專利名稱：新的肽酶底物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的化合物，其可用作PH指示劑和/或用作檢測肽酶活性的酶底物。 這些底物可用于包括產(chǎn)生物理化學(xué)信號的酶促水解步驟的應(yīng)用中，特別用于微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、組織學(xué)等中。本發(fā)明還涉及包含所述底物的反應(yīng)培養(yǎng)基、所述底物或者所述培養(yǎng)基用于檢測肽酶活性和/或區(qū)分革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌的用途，還涉及使用方法。
背景技術(shù)：
目前已有大量用于檢測微生物的培養(yǎng)基。這種檢測具體地可基于使用對期望檢測的微生物的酶具有特異性的特定底物。一般而言，制備酶的合成底物以使該底物與其靶酶代謝的產(chǎn)物具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，從而可區(qū)分它們，并且評價是否全部或者部分的底物已被酶轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。水解酶底物通常由對要顯示的酶活性特異性的第一部分以及用作標(biāo)記物的第二部分(通常是發(fā)色或者發(fā)熒光的)組成。因此，在細(xì)菌的情況中，通過選擇底物， 根據(jù)是否存在反應(yīng)，可表征微生物的性質(zhì)。肽酶活性可具體用來顯示細(xì)菌的群、屬或者種。 因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使得可以區(qū)分革蘭氏陰性細(xì)菌與革蘭氏陽性細(xì)菌。用于檢測肽酶活性的酶發(fā)色底物是本領(lǐng)域已知的。可具體提及的是Manafi的文章(Manafi等人，Microbiol Rev 55(3) :335_348，1991)，這是關(guān)于用于微生物學(xué)的酶底物的綜述。但是，所述的氨肽酶底物通過水解釋放擴(kuò)散于培養(yǎng)基中的化合物(β_萘基胺， 7-氨基-4-甲基香豆素)。因此，在非均相反應(yīng)培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿上的菌落、組織切片等) 中，不可能準(zhǔn)確定位水解的位置。還可提及由本申請人提交的專利申請WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是，雖然這些底物少量擴(kuò)散于培養(yǎng)基中，但是它們具有某些缺點(diǎn)它們難以合成，純度低，收率低，并且它們對某些微生物具有毒性。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提出新的化合物的用途，其用作ρΗ指示劑，或者用作肽酶底物，能夠用來檢測微生物。較之現(xiàn)有的底物，這些新的化合物易于合成，并且可具體地用于凝膠化的培養(yǎng)基中來檢測微生物，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的顯色在反應(yīng)培養(yǎng)基中少量或者根本不擴(kuò)散。在用作酶底物的情況中，這使得能夠在不表達(dá)肽酶活性的其他菌落或細(xì)胞器中準(zhǔn)確地定位表達(dá)肽酶活性的菌落或者細(xì)胞器。在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，為了便于公開本發(fā)明而作出以下定義。術(shù)語“_底物”是指這樣底物，其可被酶水解成允許直接或間接地檢測微生物、細(xì)胞或細(xì)胞器的產(chǎn)物。所述底物具體地包含對要顯示的酶活性特異性的第一部分以及用作標(biāo)記物的第二部分。本發(fā)明的用作底物的化合物適合用于流式細(xì)胞術(shù)，由于水解的產(chǎn)物主要保持位于表達(dá)酶活性的細(xì)胞中，因此可特異性地對表達(dá)此活性的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，乃至將它們從樣品的其余部分分離。
本發(fā)明的用作底物的化合物還非常適合用于組織酶學(xué)，由于水解的產(chǎn)物主要保持在水解的位置處，因此可特異性地鑒定在組織內(nèi)表達(dá)此活性的細(xì)胞或者細(xì)胞器。本發(fā)明的化合物由于它們的低毒性而非常適合分別用作pH指示劑，或者監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)物中的肽酶活性。本發(fā)明的化合物特別適合用于檢測和/或鑒定培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生不擴(kuò)散于反應(yīng)培養(yǎng)基中的顯色或者熒光。 在本發(fā)明中，術(shù)語“顯色”涵蓋染色、吸收可見光譜的光或者熒光，以及在一種波長吸收(λ ex)并在更高的波長發(fā)射(λ Μ，λ Μ > λ ex)。本發(fā)明的化合物可成鹽，即為鹽的形式，例如，氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸鹽。術(shù)語“pH指示劑”是指顏色和/或熒光隨著培養(yǎng)基的PH改變而改變的化學(xué)物質(zhì)， 其中所述PH改變?nèi)芜x地與在所述培養(yǎng)基上生長的微生物的代謝相關(guān)。術(shù)語“M”是指能夠通過水解切割肽的?；鶜埢c伯胺之間形成的酰胺基團(tuán)的酶。術(shù)語“MM”是指能夠通過水解切割氨基酸的酰基與伯胺之間形成的酰胺基團(tuán)的酶。 在本申請中，術(shù)語“肽酶”可適當(dāng)?shù)乇硎疽陨隙x的肽酶和氨肽酶。術(shù)語“肽”是指包含1-10個氨基酸，優(yōu)選1-4個氨基酸的肽鏈。優(yōu)選地，所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。術(shù)語“a^M”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何天然的或者非天然的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，所述氨基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸，或者甘氨酸、焦谷氨酰基等。所述肽可包含在其N末端的封端劑。本發(fā)明的封端劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠保護(hù)胺的任何封端劑。作為實(shí)例，可提及叔丁氧羰基(N-tB0C)、9-芴基氧基羰基、增溶劑如琥珀酰基，或者不可代謝的氨基酸，即非天然的氨基酸如2-哌啶酸，或者氨基酸的D形式如D-苯丙氨酸。封端劑并非系統(tǒng)地存在于本發(fā)明的化合物中。術(shù)語“烷基基團(tuán)”是指基于飽和烴基團(tuán)的鏈，具體而言，例如,C1-C6烷基，即含有 1-6個碳原子的直鏈或支鏈的烷基。作為實(shí)例，可提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基。術(shù)語“芳基基團(tuán)”是指衍生自芳香族核，具體而言，例如C6-Cltl芳香族核的官能團(tuán) (或取代基)，特別是苯基、芐基、I"萘基或者2-萘基。術(shù)語“羧基基團(tuán)”是指，具體而言,由通過雙鍵與第一氧原子鍵合并通過單鍵與第二氧原子鍵合的碳原子組成的官能團(tuán)，其本身帶負(fù)電荷或者與氫原子相連。取決于分子的 PKa和培養(yǎng)基的pH，羧基基團(tuán)可以是電離的形式，即不含有與第二氧原子相連的H，由此帶負(fù)電荷。術(shù)語“反應(yīng)培養(yǎng)基”是指這樣的培養(yǎng)基,其包含微牛物、細(xì)胞或者細(xì)胞器的代謝表達(dá)和/或生長所需的所有組分。反應(yīng)培養(yǎng)基可用于流式細(xì)胞術(shù)、組織酶學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等，或者用作檢測和/或鑒定微生物的培養(yǎng)基。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可包含一種或者多種組分的組合，例如，氨基酸、胨、糖、核苷酸、 礦物質(zhì)、維生素、抗生素、表面活性劑、緩沖劑、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽或者金屬鹽。所述培養(yǎng)基還可包含染料。作為染料的實(shí)例，可提及伊文思藍(lán)、中性紅、羊血、馬血、遮光劑如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠等。
所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以是固體、半固體或者液體。術(shù)語“固體培養(yǎng)基”是指，例如凝膠化的培養(yǎng)基。瓊脂是常規(guī)的凝膠劑，在微生物學(xué)中用于培養(yǎng)微生物，但是可使用明膠或者瓊脂糖?？缮藤彨@得某些配制品，例如，Columbia瓊脂、Trypcase-soy瓊脂、MacConkey瓊月旨、Sabouraud瓊脂，或者，更概括地，Handbook of Microbiological Media (CRC Press)中所述的那些。所沭反應(yīng)培養(yǎng)基可以是檢測和/或鑒定培養(yǎng)基,即，顯示培養(yǎng)基或者培養(yǎng)且顯示的培養(yǎng)基。在第一種情況中，微生物的培養(yǎng)在接種之前進(jìn)行；在第二種情況中，檢測和/或鑒定培養(yǎng)基也構(gòu)成培養(yǎng)基。術(shù)語“^li^M^”是指臨床樣品，其來源于生物學(xué)流體的樣本或者食物樣品，來源于任何類型的食物，或者來源于任何化妝品或藥物制劑的化妝品或藥物樣品。因此，樣品可以是液體或者固體，并且可非限制性地提及，血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品，鼻、咽喉、皮膚、傷口或者腦脊髓流體樣本的臨床樣品，來自水、飲料如乳品或果汁、酸奶、肉類、蛋類、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚類等的食物樣品；來源于動物飼料的食物樣品，具體而言，例如來源于動物食物的樣品。所述樣品還可來源于臨床環(huán)境樣本、家畜樣本，或者食物、化妝品或藥物生產(chǎn)的樣本。術(shù)語“環(huán)境樣本”具體是指表面、液體、原料或者產(chǎn)品的樣本。因此，術(shù)語 “樣品”是指樣本本身(拭子、糞便、食物等)和由所述樣本而得的微生物菌落(例如在凝膠化的培養(yǎng)基上分離后)，或者包含由所述樣本而得的微生物的培養(yǎng)基(例如用所述樣本接種的富集培養(yǎng)液)。對于本發(fā)明，術(shù)語“微牛物”涵蓋細(xì)菌、酵母、霉菌，更概括而言，有機(jī)體，其通常是單細(xì)胞的有機(jī)體，并且是裸眼不可見的，可在實(shí)驗(yàn)室中對其進(jìn)行倍增或者操作。作為革蘭氏陰性細(xì)菌，可提及以下屬的細(xì)菌假單胞菌屬(I^seudomonas)、 埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、 J ff ^ M (Enterobacter)、 3 胃 白 ft 胃 M (Klebsiella) > ^ W K ^ M (Serratia)、 變形菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、伯克霍爾德氏菌屬(Burldiolderia)、檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、 產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、博德特氏菌屬(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)禾口軍團(tuán)菌屬(Legionella)。作為革蘭氏陽性細(xì)菌，可提及以下屬的細(xì)菌氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、庫克菌屬(Kocuria)、乳球菌屬 (Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、Falkamia、孿生球菌屬(Gemella)、片球菌屬(Pediococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)禾口棒桿菌屬 (Corynebacterium)0
作為酵母，可提及以下屬的酵母假絲酵母屬(Candida)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、酵母屬(Saccharomyces)禾口絲抱酵母屬(Trichosporon)。優(yōu)選地，所述微生物選自大腸桿菌(Escherichia coli)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)、弗氏梓樣酸桿菌(Citrobacter freundii)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)禾口糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)。在此方面，本發(fā)明涉及式⑴的化合物及其鹽作為檢測肽酶活性和/或PH變化的酶底物的用途
權(quán)利要求
1.式⑴的化合物及其鹽作為檢測肽酶活性和/或PH變化的酶底物的用途
2.如權(quán)利要求1所述的式I的化合物的用途，其中Y1是肽，優(yōu)選選自丙氨酸和甘氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的式I的化合物的用途，其中η= 1。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的式I的化合物的用途，其中m和W4獨(dú)立地為H0
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的式I的化合物的用途，其中U是CZ4，優(yōu)選CH。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的式I的化合物的用途，其中V是N+R，優(yōu)選N+CH3。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的式I的化合物的用途，其中W、Z3和\是H。
8.如權(quán)利要求1所述的式I的化合物的用途，其中所述化合物選自甘氨?；?4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺TFA、β -丙氨酰基_4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鐺氯化物和L-丙氨?；鵢4-(4’ -酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季銨化)。
9.檢測微生物中的肽酶活性和/或PH變化的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)提供檢測和/或鑒定培養(yǎng)基，其包含式(I)的化合物及其鹽
10.區(qū)分細(xì)菌屬于革蘭氏陽性細(xì)菌或者革蘭氏陰性細(xì)菌的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)提供檢測和/或鑒定培養(yǎng)基，其包含式(I)的化合物及其鹽
11.用于檢測和/或鑒定微生物的培養(yǎng)基，其包含用于檢測肽酶活性和/或PH變化的式(I)的化合物及其鹽
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的化合物及其鹽用于檢測肽酶活性和/或pH變化的用途其中Y1是肽、H或者烷基；W1、W2、W3和W4獨(dú)立地為H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基團(tuán)的任何組合；n＝0、1或者2；U和V是N、N+R或者CZ4，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷?；蛘咄榛酋；?；Z1、Z2、Z3和Z4獨(dú)立地為H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺?；?，包括該羧基或者磺?；孽セ蛘啧０?。
文檔編號C12Q1/37GK102482704SQ201080033829
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者A·詹姆斯, J·佩里, S·奧倫加, S·斯坦福斯, V·L·薩爾瓦圖拉 申請人:生物梅里埃公司