一種化學?酶法制備熊去氧膽酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化學?酶法制備熊去氧膽酸的方法，以鵝去氧膽酸為初始底物，依次經過化學法和生物酶法制備熊去氧膽酸，期間采用了7?KLCA還原酶作為生物催化劑，不會出現(xiàn)現(xiàn)有技術中采用化學法制得7?酮石膽酸過程中殘留的氧化劑導致后期酶失活的情況發(fā)生，且采用本發(fā)明的制備方法所制得的產物的ee值高，綜合成本低。
【專利說明】
一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領域，具體涉及一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法。
【背景技術】
[0002] 熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)結構如式1所示，用于治療膽固醇型膽 結石，形成及膽汁缺乏性脂肪瀉，也可用于預防藥物性結石形成。
[0003]
[0004]目前已經公開的制備熊去氧膽酸的方法中，"活熊引流取膽"的方法由于與野生動 物保護法規(guī)沖突，且違反人道主義，受到限制。因此，從家禽的膽汁中提取膽酸類物質，如鵝 去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，⑶CA)并轉化為熊去氧膽酸的方法的報道較多（式2)。 例如專利CN201210473483等報道了將CDCA酶法氧化為7-酮石膽酸(7-KLCA)，后經酶法還原 獲得UDCA的方法，由于采用的兩步酶反應的輔酶均沒有循環(huán)再生，因此需按當量加入，用量 較高(式3)。而專利201310002127.2等報道了將CDCA化學法氧化為7-KLCA，并化學法還原為 UDCA?；瘜W法通常采用NBS等氧化劑，和硼氫化鈉或醇鈉等還原劑，存在的問題是產物ee不 高，通常僅為90%，因此需要額外的后處理步驟，降低了收率，提高了成本(式4)。
[0005]
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【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種化學-酶法制備熊去氧膽酸 的方法。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方 法，包括如下步驟：
[0009] 1)以鵝去氧膽酸為底物，在酒石酸及溶劑條件下，室溫加入氧化劑，氧化反應生成 7-酮石膽酸，其中，所述的溶劑為甲醇，所述的氧化劑為次氯酸鈉溶液，起始反應體系中，所 述鵝去氧膽酸的底物濃度為0.1~〇.2g/mL;所述酒石酸與鵝去氧膽酸的投料質量比為1:2 ~1:3，所述氧化劑與鵝去氧膽酸的投料質量比為4:1~6:1;
[0010] 2)以步驟1)制得的7-酮石膽酸為底物，在生物催化劑、輔因子和輔酶再生系統(tǒng)的 存在下，發(fā)生還原反應生成目標產物熊去氧膽酸，其中，所述的生物催化劑為7-KLCA還原 酶，所述的輔酶再生系統(tǒng)為一水葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述反應在溫度為25~40°C、pH為 6~7的水相緩沖溶液中，在助溶劑條件下進行，其中，所述的一水葡萄糖:7-KLCA還原酶:葡 萄糖脫氫酶:7-酮石膽酸的投料質量比為:0.8~1.2:0.005~0.02:0.005~0.02:1。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟2)中的輔因子為NADP，所述輔因子與鵝去氧膽酸的投料質量比 為0.001~0.0005:1。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟2)在pH為6.5的磷酸緩沖溶液進行。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述的助溶劑為正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助 溶劑的投料體積為反應總體積的5%~30%。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2)中的葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌號 為EW002的葡萄糖脫氫酶。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟2)中的7-KLCA還原酶的基因序列與序列1-20中的任一序列具有 至少90 %的同源性。
[0016] 進一步優(yōu)選地，所述7-KLCA還原酶是在非致病微生物中的表達產物。
[0017] 更進一步優(yōu)選地，所述的非致病微生物為大腸桿菌。
[0018] 優(yōu)選地，具體實施過程如下：
[0019] 1)將鵝去氧膽酸、酒石酸加入到甲醇中，室溫條件下攪拌滴加次氯酸鈉溶液，滴加 完畢后，攪拌反應，HPLC檢測反應進程，當底物轉化率達90~99 %時，反應結束，加入亞硫酸 鈉，攪拌加水過濾，得到7-酮石膽酸；
[0020] 2)在反應容器中，依次加入步驟1)得到的7-酮石膽酸、所述的一水葡萄糖及緩沖 溶液，在25~40°C、pH為6~8的水浴鍋中，400~450rpm攪拌均勻，而后加入所述的助溶劑， 待攪拌均勻后加入所述的7-KLCA還原酶、葡萄糖脫氫酶、輔因子進行還原反應，控制反應體 系pH在6 · 5 ± 0 · I，HPLC檢測反應進程，當轉化率達90-99 %時，調節(jié)體系pH至3 · 0~3 · 2，等體 積乙酸乙酯多次萃取、合并有機相，調節(jié)pH至9.5~9.7,等體積水反萃取，合并水相，并旋蒸 得到熊去氧膽酸產品。
[0021] 由于上述技術方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點:本發(fā)明的化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法，采用了化學法將鵝去氧膽酸氧化成7-酮石膽酸，再通過生物 酶法將7-酮石膽酸還原至熊去氧膽酸，期間所采用的生物催化劑為7-KLCA還原酶，并對第 一步氧化過程進行了優(yōu)化，有效地杜絕了現(xiàn)有技術中采用在采用化學法制備7-酮石膽酸過 程中殘留的氧化劑導致第二步還原過程中酶失活的情況發(fā)生，大大提高了產物的ee值，且 綜合成本更低。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明的反應式如下：
[0024]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施 例。實施例中采用的實施條件可以根據具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施 條件為常規(guī)實驗中的條件。
[0025] 實施例1制備7-KLCA
[0026] 將⑶CA 5g，酒石酸2g加入50ml甲醇中，室溫攪拌10分鐘。緩慢滴加次氯酸鈉溶液 (活性氯5 % )25mL，3小時滴加完畢，繼續(xù)攪拌5小時，HPLC監(jiān)控反應，轉化率99 %。反應結束 后，加入亞硫酸鈉0.5g，攪拌后加入水200mL，過濾得7-KLCA 5g，含量95 %。
[0027] 實施例2制備UDCA
[0028] 向1001^三口反應燒瓶中，加入587-1^0厶，48-水葡萄糖，4511^0.謂？!16.5的 PBS緩沖溶液，置于35 °C水浴鍋中，400-450rpm機械攪拌5min;
[0029] 向反應瓶中加入5mL正己醇，曲拉通X-100 0.25mL，待攪拌均勻后，向反應瓶中加 入7-KLCA還原酶（由序列20在大腸桿菌中表達獲得)0.1g、葡萄糖脫氫酶(來自蘇州漢酶生 物技術有限公司，編號EW002)0.1g，NADP 0.005g，開始反應，反應過程中用IM NaOH溶液控 制pH在6.5 ±0.1。4小時后反應完畢，調節(jié)pH至3.0，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機相， 調節(jié)pH至9.5，等體積水反萃取三次，合并水相，旋蒸得到產品4.7g，HPLC檢測產品含量為 95%，純度 98 %。
[0030] 上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人 士能夠了解本發(fā)明的內容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據本發(fā)明 精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種化學-酶法制備熊去氧膽酸的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 以鵝去氧膽酸為底物，在酒石酸及溶劑條件下，室溫加入氧化劑，氧化反應生成7-酮 石膽酸，其中，所述的溶劑為甲醇，所述的氧化劑為次氯酸鈉溶液，起始反應體系中，所述鵝 去氧膽酸的底物濃度為0.1~0.2g/mL;所述酒石酸與鵝去氧膽酸的投料質量比為1:2~1:3， 所述氧化劑與鵝去氧膽酸的投料質量比為4:1~6:1; 2) 以步驟1)制得的7-酮石膽酸為底物，在生物催化劑、輔因子和輔酶再生系統(tǒng)的存在 下，發(fā)生還原反應生成目標產物熊去氧膽酸，其中，所述的生物催化劑為7-KLCA還原酶，所 述的輔酶再生系統(tǒng)為一水葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述反應在溫度為25~40°C、pH為6~7的 水相緩沖溶液中，在助溶劑條件下進行，其中，所述的一水葡萄糖:7-KLCA還原酶:葡萄糖脫 氫酶:7-酮石膽酸的投料質量比為:0 · 8~1 · 2:0 · 005~0 · 02:0 · 005~0 · 02:1。2. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中 的輔因子為NADP，所述輔因子與鵝去氧膽酸的投料質量比為0.001~0.0005:1。3. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)在 pH為6.5的磷酸緩沖溶液進行。4. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中， 所述的助溶劑為正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助溶劑的投料體積為反應總體積的 5%~30%〇5. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，步驟2)中的葡 萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌號為EW002的葡萄糖脫氫酶。6. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述步驟2)中 的7-KLCA還原酶的基因序列與序列1 -20中的任一序列具有至少90%的同源性。7. 根據權利要求6所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述7-KLCA還 原酶是在非致病微生物中的表達產物。8. 根據權利要求7所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，所述的非致病 微生物為大腸桿菌。9. 根據權利要求1所述的化學-酶法制備熊去膽酸的方法，其特征在于，具體實施過程 如下： 1) 將鵝去氧膽酸、酒石酸加入到甲醇中，室溫條件下攪拌滴加次氯酸鈉溶液，滴加完畢 后，攪拌反應，HPLC檢測反應進程，當底物轉化率達90~99%時，反應結束，加入亞硫酸鈉，攪 拌加水過濾，得到7-酮石膽酸； 2) 在反應容器中，依次加入步驟1)得到的7-酮石膽酸、所述的一水葡萄糖及緩沖溶液， 在25~40 °C、pH為6~8的水浴鍋中，400~450rpm攪拌均勻，而后加入所述的助溶劑，待攪拌均 勻后加入所述的7-KLCA還原酶、葡萄糖脫氫酶、輔因子進行還原反應，控制反應體系pH在 6.5 ± 0.1，HPLC檢測反應進程，當轉化率達90-99%時，調節(jié)體系pH至3.0~3.2，等體積乙酸乙 酯多次萃取、合并有機相，調節(jié)pH至9.5~9.7，等體積水反萃取，合并水相，并旋蒸得到熊去 氧膽酸產品。
【文檔編號】C12P33/06GK106086149SQ201610439896
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】張躍
【申請人】蘇州漢酶生物技術有限公司