專利名稱：：以bcip/nbt為底物的顯色蛋白芯片及其在自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白芯片及其應(yīng)用，尤其是及一種以BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色蛋白芯片及其在自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用；屬生物芯片和診斷試劑等
技術(shù)領(lǐng)域：
。(二)
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(AID)可累及多器官、多系統(tǒng)，對(duì)患者造成的危害極大。近年來，AID的發(fā)病率呈明顯上升，約占世界總?cè)丝诘?%5%，我國患者約超過12000萬。自身抗體的出現(xiàn)是AID最重要的特征，自身抗體的檢測(cè)不僅對(duì)AID的早期診斷具有重要作用，而且在疾病分型、判斷預(yù)后和治療效果監(jiān)測(cè)等多方面具有重要的意義。目前臨床上開展的自身抗體檢測(cè)方法主要有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法、免疫沉淀法等，其中多數(shù)檢測(cè)方法仍以手工操作為主，檢測(cè)程序較復(fù)雜，且多數(shù)檢測(cè)方法不能同時(shí)檢測(cè)多種自身抗體，檢測(cè)結(jié)果受到檢測(cè)方法、試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)等諸多因素的影響；因此，臨床迫切需要一種操作簡便，快速可靠，能同時(shí)檢測(cè)多種自身抗體的新方法。蛋白芯片具有的高通量、平行檢測(cè)、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，為簡便、快速、同時(shí)檢測(cè)多種自身抗體的解決帶來了希望。目前國外Zeus公司等已經(jīng)構(gòu)建了包括10種自身抗原的蛋白芯片，且在自身免疫疾病中的檢測(cè)中結(jié)果與傳統(tǒng)方法的結(jié)果相似，國內(nèi)也有相關(guān)方面的研究，但是蛋白芯片的檢測(cè)均是采用熒光檢測(cè)的方法。該方法雖然靈敏度好，但需要專用的掃描儀，對(duì)于基層的檢驗(yàn)單位卻難以全面實(shí)現(xiàn)，使應(yīng)用受到了限制。NBT/BCIP顯色方法是一種常用的、穩(wěn)定的檢測(cè)系統(tǒng)，底物反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色或紫色，既可定性又可定量，作為終點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)廣泛的應(yīng)用在免疫組織化學(xué)、原位雜交、Westernblot等檢測(cè)中，在實(shí)驗(yàn)室和臨床上應(yīng)用廣泛。然而，經(jīng)檢索NBT/BCIP顯色方法在蛋白芯片中的應(yīng)用至今國內(nèi)外還沒有相關(guān)的報(bào)道，因此，有必要將這種常用的檢測(cè)方法和新的蛋白芯片技術(shù)體系結(jié)合，開發(fā)更適用于不同級(jí)別臨床檢測(cè)需要的簡便、快速、同時(shí)檢測(cè)多種抗體或抗原的蛋白芯片。(三)
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和臨床診斷的實(shí)際需要，本發(fā)明要解決的問題是提供一種以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片及其在自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明所述以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片，由基片和陣列涂布于其上的12種抗原以及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照制成，其特征在于所述基片是APES修飾的玻片；所述12種抗原的種類及其點(diǎn)樣濃度為ANA:520ng/ml，Ro-60/SSa:465ug/ml，La/SSb:530卩g/ml，Jo—1:530卩g/ml'Scl—70:525ug/ml，Sm:520ug/ml，Ro—52/SSa:615tig/ml，RF:340yg/ml，CCP:465pg/ml，ulRNP:410iig/ml，CENP-B:490ug/ml，dsDNA:580"g/ml;所述陰性對(duì)照為5ug/mlHumanIgG;所述陽性對(duì)照為250yg/mlHumanIgG;所述空白對(duì)照為含0.l%Tween20的TBST;所述陣列布局如圖1所示。本發(fā)明所述以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片在自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。其中所述芯片應(yīng)用方法是以BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色法作為蛋白芯片的終點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。.進(jìn)一步的所述芯片應(yīng)用方法是將制備好的蛋白芯片經(jīng)37。C溫育lh、37。C封閉30min、37。C與血清反應(yīng)30min、37。C與堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)30min、BCIP/NBT顯色2030min，用掃描儀掃描圖像，Totallab軟件進(jìn)行灰度分析、以同一芯片相應(yīng)區(qū)域的陰性、陽性對(duì)照的灰度值作為陰性和陽性的Cutoff值對(duì)結(jié)果判讀。其中所述掃描儀優(yōu)選采用UMAXPowerLookIII掃描儀。本發(fā)明的顯色反應(yīng)蛋白芯片能同時(shí)檢測(cè)多種自身免疫性抗體，包括定性和定量檢領(lǐng)1J，極適用于基層的臨床檢測(cè)應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明所述的顯色反應(yīng)蛋白芯片技術(shù)體系能進(jìn)一步研究開發(fā)包括檢測(cè)其他抗體、抗原及其他蛋白的蛋白芯片及相應(yīng)的應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的顯色蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，兩者具有較高的符合率。說明采用以BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色法作為終點(diǎn)信號(hào)的檢測(cè)是可行的。建立的顯色反應(yīng)蛋白芯片技術(shù)體系與現(xiàn)有的蛋白芯片技術(shù)相比，具有檢測(cè)成本低、易于向基層推廣等優(yōu)點(diǎn)，且該顯色蛋白芯片具有較高的敏感性和特異性，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)體系。適用于臨床檢測(cè)，衛(wèi)生監(jiān)督，海關(guān)檢疫及科研等廣泛的領(lǐng)域。(四)圖1為本發(fā)明的蛋白芯片陣列分布圖，其中l(wèi)為陽性對(duì)照l;2為陽性對(duì)照2;3為陰性對(duì)照；4為空白對(duì)照；516依次為抗原ANA、Ro-60/SSa、La/SSb、Jo-1、Scl-70、Sm、Ro-52/SSa、RF、CCP、ulRNP、CENP-B和dsDNA。圖2為點(diǎn)樣液優(yōu)化陣列分布圖，從左到右AF依次為含0.1%、0.02%、0.04%、0.1%、0.2%、0.4XTween20的TBST;從上到下①PC;②NC;③BC;④⑩為抗原的濃度梯度，依次為50ug/ml、'100ug/ml、200ug/ml、300yg/ml、500ug/ml750iig/ml、1000ug/ml;其中，I為H腿nigG，nvi為單種抗原。圖3為芯片抗原濃度、陽性對(duì)照優(yōu)化陣列分布圖，.其中A1A9為HumanIgG，濃度依次為5、20、50、100、200、300、500、750、1000yg/ml;B1B9:為分別優(yōu)化的12種抗原，濃度依次為5、20、50、100、200、300、500、750、1000ug/ml。圖4為芯片陰性對(duì)照優(yōu)化陣列分布圖，其中AlA6為HumanIgG，濃度依次為5、10、20、50、100、200ug/ml;B1B6:ANA、Ro-60/SSa、La/SSb、Jo—1、Scl-70、Sm;C1C6:Ro-52/SSa、RF、CCP、ulRNP、CENP-B、dsDNA。圖5為12種抗原的點(diǎn)樣液優(yōu)化結(jié)果(血清稀釋度1:4)掃描圖像。圖6為HumanIgG和12種抗原濃度-灰度線性關(guān)系擬合結(jié)果。圖7為抗原濃度和陽性Cutoff值確定法示意圖。圖8為芯片對(duì)SLE(A)、RA(B)和MCTD(C)各一例患者血清樣本檢測(cè)結(jié)果，其中A:ANA、抗Ro-60/SSa抗體、抗Ro-52/SSa抗體、抗ulRNP抗體陽性，抗Sm抗體、抗dsDNA抗體弱陽性；B:RF、抗CCP抗體陽性，ANA弱陽性;C:ANA、抗ulRNP抗體陽性，抗Ro-60/SSa抗體、抗Ro-52/SSa抗體弱陽性。具體實(shí)施方式實(shí)施例1以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片1.APES修飾基片的制備①將玻片清洗甩干后，強(qiáng)堿(10MNaOH)浸泡24小時(shí)；②用去離子水沖洗3次，每次10分鐘，再乂強(qiáng)酸(濃鹽酸)中浸泡24小時(shí)；③用去離子水沖洗3次，每次10分鐘，離心機(jī)甩干，入2XAPES丙酮溶液中停留3040秒，拿出稍停片刻，再入純丙酮溶液中涮去未結(jié)合的APES，在入去離子水中涮去多余的丙酮；④離心機(jī)甩干備用，注意防塵。2.抗原的選擇本發(fā)明選擇了臨床上常用的用于自身抗體檢測(cè)的12種抗原，其中Ro-52/SSa、La/SSb、Jo-1和GoatIgG購自sigma;Ro-60/SSa、Scl-70、CENP-B和ulRNP購自Diarect;Sm購自Immunovision;抗環(huán)卩瓜氨酸多肽(CCP)采用商業(yè)合成；ANA和dsDNA以如下方法制備ANA制備方法培養(yǎng)H印-2細(xì)胞，待細(xì)胞長到一定數(shù)量時(shí)，用PBS洗一次，用EDTA溶液處理細(xì)胞(盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免造成目的蛋白的降解)，吹打后收集細(xì)胞；800rpm離心5min，棄上清，加入200u1添加了PMSF的細(xì)胞槳蛋白裂解液A(細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Vortex5秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開；離心去上清、(洗細(xì)胞)，加入60ul細(xì)胞漿蛋白裂解液A，最高速Vortex5秒，冰浴10分鐘，最高速Vortex5秒，4:C14000rpm離心10分鐘；棄上清(完全吸干凈)，加入50y1添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白裂解液B，最高速Vortex5秒，放入冰浴中，每隔5分鐘再高速劇烈Vortex15-30秒，共40分鐘；4°C14000rpm離心10分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的EP管中，即為抽提得到的核蛋白，濃縮后(終濃度為1000iig/ml)備用。dsDNA制備方法采用BloodDNAKit(OMGEA)提取人全血DNA,取250u1全血至EP管中，加入BLBuffer250ul和25ul^20mg/ml)蛋白酶K,Vortex5秒，70°C水浴10分鐘，中間取出渦旋一次；加250ul異丙醇，顛倒混勻；上柱，8000g離心l分鐘；棄去接受管，將柱子置于新的接收管上，加入500ylHBBuffer,8000g離心1分鐘；倒掉液體，加入750u1WashBuffer(已加異丙醇)，8000g離心l分鐘，重復(fù)一次；倒掉液體，10000g空柱離心2分鐘；加50y1ElutionBuffer,置柱中間，室溫放置兩分鐘；將柱放入1.5ulEP管中，8000g離心l分鐘；將EP管中的液體再吸入柱中間，室溫放置2分鐘8000g離心l分鐘，所得到的液體即為dsDNA，濃縮后(終濃度為1000ug/ml)備用。'3.點(diǎn)樣本發(fā)明的點(diǎn)樣液為含0.l%Tween20的TBST，12種抗原的點(diǎn)樣濃度如表1所示，用Cartisian5500點(diǎn)樣儀按照?qǐng)D1所示陣列布局圖點(diǎn)樣。表l:12種P抗原的點(diǎn)杉,濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>4.樣品檢測(cè)本發(fā)明將點(diǎn)制好的蛋白質(zhì)微陣列在37'C雜交盒中溫孵lh，用封閉液(0.01mol/LPBS，含0.l%Tween-20，2.5%蔗糖)封閉30min，PBST洗三次，每次15s，離心機(jī)鬼干，每個(gè)陣列中加入l:4稀釋的待測(cè)血清，37。C溫孵30min,PBST洗三次，方法同前，每個(gè)陣列中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，37r溫孵30min,PBST洗三次，方法同前，BCIP/NBT顯色2030min，UMAXPowerLookIII掃描儀掃描圖像，Totallab軟件進(jìn)行結(jié)果判讀。實(shí)施例2優(yōu)化方案選擇試驗(yàn)1.點(diǎn)樣液的優(yōu)化選擇含不同濃度Tween20的TBST為點(diǎn)樣液，以APES修飾玻片作為基片，以Cartisian5500點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，陣列布局如圖2所示。每個(gè)樣品點(diǎn)重復(fù)4次，選擇既可以很好的固定抗原，又可以提高檢測(cè)靈敏性的點(diǎn)樣液作為芯片的點(diǎn)樣液。2.血清稀釋度的優(yōu)化將標(biāo)準(zhǔn)抗體血清用PBS稀釋，稀釋度分別為l:]，1:2，1:4，1:8,1:]6，1:32，在同一張基片上，每一陣列與一種稀釋度的血清反應(yīng)；選擇信噪比最高的血清稀釋度作為芯片的血清反應(yīng)稀釋度。3.12種抗原的點(diǎn)樣濃度和陽性Cutoff值、陰性Cutoff值的確定本發(fā)明用優(yōu)化好的點(diǎn)樣液按照?qǐng)D3所示點(diǎn)制芯片(每個(gè)樣品點(diǎn)重復(fù)4次)，在優(yōu)化好的血清稀釋度(其余條件相同)下檢測(cè)A工D陽性血清240份(每種自身抗體檢測(cè)20份)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。在抗原的濃度-灰度值線性范圍之內(nèi)選取連續(xù)的34個(gè)信噪比高、均一穩(wěn)定的濃度點(diǎn)，以單側(cè)99.5^的可信限分別確定每個(gè)濃度點(diǎn)的Cutoff值(灰度值)，通過H咖anlgG的濃度-灰度標(biāo)準(zhǔn)曲線(相同檢測(cè)條件下)，選取12種抗原的線性Cutoff值范圍內(nèi)所共有的最低灰度值作為芯片的Cutoff值，該灰度值對(duì)應(yīng)的每個(gè)抗原的濃度即為芯片中該抗原的點(diǎn)樣濃度，對(duì)應(yīng)的H匿anIgG的濃度為芯片的陽性對(duì)照n中HumanIgG的濃度，即為芯片的陽性Cutoff值；陽性對(duì)照I中HumanlgG的濃度是根據(jù)"灰區(qū)"(陽性Cutoff值和陰性Cutoff值之間的區(qū)域)的大小，綜合考慮假陽性和假陰性率的情況下確定，既為強(qiáng)陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，又為芯片的質(zhì)控區(qū)。陰性對(duì)照的確定用優(yōu)化好的點(diǎn)樣液和抗原濃度按照?qǐng)D4所示陣列點(diǎn)制芯片(每個(gè)樣品點(diǎn)重復(fù)4次)，在優(yōu)化好的血清稀釋度(其余條件相同)下檢測(cè)AID陰性血清(來自健康獻(xiàn)血員，經(jīng)過相同的檢測(cè)方法，不含有該12種自身抗體的陰性血清標(biāo)本)IOO份，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。以單側(cè)99.5。/。的可信限確定每個(gè)抗原的陰性Cutoff值，計(jì)算它們的均值，在綜合考慮標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)的情況下得出一個(gè)共同的陰性Cutoff值，通過HumanIgG的濃度-灰度標(biāo)準(zhǔn)曲線(相同檢測(cè)條件下)，以相同灰度值所對(duì)應(yīng)的HumanIgG濃度作為芯片陰性對(duì)照中HumanIgG的濃度，即為芯片的陰性Cuttoff值。優(yōu)化結(jié)果確定l.芯片制備條件的優(yōu)化結(jié)果通過對(duì)5種點(diǎn)樣液和6種血清稀釋度的比較，篩選出信噪比最高的血清稀釋度為1:4，最佳的點(diǎn)樣液為含0.l!Tween20的TBST，如圖5所示。芯片的HumanIgG和12種抗原(點(diǎn)樣液為含O.1。/。Tween20的TBST，血清稀釋度為1:4時(shí))的濃度-灰度值線性關(guān)系如圖6所示，R2均大于0.97,線性關(guān)系較好，說明該芯片在我們所選擇范圍的抗原濃度下可以進(jìn)行血清中相應(yīng)抗體的定性和半定量檢測(cè)。1.2抗原濃度及陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的優(yōu)化結(jié)果通過對(duì)12種抗原的線性Cutoff值的綜合分析，如圖7所示，分別確定了每種抗原的點(diǎn)樣濃度及陽性Cutoff值和陰性Cutoff值。2.芯片對(duì)血清標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)用結(jié)果采用本發(fā)明的顯色蛋白芯片共檢測(cè)了678份AID陽性血清和120份陰性血清，檢測(cè)結(jié)果見表2.表2:自身免疫性疾病抗體檢測(cè)芯片檢測(cè)臨床標(biāo)本結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*針對(duì)12個(gè)指標(biāo)采用SPSS10.0forWindows軟件分別進(jìn)行配對(duì)x2檢驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)果顯示本發(fā)明的顯色蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，兩者具有較高的符合率。如圖8顯示1例SLE、1例RA和1例MCTD患者血清樣本檢測(cè)結(jié)果。綜上，本發(fā)明的以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片與臨床常規(guī)檢測(cè)方法相比符合率較高，說明采用以BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色法作為終點(diǎn)信號(hào)的檢測(cè)是可行的。建立的顯色反應(yīng)蛋白芯片技術(shù)體系與現(xiàn)有的蛋白芯片技術(shù)相比，具有檢測(cè)成本低、易于向基層推廣等優(yōu)點(diǎn)，且該顯色蛋白芯片具有較高的敏感性和特異性，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)體系。'權(quán)利要求1.一種以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片，由基片和陣列涂布于其上的12種抗原以及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照制成，其特征在于所述基片是APES修飾的玻片；所述12種抗原的種類及其點(diǎn)樣濃度為ANA520μg/ml，Ro-60/SSa465μg/ml，La/SSb530μg/ml，Jo-1530μg/ml，Scl-70525μg/ml，Sm520μg/ml，Ro-52/SSa615μg/ml，RF340μg/ml，CCP465μg/ml，u1RNP410μg/ml，CENP-B490μg/ml，dsDNA580μg/ml；所述陰性對(duì)照為5μg/mlHumanIgG；所述陽性對(duì)照為250μg/mlHumanIgG；所述空白對(duì)照為含0.1％Tween20的TBST；所述陣列布局如圖1所示。2.權(quán)利要求1所述以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片在自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述芯片應(yīng)用方法是以BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色法作為蛋白芯片的終點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述芯片應(yīng)用方法是將制備好的蛋白芯片經(jīng)37。C溫育lh、37。C封閉30min、37。C與血清反應(yīng)30min、37。C與堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)30min、BCIP/NBT顯色2030min，用掃描儀掃描圖像，Totallab軟件進(jìn)行灰度分析、以同一芯片相應(yīng)區(qū)域的陰性、陽性對(duì)照的灰度值作為陰性和陽性的Cutoff值對(duì)結(jié)果判讀。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述掃描儀采用UMAXPowerLookIII掃描儀。全文摘要本發(fā)明公開了一種以BCIP/NBT為底物的顯色蛋白芯片，由基片和陣列涂布于其上的12種抗原以及陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照制成，其中所述基片是APES修飾的玻片；所述12種抗原的種類及其點(diǎn)樣濃度為ANA520μg/ml，Ro-60/SSa465μg/ml，La/SSb530μg/ml，Jo-1530μg/ml，Scl-70525μg/ml，Sm520μg/ml，Ro-52/SSa615μg/ml，RF340μg/ml，CCP465μg/ml，u1RNP410μg/ml，CENP-B490μg/ml，dsDNA580μg/ml。本發(fā)明用BCIP/NBT為底物的堿性磷酸酶顯色法作為蛋白芯片的終點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)能廣泛應(yīng)用于自身抗體檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度與目前的檢測(cè)方法相比有較高的符合率，但檢測(cè)成本和時(shí)間明顯縮短。本發(fā)明的技術(shù)體系還能適用于臨床檢測(cè)，衛(wèi)生監(jiān)督，海關(guān)檢疫及科研等領(lǐng)域。文檔編號(hào)G01N33/53GK101226192SQ20081001414公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月3日優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日發(fā)明者王國強(qiáng),韓金祥,高雪芹申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心