一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的酶底物培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能夠同時檢測糞便污染指示菌的酶底物培養(yǎng)基及其應(yīng)用。所述的培養(yǎng)基中含有硫酸銨、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫胺、葉酸、維生素H、混合微量元素、酵母提取物、5?溴?4?氯?3?吲哚?β?D?半乳糖苷、4?甲基傘形酮?β?D?葡萄糖醛酸苷以及異丙基硫代半乳糖苷。本發(fā)明的培養(yǎng)基可在36℃±1℃的培養(yǎng)條件下，同時檢測樣品中的大腸菌群和大腸埃希氏菌；在44.5℃±1℃的培養(yǎng)條件下，可同時檢測樣品中的耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌。根據(jù)顏色的變化和熒光的產(chǎn)生判定大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的存在。本發(fā)明的提出為糞便污染指示菌的檢測提供了一種操作簡便、結(jié)果易判斷、無需確認實驗的檢測手段，以便于對環(huán)境及食品進行檢測。
【專利說明】
一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的酶底物培養(yǎng)基及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能同時快速檢測樣品中糞便污染指示菌的培養(yǎng)介質(zhì)與方法，特別 涉及一種能同時快速檢測樣品中大腸菌群(Co Iiforms )、耐熱大腸菌群（Thermotolerant col if orms)或奠大腸菌群(Fecal Col if orms)和大腸埃希氏菌(Escherichia col i)的培養(yǎng) 介質(zhì)與方法，本發(fā)明屬于環(huán)境微生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物污染導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重影響人的生活，而通過糞口途徑傳播的傳染病嚴(yán)重影 響環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生質(zhì)量，糞便污染指示菌是評價環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生領(lǐng)域的最重要的 指示菌，包括大腸菌群(Coliforms)、耐熱大腸菌群(Thermotolerant coliforms)或奠大腸 菌群(Fecal Coliforms)和大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，這些指標(biāo)是世界衛(wèi)生組織 推薦的，同時也是各個國家、地區(qū)、組織使用的評價環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生質(zhì)量和衛(wèi)生學(xué)安全 的指標(biāo)。
[0003] 我國的環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對糞便污染指示菌都做了限值要求并規(guī) 定了檢驗方法，傳統(tǒng)的糞便污染指示菌檢測方法操作步驟繁瑣，需經(jīng)確認試驗對陽性結(jié)果 做出判斷，檢測時間較長。因此，急需建立一種操作簡便、結(jié)果易判斷、無需確認實驗的檢測 方法，以便于各級檢測單位使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提出了一種能夠同時檢測糞便污染指示 菌的酶底物培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法，使用本發(fā)明的方法不需要繁瑣的操作步驟、操作方便、結(jié) 果易判斷、無需確認實驗。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明通過營養(yǎng)指示劑物理性狀的改變來判定樣品中目標(biāo)菌的存在。不同種屬的 微生物往往具有自己特定的酶，這些酶是代謝不同營養(yǎng)成份的基礎(chǔ)。例如，大腸菌群細菌具 有半乳糖苷酶，大腸埃希氏菌具有葡萄糖醛酸苷酶。一般來講，一種特定酶只能代謝一 些特定的營養(yǎng)成份。營養(yǎng)指示劑同時也是目標(biāo)菌繁殖的基本營養(yǎng)成分，該營養(yǎng)成分無法被 目標(biāo)菌以外的其它細菌代謝。當(dāng)該營養(yǎng)成分被特定的酶代謝后，其原來物理特性即會發(fā)生 變化，產(chǎn)生特定的顏色變化或發(fā)出熒光等。通過這些物理性狀的變化，既可以判定某種特定 細菌的存在。
[0007]在某些情況下，少數(shù)非目標(biāo)菌也可能產(chǎn)生與目標(biāo)菌相同的酶，造成假陽性結(jié)果。本 發(fā)明為了消除或把假陽性結(jié)果降至最低，根據(jù)檢測的目標(biāo)菌情況，在培養(yǎng)介質(zhì)中加入能抑 制非目標(biāo)菌繁殖的特殊物質(zhì)。即根據(jù)目標(biāo)菌所產(chǎn)生的酶，制成對應(yīng)的含酶底物的培養(yǎng)介質(zhì)， 使目標(biāo)菌得以繁殖生長，而非目標(biāo)菌最大可能地被抑制。這樣，只有在目標(biāo)菌存在的情況 下，其培養(yǎng)介質(zhì)中的特定營養(yǎng)成分才能被代謝，并游離出指示劑部分，從而顯示出物理性狀 的變化。同時，培養(yǎng)介質(zhì)配方中適量的細菌酶誘導(dǎo)劑，可增加目標(biāo)菌特異性酶的活性，從而 縮短細菌的培養(yǎng)時間并提高檢測靈敏度。
[0008]營養(yǎng)指不劑由兩部分構(gòu)成，一部分可以作為目標(biāo)菌的基本營養(yǎng)成分，另一部分是 單純的指示劑。營養(yǎng)指示劑通常是某種色素原通過化學(xué)鍵鏈接到鹽、碳、氨基酸、脂肪酸或 肽鏈等營養(yǎng)物質(zhì)上形成。在對大腸菌群和耐熱大腸菌群(糞大腸菌群）的檢測中，本發(fā)明選 用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-GAL)作為其營養(yǎng)指示劑。由于大腸菌群和耐熱大腸 菌群都能產(chǎn)生半乳糖苷酶，可以代謝X-GAL產(chǎn)生半乳糖和5-溴-4-靛藍，溶解在液體中的 X-GAL為無色，而游離的5-溴-4-靛藍為藍色。而大腸菌群和耐熱大腸菌群可以通過培養(yǎng)溫 度的不同加以區(qū)分，前者最適宜培養(yǎng)溫度為36°C 土 1°C，后者為44.5Γ 土 1°C。在對大腸埃希 氏菌的檢測中，本發(fā)明選用4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)作為其營養(yǎng)指示劑，大 腸埃希氏菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，可以代謝MUG，游離出4-甲基傘形酮，該物質(zhì)在366nm紫 外燈下呈現(xiàn)特征性藍色熒光。
[0009] 為了加速目標(biāo)菌的繁殖生長，本發(fā)明中將一些生長促進劑添加于培養(yǎng)基介質(zhì)中。 這些生長促進劑主要包括維生素、微量元素等。它們主要在細菌開始對數(shù)生長期前發(fā)揮作 用，可以加速細菌繁殖生長，從而顯著地縮短目標(biāo)菌的培養(yǎng)時間。
[0010] 為了加速目標(biāo)微生物的酶產(chǎn)生速度，本發(fā)明中添加了酶促劑異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) JPTG是β-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)，酶促性強、性質(zhì)穩(wěn)定、不被細菌代謝，可快速 高效的促進大腸菌群、耐熱大腸菌群(糞大腸菌群)和大腸埃希氏菌產(chǎn)生半乳糖苷酶，提 高檢測的靈敏度。
[0011]本發(fā)明的培養(yǎng)基可在36 °C ± TC的培養(yǎng)條件下，同時檢測樣品中大腸菌群和大腸 埃希氏菌;在44.5°C±rC的培養(yǎng)條件下，同時檢測樣品中耐熱大腸菌群(或糞大腸菌群)和 大腸埃希氏菌。根據(jù)顏色的變化和熒光的產(chǎn)生判定大腸菌群、耐熱大腸菌群（或糞大腸菌 群)和大腸埃希氏菌的存在。
[0012]具體的，本發(fā)明的一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的液體酶底物培養(yǎng)基， 其含有以下濃度的各物質(zhì)： 硫酸銨 3-7g/L 氯化鈉 8-12g/L 無水嶙酸氫二納 4-5g/L 磷酸二氫鉀 0.5 -1. Og/ L 硫胺 8-12mg/L 葉酸 （).()l-().05uii/L
[0013] 維生素 H 0.01-0.05ug/L 混合微量元素 80-120mg/L 酵母提取物 450-550mg/L 5-溴-4-氯-.3-吲咮-β-D-半乳糖苷 80-120mg/L 4- 甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷 50-100mg/L 異丙基硫代半乳糖苷 80-120mg/L
[0014] 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸鎂40-60%、氯化鈣30-50%、硫酸錳1-5%、硫酸鋅1-5%、硫酸銅0.1-1 %。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的液體酶底物培養(yǎng)基中含有以下濃度的各物質(zhì)： 硫酸銨 5g/L 氯化鈉 10g/L 無水磷酸氫二鈉 4.8g/L 磷酸二氫鉀 0.7g/L: 硫胺 I ()mg/L 葉酸 0.02μL?/?
[0016] 維生素 H 0.02μ?/? 混合微.量元素 100ing/L 酵母提取物 500mg/L 5- 溴-4-氯-3-吲咮-β-D-半乳糖苷 lOOing/L 4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷 75mg/L 異丙基硫代半乳糖苷 100mg/L
[0017] 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸鎂55%、氯化鈣40%、 硫酸錳2.5 %、硫酸鋅2.4 %、硫酸銅0.1 %。
[0018] 本發(fā)明的一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的干粉酶底物培養(yǎng)基，將用于檢 測IOOrnl水的干粉酶底物培養(yǎng)基作為一個劑量，每個劑量的干粉酶底物培養(yǎng)基中含有以下 重量的各物質(zhì)： 硫酸銨 0.3-0.7g 氯化鈉 （).8-1.2g 無水磷酸氫二鈉 0.4-0.5g 磷酸二氫鉀 （).05-0.1 g 硫胺 0.8-1.2 mg 葉酸 0.001-0.0()5μL：
[0019] " 維生素 H 0.0()1-0.0()5[ig 混合微量元素 8-12mg 酵母提取物 45-55mg 5-溴-4-氯-3-p引哚-β-D-半乳糖苷 8-12mg 4- 曱基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷 5-1 Omg 異丙基較代半乳糖苷 8-12mg
[0020] 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸鎂40-60%、氯化鈣30-50%、硫酸錳1-5%、硫酸鋅1-5%、硫酸銅0.1-1 %。
[0021] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，每個劑量的干粉酶底物培養(yǎng)基中含有以下重量的各物質(zhì)： 硫酸銨 0 5g 氯化鈉 Ig 無水磷酸氫二納 0 48g 磷酸二氫鉀 0.07g 硫胺 Iuig 葉酸 0·002μL?
[0022] " 維生素 H 0.002μδ 混合微量元素 IOmg 酵母提取物 5 Omg 5- 漠-4-氯-3-吲咮-β-D-半乳糖苷 IOmg 4-曱基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷 7,5mg 異丙基硫代半乳糖苷 IOmg
[0023]其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸鎂55%、氯化鈣40%、 硫酸錳2.5 %、硫酸鋅2.4 %、硫酸銅0.1 %。
[0024] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的干粉酶底物培養(yǎng)基還包括將以上各物質(zhì)研磨成粉末 狀，混勻，常溫下制成10~30目的速溶顆粒。
[0025] 進一步的，本發(fā)明還提出了所述的液體或干粉酶底物培養(yǎng)基在檢測環(huán)境或食品樣 本中糞便污染指示菌中的用途，其中所述的糞便污染指示菌包括大腸菌群(Colifoms)Ji 熱大腸菌群（Thermotolerant coliforms)和大腸埃希氏菌(Escherichia coli) 〇
[0026]更進一步的，本發(fā)明還提出了一種用于同時檢測環(huán)境或食品樣本中大腸菌群和大 腸埃希氏菌的方法，包括以下步驟：
[0027]取未經(jīng)處理過的環(huán)境或食品樣本置于一有蓋無菌容器中，向該容器中加入本發(fā)明 所述的液體酶底物培養(yǎng)基或干粉酶底物培養(yǎng)基，混搖均勻，蓋緊容器，置于36?！?Γ培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24h，然后觀察容器中水樣顏色變化，如果呈現(xiàn)藍色，即為大腸菌群陽性，在366mn 紫外燈下觀測，如果有熒光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽性。以及
[0028] -種用于同時檢測環(huán)境或食品樣本中耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，包括 以下步驟：
[0029] 取未經(jīng)處理過的環(huán)境或食品樣本置于一有蓋無菌容器中，向該容器中加入本發(fā)明 所述的液體酶底物培養(yǎng)基或干粉酶底物培養(yǎng)基，混搖均勻，蓋緊容器，置于44.5°C±1°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后觀察容器中水樣顏色變化，如果呈現(xiàn)藍色，即為耐熱大腸菌群陽性，在 366mn紫外燈下觀測，如果有熒光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽性。以及
[0030] -種用于檢測公共用品物體表面大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的方 法，包括以下步驟：
[0031] 使用本發(fā)明所述的液體酶底物培養(yǎng)基浸泡紙片，浸泡后干燥并無菌包裝，使用時， 取適量無菌水充分濕潤紙片后貼在需檢測的物體表面，將采樣后的紙片置于36°C±1°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h以檢測大腸菌群;如果檢測耐熱大腸菌群，則將采樣后的紙片置于44.5°C± TC環(huán)境中培養(yǎng)24h，然后觀察生長的菌落顏色，如果菌落呈現(xiàn)藍色，即為大腸菌群或耐熱大 腸菌群陽性;在366mn紫外燈下觀測，如果藍色的菌落有熒光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽性。
[0032] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0033] 1)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法適用于環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生領(lǐng)域檢測糞便污染指示菌；
[0034] 2)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法適用于各級衛(wèi)生部門、環(huán)保部門、食品監(jiān)測站、水質(zhì)監(jiān)測 站等；
[0035] 3)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法對實驗室和實驗人員要求低，適用于基層的使用；
[0036] 4)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法操作簡單，檢測步驟簡捷；
[0037] 5)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法比傳統(tǒng)的方法檢測時間短，只需要24h，對陽性結(jié)果不需 進行確認試驗；
[0038] 6)本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法靈敏度高，特異性強，結(jié)果準(zhǔn)確；
[0039] 7)本發(fā)明的培養(yǎng)基可制成干粉培養(yǎng)基，可高壓滅菌后制成液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng) 基或用于紙片法；
[0040] 8)本發(fā)明的培養(yǎng)基可采用無菌一次性包裝，最大程度地避免了對檢測結(jié)果污染的 可能。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0042]實施例一能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的液體酶底物培養(yǎng)基的制備 [0043] (1)按照以下重量分別稱取各物質(zhì)： 硫酸銨 5% 氣化鈉 IQkg 無水磷酸氫二鈉 __4.._8kg 磷酸二氫鉀 0.7kg
[0044] 硫胺 IOg 葉酸 0.()2mg 維生素 H 0.02mg 混合微量元素 100g 酵母提取物 50()g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 100g
[0045] 4_甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷 ？ 5容 異丙基硫代半乳糖苷 100g
[0046] 其中，所述的混合微量元素中含有：硫酸鎂55g、氯化鈣40g、硫酸錳2.5g、硫酸鋅 2.4g、硫酸銅0. lg。
[0047] (2)將上述物質(zhì)溶解于蒸餾水中，補足體積至1000L，高壓滅菌，即得。
[0048] 實施例二能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的干粉酶底物培養(yǎng)基的制備
[0049] (1)按照以下重量分別稱取各物質(zhì)： 硫酸按 5 kg 氯化納 IOkg 無水磷酸氫二鈉 4.8kg 磷酸二氫鉀 0 7kg 硫胺 IOg 葉酸 0..02mg
[0050] 維生素 H 0.02mg 混合微量元素 100g 酵母提取物 500g 5-溴-4-氯-3-叫哚-β-D-半乳糖苷 100g 4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷 75g 異丙基硫代半乳糖苷 100g
[0051 ]其中，所述的混合微量元素中含有：硫酸鎂55g、氯化鈣40g、硫酸錳2.5g、硫酸鋅 2.4g、硫酸銅0. lg。
[0052] (2)將上述物質(zhì)研磨成粉末狀，混勻，常溫下制成10~30目的速溶顆粒，按檢測 IOOmL水樣的劑量分裝、密封、滅菌。分裝，每個劑量的干粉酶底物培養(yǎng)基中含有以下重量的 各物質(zhì)： 硫酸銨 0.5g 氯化納 l..g
[0053] 無水磷酸氫二鈉 0.48g 磷酸二氫鉀 0.07g 硫胺 Img 葉酸 0.002pg 維生素 H 0,002^ig 混合微量元素 IOing
[0054] 酵母提取物 50mg 5-溴-4-氯-3-p引哚-P-D-半乳耱苷 IOmg 4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖釀酸苷 7,5.mg 異丙基硫代半乳糖苷 IOing0
[0055]其中，所述的混合微量元素中含有:硫酸鎂5.5mg、氯化鈣4mg、硫酸錳0.25mg、硫酸 鋅0.24mg、硫酸銅0.0 Img。
[0056]在室溫下，該培養(yǎng)基通?？梢员４?2個月。
[0057]實施例三水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌定性檢測及與常規(guī)方法的比較 [0058] 取IOOmL未經(jīng)處理過的環(huán)境水樣置于120mL左右有蓋無菌容器中，加入一個劑量的 上述干粉酶底物培養(yǎng)基(實施例二制備），混搖均勻使其溶解。蓋緊容器，置于36°C±1°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。如果檢測耐熱大腸菌群，則將容器置于44.5°C 土 TC環(huán)境中培養(yǎng)24h。然后 觀察容器中水樣顏色變化，如果呈現(xiàn)藍色，即為大腸菌群或耐熱大腸菌群陽性。在366mn紫 外燈下觀測，如果有熒光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽性。
[0059]同時采用《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》(GB/T 5750.12-2006)規(guī)定的乳糖發(fā)酵法進 行5管法的常規(guī)方法檢測，將初步發(fā)酵陽性的結(jié)果進行分離培養(yǎng)和證實實驗，共進行30組實 驗，實驗結(jié)果如表1所示，本發(fā)明的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法的檢驗效果表與常規(guī)方法比較，無統(tǒng) 計學(xué)差異(采用卡方檢驗），認為兩種方法具有等效性。常規(guī)方法確定陽性結(jié)果需要72h，需 要顯微鏡等復(fù)雜的實驗室設(shè)備，而本發(fā)明方法只需要培養(yǎng)24h，不需要顯微鏡等實驗室設(shè) 備，無需進行分離培養(yǎng)和證實實驗;常規(guī)方法只可進行大腸菌群的檢測，不能同時進行大腸 埃希氏菌檢測，而本發(fā)明的方法可同時進行兩個指示菌指標(biāo)的檢測。
[0060]表1本發(fā)明方法與常規(guī)方法的定性檢測比較
[0062]實施例四水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌定量檢測及與常規(guī)方法的比較 [0063]將IOOmL經(jīng)定性實驗確定為陽性的水樣加入一個劑量的上述干粉酶底物培養(yǎng)基 (實施例二制備），搖動使其溶解，采用國標(biāo)方法最常用的51孔法，置于36°C± TC培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h，查相應(yīng)的MPN表，可計算出IOOmL目標(biāo)菌的MPN值；同時采用《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗 方法》GB/T 5750.12-2006規(guī)定的乳糖發(fā)酵法進行15管法的常規(guī)方法檢測大腸菌群，用EC-MUG培養(yǎng)基法檢測大腸埃希氏菌，共進行15組檢測。結(jié)果如表2，本發(fā)明的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 的檢驗效果表與常規(guī)方法比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(采用配對t檢驗和卡方檢驗），認為兩種方法 具有等效性。常規(guī)方法需要采用兩種不同的培養(yǎng)基，采用兩種不同的培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)需要 48h-72h，而本發(fā)明的方法只需要一種培養(yǎng)基與一個培養(yǎng)溫度。
[0064]表2本發(fā)明方法與常規(guī)方法定量檢測結(jié)果(MPN/100mL)
[0066] 注："+"表示陽性；表示陰性
[0067] 實施例五公共用品物體表面大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測
[0068] 按照實施例一的方法制備液體酶底物培養(yǎng)基，浸泡紙片后干燥并無菌包裝。使用 時，取適量無菌水充分濕潤紙片后貼在需檢測的物體表面，將采樣后的紙片置于36°C±1°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h以檢測大腸菌群;如果檢測耐熱大腸菌群(糞大腸菌群），則將采樣后的紙 片置于44.5°C 土 1°C環(huán)境中培養(yǎng)24h。然后觀察生長的菌落顏色，如果菌落呈現(xiàn)藍色，即為大 腸菌群或耐熱大腸菌群陽性;在366mn紫外燈下觀測，如果藍色的菌落有熒光產(chǎn)生，即為大 腸埃希氏菌陽性。
【主權(quán)項】
1. 一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的液體酶底物培養(yǎng)基，其特征在于所述的酶 底物培養(yǎng)基中含有W下濃度的各物質(zhì)： 硫酸鎮(zhèn) 3-7g/L 氯化納 8-12g/L 無水禱酸氨二鋪 4-5g/L 礙酸二氨鐘 0.5-U)g/L 疏胺 8-12mg/L 葉酸 0.01-0.()5,ug,''L 維生素 Η 化01-0.()5,ug,''L 澀合微量元素 80-120mg/L 酵母提取物 450-550mg/L 5-澳-4-氯-3-。引味-β-D-半乳糖魯 80-I20ing/L 4- 甲基傘形駒-β -D-葡萄糖醒酸菩 5(M00mg/L 異巧基疏代率乳擔(dān)毎 80-120mg/L 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸儀40-60%、氯化巧so- so % 、 硫酸儘 1-5 % 、 硫酸鋒 1-5 % 、 硫酸銅0.1-1 % 。2. 如權(quán)利要求1所述的液體酶底物培養(yǎng)基，其特征在于所述的酶底物培養(yǎng)基中含有W 下濃度的各物質(zhì)： 硫酸按 5g:/L 氯化納 lOg/L 無水蹲酸氨二納 4.8g/L 蹲酸二氨鐘 化7按/'L 硫胺 Wmg化 葉酸 0.02叫廷/1_ 維生素 Η 0.02ng/L 混合微量元素 I()0mg/L 酵母提取物 500mg/L 5- 澳-4-氯-3-。引咪-β-D-半乳搪每 lOOnig/L 4-甲基傘形稠 -β -D-葡萄糖醒酸普 75mg/L 異丙基碗代半乳搪每 1 OOmg/L 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸儀55%、氯化巧40%、硫酸 車孟2.5 %、硫酸鋒2.4 %、硫酸銅0.1 %。3. 權(quán)利要求1或2所述的液體酶底物培養(yǎng)基在檢測環(huán)境或食品樣本中糞便污染指示菌 中的用途，其中所述的糞便污染指示菌包括大腸菌群（Col if orms)、耐熱大腸菌群 (Thermotolerant coliforms)和大腸埃希氏菌化scherichia coli)。4. 一種能夠同時檢測兩種糞便污染指示菌的干粉酶底物培養(yǎng)基，將用于檢測100ml水 的干粉酶底物培養(yǎng)基作為一個劑量，其特征在于每個劑量的干粉酶底物培養(yǎng)基中含有W下 重量的各物質(zhì)： 硫酸按 0J-0.7g 氯化鋼 0.8-1.2g 無水蹲酸氨二舖 0.4-0.5g 蹲酸二氯鐘 0.05-0.1 g 碗胺 0.8-1.2mg 葉酸 0.001-O.Q敝惦 維生素 Η 化()01-0.005扛巧 混合微量元素 8-12ing 酵母提取物 45-55風(fēng)g: 5-澳-4-氯-3-嗎I咪-β-D-半乳糖普 8-12mg 4-甲基傘形爾-β-D-葡萄搪酪酸普 5-lOmg 異丙基硫代半乳搪普 8-12mg 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸儀40-60%、氯化巧so- so % 、 硫酸儘 1-5 % 、 硫酸鋒 1-5 % 、 硫酸銅0.1-1 % 。5. 如權(quán)利要求4所述的干粉酶底物培養(yǎng)基，其特征在于每個劑量的干粉酶底物培養(yǎng)基 中含有W下重量的各物質(zhì)： 硫驗錠 化5g 氯化納 Ig 無水蹲酸氨二娜 化48g 蹲酸二氯卸 化07g 硫胺 1 mg 葉酸 化002贓 維生素 Η 化0()2μg 混合微量元素 K)mg 酵母提取物 5化1巧 5-澳-4-氯-3-P引味-β-D-半乳搪普 K)mg 4-甲基傘形爾-β -D-葡萄搪酪酸尊 7.5mg 異巧基硫代半乳搪尊 I On'ig 其中，按重量百分比計算，所述的混合微量元素中含有硫酸儀55%、氯化巧40%、硫酸 車孟2.5 %、硫酸鋒2.4 %、硫酸銅0.1 %。6. 如權(quán)利要求5或6所述的干粉酶底物培養(yǎng)基，其特征在于:還包括將所述各物質(zhì)研磨 成粉末狀，混勻，常溫下制成10~30目的速溶顆粒。7. 權(quán)利要求4-6任一項所述的干粉酶底物培養(yǎng)基在檢測環(huán)境或食品樣本中糞便污染指 示菌中的用途，其中所述的糞便污染指示菌包括大腸菌群（Coliforms)、耐熱大腸菌群 (Thermotolerant coliforms)和大腸埃希氏菌（Escherichia coli)。8. -種用于同時檢測環(huán)境或食品樣本中大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，其特征在于 包括W下步驟： 取未經(jīng)處理過的環(huán)境或食品樣本置于一有蓋無菌容器中，向該容器中加入權(quán)利要求1 或2所述的液體酶底物培養(yǎng)基或權(quán)利要求4-6任一項所述的干粉酶底物培養(yǎng)基，混搖均勻， 蓋緊容器，置于36°C±rC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地，然后觀察容器中水樣顏色變化，如果呈現(xiàn)藍 色，即為大腸菌群陽性，在366mn紫外燈下觀測，如果有巧光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽性。9. 一種用于同時檢測環(huán)境或食品樣本中耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，其特征 在于包括W下步驟： 取未經(jīng)處理過的環(huán)境或食品樣本置于一有蓋無菌容器中，向該容器中加入權(quán)利要求1 或2所述的液體酶底物培養(yǎng)基或權(quán)利要求4-6任一項所述的干粉酶底物培養(yǎng)基，混搖均勻， 蓋緊容器，置于44.5°C±rC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地，然后觀察容器中水樣顏色變化，如果呈現(xiàn)藍 色，即為耐熱大腸菌群陽性，在366mn紫外燈下觀測，如果有巧光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽 性。10. -種用于檢測公共用品物體表面大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法， 其特征在于包括W下步驟： 使用權(quán)利要求1或2所述的液體酶底物培養(yǎng)基浸泡紙片，浸泡后干燥并無菌包裝，使用 時，取適量無菌水充分濕潤紙片后貼在需檢測的物體表面，將采樣后的紙片置于36°C±rC 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hW檢測大腸菌群;如果檢測耐熱大腸菌群，則將采樣后的紙片置于44.5 °C ±rC環(huán)境中培養(yǎng)24h，然后觀察生長的菌落顏色，如果菌落呈現(xiàn)藍色，即為大腸菌群或耐熱 大腸菌群陽性;在366mn紫外燈下觀測，如果藍色的菌落有巧光產(chǎn)生，即為大腸埃希氏菌陽 性。
【文檔編號】C12R1/01GK106086159SQ201610447924
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】孫宗科, 丁培, 鄭萍, 武利平, 李霞, 王友斌, 丁珵, 張曉 , 毛怡心, 陳西平
【申請人】中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所