專利名稱：以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物轉化/生物催化技術、微生物菌株篩選領域，具體為一種以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株的篩選策略及方法。
背景技術：
磷霉素[(-)-順-(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基磷酸，英文名Fosfomycin，簡稱FOM]是一種廣譜抗生素。磷霉素的化學結構簡單且迥異于大多數常用抗生素，它具有毒性低、無抗原性、抗菌譜廣、適應癥多、不易形成耐藥性等特點。近年的研究結果又發(fā)現了磷霉素的一些新功效，例如與其它抗生素的協同作用、減輕其它抗生素的毒副反應、聯合用藥治療危重感染、免疫增強作用。因此，磷霉素被稱為二十一世紀的新抗生素。
目前，磷霉素生產主要采用化學合成法，即以丙炔醇為原料，經過酯化、水解、加氫、環(huán)氧化、拆分、成鹽等工藝而最終獲得左旋磷霉素。但是，化學合成工藝的生產收率不到20％，這是因為在環(huán)氧化過程中形成的是磷霉素消旋體，即50％左旋磷霉素和50％右旋磷霉素的混合物。將消旋體進行化學拆分，分離出的左旋磷霉素為有療效的成品，分離出的右旋磷霉素則作為廢棄物排放掉。這不僅導致生產成本提高和資源浪費，也同時形成了嚴重的環(huán)境污染問題。例如，某制藥企業(yè)的有機磷廢水排放量為20噸/日，COD值高達200000～300000mg/L。因此，實現左旋磷霉素的不對稱合成或右旋磷霉素的再利用，是降低磷霉素生產成本、提高產值和利稅、減少廢水排放的一項迫切需求。
近年來，人們逐漸認識到生物轉化(Biotransformation)/生物催化(Biocatalysis)將成為生產手性化合物的關鍵技術。因為大多數生物催化劑(微生物菌體或酶)本身就是手性催化劑，它們對底物構型往往有嚴格要求，能選擇性地作用于對映體中的一個，而對另一個不起作用。生物轉化或合成正是利用酶促反應的高度立體選擇性，將化學合成的外消旋物、前體或潛手性化合物轉化成單一光學活性產物。目前，生物轉化作用產物的89％是手性的。生物轉化作用的優(yōu)點為手性專一性強、反應條件溫和(20℃～50℃、pH中性)、立體選擇性強、副反應少、收率高、產物光學純度高，環(huán)境污染少。
左旋磷霉素可以由順丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，cPA)經過微生物的轉化作用來進行合成。目前，已經發(fā)現真菌、放線菌和細菌中的十多個菌株具有催化順丙烯磷酸不對稱合成左旋磷霉素的能力，這些菌株包括Penicillinspinulosum、Cellvibrio gilvus、Acetobacter aceti、Achromobacter turbidus、Brecibacterium acetylicum、Derxia gummosa、Pseudomonas purpurrescens、Pseudomonas syringae、Flavobacterium esteroaromaticum、Pseudomonas putida、Alcaligenesfaecalis、Corynebacterium sp.、Streptomyces albidoflavus、Bacillus firmus等。但是，因為這些菌株對底物和產物的耐受能力均很低，它們的轉化能力均遠遠不能達到應用于工業(yè)生產的需求。因此，能否篩選到具有高效生物轉化能力的菌株(或酶)是能否成功地把不對稱生物合成/轉化技術應用于磷霉素生產實踐的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高效率的以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株篩選策略和方法。
本發(fā)明的技術方案是一種以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株篩選方法，包括初篩和復篩兩個步驟，復篩過程中以初篩過程中所獲得的菌株為出發(fā)菌株；在初篩中采用以順丙烯磷酸為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，該選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)出那些能夠以順丙烯磷酸為底物進行生長的菌株；復篩所采用培養(yǎng)基是以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基。
所述初篩步驟如下1)順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基按重量百分數計，順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基具有如下配方(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復合液0.1％，順丙烯磷酸0.3～2.0％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘，備用；2)初篩過程吸取土壤懸液，加到順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，倒置于37℃培養(yǎng)5～7天；3)初篩獲得菌株的分離純化并保藏菌種按重量百分數計，分離純化培養(yǎng)基配方如下(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復合液0.1％，酵母膏0.1％，順丙烯磷酸0.3％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘；
挑取在順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落，劃線接種于上述分離純化培養(yǎng)基斜面上進行純化，然后再接種于相同培養(yǎng)基斜面上進行保藏。
所述復篩步驟如下1)以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基按重量百分數計，復篩中的順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基具有如下配方順丙烯磷酸0.3～1.0％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.2-7.4，115℃滅菌30分鐘，備用；2)瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，靜置凝固后，用打孔器打出瓊脂塊，然后在其表面接種初篩步驟中獲得的待檢測菌株，置于30℃，75％-85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
經復篩獲得磷霉素轉化菌株的檢定包括如下步驟1)生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備培養(yǎng)基I成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板；2)磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于生物鑒定盤上，37℃培養(yǎng)16小時，觀察并測量抑菌圈直徑，依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種效率高、操作簡易的篩選策略及相應的具體操作方法，用于篩選以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株。該篩選策略及具體操作方法的要點是在篩選過程中包括了初篩和復篩兩個步驟。初篩過程使樣品中占絕大多數的不相關微生物被淘汰掉，復篩中再以初篩中獲得的菌株為出發(fā)菌株進一步篩選出左旋磷霉素生物轉化菌株。由于有了初篩中的先期淘汰，從而大大減少了復篩工作量，使篩選工作的整體效率大為提高。該篩選策略及其方法的不足之處在于初篩步驟中存在著淘汰掉部分潛在目的微生物的可能性。
具體實施例方式
本發(fā)明篩選策略把篩選過程分為兩個步驟，即初篩和復篩步驟。初篩步驟使樣品中占絕大多數的不相關微生物被淘汰掉，復篩過程中則以初篩過程中獲得的菌株為出發(fā)菌株，進一步篩選出目的菌株，即以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株。
與該篩選策略相對應的具體操作過程包括初篩和復篩兩個步驟。在初篩中采用了以順丙烯磷酸為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，該選擇性培養(yǎng)基可以選擇性培養(yǎng)出那些能夠以順丙烯磷酸為底物進行生長的菌株，從而排除掉大量不能以順丙烯磷酸為底物生長的菌株。因為初篩步驟中淘汰了大量不相關菌株，使進入復篩步驟的菌株數量大大降少，減輕了復篩工作量。在初篩步驟中獲得的菌株，再經過復篩過程，從而確定出能以順丙烯磷酸為底物生成左旋磷霉素的菌株。復篩步驟中采用的培養(yǎng)基是以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基。
本發(fā)明的具體操作步驟如下一、制備土壤懸液稱取土壤樣品5g，放入盛有100mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的250mL的三角瓶中，置搖床振蕩30min，使土壤樣品在水中分散均勻，制成為土壤懸液。
二、初篩1.順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基配方如下按重量百分數計，(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復合液0.1％，順丙烯磷酸1.0％，余量為蒸餾水。pH 7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘。其中，維生素復合液的組成如下按重量百分數計，葉酸0.002‰、生物素0.002‰、維生素B60.01‰、維生素B10.005‰、泛酸鈣0.005‰、維生素B20.005‰、維生素B120.0001‰，余量為蒸餾水。維生素復合液須經0.2μm濾膜過濾除菌，并在培養(yǎng)基滅菌后以無菌操作加入。
2.初篩過程吸取0.1mL土壤懸液，加到順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。倒置于37℃培養(yǎng)5～7天。每天觀察菌落生長狀況。
3.初篩獲得菌株的分離純化并保藏菌種分離純化培養(yǎng)基配方如下按重量百分數計，(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，pH 7.2-7.4，維生素復合液0.1％，酵母膏0.1％，順丙烯磷酸0.3％，余量為蒸餾水。121℃滅菌20分鐘。
挑取在順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落，劃線接種于上述分離純化培養(yǎng)基斜面上進行純化，然后再接種于相同培養(yǎng)基斜面上進行保藏。
二、復篩1.以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方按重量百分數計，順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8％，余量為蒸餾水。115℃滅菌30分鐘。
瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，于每個直徑90mm平皿中倒入25mL，靜置凝固。凝固后，用打孔器打出瓊脂塊(直徑6mm，高8mm)，然后在其表面接種初篩步驟中獲得的待檢測菌株，置于30℃，75％-85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
2.磷霉素轉化菌株的檢定生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備培養(yǎng)基I成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為蒸餾水，pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為蒸餾水，pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘。將200mL融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤(20×30cm)，制成下層平板；再將100mL融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液1mL，迅速混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板。
磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下(30W，40cm)滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于涂布了指示菌的生物鑒定盤上，37℃培養(yǎng)16hr。觀察并測量抑菌圈直徑。依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
所述指示菌為大腸桿菌(E.coli)，指示菌培養(yǎng)與懸液的配制如下指示菌培養(yǎng)基組成按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來水。加熱溶解后，調pH 7.0-7.2。裝入茄型瓶90mL，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆谩?br> 指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的制備把100mL滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的空錐瓶中，測定吸光度(O.D.值)為0.54-0.57。
實施例將采集自不同位點的五種土壤樣品制成土壤懸液，經過初篩步驟，獲得了180余株細菌菌株，這些菌株再經過復篩步驟，發(fā)現其中有30余株細菌有明顯的抑菌圈。經過薄層層析檢驗，證明了這些菌株是通過轉化順丙烯磷酸為左旋磷霉素而呈現抑菌圈的。
權利要求
1.一種以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株篩選方法，其特征在于包括初篩和復篩兩個步驟，復篩過程中以初篩過程中所獲得的菌株為出發(fā)菌株；在初篩中采用以順丙烯磷酸為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，該選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)出那些能夠以順丙烯磷酸為底物進行生長的菌株；復篩所采用培養(yǎng)基是以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述初篩步驟如下1)順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基按重量百分數計，順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基具有如下配方(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復合液0.1％，順丙烯磷酸0.3～2.0％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘，備用；2)初篩過程吸取土壤懸液，加到順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，倒置于37℃培養(yǎng)5～7天；3)初篩獲得菌株的分離純化并保藏菌種按重量百分數計，分離純化培養(yǎng)基配方如下(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復合液0.1％，酵母膏0.1％，順丙烯磷酸0.3％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘；挑取在順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落，劃線接種于上述分離純化培養(yǎng)基斜面上進行純化，然后再接種于相同培養(yǎng)基斜面上進行保藏。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述復篩步驟如下1)以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基按重量百分數計，復篩中的順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基具有如下配方順丙烯磷酸0.3～1.0％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.2-7.4，115℃滅菌30分鐘，備用；2)瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，靜置凝固后，用打孔器打出瓊脂塊，然后在其表面接種初篩步驟中獲得的待檢測菌株，置于30℃，75％-85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于經復篩獲得磷霉素轉化菌株的檢定包括如下步驟1)生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備培養(yǎng)基I成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分按重量百分數計，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板；2)磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于生物鑒定盤上，37℃培養(yǎng)16小時，觀察并測量抑菌圈直徑，依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物轉化/生物催化技術、微生物菌株篩選領域，具體為一種以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株的篩選策略及方法。該篩選策略及具體操作方法在篩選過程中包括了初篩和復篩兩個步驟。在初篩中采用了以順丙烯磷酸為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，使樣品中占絕大多數的不相關微生物被淘汰掉。復篩中以初篩中獲得的菌株為出發(fā)菌株，采用以順丙烯磷酸為底物的左旋磷霉素生物轉化菌株固體培養(yǎng)基，進一步篩選出左旋磷霉素生物轉化菌株。由于有了初篩中的先期淘汰，從而大大減少了復篩工作量，使篩選工作的整體效率大為提高。
文檔編號C12N1/00GK1673344SQ200510045889
公開日2005年9月28日 申請日期2005年2月18日 優(yōu)先權日2005年2月18日
發(fā)明者徐慧, 李智峰, 張雪姝, 張穎, 陳冠雄, 張忠澤, 紀悅, 王蘭君, 陳玉 申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所