的第一種組合物與包括本發(fā)明融合蛋白的第二種組合物接觸；和測(cè)定所述融合蛋白的切割。
上述方法的γ-分泌酶復(fù)合物可以包括從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或用包括編碼γ-分泌酶復(fù)合物的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞中純化并且分離的膜級(jí)份。在上述方法中，所述融合蛋白是按照本文所披露的方法制備的可溶化Notch蛋白。
本發(fā)明具體涉及包括通過(guò)本發(fā)明所披露的篩選方法鑒定的γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑的組合物。本發(fā)明還涉及在體內(nèi)調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性的方法，包括以能有效調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的γ-分泌酶活性的量給所述哺乳動(dòng)物施用通過(guò)本文所披露的篩選方法鑒定的調(diào)節(jié)劑的步驟，所述調(diào)節(jié)劑是γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑，與γ-分泌酶-介導(dǎo)的Notch蛋白的切割相比，它能選擇性地抑制γ-分泌酶-介導(dǎo)的APP的切割。
本發(fā)明還涉及包含通過(guò)本發(fā)明鑒定的一種或多種調(diào)節(jié)劑和可以藥用的載體的藥物組合物。還涉及治療以異常的γ-分泌酶活性為特征的疾病或癥狀的方法，包括給需要治療的對(duì)象施用本發(fā)明的藥物組合物。特別涉及將本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)用來(lái)治療阿爾茨海默病的藥品的用途。
通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明可以了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些詳細(xì)說(shuō)明和具體實(shí)施例表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，它們僅僅是以說(shuō)明形式提供的，因?yàn)樵诒景l(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)的各種改變和改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在閱讀該詳細(xì)說(shuō)明之后是顯而易見(jiàn)的。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明以下附圖構(gòu)成了本說(shuō)明書的一部分，并且包含在本發(fā)明內(nèi)以便進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面。通過(guò)結(jié)合附圖和本文所提供的具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1.γ-分泌酶-樣切割位點(diǎn)的比較。示出了位于APP(SEQ ID NO10)，Notch-1(SEQ ID NO12)，和E-cathedrin(SEQ ID NO11)的跨膜結(jié)構(gòu)域周圍的序列。還示出了APP中的γ-分泌酶切割位點(diǎn)，用于產(chǎn)生Aβ1-40和1-42，以及用于這三種底物的ε-切割(ε)或γ-分泌酶-樣切割位點(diǎn)。
圖2.Notch-1中的γ-分泌酶-樣切割位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。選擇該序列(1703-1860；SEQ ID NO13)以便在大腸桿菌中表達(dá)。所述跨膜結(jié)構(gòu)域由下劃線表示，用粗體和下劃線符號(hào)表示1743/1744切割位點(diǎn)。該Notch序列的切割會(huì)產(chǎn)生包括1744-1860位氨基酸的NICD片段。
圖3.a)克隆的、用于在大腸桿菌中表達(dá)Notch的構(gòu)建體。示出了四種構(gòu)建體，都包括Notch-1的1703-1860位氨基酸序列。當(dāng)caspase前導(dǎo)序列，泛素，或tau的N-末端結(jié)構(gòu)域被用作N-末端標(biāo)記以便協(xié)助驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，沒(méi)有觀察到表達(dá)。當(dāng)Notch(1703-1860)與NusA蛋白融合時(shí)，在大腸桿菌中觀察到了可溶性表達(dá)。b)克隆到ET 43.1a.中的Notch F構(gòu)建體的示意圖。該構(gòu)建體還包括C-末端Flag和8His標(biāo)記。
圖4.NusA-Notch融合體的IMAC分離。在上部示出了所述融合蛋白的示意圖。NusA-Notch的表達(dá)和純化的細(xì)節(jié)可以參見(jiàn)材料和方法部分。箭頭表示在10％SDS-PAGE凝膠上的融合蛋白表達(dá)條帶。泳道1，粗制大腸桿菌裂解物；泳道2，大腸桿菌上清液，泳道3，IMAC流過(guò)物；泳道4，50mM咪唑洗滌物；泳道5-9，300mM咪唑洗脫級(jí)份；泳道10，BenchMark分子量標(biāo)記。
圖5.表示用可溶化γ-分泌酶切割NusA-Notch融合體的Western印跡。該實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)披露于實(shí)施例1中。簡(jiǎn)單地講，將可溶化γ-分泌酶與NusA-Notch融合體在有或沒(méi)有各種濃度的DAPT(PHA-568638)的存在的條件下溫育過(guò)夜。對(duì)所述樣品進(jìn)行電泳，印跡，并且用Val 1744抗體探測(cè)，該抗體對(duì)Val 1744處的切割是特異性的。
圖6.通過(guò)ELISA檢測(cè)特異性Notch切割。示出了將夾心ELISA用于檢測(cè)可溶化γ-分泌酶對(duì)NusA-Notch融合體的切割的示意圖。用Val1744抗體檢測(cè)特異性切割。
圖7.通過(guò)ELISA檢測(cè)的γ-分泌酶對(duì)NusA-Notch融合蛋白的切割。在有或沒(méi)有68μg/ml可溶化γ-分泌酶(酶)存在的條件下溫育NusA-Notch(0.9μM)底物，并且按照材料和方法部分所述進(jìn)行ELISA測(cè)定。數(shù)據(jù)表示六次實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖8.通過(guò)ELISA表征Notch切割。ELISA測(cè)定是按照材料和方法部分所披露的方案進(jìn)行的。在改變Notch底物濃度時(shí)，將0.11-3.6μM的NusA-Notch與68μg/ml可溶化γ-分泌酶一起溫育，并且用Michaelis-Menton曲線擬合法對(duì)所述數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。在改變所述酶濃度時(shí)，將2.1-68μg/ml可溶化γ-分泌酶與0.9μM Notch底物一起溫育。數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值，并且用GraFit 4.0作圖。存在大約5倍的信號(hào)背景(僅使用酶的背景是可以忽略的)。
圖9.通過(guò)已知能抑制γ-分泌酶對(duì)CT-100的體外切割的化合物抑制Notch切割。示出了用Notch切割ELISA測(cè)定的對(duì)DAPT(PHA-568638)和葑胺(PHA-512088)的抑制曲線。還示出了相對(duì)IC50值。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明AD是主要的與年齡相關(guān)的疾病，這種疾病與以皮層萎縮和衰老斑的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)為特征的漸進(jìn)性癡呆和病理學(xué)相關(guān)。衰老斑的主要成分是長(zhǎng)度為40-42個(gè)氨基酸的肽，Aβ，它來(lái)自APP的靠近全長(zhǎng)APP的跨膜結(jié)構(gòu)域并且包括其一部分的區(qū)域。這種致病性肽是由于β-和γ-分泌酶活性的順序加工的結(jié)果產(chǎn)生的。因此，這兩種分泌酶的酶促活性是藥物開(kāi)發(fā)的目標(biāo)(Olson等，Curr.Opin.Drug Discovery & Develop.4390-401，2001)。
業(yè)已證實(shí)細(xì)胞表面受體Notch的加工與APP加工類似(Wolf等，J.Biol.Chem.2765413-5416，2001)。圖1表示在APP和Notch中γ-分泌酶-樣切割位點(diǎn)的比較。如圖所示，APP中的切割位點(diǎn)位于所述跨膜結(jié)構(gòu)域的中間，而Notch是在非常接近它的跨膜結(jié)構(gòu)域的C-末端切割的。最近業(yè)已報(bào)導(dǎo)了存在于cathedrin E(圖1)上的類似的ε-切割位點(diǎn)(Marambaud等，EMBO J.，211948-1956，2002)。圖2表示Notch蛋白的從1703-1860的氨基酸序列，其中包括Notch上的S3切割位點(diǎn)(Steiner等，J.Mol.Neuro sci.17193-198，2001)。在1743/1744接合部分處的特異性切割會(huì)產(chǎn)生V1744-D1860 Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，它是在用缺少S1和S2切割位點(diǎn)的mdE Notch構(gòu)建體(1704-2183)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的NICD片段(Kopan等，Proc.Natl.Acad.Sci.931683-1688，1996)。盡管業(yè)已報(bào)導(dǎo)了Notch構(gòu)建體(Val 1711-Glu 1809)(Esler等Proc.Natl.Acad.Sci.99，2720-2725，2002)，但還沒(méi)有γ-分泌酶在體外在1743/1744接合部位的特異性切割的報(bào)導(dǎo)。通過(guò)使用Val-1744抗體(Cell SignalingTechnology)可以方便地確定1743/1744接合部分處的特異性切割。這種抗體對(duì)于切割的Notch具有特異性，并且不會(huì)與未切割的Notch蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。
因此，在細(xì)胞中，除了切割通過(guò)β-分泌酶的作用產(chǎn)生的CT-100片段之外，PSI依賴性γ-分泌酶還能切割ε位點(diǎn)1743/1744，產(chǎn)生NICD。這種切割的NICD轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，并且參與信號(hào)傳導(dǎo)。被設(shè)計(jì)成緩解AD的γ-分泌酶活性的治療性抑制作用還導(dǎo)致了NICD產(chǎn)生的抑制。本發(fā)明首次提供了用于鑒定不會(huì)抑制由Notch-1產(chǎn)生NICD的治療劑的方法和組合物。
本發(fā)明的方法提供了對(duì)Notch切割的體外測(cè)定，以及將所述測(cè)定用于γ-分泌酶抑制劑的二級(jí)評(píng)估的用途。所述測(cè)定方法采用了γ-分泌酶的可溶性Notch底物，它包括含有與NusA蛋白序列的C-末端相融合的重組Notch蛋白的可溶性融合蛋白。本發(fā)明的測(cè)定方法可以通過(guò)直接體外ELISA測(cè)定進(jìn)行和/或?qū)τ搔?分泌酶切割的Notch蛋白的Western印跡進(jìn)行分析。本發(fā)明的方法提供了可溶性重組Notch蛋白(Asn 1703-Asp 1860)底物的生產(chǎn)和純化，所述蛋白底物是以具有加工到Notch蛋白序列上的NusA的融合蛋白形式在合適的細(xì)胞系，例如大腸桿菌中表達(dá)的(參見(jiàn)圖6)。
使用本發(fā)明的純化的融合蛋白底物，本發(fā)明人證實(shí)了使用來(lái)自HeLa細(xì)胞的可溶化γ-分泌酶在Notch中的1743/1744位點(diǎn)處的特異性切割。正如在具體實(shí)施例中所披露的，切割的Notch蛋白可以用對(duì)Val-1744特異的抗體檢測(cè)。本發(fā)明人證實(shí)了該測(cè)定法，并且顯示出所述Notch的切割是以劑量依賴性方式由DAPT抑制的(DAPT是γ-分泌酶的眾所周知的強(qiáng)抑制劑)。開(kāi)發(fā)出了基于抗-Val-1744抗體的ELI SA。通過(guò)γ-分泌酶抑制劑抑制所述切割，進(jìn)一步證實(shí)了體外Notch測(cè)定法。在實(shí)踐中，將抑制劑或調(diào)節(jié)劑定義為能通過(guò)γ-分泌酶降低Aβ的化合物。
1.用于體外Notch測(cè)定的Notch底物用于本發(fā)明測(cè)定法的Notch底物是Notch多肽與Nus蛋白的可溶性融合蛋白。所述融合蛋白可以被標(biāo)記，或者以其他方式修飾，以便有利于所述肽的純化，Notch融合蛋白本身的檢測(cè)，或在γ-分泌酶作用后檢測(cè)所述Notch融合蛋白的切割產(chǎn)物。在本文的下面更詳細(xì)地披露了所述融合蛋白的生產(chǎn)和代表性修飾。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，包括小鼠notch-1蛋白的氨基酸N1703-D1860(DNA序列保藏號(hào)Z11886；參見(jiàn)圖2)的所述Notch底物，在它的N-末端與NusA的C-末端連接。預(yù)計(jì)所述融合多肽可以通過(guò)重組蛋白生產(chǎn)產(chǎn)生，或?qū)嶋H上通過(guò)在本說(shuō)明書其他地方所討論的自動(dòng)化肽合成法產(chǎn)生。在圖2中的跨膜結(jié)構(gòu)域跨越氨基酸1723-1744(參見(jiàn)圖1)。γ-分泌酶能在氨基酸1743和1744之間的ε-切割位點(diǎn)處切割Notch。該切割位點(diǎn)又被稱為S3-切割位點(diǎn)，并且產(chǎn)生NICD(即跨越V1744-D1860的肽)。
除了這種新型融合蛋白之外，本發(fā)明還涉及生成如上文所述或按照本發(fā)明方法鑒定的Notch/NusA融合蛋白底物的末端加成物，又被稱為融合蛋白或融合多肽。另外，盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案示出了包括小鼠Notch-1的N1703-D1860的Notch/NusA融合肽，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述Notch蛋白可來(lái)自任何來(lái)源。所述來(lái)源可以是哺乳動(dòng)物，或非哺乳動(dòng)物。因此，盡管優(yōu)選的是Notch-1來(lái)自人，小鼠，大鼠或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源，預(yù)計(jì)在某些實(shí)施方案中，Notch-1可來(lái)自例如C.elegans，非洲爪蟾屬，果蠅，和其他無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)源。
另外，預(yù)計(jì)包括γ-分泌酶切割位點(diǎn)1731/1732(γ位點(diǎn))和1743/1744位點(diǎn)(ε-切割)的任何Notch-1衍生物都可用于本發(fā)明的融合蛋白底物中。在Notch-1中，能釋放NICD的γ-分泌酶切割位點(diǎn)位于Notch中的1743/1744位點(diǎn)。預(yù)計(jì)所述切割位點(diǎn)和NusA的起始位點(diǎn)之間的距離為大約500個(gè)氨基酸，以便模擬Notch γ-分泌酶切割結(jié)構(gòu)域的空間特性。該距離可以通過(guò)NusA蛋白產(chǎn)生，或者可以通過(guò)異源肽接頭產(chǎn)生。優(yōu)選的是，該區(qū)域來(lái)自NusA蛋白。Notch/NusA融合多肽的NusA蛋白結(jié)構(gòu)域成分大體上可以是NusA蛋白的、可使得所述Notch/NusA融合體保留可溶性的任何部分，并因此可用于體外測(cè)定。
NusA以前業(yè)已被用于在大腸桿菌中可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)(例如，參見(jiàn)Wilkinson，等，Biol Technology 9，443-448，1991；Davis等，BiotechnolBioeng.，65(4)382-8，1999)。在這里，將包含SEQ IDNO17所示序列(由SEQ ID NO16的核酸序列編碼)的NusA蛋白與Notch相融合。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用除了SEQ ID NO17所示序列之外的NusA序列，并且仍然能產(chǎn)生本發(fā)明的可溶性Notch/NusA融合蛋白。例如，技術(shù)人員可以使用包括與SEQ ID NO17的序列具有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或更高序列同源性的NusA蛋白。另外，技術(shù)人員可以采用來(lái)自SEQ ID NO17的更小的連續(xù)片段NusA，例如，所述片段可以是SEQ ID NO17中的50，100，150，200，250，300，350，400，425，450，475，500，510，520，530，540，550或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。
設(shè)計(jì)和制備融合蛋白的一般原則為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，融合通常采用來(lái)自其他物種的前導(dǎo)序列，以便能夠在異源宿主中重組表達(dá)蛋白或肽。其他有用的融合包括添加免疫學(xué)活性結(jié)構(gòu)域，如抗體表位，以便有利于所述融合多肽的純化。在所述融合接合部位或靠近該部位的地方包括切割位點(diǎn)將有助于在純化之后除去外源多肽。所述融合體的重組生產(chǎn)在本說(shuō)明書的其他地方有更詳細(xì)的說(shuō)明。其他有用的融合包括連接功能性結(jié)構(gòu)域，如來(lái)自酶的活性位點(diǎn)，糖基化結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞定向信號(hào)或跨膜區(qū)。
更具體地講，本發(fā)明涉及融合多肽，其中存在包含含有1731/1732(γ切割)和1743/1744(ε-切割)切割位點(diǎn)的Notch蛋白的第一成分以及與之連接的含有NusA蛋白的全部或一部分的第二成分。在其他實(shí)施方案中，所述融合多肽還可以包括含有報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物的第三成分。在其他實(shí)施方案中，所述融合多肽還可以包括標(biāo)記的序列成分。涵蓋的特定的融合多肽是這樣的融合多肽，它包括位于NusA部分的一側(cè)的報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物，包括具有γ-分泌酶切割位點(diǎn)的Notch蛋白的一段序列，和位于所述Notch蛋白另一側(cè)的被標(biāo)記序列。用于本發(fā)明融合多肽的報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的任何報(bào)導(dǎo)蛋白。
典型的報(bào)道蛋白包括，但不局限于熒光素酶；分泌的堿性磷酸酶(SEAP)；β半乳糖苷酶；β-葡糖醛酸酶；綠色熒光蛋白和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
其他具體實(shí)施方案還涉及作為本發(fā)明融合多肽的第四種成分的被標(biāo)記序列。存在多種可通過(guò)商業(yè)渠道獲得的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可用于提供本發(fā)明范圍內(nèi)的被標(biāo)記序列。特別有用的系統(tǒng)包括，但不局限于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)，麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB，Beverley，MA)，F(xiàn)LAG系統(tǒng)(IBI，New Haven，CT)，和6×His系統(tǒng)(Qiagen，Chatsworth，CA)。以上系統(tǒng)能夠生產(chǎn)僅具有少量額外氨基酸的重組多肽，它們不太可能影響所述重組融合蛋白的生物學(xué)相關(guān)活性。例如，F(xiàn)LAG系統(tǒng)和6×His系統(tǒng)都僅添加了短序列，已知二者的抗原性弱，并且不會(huì)對(duì)所述多肽折疊成它的天然構(gòu)象產(chǎn)生負(fù)面影響。可能有用的其他N-末端融合是Met Lys二肽在所述蛋白或肽的N末端區(qū)的融合。這種融合可以使蛋白表達(dá)和/或活性得到有益的增加?？捎糜诒景l(fā)明的具體的被標(biāo)記序列包括C-末端FLAG標(biāo)記序列DYKDDDDK(SEQ ID NO14)。另外，所述被標(biāo)記序列還可以包括8His標(biāo)記，以便產(chǎn)生附著在所述融合蛋白上的FLAG/8his標(biāo)記(DYKDDDDKHHHHHHHH，SEQ ID NO15)。
本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白的例子是這樣一種蛋白，其中，NusA與部分或完整長(zhǎng)度的小鼠Notch-1蛋白融合，所述蛋白包括1731/1732和1743/1744γ-分泌酶切割位點(diǎn)以及短的C-末端FLAG/8His-標(biāo)記的尾巴。典型融合多肽的序列包括與NusA蛋白融合的小鼠Notch氨基酸1703-1860(即，如SEQ ID NO13所示)。這種典型的融合多肽具有SEQ ID NO2的序列。為了監(jiān)測(cè)γ-分泌酶對(duì)這種嵌合構(gòu)建體的切割，可采用針對(duì)包括Val-1744殘基的Notch切割產(chǎn)物的抗-Val 1744抗體，以便確定由于Notch切割產(chǎn)生的Val-1744片段的存在和濃度?？梢圆捎每?Flag抗體檢測(cè)所述嵌合構(gòu)建體的C-末端。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)指出的是，所述嵌合構(gòu)建體還可以采用報(bào)道蛋白，如堿性磷酸酶，例如位于所述C-末端，以便代替所述Flag標(biāo)記。所述報(bào)道蛋白可因Notch切割釋放，并且使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的測(cè)定方法檢測(cè)。
除了提供業(yè)已披露的融合多肽之外，本發(fā)明提供了進(jìn)一步修飾以便引入例如標(biāo)記或其他可檢測(cè)部分的Notch融合蛋白。
例如，所述Notch/NusA融合蛋白底物可以包括內(nèi)在淬滅標(biāo)記，在切割所述Notch底物之后，它能導(dǎo)致可檢測(cè)性增強(qiáng)。所述Notch/NusA融合蛋白底物可以修飾成附著配對(duì)熒光團(tuán)和淬滅劑，包括但不局限于7-氨基，4-甲基香豆素和2，4-二硝基苯酚，以便γ-分泌酶對(duì)所述肽的切割導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，這是由于分別附著在γ-分泌酶易切割鍵相反兩側(cè)的所述熒光團(tuán)和淬滅劑的物理分離造成的。其他成對(duì)的熒光團(tuán)和淬火劑包括bodipy-四甲基羅丹明和QSY-5(Molecular Probes，Inc.)。在本測(cè)定方法的變化形式中，可以將生物素或另一種合適的標(biāo)記置于所述肽的一端，以便將所述肽錨定在底物測(cè)定平板上，并且可以將熒光團(tuán)置于所述融合蛋白的另一端。有用的熒光團(tuán)包括在上文所列舉的，以及銪標(biāo)記，如W8044(EG & g Wallac，Inc.)?？梢允褂玫牧硪环N優(yōu)選標(biāo)記是Oregon綠，它能夠附著在Cys殘基上。γ-分泌酶對(duì)所述融合蛋白的切割會(huì)從所述平板上釋放出所述熒光團(tuán)或其他標(biāo)記，從而可以測(cè)定化合物對(duì)蛋白水解切割的抑制作用，這種作用是通過(guò)所保留熒光的增強(qiáng)證實(shí)的。γ-分泌酶蛋白分解活性的優(yōu)選比色測(cè)定法采用了其他Notch/NusA融合蛋白，其中，包括用于切割的γ-分泌酶識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸通過(guò)酰胺鍵與o-硝基苯酚連接，從而在將測(cè)定緩沖液改變成堿性pH之后，γ-分泌酶對(duì)所述融合蛋白的切割導(dǎo)致了光學(xué)密度的提高。
另外，所述Notch/NusA融合蛋白可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)記物標(biāo)記，例如，生物素標(biāo)記是特別有用的。這種標(biāo)記的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且披露于例如以下文獻(xiàn)中美國(guó)專利號(hào)3,817,837；美國(guó)專利號(hào)3,850,752；美國(guó)專利號(hào)3,996,345和美國(guó)專利號(hào)4,277,437?？梢允褂玫钠渌麡?biāo)記包括，但不局限于放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。涉及這種標(biāo)記的使用的美國(guó)專利包括例如美國(guó)專利號(hào)3,817,837；美國(guó)專利號(hào)3,850,752；美國(guó)專利號(hào)3,939,350和美國(guó)專利號(hào)3,996,345。本發(fā)明的任一種Notch/NusA融合蛋白組合物可以包括上述任何標(biāo)記的一種、兩種或兩種以上。
II.γ-分泌酶組合物除了新型Notch融合蛋白之外，本發(fā)明涉及將所述Notch融合蛋白用于各種γ-分泌酶測(cè)定的方法。這一部分提供了對(duì)制備包括具有γ-分泌酶活性的蛋白的級(jí)份的說(shuō)明。
盡管γ-分泌酶的確切身份尚有待揭示，有有力證據(jù)暗示γ-分泌酶可能是早老素1。盡管事實(shí)上γ-分泌酶的序列尚有待確定，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解用于分離包含γ-分泌酶的細(xì)胞級(jí)份的方法和組合物。例如，Li等(Proc.Natl.Acad.Sci.976138-6143，2000)披露了用于生產(chǎn)包含增溶γ-分泌酶活性的膜制劑的方法和組合物。這樣的方法可用于本發(fā)明中，用于提供含有γ-分泌酶的純化的級(jí)份。一旦生產(chǎn)了所述級(jí)份，預(yù)計(jì)可將它用于本發(fā)明的測(cè)定。另外，本發(fā)明的新型融合蛋白還可用于從所述膜級(jí)份中進(jìn)一步分離并且純化所述γ-分泌酶，例如采用親和層析分離技術(shù)。
γ-分泌酶級(jí)份通?？蓮娜魏文鼙磉_(dá)γ-分泌酶活性的細(xì)胞中分離。例如，可以使用HeLa3細(xì)胞。所述細(xì)胞可使用例如弗氏壓碎器或其他細(xì)胞破碎技術(shù)破碎，這些技術(shù)包括、但不局限于凍溶技術(shù)(例如，讓細(xì)胞在干冰和37℃水浴之間循環(huán))；使用Hughes或弗氏壓碎器的固態(tài)剪切方法；去污劑裂解(例如，on-ionic去污劑溶液，如Tween，Triton，NP-40等)；低滲溶液裂解(例如，水，檸檬酸緩沖液)；液態(tài)剪切方法(勻漿器；撞擊-噴射微流化器)；超聲波降解(超聲波)。在細(xì)胞裂解之后，可以通過(guò)離心沉淀除掉細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。所述膜級(jí)份可通過(guò)例如100,000g的速度離心60分鐘而沉淀，并且所述膜級(jí)份可以用去污劑進(jìn)一步溶解。例如，在由Li等在上文所披露的溶解方法中，將來(lái)自100,000g離心步驟的膜級(jí)份沉淀重懸浮在緩沖液中，并且在4℃下用1％CHAPSO處理60分鐘，再離心60分鐘。所述去污劑溶解方法可使得100,000g級(jí)份的上清液包括溶解化的γ-分泌酶。
將上述溶解化的級(jí)份用于在本文中所披露的γ-分泌酶測(cè)定。
III.蛋白或肽生產(chǎn)和純化本發(fā)明提供了用于鑒定γ-分泌酶的調(diào)節(jié)劑的可溶性Notch蛋白底物，所述調(diào)節(jié)劑對(duì)APP切割是特異性的，但是不能抑制Notch切割。這樣的底物可以通過(guò)常規(guī)自動(dòng)化肽合成方法或重組表達(dá)生產(chǎn)。
A.合成肽生產(chǎn)本發(fā)明的所述肽或?qū)嶋H上完整長(zhǎng)度的融合多肽可以按照常規(guī)技術(shù)在溶液或在固體支持物上合成。各種自動(dòng)化合成儀可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得，并且可以按照已知方法使用。例如，參見(jiàn)Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.，(1984)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.，1056442，1983；Merrifield，Science，232341-347，1986；和Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer，eds，Academic Press，New York，1-284，1979，分別被收入本文作為參考。本發(fā)明的新型Notch融合蛋白底物包括能夠被γ-分泌酶切割的γ-分泌酶切割位點(diǎn)1731/1732和1743/1744，所述底物可以方便地合成，然后在γ-分泌酶篩選測(cè)定中篩選。
在特別優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的融合蛋白是通過(guò)采用購(gòu)自AppliedBiosystems Inc.的Model433A的固相技術(shù)合成的?？梢圆捎梅聪郒PLC分析測(cè)定通過(guò)自動(dòng)化肽合成或通過(guò)重組方法制備的任何特定Notch融合蛋白的純度。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何方法確定每一種肽的化學(xué)真實(shí)性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真實(shí)性是通過(guò)質(zhì)譜分析確定的。
另外，所述融合蛋白可以通過(guò)氨基酸分析定量，其中進(jìn)行微波水解。所述分析可以使用微波爐，如CEM公司的MDS 2000微波爐。使所述肽(大約2mg蛋白)與6N HCl(Pierce Constant Boiling，例如大約4ml)和大約0.5％(體積比)苯酚(Mallinckrodt)接觸。在水解之前，交替對(duì)所述樣品進(jìn)行抽真空和用N2沖洗。使用兩階段方法進(jìn)行蛋白水解。在第一階段，使所述融合蛋白處于大約100℃的反應(yīng)溫度，并且在該溫度下保持1分鐘。在該步驟之后，立即將溫度提高到150℃，并且在該溫度下保持大約25分鐘。在冷卻之后，使所述樣品干燥，并且對(duì)來(lái)自所述水解的融合蛋白樣品的氨基酸用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯衍生化，產(chǎn)生穩(wěn)定的脲，它能產(chǎn)生395nm波長(zhǎng)的熒光(WatersAccQ Tag Chemistry Package)。所述樣品可以通過(guò)反相HPLC分析，并且可以用強(qiáng)化積分儀進(jìn)行定量。
B.重組蛋白生產(chǎn)作為自動(dòng)化肽合成的替代方案，可以采用重組DNA技術(shù)，其中，將編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中，并且在如下文所述的適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)。重組方法特別優(yōu)選用于生產(chǎn)包括本發(fā)明肽序列的較長(zhǎng)多肽。根據(jù)本發(fā)明對(duì)新型Notch融合蛋白底物的說(shuō)明，可以通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)所述融合多肽。有多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可用于包含并且表達(dá)所述肽或融合多肽編碼序列。其中包括，但不局限于微生物，如用重組噬菌體，質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系；用病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的或用細(xì)菌表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)?？捎糜谥亟M蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，但不局限于VERO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，COS細(xì)胞(如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和293細(xì)胞。下面披露了用于在細(xì)菌，酵母和其他無(wú)脊椎動(dòng)物中重組表達(dá)所述Notch融合體的示例性方法。
用于原核宿主的表達(dá)載體通常包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記基因。這種基因通常編碼例如賦予抗生素抗性的蛋白或補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型需求的蛋白。有多種這樣的載體可以通過(guò)商業(yè)渠道方便地獲得。其例子包括pSPORT載體，pGEM載體(Promega)，pPROEX載體(LTI，Bethesda，MD)，Bluescript載體(Stratagene)，pET載體(Novagen)和pQE載體(Qiagen)。編碼給定Notch融合蛋白的DNA序列可通過(guò)PCR擴(kuò)增，并且克隆到所述載體中，例如設(shè)計(jì)成產(chǎn)生包含由所述載體編碼的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和由插入所述載體的克隆位點(diǎn)的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白的pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，NJ)?？梢詫⒂糜谒鯬CR的引物制成包括例如合適的切割位點(diǎn)。預(yù)計(jì)用凝血酶或因子X(jué)a(Pharmacia，Piscataway，NJ)處理所述重組融合蛋白能切割它，從GST部分上釋放所述底物或包含底物的多肽。將pGEX-3X/融合肽構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞(Stratagene，La Jolla CA)，并且分離和培養(yǎng)單個(gè)轉(zhuǎn)化體。純化來(lái)自單個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，并且用自動(dòng)化測(cè)序儀進(jìn)行部分測(cè)序，以便證實(shí)處于正確方向的所需肽或多肽編碼核酸插入片段的存在。
GST/底物融合蛋白的誘導(dǎo)是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的在37℃下在LB培養(yǎng)基(補(bǔ)充了羧芐青霉素)中將轉(zhuǎn)化的XL 1 Blue培養(yǎng)物生長(zhǎng)到在600nm波長(zhǎng)下的光學(xué)密度為0.4，然后在存在0.5mM異丙基*-D-硫代半乳吡喃糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
所述GST融合蛋白預(yù)計(jì)以不溶性包涵體形式在所述細(xì)菌中生產(chǎn)，可以按以下方法進(jìn)行純化。通過(guò)離心收獲細(xì)胞；用0.15M NaCl，10mMTris，pH 8，1mM EDTA洗滌；并且在室溫下用0.1mg/ml溶菌酶(SigmaChemical Co.)處理15分鐘。通過(guò)超聲波處理清除所述裂解物，并且通過(guò)以12,000×g的速度離心10分鐘使細(xì)胞碎片沉淀。將含有所述融合蛋白的沉淀物重新懸浮在50mM Tris(pH 8)和10mM EDTA中，鋪放在50％甘油上，并且以6000×g的速度離心30分鐘。將沉淀物重新懸浮在不含Mg++和Ca++的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。通過(guò)在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠中分級(jí)分離所述重新懸浮的沉淀物而進(jìn)一步純化所述融合蛋白(Sambrook等eds.Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。將所述凝膠浸泡在0.4M KCl中以便顯現(xiàn)所述蛋白，將所述蛋白切下來(lái)，并且在不含SDS的凝膠電泳緩沖液中進(jìn)行電洗脫。如果所述GST/Notch融合蛋白是以可溶性蛋白形式在細(xì)菌中生產(chǎn)的話，可以用GST Purification Module(PharmaciaBiotech)純化。
所述融合蛋白可以進(jìn)行凝血酶消化，以便從成熟的Notch融合多肽上切割所述GST。所述消化反應(yīng)(20-40μg融合蛋白，20-30單位的人凝血酶(4000U/mg(Sigma)，存在于0.5ml PBS中)在室溫下溫育16-48小時(shí)，并且加樣到變性SDS-PAGE凝膠上，以便分級(jí)分離所述反應(yīng)產(chǎn)物。將所述凝膠浸泡在0.4M KCl中，以便顯現(xiàn)所述蛋白質(zhì)條帶。相應(yīng)于所述融合多肽預(yù)期分子量的蛋白質(zhì)條帶的身份可以通過(guò)使用自動(dòng)化測(cè)序儀的部分氨基酸序列分析方法證實(shí)(Applied BiosystemsModel 473A，F(xiàn)oster City，CA)。
另外，可以將編碼含有編碼推測(cè)底物的融合多肽的DNA序列克隆到包括需要的啟動(dòng)子，并且可選地包括前導(dǎo)序列的質(zhì)粒上(例如，參見(jiàn)Better等，Science，2401041-43，1988)。可以通過(guò)自動(dòng)化測(cè)序證實(shí)該構(gòu)建體的序列。然后采用CaCl2溫育和細(xì)菌熱休克處理經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Sambrook等，同上)。讓轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在補(bǔ)充了羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且通過(guò)在合適培養(yǎng)基中生長(zhǎng)誘導(dǎo)所述表達(dá)蛋白的產(chǎn)生。如果存在的話，所述前導(dǎo)序列會(huì)影響成熟的Notch-型融合蛋白的分泌，并且在分泌期間裂解。
所述分泌的重組蛋白是通過(guò)本文所披露的方法從細(xì)菌培養(yǎng)基中純化的。類似的，可以將來(lái)自包括酵母屬，畢赤酵母屬，和克魯維酵母屬在內(nèi)的生物屬的酵母宿主細(xì)胞用于制備所述重組肽。優(yōu)選的酵母宿主是釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母。酵母載體通常包括來(lái)自2T酵母質(zhì)粒的復(fù)制序列起點(diǎn)，自主復(fù)制序列(ARS)，啟動(dòng)子區(qū)，聚腺苷酸化序列，轉(zhuǎn)錄終止序列，以及選擇標(biāo)記基因。還可以使用能夠在酵母和大腸桿菌二者中復(fù)制的載體(稱之為穿梭載體)。除了上面所提到的酵母載體的特征之外，穿梭載體還可以包括用于在大腸桿菌中復(fù)制和選擇的序列。在酵母宿主中表達(dá)的多肽的直接分泌可以通過(guò)在編碼所述底物的核苷酸序列的5′末端添加編碼酵母I-因子前導(dǎo)序列的核苷酸序列而實(shí)現(xiàn)。
一般地，給定底物可以在酵母中使用可通過(guò)商業(yè)渠道獲得的表達(dá)系統(tǒng)，例如畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，San Diego，CA)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行重組表達(dá)。該系統(tǒng)還取決于指導(dǎo)分泌的前原α序列，不過(guò)，所述插入片段的轉(zhuǎn)錄是在甲醇誘導(dǎo)時(shí)由醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的。
所述分泌的重組底物是從酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化的，例如，通過(guò)用于從細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清液中純化底物的方法。
另外，可以將編碼本發(fā)明新型底物的合成DNA克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pVL1393(PharMingen，SanDiego，CA；Luckow和Summers，BiolTechnology 647(1988))上。然后按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(PharMingen)將這種含有底物的載體用于在s F9無(wú)蛋白培養(yǎng)基中感染草地夜蛾，并且生產(chǎn)重組蛋白。使用肝素-Sepharose柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)和系列分子大小分級(jí)柱(Amicon，Beverly，MA)從所述培養(yǎng)基中純化和濃縮所述蛋白或肽，并且重新懸浮在PBS中。SDS-PAGE分析顯示有一條帶，證實(shí)了所述蛋白的大小，并且在Porton 2090肽測(cè)序儀上進(jìn)行的Edman測(cè)序證實(shí)了它的N-末端序列。
另外，所述Notch融合蛋白底物可以在昆蟲系統(tǒng)中表達(dá)。用于蛋白表達(dá)的昆蟲系統(tǒng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一種這樣的系統(tǒng)中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作載體，用于在草地夜蛾細(xì)胞或Trichoplusia larvae中表達(dá)外源基因。將所述底物編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)，如多角體蛋白基因，并且使它受所述多角體蛋白啟動(dòng)子的控制。底物的成功插入會(huì)使得多角體蛋白基因失活，并且產(chǎn)生缺少外殼蛋白外被的重組病毒。然后將這種重組病毒用于感染草地夜蛾細(xì)胞或Trichoplusia larvae，在其中表達(dá)所述底物(Smith等，J Tirol 46584，1983；Engelhard EK等，Proc.Nat.Acad.Sci.913224-7，1994)。
用于表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)同樣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。可以針對(duì)加工所表達(dá)的蛋白或產(chǎn)生某些可提供蛋白活性的翻譯后修飾的能力選擇宿主細(xì)胞株。所述多肽的這種修飾包括，但不局限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。裂解所述蛋白的“前原”形式的翻譯后加工對(duì)于正確插入，折疊和/或功能來(lái)說(shuō)可能同樣是重要的。諸如CHO，HeLa，MDCK，293，WI38等的不同宿主細(xì)胞具有特殊細(xì)胞器和特征機(jī)制，可以實(shí)現(xiàn)所述翻譯后活性。可以選擇宿主細(xì)胞，以便確保所導(dǎo)入的外源蛋白的正確修飾和加工。
優(yōu)選將轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)胞用于長(zhǎng)期的高產(chǎn)量蛋白生產(chǎn)，并且這種穩(wěn)定表達(dá)是理想的。一旦用包括選擇標(biāo)記和需要的表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化了所述細(xì)胞，就可以讓所述細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后將它們轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。將所述選擇標(biāo)記設(shè)計(jì)成能產(chǎn)生對(duì)選擇的抗性，并且它的存在使得成功地表達(dá)所導(dǎo)入序列的細(xì)胞可以生長(zhǎng)和回收。可以使用適合所述細(xì)胞的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性團(tuán)塊。
有多種選擇系統(tǒng)可用于回收業(yè)已轉(zhuǎn)化用于重組蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞。所述選擇系統(tǒng)包括，但不局限于分別存在于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞中的HSV胸苷激酶，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。另外，可以將抗代謝物抗性用作選擇以下基因的基因dhfr，它能產(chǎn)生對(duì)氨甲蝶呤的抗性；gpt，它能產(chǎn)生對(duì)霉酚酸的抗性；neo，它能產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷G418的抗性；ALS，它能產(chǎn)生對(duì)chlorsulfuron的抗性；和hygro，它能產(chǎn)生對(duì)對(duì)潮霉素的抗性?？梢允褂玫钠渌x擇基因包括trpB，它允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允許細(xì)胞利用組胺醇代替組氨酸。能提供鑒別轉(zhuǎn)化體的視覺(jué)標(biāo)志的標(biāo)記包括花色素苷，b-葡糖醛酸糖苷酶以及它的底物GUS，和螢光素酶以及它的底物螢光素。
C.位點(diǎn)特異性誘變位點(diǎn)特異性誘變是可用于制備單個(gè)γ-分泌酶底物肽、尤其是包含本發(fā)明的γ-分泌酶底物融合蛋白之一作為其成分的融合蛋白的另一種技術(shù)。這種技術(shù)采用了所述基本DNA(它編碼作為修飾目標(biāo)的氨基酸序列)的特殊誘變?？紤]上述一種或多種因素，通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸變化導(dǎo)入所述DNA，所述技術(shù)還可以容易地用于制備并且檢測(cè)序列變體。通過(guò)使用編碼具有所需突變的DNA序列以及足夠數(shù)量的相鄰核苷酸的特殊寡核苷酸序列生產(chǎn)突變體，以便提供具有足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，在要轉(zhuǎn)變的缺失接合處兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體，可以經(jīng)位點(diǎn)特異性誘變生成突變體。通常，長(zhǎng)度為大約17-25個(gè)核苷酸的引物是優(yōu)選的，其中所述序列接合處兩側(cè)的大約5-10個(gè)殘基得到改變。
所述技術(shù)通常采用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體?？捎糜诙ㄎ徽T變的典型載體包括諸如M13噬菌體的載體。所述噬菌體載體可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得，并且它們的應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。雙鏈質(zhì)粒通常也可常規(guī)用于定位誘變中，這種方法中不需要將感興趣的基因從噬菌體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒中的步驟。
一般地，定位誘變是這樣進(jìn)行的首先獲得單鏈載體，或者將雙鏈載體的雙鏈熔解，所述載體的序列上包括編碼所需蛋白的DNA序列。通過(guò)合成制備具有需要的突變序列的寡核苷酸引物。然后讓該引物與所述單鏈DNA制劑退火，在選擇雜交(退火)條件時(shí)，要考慮錯(cuò)配程度。用諸如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段的DNA聚合酶處理，以便完成所述具有突變的鏈的合成。因此，形成了異源雙鏈體，其中一股鏈編碼原始非突變序列，而第二股鏈具有需要的突變。然后將這種異源雙鏈體用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌細(xì)胞的合適細(xì)胞，并且選擇包括具有所述突變序列排列的重組載體的克隆。
當(dāng)然，上述用于定位誘變的方法不是制備潛在有用的突變肽類型的唯一方法，因此并非局限于此。本發(fā)明還涉及實(shí)現(xiàn)誘變的其他方法，例如，用諸如羥胺的誘變劑處理具有感興趣基因的重組載體，以便獲得序列變體。
D.蛋白質(zhì)純化比較理想的是純化本發(fā)明的融合蛋白。蛋白純化技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些技術(shù)在一種水平上涉及將細(xì)胞環(huán)境大致分級(jí)分離成多肽和非多肽級(jí)份。在將本發(fā)明的所述肽或多肽與其他蛋白分離之后，可以用層析和電泳技術(shù)進(jìn)一步純化感興趣的融合多肽或肽，以便實(shí)現(xiàn)部分或完全純化(或純化到均一)。特別適合制備純肽的分析方法是離子交換層析，排阻層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳；等電聚焦。特別有效的純化融合蛋白的方法是快速蛋白液相層析(FPLC)或者甚至是高效液相層析(HPLC)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述NusA-Notch融合體可通過(guò)固定化金屬親和層析(IMAC)分離。
IMAC主要被用于純化多聚組氨酸標(biāo)記的重組蛋白。在本發(fā)明中，所述融合蛋白的C-末端包括多聚組氨酸標(biāo)記，可以通過(guò)這種有效的技術(shù)純化。這種純化取決于組氨酸螯合二價(jià)金屬的天然傾向。將金屬離子放在層析支持物上，可以純化出所述組氨酸標(biāo)記的蛋白。這是業(yè)已被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于多種蛋白純化方法的高度有效的方法。在實(shí)施例1中披露了分離本發(fā)明蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案的典型條件。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變所述條件和培養(yǎng)基，并且仍然能按本發(fā)明實(shí)現(xiàn)純化。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,431,546，其中披露了從混合物中對(duì)生物學(xué)或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行金屬親和層析分離的詳細(xì)方法。在上述專利中披露的層析介質(zhì)包括結(jié)合材料，其中具有含有蒽醌、酞菁或芳香族偶氮中的至少一種基團(tuán)的配體，并且在選自下列一組中的至少一種金屬離子存在下進(jìn)行Ca2+，Sr2+，Ba2+，Al3+，Co2+，Ni2+，Cu2+或Zn2+。其他培養(yǎng)基和條件披露于以下網(wǎng)站例如，http//www.affiland.com/imac/nta.Htm和http//www.affiland.com/imac/pdc.Htm。
本發(fā)明的某些方面涉及編碼的多肽、蛋白或肽的純化，并且在具體實(shí)施方案中涉及其實(shí)質(zhì)性純化。在本文中，術(shù)語(yǔ)″純化的多肽、蛋白或肽″用于表示與其他成分分離的組合物，其中，所述多肽、蛋白或肽相對(duì)于用于產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞或合成成分來(lái)說(shuō)純化到任意程度。因此，純化的多肽、蛋白或肽還表示離開(kāi)它天然存在的環(huán)境的多肽、蛋白或肽。
一般，″純化的″指業(yè)已進(jìn)行過(guò)分級(jí)分離、以便除去各種其他成分的多肽、蛋白或肽，并且，該組合物大體上保持了它的表達(dá)的生物學(xué)活性。其中，使用術(shù)語(yǔ)″大體上純化的″時(shí)，該術(shù)語(yǔ)表示其中所述多肽、蛋白或肽構(gòu)成主要成分的組合物，如占組合物中蛋白質(zhì)的大約50％，大約60％，大約70％，大約80％，大約90％，大約95％或更高。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本說(shuō)明書可以了解對(duì)所述多肽、蛋白或肽的純化程度進(jìn)行定量的各種方法。其中包括例如確定活性級(jí)份的比活性，或通過(guò)SDS/PAGE分析評(píng)估級(jí)份內(nèi)的多肽量。評(píng)估級(jí)份純度的優(yōu)選方法是計(jì)算所述級(jí)份的比活性，將該比活性與原始提取物的比活性進(jìn)行比較，并因此計(jì)算純度，在這里通過(guò)″純化倍數(shù)″評(píng)估。當(dāng)然，用于表示所述活性量的實(shí)際單位取決于選擇用于所述純化的特定測(cè)定技術(shù)，以及所述表達(dá)的多肽、蛋白或肽是否具有可檢測(cè)活性。
各種適用于蛋白純化的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。其中包括，例如，用硫酸銨沉淀，PEG，抗體等或通過(guò)加熱變性然后離心；層析步驟，如離子交換，凝膠過(guò)濾，反向，羥磷灰石和親合層析；等電聚焦；凝膠電泳；和上述方法與其他技術(shù)的組合。正如本領(lǐng)域中所公知的，相信進(jìn)行各個(gè)純化步驟的順序可以改變，或者某些步驟可以省略，并且仍然能得到用于制備大體上純化的多肽、蛋白或肽的合適方法。
沒(méi)有普遍要求所述多肽、蛋白或肽總是以它們的最純的狀態(tài)提供。實(shí)際上，預(yù)計(jì)不太純的產(chǎn)品在某些實(shí)施方案中可以使用。部分純化可以通過(guò)總體使用較少純化步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)使用同一普遍純化方法的不同形式進(jìn)行。例如，可以理解的是，使用HPLC裝置進(jìn)行的陽(yáng)離子交換柱層析得到的純化“-倍數(shù)”一般大于采用低壓力層析系統(tǒng)的相同技術(shù)。在蛋白產(chǎn)物的總回收量方面，或在保持所表達(dá)蛋白的活性方面，具有較低相對(duì)純化程度的方法可能是優(yōu)選的。
已知多肽的遷移可能隨著SDS/PAGE的不同條件而改變，有時(shí)候是顯著改變(Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76425，1977)。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不同電泳條件下，純化的或部分純化的表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子量可以改變。
IV.用于生產(chǎn)本發(fā)明底物的表達(dá)構(gòu)建體在本發(fā)明中，可能必須表達(dá)本發(fā)明的Notch融合蛋白。為了實(shí)現(xiàn)這種表達(dá)，本發(fā)明采用了包括編碼本發(fā)明的Notch融合蛋白的多核苷酸分子的載體，以及用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述多核苷酸分子可以與載體連接，該載體通常包括選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以便在宿主中增殖。在本發(fā)明中使用的表達(dá)構(gòu)建體的這些因子在下文進(jìn)一步詳細(xì)披露。
所述表達(dá)載體包括編碼上文或下文所述給定肽或融合多肽γ-分泌酶底物的DNA，它選擇性地與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列連接，如來(lái)自哺乳動(dòng)物，微生物，病毒，或昆蟲基因的調(diào)控序列。調(diào)控序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，操縱子或增強(qiáng)子，mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的合適的序列。
術(shù)語(yǔ)″表達(dá)載體″，″表達(dá)構(gòu)建體″或″表達(dá)盒″在本說(shuō)明書中可以互換使用，它們表示包括包含編碼基因產(chǎn)物的核酸的任何類型遺傳構(gòu)建體，其中，所述核酸編碼序列的一部分或全部是能夠轉(zhuǎn)錄的。
當(dāng)然，用于表達(dá)本發(fā)明融合多肽的合適表達(dá)載體的選擇取決于要使用的特定宿主細(xì)胞，并且屬于普通技術(shù)人員的技能范圍。合適的表達(dá)載體的例子包括pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(Pharmacia Biotech)。用于在本發(fā)明中表達(dá)的優(yōu)選載體是pcDNA3.1-Hygro(Invitrogen)。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括來(lái)自病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。可用于本發(fā)明的常用的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列包括，但不局限于來(lái)自人巨細(xì)胞病毒(CMV)，腺病毒2，多瘤病毒，和猿猴病毒40(SV40)的序列。用于構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的方法，被披露在例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3280，1983)；Cosman等(Mol.Immunol.23935，1986)；Cosman等(Nature 312768，1984)；BP-A-0367566；和WO 91/18982中。
所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼本發(fā)明特定Notch融合蛋白的核酸區(qū)。用于構(gòu)建所述表達(dá)載體的編碼區(qū)應(yīng)當(dāng)至少編碼本文所披露的所述融合蛋白的γ-分泌酶切割，當(dāng)然，預(yù)計(jì)可以編碼更大的多肽，只要所產(chǎn)生的肽之一包括可以通過(guò)γ-分泌酶切割的γ-分泌酶切割位點(diǎn)1731/1732和1743/1744就行。
在本發(fā)明的某些方面，所述表達(dá)構(gòu)建體還可以包括它可用于檢測(cè)所述肽或多肽表達(dá)的選擇標(biāo)記。通常，藥物選擇標(biāo)記的使用有助于轉(zhuǎn)化體的克隆和篩選。例如，新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，DHFR，zeocin和組胺醇。另外，可以采用諸如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)(真核的)，β-半乳糖苷酶，螢光素酶，或氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(CAT)(原核的)之類的酶。還可以使用免疫學(xué)標(biāo)記，例如，可以使用表位標(biāo)記，如FLAG系統(tǒng)(IBI，New Haven，CT)，HA和6xHis系統(tǒng)(Qiagen，Chatsworth，CA)。另外，還可以使用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)，或麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB，Beverley，MA)。相信所使用的選擇標(biāo)記并不重要，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)就行。選擇標(biāo)記的其他例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？捎糜诒景l(fā)明的特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記是新霉素抗性或GFP標(biāo)記。
表達(dá)要求在所述載體上提供合適的信號(hào)。本部分包括有關(guān)各種調(diào)控元件的討論，如來(lái)自病毒和哺乳動(dòng)物來(lái)源的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，它們可用于驅(qū)動(dòng)感興趣的核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)。還對(duì)被設(shè)計(jì)成優(yōu)化在宿主細(xì)胞中的信使RNA穩(wěn)定性和翻譯能力的元件作了說(shuō)明。還提供了將多種顯性藥物選擇標(biāo)記用于建立永久性的、表達(dá)所述產(chǎn)物的穩(wěn)定細(xì)胞克隆的條件，以及將所述藥物選擇標(biāo)記與突變表型的表達(dá)聯(lián)系在一起的因素。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼給定肽的核酸或編碼選擇標(biāo)記的核酸受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制?！皢?dòng)子”表示由細(xì)胞的合成器官，或?qū)氲暮铣善鞴僮R(shí)別的DNA序列，它是啟動(dòng)基因的特異性轉(zhuǎn)錄所必需的。
當(dāng)所述調(diào)控序列與編碼所述Notch融合蛋白的DNA在功能上相關(guān)時(shí)，這些核苷酸序列就是可操作地連接的。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列能指導(dǎo)給定DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動(dòng)子核苷酸序列就是與該DNA序列可操作地連接的。類似的，短語(yǔ)“受轉(zhuǎn)錄控制”表示所述啟動(dòng)子相對(duì)于所述核酸處于正確的位置和方向上，可以控制RNA聚合酶啟動(dòng)和所述基因的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子在本文中被用于表示圍繞在RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)周圍成簇的一組轉(zhuǎn)錄控制組件。有關(guān)啟動(dòng)子如何組織的大部分想法來(lái)自對(duì)若干病毒啟動(dòng)子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子。得到了最新研究工作支持的上述研究業(yè)已證實(shí)了啟動(dòng)子是由離散的功能性組件組成的，各組件各自由DNA的大約7-20bp組成，并且包括轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制劑蛋白的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。
在每一個(gè)啟動(dòng)子上的至少一個(gè)組件起著定位RNA合成的起始位點(diǎn)的作用，其中最著名的例子是TATA框，不過(guò)在缺少TATA框的某些啟動(dòng)子中，如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40晚期基因的啟動(dòng)子中，覆蓋所述起始位點(diǎn)的離散因子本身有助于固定起始位置。
其他啟動(dòng)子因子能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些因子位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域內(nèi)，不過(guò)，最近業(yè)已證實(shí)了多種啟動(dòng)子同樣包括位于所述起始位點(diǎn)下游的功能性元件。啟動(dòng)子因子之間的距離通常是可變的，從而在所述啟動(dòng)子倒轉(zhuǎn)或彼此相對(duì)移動(dòng)時(shí)仍保持啟動(dòng)子功能。在tk啟動(dòng)子中，在活性開(kāi)始減弱之前，啟動(dòng)子因子之間的距離可增加到50bp。根據(jù)所述啟動(dòng)子，似乎單個(gè)因子能夠協(xié)同地或獨(dú)立地起作用，以便激活轉(zhuǎn)錄。用于控制感興趣的核酸序列表達(dá)的特定啟動(dòng)子據(jù)信是不重要的，只要它能指導(dǎo)所述核酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)就行。因此，在靶定人細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選將所述核酸編碼區(qū)定位在與能夠在人類細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子相鄰之處并受該啟動(dòng)子的控制。一般來(lái)說(shuō)，這樣的啟動(dòng)子可能包括人或病毒啟動(dòng)子。
在各種實(shí)施方案中，人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子，勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)，β-肌動(dòng)蛋白，大鼠胰島素啟動(dòng)子，磷酸甘油激酶啟動(dòng)子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子，所有這些啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并可以方便地獲得的啟動(dòng)子，可將其用于感興趣的編碼序列的高水平表達(dá)。還涉及將本領(lǐng)域所公知的其他病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子用于實(shí)現(xiàn)感興趣的編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平對(duì)于特定目的來(lái)說(shuō)是足夠的即可。通過(guò)采用具有已知特性的啟動(dòng)子，可以優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化之后感興趣的蛋白的表達(dá)水平和形式。
根據(jù)特殊生理學(xué)或合成信號(hào)調(diào)控的啟動(dòng)子的選擇可以進(jìn)行所述基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型表達(dá)?？梢詫⑷舾烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)用于病毒載體的生產(chǎn)。一種這樣的系統(tǒng)是蛻皮激素系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，它被設(shè)計(jì)成能夠?qū)崿F(xiàn)感興趣的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的受控制表達(dá)。它包括嚴(yán)格調(diào)控的表達(dá)機(jī)制，從而實(shí)際上沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)，但是具有超過(guò)200倍的可誘導(dǎo)性。
另一種有用的誘導(dǎo)系統(tǒng)是Tet-OffTM或Tet-OnTM系統(tǒng)(Clontech，Palo Alto，CA)，它們最初是由Gossen和Bujard開(kāi)發(fā)的(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.15；89(12)5547-51，1992；Gossen等，Science，268(5218)1766-9，1995)。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CMV立即早期啟動(dòng)子常常被用來(lái)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活。在需要轉(zhuǎn)基因的較低水平的表達(dá)時(shí)，使用了CMV啟動(dòng)子的較弱的經(jīng)修飾形式。諸如來(lái)自MLV或MMTV的LTRs之類的逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子預(yù)計(jì)可用于本發(fā)明中。可以使用的其他病毒啟動(dòng)子包括SV40，RSV LTR；HIV-1和HIV-2LTR，腺病毒啟動(dòng)子，如來(lái)自E1A，E2A，或MLP區(qū)，AAVLTR，花椰菜花葉病毒，HSV-TK，和禽肉瘤病毒的啟動(dòng)子。
在某些實(shí)施方案中，可調(diào)控的啟動(dòng)子可能是有用的。例如，所述啟動(dòng)子包括激素或細(xì)胞因子可調(diào)控的啟動(dòng)子。激素可調(diào)控的啟動(dòng)子包括MMTV，MT-1，蛻皮激素和RuBisco，以及其他激素調(diào)控的啟動(dòng)子，如對(duì)甲狀腺、腦垂體和腎上腺激素有響應(yīng)的啟動(dòng)子。
可用于本發(fā)明的其他調(diào)控因子是增強(qiáng)子。增強(qiáng)子是能增強(qiáng)從位于同一DNA分子上的遠(yuǎn)處部位的啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄的遺傳學(xué)元件。增強(qiáng)子的組構(gòu)更像啟動(dòng)子，即它由多個(gè)獨(dú)立的因子組成，各自與一種或多種轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的根本差別是可操縱性。增強(qiáng)子區(qū)作為整體必須能夠在遠(yuǎn)處刺激轉(zhuǎn)錄；對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)或它的組成元件來(lái)說(shuō)這一特征不是必須的。另一方面，啟動(dòng)子必須具有能夠在特定位點(diǎn)并且沿特定方向指導(dǎo)RNA合成啟動(dòng)的一個(gè)或多個(gè)元件，而增強(qiáng)子缺少這樣的特異性。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子通常是重疊的并且是毗鄰的，通常似乎具有非常類似的組件組構(gòu)?？捎糜诒景l(fā)明的增強(qiáng)子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且取決于所采用的特定的表達(dá)系統(tǒng)(Scharf D等，(1994)Results ProblCell Differ 20125-62；Bittner等，(1987)Methods in Enzymol.153516-544)。
當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體采用cDNA插入片段時(shí)，人們通常希望采用聚腺苷酸化信號(hào)序列，以便實(shí)現(xiàn)所述基因轉(zhuǎn)錄物的正確聚腺苷酸化。由所選擇的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物種的細(xì)胞識(shí)別的任何聚腺苷酸化信號(hào)序列都適合實(shí)施本發(fā)明，如人或牛生長(zhǎng)激素和SV40聚腺苷酸化信號(hào)。
可以作為所述表達(dá)盒元件的還有終止子。這些元件可以提高信息水平，并且使得從所述表達(dá)盒通讀到其他序列中的可能性減至最小。主要使用的終止區(qū)可根據(jù)方便性而選擇，因?yàn)橛糜谥T如本發(fā)明的目的終止區(qū)似乎是相對(duì)可互換的。終止區(qū)可以是所述轉(zhuǎn)錄起始的天然區(qū)，可以是感興趣的DNA序列的天然區(qū)，或者可以來(lái)自其他來(lái)源。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(I RES)因子用于產(chǎn)生多基因，或多順?lè)醋有畔?。IRES因子能夠繞過(guò)5′甲基化Cap依賴性翻譯的核糖體掃描模式，并且在內(nèi)部位點(diǎn)開(kāi)始翻譯(Pelletier和Sonenberg，Nature，334320-325，1988)。業(yè)已披露了來(lái)自小核糖核酸病毒家族的兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎)的IRES因子(Pelletier和Sonenberg，1988同上)以及來(lái)自哺乳動(dòng)物信息的IRES(Macejak和Sarnow，Nature，35390-94，1991)。IRES因子可以與異源開(kāi)放讀框連接。多個(gè)開(kāi)放讀框可以一起轉(zhuǎn)錄，各自通過(guò)I RES隔開(kāi)，產(chǎn)生多順?lè)醋有畔?。通過(guò)IRES因子，每一個(gè)開(kāi)放讀框都是核糖體可以接觸的，以便有效翻譯。用一個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄一種信息，能夠有效表達(dá)多個(gè)基因。
任何異源開(kāi)放讀框都可以與IRES元件連接。其中包括分泌蛋白的基因，由獨(dú)立基因編碼的多亞基蛋白，細(xì)胞內(nèi)或膜結(jié)合蛋白以及選擇標(biāo)記。這樣，若干蛋白的表達(dá)可以用一種構(gòu)建體和一種選擇標(biāo)記而同時(shí)通過(guò)工程方法在細(xì)胞中進(jìn)行。
V.將所述底物用于γ-分泌酶測(cè)定在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)γ-分泌酶的活性和/或功能的測(cè)定法，更具體地講是γ-分泌酶活性和/或γ-分泌酶功能。所述測(cè)定法涉及在溶液中溫育γ-分泌酶復(fù)合物(或純化的多肽)與本發(fā)明的合適的底物，利用所述Notch融合蛋白的切割作為γ-分泌酶蛋白水解活性的度量。
A.測(cè)定方案在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于鑒定能調(diào)節(jié)人γ-分泌酶活性的制劑的方法。所述測(cè)定的一個(gè)方面是在有和沒(méi)有潛在的調(diào)節(jié)化合物或藥劑的條件下監(jiān)測(cè)γ-分泌酶在ε切割位點(diǎn)1743/1744上的Notch-切割活性。例如，用于測(cè)定Notch-切割的這種方法通常包括以下步驟(a)使本發(fā)明的任意的Notch/NusA融合蛋白在體外與包含γ-分泌酶活性的組合物接觸；(b)測(cè)定所述γ-分泌酶對(duì)所述Notch/NusA融合蛋白在γ-分泌酶切割位點(diǎn)處的切割。
包含γ-分泌酶活性的組合物通常可以是包含γ-分泌酶活性的任何分離的組合物。因此，所述組合物可以是從細(xì)胞中分離的膜級(jí)份(具有γ-分泌酶活性的天然細(xì)胞，或業(yè)已工程改造成能表達(dá)所述活性的重組宿主細(xì)胞)。另外，組合物可以包括分離的和純化的γ-分泌酶蛋白，其基本上不含其他蛋白。
為了鑒定γ-分泌酶的Notch切割活性的調(diào)節(jié)劑，在有和沒(méi)有候選調(diào)節(jié)劑的條件下實(shí)施上述步驟(a)和(b)，并且通過(guò)將在有所述測(cè)試制劑存在時(shí)γ-分泌酶的Notch切割活性和在不存在所述測(cè)試制劑時(shí)的活性相比較，鑒定調(diào)節(jié)γ-分泌酶的這種切割的制劑，從而評(píng)估調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)活性。在存在所述候選調(diào)節(jié)劑的條件下Notch切割的量或程度的任何改變是在存在所述測(cè)試制劑的條件下γ-分泌酶活性改變的指征，鑒定出作為所述γ-分泌酶活性的調(diào)節(jié)劑的制劑。
能導(dǎo)致相對(duì)所述對(duì)照(非測(cè)試制劑)切割增強(qiáng)的制劑評(píng)判為γ-分泌酶蛋白質(zhì)分解活性的激動(dòng)劑或促進(jìn)劑，而導(dǎo)致在Aβ1-40和/或Aβ1-42處的切割減弱的制劑評(píng)判為抑制劑。γ-分泌酶的抑制劑具有特殊價(jià)值，因?yàn)棣?分泌酶活性的抑制劑具有用于治療和預(yù)防AD或它的癥狀或發(fā)展的治療性和預(yù)防性作用。
由于需要發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的融合蛋白的切割相比能夠優(yōu)先抑制γ-分泌酶介導(dǎo)的APP或CT-100切割的測(cè)試化合物，可以在使用本發(fā)明的測(cè)定同時(shí)或之前對(duì)測(cè)試化合物進(jìn)行評(píng)估，以便確定它們調(diào)節(jié)APP切割的能力。測(cè)定γ-分泌酶介導(dǎo)的APP或CT-100切割的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，WO/01/83811披露了可用于測(cè)定APP或CT-100切割的底物和體外測(cè)定方法。WO/01/83811披露了包含M末端Met(M)，APP597-695和FLAG標(biāo)記的γ-分泌酶底物，以及用于它的切割和切割產(chǎn)物檢測(cè)的方法和條件(M-Aβ40和M-Aβ40)。
能夠抑制在Aβ1-40和/或Aβ1-42處的APP/CT-100切割活性、而不能抑制所測(cè)定的γ-分泌酶的Notch切割活性的抑制劑是最優(yōu)選的。
所述γ-分泌酶可以是純化的γ-分泌酶多肽或它的復(fù)合物或生物活性片段，類似物，或變體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述γ-分泌酶來(lái)自展示γ-分泌酶活性的細(xì)胞的膜級(jí)份。所述膜級(jí)份優(yōu)選包括γ-分泌酶復(fù)合物所需要的所有成分。還可將人γ-分泌酶的非人直向同系物用于測(cè)定法中。
將本發(fā)明的測(cè)定法設(shè)計(jì)成用γ-分泌酶多肽在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。例如，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，所述接觸步驟可以通過(guò)將γ-分泌酶或含有所述酶的膜級(jí)份與本發(fā)明的肽或蛋白底物在有或沒(méi)有測(cè)試制劑的條件下相混合而進(jìn)行。為了獲得最佳結(jié)果，所述酶和γ-分泌酶底物優(yōu)選是實(shí)質(zhì)上純化的，以特定的和受控制的量混合，并且在能使酶促活性最優(yōu)化和/或模擬生理學(xué)條件的合適的緩沖液中混合。
所述測(cè)定步驟可以涉及N-末端片段，C-末端片段或這兩者的測(cè)定，或者可以涉及裂解的其他參數(shù)指標(biāo)的測(cè)定。例如，所述Notch-型或其他γ-分泌酶底物可以包含淬滅標(biāo)記，它只有在發(fā)生裂解而使所述標(biāo)記與淬火部分分離開(kāi)之后才變得更容易檢測(cè)。另外，所述Notch-型或其他γ-分泌酶底物可以在N-末端或C-末端固定在固體支持物上。在這種方案中，可以通過(guò)從固體支持物上釋放裂解片段而測(cè)定所述裂解。所述釋放可以通過(guò)介質(zhì)中標(biāo)記的增加，或所述固體支持物上結(jié)合的標(biāo)記的減少來(lái)衡量。另外，所述釋放可以通過(guò)所釋放肽的定量捕獲來(lái)測(cè)定(例如，使用抗體)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述切割的Notch蛋白是使用對(duì)Val-1744特異的抗體檢測(cè)的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述切割的Notch蛋白是使用根據(jù)抗-Val 1744抗體和抗-Flag抗體開(kāi)發(fā)的ELISA檢測(cè)的。將抗-Val 1744抗體用于檢測(cè)所述切割的一種片段，而將抗-Flag抗體用于檢測(cè)所述Notch蛋白的片段(C-末端)，它是通過(guò)γ-分泌酶的作用產(chǎn)生的。這種測(cè)定方法在實(shí)施例中更詳細(xì)地披露。
當(dāng)然，上述測(cè)定只是說(shuō)明性的，并且還可以使用其他測(cè)定方法。例如，上述測(cè)定可以以如下方式建立。用BSA封閉384孔微量滴定板，將要測(cè)定的γ-分泌酶和50μM的γ-分泌酶抑制劑化合物溫育1小時(shí)，并且通過(guò)添加Notch/NusA融合蛋白底物啟動(dòng)所述反應(yīng)。在最終的測(cè)定條件下，體積為30μl/孔；50μM化合物；15ng酶/孔；250nM底物；5％DMSO和0.001％TWEEN-20。所述測(cè)定在室溫下培養(yǎng)過(guò)夜，并且通過(guò)添加Tris-HCl，pH 8.3終止反應(yīng)。取出包含6.25皮摩爾底物的等分樣品，并且將切割和/或未切割的底物俘獲在包被了鏈霉抗生物素蛋白的平板上。洗滌所述平板3次，并且添加緩沖液。通過(guò)在LJL分析儀(Ex485/Em530)上讀出由Oregon綠發(fā)出的熒光來(lái)監(jiān)測(cè)所述俘獲測(cè)定。
本發(fā)明可以使用的另一種測(cè)定方法是熒光偏振測(cè)定法。熒光偏振測(cè)定法是一種靈敏的，便捷的和非破壞性的方法，可用于監(jiān)測(cè)候選制劑對(duì)本發(fā)明γ-分泌酶復(fù)合物的作用?？蓪⑺糜诒O(jiān)測(cè)所述底物與γ-分泌酶的相互作用。在受控制的條件下，熒光偏振測(cè)定能夠揭示熒光分子在溶液中的“分子抖動(dòng)”程度，例如，預(yù)計(jì)具有緊湊分子空間的小分子會(huì)快速地抖動(dòng)。如果用偏振光照射的話，所述分子在溶液中的快速運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致光線的充分去偏振化，并且會(huì)產(chǎn)生“低”偏振值的結(jié)果。在相同條件下，大分子或大復(fù)合物的大分子空間可以延緩分子旋轉(zhuǎn)(抖動(dòng))過(guò)程。結(jié)果會(huì)導(dǎo)致平面偏振光的較低的偏振化，并且可以測(cè)定較高的偏振值。
通過(guò)用熒光探針標(biāo)記小的配體，可以測(cè)定由于配體與另一種系統(tǒng)成分相互作用導(dǎo)致的熒光偏振的改變。這種方法可用于測(cè)定酶(γ-分泌酶)和熒光酶底物之間的相互作用強(qiáng)度。
在典型的熒光偏振測(cè)定中，在預(yù)先封閉的低親和力黑色平板上，將酶和抑制/調(diào)節(jié)化合物溫育30分鐘，通過(guò)添加150nM底物(例如，本發(fā)明的熒光標(biāo)記的Notch/NusA融合蛋白)使最終體積為30μl/孔而啟動(dòng)反應(yīng)。然后在室溫下溫育所述平板15分鐘，并且在LJL Acquest(Ex485/Em 530)上測(cè)定熒光偏振。
本發(fā)明的一個(gè)方面可用于分離并且表征本發(fā)明所涉及的γ-分泌酶。該方面涉及用于測(cè)定與所述酶的活性位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)相結(jié)合的化合物的結(jié)合測(cè)定方法。為了進(jìn)行所述測(cè)定，可以使用本發(fā)明的Notch底物的不可水解衍生物。例如，在待切割鍵的接合處存在statine衍生物會(huì)使得本發(fā)明的Notch在所述切割位點(diǎn)處不能水解。還可以通過(guò)添加合適的熒光標(biāo)記而進(jìn)一步修飾所述底物，例如添加BODIPY FL，以便有利于檢測(cè)。
本發(fā)明的底物可以用熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，并且用于開(kāi)發(fā)γ-分泌酶的熒光偏振結(jié)合測(cè)定方法。通過(guò)測(cè)定由于用所述酶滴定所述底物而導(dǎo)致的熒光偏振改變，測(cè)定所述酶和底物之間相互作用的平衡解離常數(shù)(KD)。
為了測(cè)定本發(fā)明的底物與γ-分泌酶的相互作用的KD，可以將各種量的γ-分泌酶與3.1nM的熒光底物合并，并且在室溫下培養(yǎng)3小時(shí)。在培養(yǎng)之后，用LJL分析儀(96孔形式)或PanVera Beacon(單樣品池形式)測(cè)定熒光偏振。一種例示性的測(cè)定是在25mM乙酸鈉，20％甘油，pH 4.75中進(jìn)行的。通過(guò)將偏振值標(biāo)在縱軸上、并且將酶的濃度標(biāo)在水平軸上而獲得的數(shù)據(jù)的圖解曲線為測(cè)定所述酶與底物的相互作用的KD提供了結(jié)合等溫線?？梢岳靡韵玛P(guān)系式分析所述數(shù)據(jù)Px＝PF+(PB-PF)*[E]/(KD+[E])，其中，P＝極化值，x＝樣品，F(xiàn)＝游離的抑制劑，B＝結(jié)合的抑制劑，E＝γ-分泌酶(Fluorescence PolarizationApplications Guide，1998；PanVera，Madison，WI)，以便獲得所述KD?？梢詫⑦@種測(cè)定方法用于篩選能結(jié)合所述酶的活性位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)的化合物。
應(yīng)當(dāng)理解的是，在有或沒(méi)有測(cè)試制劑的條件下進(jìn)行的活性測(cè)定，可以平行或以任何順序依次進(jìn)行。另外，一旦獲得了特定反應(yīng)條件下的酶促活性的可靠基線水平，可能就沒(méi)有必要針對(duì)每一種測(cè)試試劑平行地重復(fù)所述對(duì)照測(cè)定(即在沒(méi)有測(cè)試制劑的條件下測(cè)定切割)。在沒(méi)有抑制劑的條件下獲得的有關(guān)γ-分泌酶對(duì)特定底物(例如，本發(fā)明的Notch組合物或來(lái)自APP的組合物)的酶促活性的知識(shí)可以用作實(shí)施所述比較步驟的基礎(chǔ)。
B.候選物質(zhì)在本文中，術(shù)語(yǔ)″候選物質(zhì)″或″測(cè)試物質(zhì)″表示能夠調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性優(yōu)選人γ-分泌酶活性的任何分子。所述候選物質(zhì)可以是蛋白或它的片段，小分子抑制劑或者甚至是核酸分子。很可能通過(guò)采用篩選測(cè)定方法鑒定的最有用的藥用化合物是通過(guò)篩選大的化合物文庫(kù)鑒定的或者在結(jié)構(gòu)上與APP加工，Notch加工或這兩者的其他已知調(diào)節(jié)劑在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物。例如，被收作本文參考的美國(guó)專利號(hào)6,448,229披露了特定類型的化合物，它能抑制γ-分泌酶，而又不影響Notch信號(hào)傳導(dǎo)，因此可用于治療或預(yù)防AD。諸如披露于美國(guó)專利號(hào)6,448,229中的化合物可以采用本發(fā)明的測(cè)定方法驗(yàn)證。另外，所述化合物可以用作合理化藥物設(shè)計(jì)的原材料，用于鑒定可用于本發(fā)明的其他候選調(diào)節(jié)劑?？捎糜谶@種合理化藥物設(shè)計(jì)的其他抑制劑包括，但不局限于DAPT(PHA-568638)和葑胺(PHA-512088)。
所述候選物質(zhì)可以包括天然化合物的片段或部分或者可以以原本無(wú)活性的已知化合物的活性組合形式出現(xiàn)。不過(guò)，在人體或動(dòng)物模型中測(cè)試所述化合物之前，有必要測(cè)試多種候選物，以便測(cè)定哪一種更有潛力。
因此，所述候選物質(zhì)可以包括天然存在的化合物的片段或部分，或者可以以原本無(wú)活性的已知化合物的活性組合形式出現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了用于鑒定能優(yōu)先于對(duì)Notch進(jìn)行刺激或抑制而刺激或抑制γ-分泌酶-介導(dǎo)的細(xì)胞APP加工的藥劑的篩選測(cè)定方法。有人提出從天然來(lái)源，如動(dòng)物，細(xì)菌，真菌，植物來(lái)源，包括樹(shù)葉和樹(shù)皮，以及海洋樣品中分離的化合物可以作為候選物測(cè)定分析潛在有用的藥用制劑的存在情況。
應(yīng)當(dāng)理解的是，要篩選的藥用制劑還可以源于化學(xué)組合物或人造化合物或用所述物質(zhì)合成。因此，可以理解的是，通過(guò)本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑可以是多肽，多核苷酸，小分子抑制劑或任何其他無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物，它們可以是通過(guò)合理化藥物設(shè)計(jì)用γ-分泌酶活性和/或APP加工的已知刺激劑或抑制劑作原材料設(shè)計(jì)的。
所述候選篩選測(cè)定法可容易建立和實(shí)施。因此，在調(diào)節(jié)劑測(cè)定中，在獲得包含功能性γ-分泌酶的細(xì)胞膜級(jí)份(例如，包括溶解化γ-分泌酶復(fù)合物的細(xì)胞膜級(jí)份)之后，可以將候選物質(zhì)與這種γ-分泌酶組合物在存在本發(fā)明的新型底物的情況下，在允許可測(cè)定的γ-分泌酶活性(所述活性是因切割所述底物而產(chǎn)生的)發(fā)揮作用的條件下進(jìn)行混合。這樣，人們可以在缺乏所述候選物質(zhì)時(shí)測(cè)定候選物質(zhì)刺激γ-分泌酶的活性的能力。同樣，在獲得表達(dá)功能性γ-分泌酶的細(xì)胞膜級(jí)份之后進(jìn)行的抑制劑測(cè)定中，將所述候選物質(zhì)與所述級(jí)份混合。這樣，可以檢測(cè)所述候選性抑制物質(zhì)減弱、消除或減輕由γ-分泌酶介導(dǎo)的生物學(xué)影響的能力。
在某些場(chǎng)合下，物質(zhì)的“有效量”是能可再現(xiàn)地改變給定CT-100裂解性γ-分泌酶活性或APP加工的用量。所述有效量是，與在沒(méi)有所述候選物質(zhì)的情況下觀察到的裂解進(jìn)行比較，能改變APP CT-100的裂解程度或量，但不能改變本發(fā)明的Notch融合蛋白在γ-分泌酶裂解位點(diǎn)處的裂解的用量。特別適合用作治療劑和/或用于其他表征的化合物是與Notch裂解相比能優(yōu)先抑制γ-分泌酶對(duì)APP的裂解的化合物?！皟?yōu)先抑制”表示與Notch相比，所述制劑對(duì)APP的γ-分泌酶介導(dǎo)的裂解具有更高的抑制效果。盡管優(yōu)選的是所述制劑是對(duì)所述Notch裂解沒(méi)有抑制作用的制劑，但對(duì)Notch裂解的某些抑制可能是可以接受的，只要它弱于由野生型γ-分泌酶引起的APP裂解就行。
采用本發(fā)明的新型γ-分泌酶底物的測(cè)定方法適用于多種高處理量篩選(HTS)方法(有關(guān)綜述參見(jiàn)Jayawickreme和Kost，Curr.Opin.Biotechnol.8629-634，1997)。還涉及自動(dòng)化和小型化HTS測(cè)定，例如以下文獻(xiàn)中所述的那些Houston和Banks，Curr.Opin.Biotechnol.8734-740，1997。
存在用于鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的多種不同的文庫(kù)，包括化學(xué)文庫(kù)，天然產(chǎn)品文庫(kù)和由隨機(jī)的或設(shè)計(jì)的肽，寡核苷酸或有機(jī)分子組成的組合文庫(kù)?；瘜W(xué)文庫(kù)由已知化合物的結(jié)構(gòu)類似物或通過(guò)天然產(chǎn)品篩選或根據(jù)篩選潛在治療目標(biāo)鑒定為命中或前導(dǎo)體的化合物組成。天然產(chǎn)品文庫(kù)是來(lái)自微生物，動(dòng)物，植物，昆蟲或海洋生物的產(chǎn)品的總稱，可將其用于制備篩選混合物，例如，通過(guò)對(duì)來(lái)自土壤，植物或海洋生物的培養(yǎng)液的發(fā)酵和提取。天然產(chǎn)品文庫(kù)包括多肽，非核糖體肽或它的非天然存在的變體。有關(guān)綜述參見(jiàn)Science 28263-68，1998。
組合文庫(kù)是以混合物形式由大量的肽，寡核苷酸或有機(jī)化合物組成。它們可以相對(duì)簡(jiǎn)單地通過(guò)傳統(tǒng)自動(dòng)化合成方法，PCR克隆或其他合成方法制備。特別感興趣的是包括肽，蛋白，肽模擬物，多平行合成組合，重組和多肽文庫(kù)的文庫(kù)。有關(guān)組合文庫(kù)和由它制備的文庫(kù)的綜述參見(jiàn)Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8701-707，1997。然后可以優(yōu)化通過(guò)使用所披露的各種文庫(kù)鑒定的調(diào)節(jié)劑，以便通過(guò)諸如合理化藥物設(shè)計(jì)的方法調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性。
當(dāng)然，可以理解的是，本發(fā)明的所有篩選方法本身是可以使用的，盡管事實(shí)上可能不能發(fā)現(xiàn)有效的優(yōu)選物。本發(fā)明提供了用于篩選所述候選物的方法，而不僅僅是發(fā)現(xiàn)它們的方法。
C.體內(nèi)測(cè)定本發(fā)明還涉及各種動(dòng)物模型的使用。一旦在上文所述的體外環(huán)境中篩選出了所述調(diào)節(jié)劑，則可以將APP加工和/或AD的任何非人模型用于確定所述調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)作用。這為在正常表達(dá)γ-分泌酶的完整動(dòng)物系統(tǒng)中檢查γ-分泌酶的功能提供了極好的機(jī)會(huì)。
用業(yè)已被鑒定為γ-分泌酶活性調(diào)節(jié)劑的測(cè)試化合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的處理涉及以合適的形式給所述動(dòng)物施用所述化合物。施用可以通過(guò)可用于臨床或非臨床目的的任何途徑進(jìn)行，包括，但不局限于口腔，鼻腔，面頰，直腸，陰道或局部施用。另外，施用還可以通過(guò)氣管內(nèi)滴注，支氣管滴注，真皮內(nèi)注射，皮下注射，肌內(nèi)注射，腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行。特別涉及到系統(tǒng)性靜脈內(nèi)注射，通過(guò)血液的區(qū)域性施用，腦脊液(CSF)或淋巴供應(yīng)和腫瘤內(nèi)注射。
在體內(nèi)測(cè)定化合物的有效性可能涉及到多種不同的指標(biāo)。這些指標(biāo)包括，但不局限于，存活率，提高了的活性水平，以及改善了的食物攝取。其他評(píng)估方法包括病理學(xué)檢查，特別是大腦組織的檢查，以便尋求改變了的γ-分泌酶活性的跡象，如減弱了的淀粉樣β或淀粉樣β斑的產(chǎn)生和減輕了的大腦萎縮。
D.藥品生產(chǎn)本發(fā)明的測(cè)定方法能鑒定代表了用于治療以異常水平的γ-分泌酶活性為特征的疾病(包括AD在內(nèi))的候選治療劑的γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑。因此，在鑒定調(diào)節(jié)劑之后，本發(fā)明的方法可選地包括生產(chǎn)/合成所述制劑的其他步驟，以及使用可以藥用的稀釋劑，佐劑或載體將所述制劑制備成組合物的步驟。下面將更詳細(xì)地披露藥物組合物。
VI.藥物組合物通過(guò)本發(fā)明鑒定的Notch加工、APP加工和/或γ-分泌酶切割的調(diào)節(jié)劑可最終制備成藥物組合物，即適合體內(nèi)使用的形式。一般地，必須制備基本上不含熱源以及有可能對(duì)人或動(dòng)物有害的其他雜質(zhì)的組合物。
人們通常希望采用合適的鹽和緩沖液使得所鑒定的調(diào)節(jié)劑組合物穩(wěn)定，并且使得它們可以被靶細(xì)胞吸收。短語(yǔ)“藥物學(xué)或藥理學(xué)可接受的”表示在給動(dòng)物或人施用時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不利的，過(guò)敏的，或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。在本文中，″可以藥用的載體″包括任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣劑，抗細(xì)菌和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等。將所述介質(zhì)和制劑用于藥物學(xué)活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所熟知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或制劑與通過(guò)本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑不相容，否則的話都可將其用于治療組合物中。還可以將補(bǔ)充性活性成分添加到所述組合物中。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑組合物包括典型的藥用制劑。本發(fā)明組合物的服用可以通過(guò)任何常規(guī)途徑進(jìn)行，只要目標(biāo)組織可以通過(guò)所述途徑獲得該組合物就行?？梢酝ㄟ^(guò)任何常規(guī)方法將所述藥物組合物導(dǎo)入所述對(duì)象體內(nèi)，例如通過(guò)靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，肌內(nèi)，乳房?jī)?nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，眼內(nèi)，眼球后，肺內(nèi)(例如，期限釋放)；通過(guò)口腔，舌下，鼻腔，肛門，陰道，或經(jīng)真皮投遞，或在特定部位通過(guò)外科手術(shù)植入，例如包埋在脾被膜，大腦，或角膜內(nèi)。所述治療可以包括在一定時(shí)間內(nèi)的單一劑量或多個(gè)劑量。
用本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑化合物可以制備成以游離堿或可以藥用的鹽的溶解在水中的溶液形式施用，并可以適當(dāng)?shù)嘏c諸如羥丙基纖維素的表面活性劑混合。還可以用甘油，液體聚乙二醇，以及它們的混合物和在油中制備分散液。在儲(chǔ)存和使用的普通條件下，所述制劑包含用于抑制微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
適合注射使用的藥用形式包括無(wú)菌水溶液或分散液，以及無(wú)菌粉末，用于無(wú)菌注射溶液或分散液的臨時(shí)制備。在所有情況下，所述形式必須是無(wú)菌的，并且必須流動(dòng)性足夠強(qiáng)，從而便于以可注射形式存在。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下，它必須是穩(wěn)定的，并且必須能防止諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，聚丙二醇，和液體聚乙二醇等)，它們的合適混合物，以及植物油。可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，通過(guò)使用諸如卵磷脂的包衣劑，對(duì)于分散液來(lái)說(shuō)保持需要的粒度，以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。微生物作用的抑制可以通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑實(shí)現(xiàn)，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯酚，山梨酸，和硫柳汞等。在很多情形下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長(zhǎng)時(shí)間吸收可以通過(guò)在所述組合物中使用延緩吸收的試劑而實(shí)現(xiàn)，例如，單硬脂酸鋁和明膠。
無(wú)菌注射溶液可通過(guò)以需要的用量將活性化合物摻入合適的溶劑中，同時(shí)根據(jù)需要摻入上面所列舉的其他成分，然后進(jìn)行過(guò)濾除菌而制備。一般地，分散體可通過(guò)將各種無(wú)菌的活性成分摻入含有堿性分散介質(zhì)和需要的上文所列舉的其他成分的無(wú)菌媒介物中而制備。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末來(lái)說(shuō)，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由此產(chǎn)生了活性成分和來(lái)自以前無(wú)菌過(guò)濾的溶液的任何其他所需成分的粉末。
在本文中，″可以藥用的載體″包括任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣劑，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延緩劑等。將所述介質(zhì)和藥劑用作藥用活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所熟知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與所述活性成分不相容，否則的話預(yù)計(jì)都可將其用于治療組合物中。還可以將補(bǔ)充性活性成分摻入所述組合物中。
為了口服，可以將通過(guò)本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑與賦形劑混合在一起，并且以不可攝取的漱口水和牙粉形式使用。漱口水可以通過(guò)將活性成分以需要的量摻入諸如硼酸納溶液(Dobell′s溶液)等的合適溶劑中制備?；蛘?，可以將所述活性成分摻入防腐洗液中，其中包括硼酸鈉，甘油和碳酸氫鉀。所述活性成分還可以分散在牙粉中，包括凝膠，糊劑，粉末和漿體。所述活性成分能夠以治療有效量添加到糊狀牙粉中，其中可以包括水，黏合劑，摩擦劑，芳香劑，起泡劑，和濕潤(rùn)劑。
本發(fā)明的組合物能夠以中性或鹽的形式制備。可以藥用的鹽包括酸加成鹽(由所述蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，它可以是與無(wú)機(jī)酸一起形成，例如，鹽酸或磷酸，或與諸如乙酸，草酸，酒石酸，和扁桃酸等的有機(jī)酸一起形成的。由游離的羧基形成的鹽也可以用無(wú)機(jī)堿，例如，氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，以及諸如異丙胺，三甲胺，組氨酸，和普魯卡因等的有機(jī)堿衍生得到。
本發(fā)明的組合物能夠以中性或鹽的形式制備?？梢运幱玫柠}包括酸加成鹽(由所述蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，它可以是與無(wú)機(jī)酸一起形成的，例如鹽酸或磷酸，或與諸如乙酸，草酸，酒石酸，和扁桃酸等的有機(jī)酸一起形成的。由游離的羧基形成的鹽也可以自無(wú)機(jī)堿，例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，以及諸如異丙胺，三甲胺，組氨酸，和普魯卡因等的有機(jī)堿衍生得到。
在制備時(shí)，溶液以與所述劑量配方兼容的形式服用，并且其用量是治療有效的。所述制劑便于以多種劑型施用，如可注射溶液，和藥物釋放膠囊等。對(duì)于以水溶液形式腸胃外服用，例如，如果必要的話，所述溶液應(yīng)當(dāng)是適當(dāng)緩沖過(guò)的，并且首先用足夠的鹽溶液或葡萄糖使所述液體稀釋劑等滲。所述特定水溶液特別適合靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下和腹膜內(nèi)施用。
″單位劑量″被定義為分散在合適載體中的治療組合物的離散量。例如，腸胃外服用可以通過(guò)起始藥團(tuán)進(jìn)行，然后連續(xù)輸液，以便保持藥物制品的治療性循環(huán)水平。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以方便地優(yōu)化有效劑量和服用方案，可通過(guò)良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐和具體患者的臨床癥狀確定。更具體地講，應(yīng)當(dāng)選擇所述劑量，以便減弱，抑制，減輕或消除Aβ-肽的形成，尤其是表現(xiàn)AD的對(duì)象的大腦中的噬斑形成。為實(shí)現(xiàn)這種效果，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠采用AD的動(dòng)物模型(例如，正如在美國(guó)專利號(hào)5,877,399；美國(guó)專利號(hào)5,387,742；美國(guó)專利號(hào)5,811,633中所披露的)，以便優(yōu)化劑量給藥方案，并且預(yù)測(cè)干預(yù)人類對(duì)象中的AD所需要的藥用制劑的相關(guān)用量。
用藥頻率取決于所述藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及服用途徑。最佳藥用制劑可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)服用途徑和需要的劑量確定。例如，參見(jiàn)Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，MackPubl.Co，Easton PA 18042)pp 1435-1712，被收作本文作為參考。所述制劑可能影響所服用藥劑的物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，體內(nèi)釋放速度和體內(nèi)清除速度。根據(jù)服用途徑，可以根據(jù)體重，身體表面積或器官大小計(jì)算合適的劑量。確定合適治療劑量所需要的計(jì)算的進(jìn)一步微調(diào)通常可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)的情況下完成，特別可以參照本文所披露的劑量信息和測(cè)定方法，以及在動(dòng)物或人類臨床試驗(yàn)中所觀察到的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
合適的劑量可以通過(guò)使用已建立的用于結(jié)合相關(guān)劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)確定血液含量的測(cè)定來(lái)確定。最終劑量方案將由主治醫(yī)生確定，其中考慮了能改變藥物作用的因素，例如藥物的比活性，損傷的嚴(yán)重程度以及患者的反應(yīng)性，患者的年齡，狀態(tài)，體重，性別和飲食，任何感染的嚴(yán)重性，給藥時(shí)間和其他臨床因素。隨著研究的進(jìn)行，將會(huì)得到有關(guān)對(duì)于特定疾病和癥狀的合適劑量水平和治療時(shí)間的進(jìn)一步信息。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的藥物組合物和治療方法可用于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，要治療的對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人或其他動(dòng)物。對(duì)于獸用目的來(lái)說(shuō)，對(duì)象包括例如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，包括牛，綿羊，豬，馬和山羊，寵物，如狗和貓，外來(lái)的和/或動(dòng)物園動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和倉(cāng)鼠，以及家禽，如雞，火雞，鴨和鵝。
VI.實(shí)施例采用以下實(shí)施例，是為了說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。不過(guò)，在本說(shuō)明書的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠領(lǐng)會(huì)可以在不超出本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下對(duì)所披露的具體實(shí)施方案進(jìn)行多種改變，并且仍然能獲得相同或相似的結(jié)果。
實(shí)施例1材料和方法本實(shí)施例提供了有關(guān)用于獲得本文所披露的結(jié)果的一般技術(shù)，試劑和測(cè)定法的說(shuō)明。一般性實(shí)驗(yàn)化合物是從Sigma Chemical Co(St.Louis，Mo)購(gòu)買的。pET 43.1a載體來(lái)自Novagen(Madison，WI)，限制酶來(lái)自Invitrogen(Carlsbad，Ca)。寡核苷酸得自Sigma Genosys(The Woodlands，Tx)。Val-1744抗體得自Cell Signaling Technology(Beverly，Ma)購(gòu)買的。PHA/PNU化合物是從Pharmacia compoundcollection(New Jersey，USA)獲得的。
克隆Notch底物將包含小鼠notch-1蛋白的氨基酸N1703-D1860的Notch底物(DNA序列登記號(hào)Z11886)以EcoRI/HindIII插入片段形式克隆到pET 43.1a載體中，與編碼NusA的核酸讀框一致。編碼所述NusA/Notch融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建體具有SEQ ID NOSEQ ID NO1的序列。該構(gòu)建體包含通過(guò)PCR制備的C-末端標(biāo)記和8His標(biāo)記，以便在Notch的氨基酸1860包含延長(zhǎng)部分(DYKDDDDKHHHHHHHH，SEQ ID NO15)。將所述DNA轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)大腸桿菌(Stratagene)，并且用DNA Concert微量制備試劑盒(Gibco/BRL)篩選克隆中正確插入片段的存在。發(fā)現(xiàn)克隆Notch-F6包括SEQ ID NO 1的正確DNA序列。
Notch/NusA融合蛋白的表達(dá)和純化。將用克隆Notch-F6轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB/Amp中，并且在37℃下在振蕩培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，將35ml的過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種2升的LB/Amp。讓所述大腸桿菌在37℃下在振蕩培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)到A600達(dá)到0.4，然后用1mM IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，并且離心。將來(lái)自2升培養(yǎng)物的沉淀以5ml/g沉淀物的用量重新懸浮在含有蛋白酶抑制劑的50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl中，并且用弗氏壓碎器處理3次，以便得到粗制提取物。用2M Tris將所述提取物的pH調(diào)整到8.0，并且以11,000g的速度離心45分鐘。將上清液加樣到4ml用50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，和蛋白酶抑制劑平衡的4ml鎳IMAC層析柱上，并用相同的緩沖液洗滌柱，然后用含有50mM咪唑的緩沖液洗滌。用含有300mM咪唑的緩沖液洗脫NusA-Notch融合蛋白，并且收集0.8ml的級(jí)份，通過(guò)A280和SDS-PAGE進(jìn)行分析。合并含有NusA-Notch的級(jí)份，并且透析到50mM Pipes，pH 7.0，100mM NaCl中。
通過(guò)Western印跡確定Notch的切割。將NusA-Notch融合體(1.7μM)與70μg/ml溶解化的γ-分泌酶一起在37℃下，以總體積為50μl在50mM Pipes，pH 7.0，0.25％CHAPSO中培養(yǎng)過(guò)夜。以不同的濃度添加DAPT(PHA-568638)。通過(guò)添加12.5μl的5×Laemmli緩沖液(Laemmli 1970)終止該反應(yīng)，并且將30μl的混合物在15％SDS-PAGE上電泳。用半干燥印跡裝置(Millipore)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并且用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA封閉2小時(shí)。將Val-1744抗體以1∶1000的稀釋度添加到封閉溶液中，并且溫育1小時(shí)。用PBS/0.5％Tween-20洗滌所述膜3次，然后用抗兔I gG-HRP溫育(以1∶5000的比例稀釋在PBS/0.5％Tween-20中的4％BSA中)。再將所述膜洗滌3次，并且用ECL制劑(Amersham，Piscataway，NewJersey)顯影。
體外Notch切割ELISA。還采用ELISA技術(shù)評(píng)估Notch切割。在建立反應(yīng)之前，用50μl以1∶200的比例稀釋在0.1M NaHCO3，pH 8.2中的Val-1744抗體對(duì)96孔平板的(Costar)一半面積上所需數(shù)量的孔進(jìn)行包被。在4℃下溫育平板過(guò)夜。按以下方式建立所述Notch切割反應(yīng)。將NusA-Notch(0.9μM)與溶解在50mM Pipes，pH 7.0，0.25％CHAPSO中的70μg/ml溶解化γ-分泌酶在37℃下一起溫育過(guò)夜，總體積為25μl。次日，用PBS/0.05％Tween-20洗滌用Val-1744抗體包被的平板3次，并且用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA封閉1小時(shí)。用存在于PBS/0.05％Tween-20中的4％BSA將所述切割反應(yīng)混合物稀釋14倍，并且將50μl的樣品一式三份鋪平板，并且在室溫下培養(yǎng)3-4小時(shí)。用PBS/0.05％Tween-20洗滌平板3次，并且添加50μl以1∶60000的稀釋比例存在于4％BSA/PBS/0.5％Tween-20中的抗-FLAG-HRP抗體(Sigma，St.Louis，Mo)。將該抗體培養(yǎng)45分鐘，并且用PBS/0.5％Tween-20洗滌所述平板3次。將TMB制劑(Kirkegaard & Perry)以1∶1的比例混合，并且將50μl添加到所述孔中。用1小時(shí)時(shí)間顯色，并且添加50μl 1M H3PO4，在SpectraMax Plus平板讀數(shù)儀上在450nm波長(zhǎng)下對(duì)所述平板進(jìn)行讀數(shù)。在改變Notch底物濃度時(shí)，使用了0.11-3.6μM的NusA-Notch。當(dāng)所述酶濃度改變時(shí)，使用了2.1-68μg/ml溶解化γ-分泌酶。
Notch切割的抑制。在添加所述酶之前將抑制劑(1μl)以存在于50％DMSO中的25倍的濃縮液形式添加到所述切割反應(yīng)物中。將空白和無(wú)抑制劑對(duì)照調(diào)整到包括相同的最終DMSO濃度。用GraFit 4.0程序中的4-參數(shù)邏輯模型計(jì)算抑制劑的IC50′s。
實(shí)施例2結(jié)果和討論為了生產(chǎn)可溶性Notch底物，本發(fā)明人在大腸桿菌中制備了多種構(gòu)建體(圖3a)。其中包括caspase前導(dǎo)序列，泛素，N-末端tau，和Nus標(biāo)記的使用。只有用Nus融合體觀察到了可溶性表達(dá)(Wilkinson等，Biol Technology 9443-448，1991)。圖3b表示用于該構(gòu)建體的克隆細(xì)節(jié)。為了便于純化和測(cè)定的進(jìn)行，通過(guò)工程方法將His和FLAG標(biāo)記添加到Notch的C-末端。
當(dāng)所述Nus-標(biāo)記的Notch融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，在SDS-PAGE上觀察到了相當(dāng)于90kDa條帶的所述融合蛋白的高水平表達(dá)(圖4，泳道1)，這是所述融合蛋白的預(yù)期大小。在對(duì)總的裂解液進(jìn)行離心時(shí)，所述融合蛋白保留在可溶性級(jí)份中(圖4，泳道2)。利用鎳作為固定化金屬離子，通過(guò)IMAC從可溶性級(jí)份中純化含有Notch的融合蛋白。圖4(泳道5-9)表示用300mM咪唑從IMAC柱上洗脫的各種級(jí)份。合并這些級(jí)份，透析，然后用作γ-分泌酶切割的底物的來(lái)源。
在所述Notch蛋白上進(jìn)行特異性切割的技術(shù)基于的是Val-1744抗體的特異性(Cell Signaling Technology)。它對(duì)切割的Notch是特異的，并且不會(huì)與未切割的Notch蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。如圖5所示(泳道3)，用對(duì)Val-1744特異的抗體在Western印跡上檢測(cè)切割的Notch蛋白。如泳道1所示，沒(méi)有觀察到與未切割的Notch融合蛋白的交叉反應(yīng)性。另外，Notch蛋白中的這種特異性切割被DAPT(DAPT是γ-分泌酶的眾所周知的強(qiáng)抑制劑)以劑量依賴性方式抑制(Dovey等，J.Neurochem.76173-181，2001)(泳道4-8，圖5)。
為了確定在Notch蛋白上是否存在其他切割，還通過(guò)Western印跡，使用所述C-末端Hag抗體監(jiān)測(cè)了所述切割反應(yīng)。在以上三條免疫反應(yīng)條帶中，只有一種切割產(chǎn)物可以被DAPT抑制?？傊?，以上結(jié)果表明了γ-分泌酶-介導(dǎo)的體外切割似乎導(dǎo)致了在1743/1744位點(diǎn)處的特異性切割，與基于細(xì)胞的研究相吻合，所述研究證實(shí)了由Notch產(chǎn)生了NICD(Kopan等，Proc.Natl.Acad.Sci.931683-1688，1996；Schroeter等，Nature，393382-386，1998)。
以上結(jié)果表明，Notch融合蛋白容易受到γ-分泌酶-介導(dǎo)的特異性切割，這種切割可以通過(guò)高度特異性的Val-1744單克隆抗體在Western印跡上檢測(cè)到。由于Western印跡不是定量的，故難于評(píng)估用于Notch抑制的化合物和比較對(duì)AβELISA的抑制效力。
圖6表示用于開(kāi)發(fā)Notch切割的定量ELISA的策略，以便用基于CT-100的ELISA比較化合物的抑制效力。它是基于采用高度特異性的抗-Val 1744和抗Flag抗體的夾心ELISA的，以便在存在γ-分泌酶的條件下捕獲來(lái)自所述Notch融合蛋白的NICD片段的N-和C-末端。該測(cè)定方法是按照在實(shí)施例1中標(biāo)題為“體外Notch切割ELISA”的部分所披露的方法進(jìn)行的?；旧希谶@種夾心ELISA中，用Val-1744抗體對(duì)所述微量滴定板進(jìn)行包被。同時(shí)，進(jìn)行所述NusA-Notch切割反應(yīng)，其中，將NusA-Notch與γ-分泌酶一起溫育。用緩沖液洗滌用Val-1744抗體包被的平板，并且用BSA封閉。然后將所述切割反應(yīng)混合物添加到微量滴定平板中，并且在室溫下溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。洗滌平板，并且添加抗-FLAG-HRP抗體(Sigma，St.Louis，Mo)，并且再次溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。添加HRP的生色底物TMB制劑(Kirkegaard & Perry)，并且一旦產(chǎn)生了顏色，即在SpectraMax Plus平板讀數(shù)儀上在450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。圖7表示通過(guò)ELISA檢測(cè)的NusA-Notch融合蛋白的切割。在所述ELISA中觀察到了5倍的信噪比。
通過(guò)ELISA，在特定實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)一步表征了溶解化γ-分泌酶對(duì)Notch切割的酶促活性。圖8A中顯示了底物依賴性產(chǎn)物形成。所述反應(yīng)遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)，并且在特定條件下溶解化γ-分泌酶活性對(duì)Notch融合蛋白底物的水解的表觀Km為大約0.7μM。所觀察到的Notch切割活性還與含有γ-分泌酶活性的溶解化膜制劑的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系(圖8B)。
通過(guò)利用在文獻(xiàn)中報(bào)道的這種酶的特異性抑制劑進(jìn)行抑制研究，進(jìn)一步證實(shí)了ELISA中γ-分泌酶-介導(dǎo)的Notch切割。
業(yè)已報(bào)道了被稱為DAPT的γ-分泌酶的有效抑制劑(Dovey等，J.Neurochem.76173-181，2001)。正如在圖9中所示出的，DAPT(PHA-568638)能以劑量依賴性方式抑制Notch切割，IC50＝2.4nM。另一方面，業(yè)已報(bào)道了葑胺磺酰胺(PHA-512088)(Rishton等，J.Med.Chez.432297-2299，2000)能夠在CT-100體外測(cè)定中在低的μM范圍內(nèi)抑制γ-分泌酶活性。如圖9所示，PHA-512088抑制了γ-分泌酶-介導(dǎo)的Notch切割，在特定條件下，在ELISA中IC50為0.7μM。正如所證實(shí)的，在所述測(cè)定中，抑制劑(PHA-568638；PHA-512088)在低的nM至低的μM范圍內(nèi)作用非常良好?？傊陨辖Y(jié)果證實(shí)了由Notch融合蛋白底物產(chǎn)生NICD片段的體外酶促活性是由于γ-分泌酶造成的。
最近，業(yè)已報(bào)道了平行監(jiān)測(cè)APP和Notch切割的基于細(xì)胞的測(cè)定方法(Karlstrom等，J.Biol.Chem.2776763-6766，2002)。不過(guò)，本發(fā)明首次證實(shí)了監(jiān)測(cè)γ-分泌酶的特異性Notch切割(G1743-V1744)的體外定量ELISA。本發(fā)明首次證實(shí)了來(lái)自HeLa細(xì)胞的γ-分泌酶活性能在1743-1744接合處特異性地切割所述Notch蛋白。
在本說(shuō)明書公開(kāi)基礎(chǔ)上，無(wú)須進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)就可以制備并且實(shí)施本文所披露并且要求保護(hù)的所有組合物和/或方法。盡管業(yè)已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不超出本發(fā)明概念，構(gòu)思和范圍的前提下可以對(duì)所述組合物和/或方法進(jìn)行改變，并且可以對(duì)本文所披露方法的步驟或步驟的順序加以改變。更具體地講，應(yīng)當(dāng)理解的是，在化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些藥劑可以取代本文所披露的藥劑，同時(shí)可以獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的所有這樣的類似取代和修飾都被視為屬于由所附權(quán)利要求書確定的本發(fā)明的構(gòu)思、范圍和概念之內(nèi)。
在本文所引用的參考文獻(xiàn)以補(bǔ)充本文所披露方法的例示性方法或其他細(xì)節(jié)的程度都被專門收入本文作為參考。
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<223>野生型notch DNA序列<400>3aatattcctt acaagattga ggccgtgaag agtgagccgg tggagcctcc gctgccctcg 60cagctgcacc tcatgtacgt ggcagcggcc gccttcgtgc tcctgttctt tgtgggctgt120ggggtgctgc tgtcccgcaa gcgccggcgg cagcatggcc agctctggtt ccctgagggt180ttcaaagtgt cagaggccag caagaagaag cggagagagc ccctcggcga ggactcagtc240ggcctcaagc ccctgaagaa tgcctcagat ggtgctctga tggacgacaa tcagaacgag300tggggagacg aagacctgga gaccaagaag ttccggtttg aggagccagt agttctccct360gacctgagtg atcagactga ccacagacag tggacccagc agcacctgga cgctgctgac420ctgcgcatgt ctgccatggc cccaacaccg cctcaggggg aggtggatgc tgacgattat480aaagacgatg acgataaaca ccatcaccat caccatcacc attga525<210>4<211>174<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>野生型notch蛋白序列<400>4
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Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys995 10001005Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln His Val Val101010151020Asn Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu Leu Gly Gly Thr Cys Gln102510301035Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr104010451050Gly Pro Asn Cys Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp Ser Ser Pro105510601065Cys Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr Gln Tyr Arg107010751080Cys Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys Asp Val Pro108510901095Ser Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Arg Gln Gly Val Asp Val110011051110Ala Arg Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Ala Gly Asn111511201125Thr His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys113011351140Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys Gln Asn Gly114511501155Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys Lys Cys Val116011651170Ala Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asp Glu Cys117511801185Leu Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Asp Leu Pro119011951200Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His120512101215Cys Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys Asn Pro Pro Val Asp Pro Val122012251230Ser Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln123512401245Val Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu125012551260Arg Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp126512701275Ala Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His128012851290Cys Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val
129513001305Ile Asn Gly Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Thr Cys131013151320Ala Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Lys Cys Pro132513301335Ala Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys134013451350Gly Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro135513601365Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Pro Phe Thr Gly Pro Glu137013751380Cys Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Gly Gly Asn Pro Cys138513901395Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Ser Pro Phe Tyr140014051410Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile141514201425Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro143014351440Pro Leu Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp144514501455Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys146014651470Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp147514801485Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp149014951500Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp150515101515Gly Phe Asp Cys Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr152015251530Asp Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln153515401545Gly Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala155015551560Glu His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Val Val156515701575Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe158015851590Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys159516001605
Arg Asp Ala His Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg161016151620Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu Gly162516301635Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Gly Gln Val Lys Ala Ser Leu164016451650Leu Pro Gly Gly Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Leu Asp165516601665Pro Met Asp Val Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn167016751680Arg Gln Cys Val Gln Ala Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr168516901695Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu170017051710Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gln Ser Glu Thr Val Glu171517201725Pro Pro Pro Pro Ala Gln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala173017351740Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser174517501755Arg Lys Arg Arg Xaa Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly176017651770Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Xaa Leu177517801785Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp179017951800Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp180518101815Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro182018251830Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr Gln Gln His183518401845Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro185018551860Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg186518701875Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala Ser Cys Ser Gly188018851890Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu Asp Ala Pro189519001905Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser Leu His Asn
191019151920Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg192519301935Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala194019451950Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala195519601965Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg197019751980Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr198519901995Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu Glu200020052010Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu201520202025Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp203020352040Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln204520502055Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly206020652070Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg207520802085Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Ile Ala Gln209020952100Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn210521102115Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr212021252130Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly213521402145Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg Lys Pro Ser215021552160Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu Lys216521702175Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys Leu Leu Asp218021852190Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His219522002205Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro221022152220
Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met222522302235Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys224022452250Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu225522602265Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr227022752280Ser Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr228522902295Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser230023052310Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg231523202325Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala Pro Ser Leu233023352340Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser234523502355Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu Pro Ser Thr Arg236023652370Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln Val Gln Pro237523802385Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala Asn Ile239023952400Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro240524102415His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser242024252430Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val24352440<210>7<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>7deleted<210>8<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>8deleted
<210>9<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>9deleted<210>10<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>APP跨膜結(jié)構(gòu)域周圍的氨基酸序列<400>10Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile1 5 10 15Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys20 25 30<210>11<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>E-cathedrin跨膜結(jié)構(gòu)域周圍的序列<400>11Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg Arg20 25 30<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Notch-1跨膜結(jié)構(gòu)域周圍的序列<400>12Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu1 5 10 15Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg20 25 30<210>13<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Notch-1跨膜結(jié)構(gòu)域周圍的序列<400>13Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser Glu Pro Val Glu Pro1 5 10 15Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30
Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg35 40 45Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser50 55 60Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val65 70 75 80Gly Leu Lys pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp85 90 95Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg100 105 110Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Ser Asp Gln Thr Asp His115 120 125Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser130 135 140Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp145 150 155<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端flag序列<400>14Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>15<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Flag/8his標(biāo)記<400>15Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His His His1 5 10 15<210>16<211>1665<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼NusA的核酸<400>16atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa120caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt180cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca240cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt300acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa360
gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc 420gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc 480gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt 540ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc 600aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg 660attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc 720aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag 780gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt 960aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc1020gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc1080aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg1140ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag1200ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc1260caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta1320gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc1380gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca1440ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgccg aagcgactag tggttctggt1500catcaccatc accatcactc cgcgggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag1560cacatggact cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg1620attgatgacg acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattc1665<210>17<211>555<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>編碼NusA的蛋白質(zhì)序列<400>17Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys1 5 10 15Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala20 25 30Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln35 40 45Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val50 55 60Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala65 70 75 80Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln85 90 95Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln100 105 110
Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp115 120 125Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys130 135 140Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala145 150 155 160Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly165 170 175Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly180 185 190Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu195 200 205Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys210 215 220Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr225 230 235 240Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly245 250 255Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp260 265 270Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met275 280 285Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr290 295 300Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg305 310 315 320Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu325 330 335Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala340 345 350His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp355 360 365Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu370 375 380Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu385 390 395 400Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr405 410 415Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp420 425 430Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu
435 440 445Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile450 455 460Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala465 470 475 480Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala Thr485 490 495Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Lys Glu Thr500 505 510Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Pro Pro Thr515 520 525Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Gly Ser Gly Thr Ile Asp Asp Asp530 535 540Asp Lys Ser Pro Gly Ala Arg Gly Ser Glu Phe545 550 55權(quán)利要求
1.一種可溶性融合蛋白，其中包含與NusA蛋白序列的C-末端相融合的重組Notch蛋白。
2.如權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重組Notch蛋白包含Notch的S3切割位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重組Notch蛋白是脊椎動(dòng)物Notch蛋白。
4.如權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重組Notch蛋白是無(wú)脊椎動(dòng)物Notch蛋白。
5.如權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重組Notch蛋白來(lái)自具有SEQ ID NO5所示序列的小鼠Notch蛋白。
6.如權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白，其中，所述重組Notch蛋白包含小鼠Notch蛋白的氨基酸1703-1860。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的可溶性融合蛋白，其中還包含C-末端His-標(biāo)記。
8.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的可溶性融合蛋白，其中還包含C-末端Flag-標(biāo)記。
9.一種多核苷酸，其中包含編碼權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的融合蛋白的核苷酸序列。
10.編碼權(quán)利要求1的融合蛋白的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包含如SEQ ID NO1所示的序列。
11.一種分析γ-分泌酶所介導(dǎo)的Notch蛋白的ε切割(1743/1744)的體外方法，其中包括a.使包含哺乳動(dòng)物γ-分泌酶復(fù)合物或其生物學(xué)活性片段的第一組合物與包含如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的融合蛋白的第二組合物相接觸；和b.測(cè)定所述融合蛋白的切割。
12.一種篩選γ-分泌酶所介導(dǎo)的Notch蛋白的ε切割(1743/1744)的調(diào)節(jié)劑的體外方法，其中包括以下步驟(a)在有和沒(méi)有推測(cè)的調(diào)節(jié)劑化合物存在的情況下，使包含哺乳動(dòng)物γ-分泌酶復(fù)合物或其生物學(xué)活性片段的第一組合物與包含如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的融合蛋白的第二組合物相接觸；和(b)在有和沒(méi)有推測(cè)的調(diào)節(jié)劑化合物存在的情況下測(cè)定所述融合蛋白的切割；和(c)鑒定能調(diào)節(jié)γ-分泌酶介導(dǎo)的所述融合蛋白的切割的調(diào)節(jié)劑；其中，推測(cè)的調(diào)節(jié)劑化合物在步驟(b)中引起了γ-分泌酶切割的不同。
13.一種包含γ-分泌酶底物的用于進(jìn)行γ-分泌酶測(cè)定的試劑盒，所述底物包含如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的融合蛋白。
14.一種融合蛋白，其中包含與Notch多肽融合的NusA多肽，該多肽與SEQ ID NO17所示NusA序列有90-95％序列相同性，其中，所述Notch多肽包含Notch的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且，其中所述融合蛋白在水溶液中是可溶的。
15.一種用于篩選淀粉樣前體蛋白(APP)的γ-分泌酶加工的選擇性抑制劑的方法，包括a)提供能抑制γ-分泌酶介導(dǎo)的對(duì)包含APPγ分泌酶位點(diǎn)之多肽的切割的測(cè)試化合物；和b)在有和沒(méi)有所述測(cè)試化合物存在的情況下測(cè)定權(quán)利要求1的融合蛋白的γ分泌酶切割；其中，與所述融合蛋白的切割相比能優(yōu)先抑制所述多肽的γ分泌酶切割的測(cè)試化合物是APP的γ分泌酶加工的選擇性抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及γ－分泌酶的新型可溶性底物。更具體地講，本發(fā)明提供了具有Notch片段的可溶性融合多肽，其中含有與NusA蛋白融合的γ－分泌酶依賴性切割位點(diǎn)(γ和ε)。還披露了制備和使用所述融合蛋白的方法和組合物。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1717485SQ200380104233
公開(kāi)日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者K·B·蘭克, S·K·沙瑪 申請(qǐng)人:法瑪西雅厄普約翰有限責(zé)任公司