專利名稱：一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
纖維素是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子物質(zhì)，因而能降解纖維素的酶均非單一酶，而是一個復(fù)雜的多酶體系。纖維素酶是指能水解纖維素β-1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系，在工農(nóng)業(yè)諸多領(lǐng)域均廣泛的應(yīng)用。如纖維素酶可將農(nóng)作物秸桿、蔗渣等工農(nóng)業(yè)廢棄物生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖，再經(jīng)其它微生物進一步轉(zhuǎn)化為酒精、單細胞蛋白等生物化工產(chǎn)品。此外纖維素酶還可用于醫(yī)藥、印染、茶葉加工等方面。纖維素酶主要包括三類酶組分葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖苷酶或稱纖維二糖酶，三種酶共同存在并協(xié)同作用才能將晶體纖維素水解為葡萄糖。細菌、真菌、放線菌等均能產(chǎn)生纖維素酶，而絲狀真菌生產(chǎn)纖維素酶具有以下特點纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和提?。划a(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生的纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)較為合理；同時可產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。目前一般用于工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶菌種為真菌，其中酶活力較強的菌株為木霉屬、曲霉屬和青霉屬。當前，在纖維素酶的工業(yè)化應(yīng)用中，由于其過高的應(yīng)用成本，直接限制了其推廣，同時也成為制約木質(zhì)纖維原料制取乙醇工業(yè)化瓶頸之一，如何降低纖維素酶的應(yīng)用成本，通常通過降低纖維素酶的生產(chǎn)成本、降低用量、回收利用等途徑達到。目前纖維素酶研究的熱點領(lǐng)域為制備低成本、高活力的纖維素酶；其研究手段主要為改進生產(chǎn)工藝、培育高產(chǎn)菌株。高產(chǎn)酶菌株的篩選往往周期長、結(jié)果不確定性大；而結(jié)合菌株特性，通過工藝改進達到提高酶活力、降低單位酶生產(chǎn)成本則易于實現(xiàn)。大量研究表明，纖維素酶作為一種誘導(dǎo)酶，在誘導(dǎo)物存在的情況下可大量產(chǎn)酶，但大多誘導(dǎo)物由于其水溶性差，且不能作為碳源直接利用，使其在工業(yè)化應(yīng)用中受限。目前能夠誘導(dǎo)纖維素酶的可溶性碳源有槐糖、山梨糖、龍膽二糖、纖維二糖、纖維低聚糖等，槐糖是公認的纖維素酶最有效的誘導(dǎo)物，但其價格昂貴，難以工業(yè)化應(yīng)用；能夠誘導(dǎo)纖維素酶并能工業(yè)化應(yīng)用的可溶性碳源主要是纖維二糖、纖維低聚糖等。在CN 101525606 A中公開了一種纖維素酶的制各方法，其包括以下步驟(I)培養(yǎng)皿液體菌種制備；(2)三角瓶種曲培養(yǎng)；(3)固態(tài)厚層通風發(fā)酵培養(yǎng)；(4)精制提純。它采用制備液體菌種、固態(tài)厚層通風發(fā)酵培養(yǎng)制取高活力纖維素酶，但是它采用的發(fā)酵物為米糠和麩皮，未能用到秸桿微晶纖維素，所以需要一種以可溶性碳源A和不溶性秸桿微晶纖維素作為誘導(dǎo)物并用而且大量生產(chǎn)的一種以底物誘導(dǎo)生產(chǎn)高效纖維素酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法， 即以綠色木霉(CGMCC編號NO. 5832)作為纖維素酶生產(chǎn)菌，以可溶性碳源A和不溶性秸桿微晶纖維素作為誘導(dǎo)物進行代謝過程調(diào)控，通過控制培養(yǎng)基組成、PH調(diào)控、通風比、誘導(dǎo)物流加方式等手段生產(chǎn)高活性纖維素酶。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供的利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)工藝步驟如下
(1)菌種制備選用綠色木霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培養(yǎng)、搖瓶擴大培養(yǎng)或種子罐擴大培養(yǎng)，制備所需液體菌種；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)將綠色木霉的液體菌種，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8 10%接種，28 30°C下通氣培養(yǎng),培養(yǎng)至40 60h后以流加補料的方式,流加以可溶性碳源A和微晶纖維素作為誘導(dǎo)物的補料培養(yǎng)基，流加速率4. O 28. 0L/h*m3發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束；整個培養(yǎng)過程米用流加氨水調(diào)控發(fā)酵pH在4. 2 4. 8 ;發(fā)酵時長為90 168h ;發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液過濾即得粗酶液，粗酶液可直接使用或經(jīng)濃縮后使用。本發(fā)明提供的菌種及培養(yǎng)基制備具體操作步驟如下
(I)斜面培養(yǎng)
馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA):將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200g，切成小塊，置于IL水中，煮沸30分鐘，8層紗布過濾，濾液中加入瓊脂18克，不斷攪拌至瓊脂完全融化，停止加熱；迅速加入IOg葡萄糖，攪拌使其溶解，補足水分至IOOOmL,適量分裝至試管或茄子瓶中，蓋上棉塞，于121°C下高壓蒸汽滅菌30分鐘。劃線接種綠色木霉于28 30°C下培養(yǎng)5 7天。⑵搖瓶培養(yǎng) 無菌條件下，將斜面菌種孢子接入三角瓶的種子培養(yǎng)基中，置于搖床，220rpm下，振蕩培養(yǎng)22 24h，培養(yǎng)溫度為28 30°C。⑶擴大培養(yǎng)
將搖瓶種子轉(zhuǎn)接于種子罐擴大培養(yǎng)18 24h，培養(yǎng)溫度28 30°C。以上所述種子培養(yǎng)基含有葡萄糖1. 0%,麩皮4. 0%, (NH4) 2S04 O. 6%，KH2PO4 O. 2%，CaCl2 O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 08%, pH 5· O。⑷液體發(fā)酵培養(yǎng)基
秸桿微晶纖維素2 6%，碳原Α0. 5 1. 0%，麩皮O. 5 1. 0%，玉米漿1. 5 2. 0%，(NH4)2SO4 O. 3 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 08%, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 1%，MnSO4O. 02 O. 04 %，F(xiàn)eSO4O. 02 O. 04 %，ZnSO4 · 7Η20 O. 04 O. 08 %，Cocl2 · 6 H2OO. 04 O. 08%。余量為水，制成混合漿料，調(diào)節(jié)pH在4. 4 5. 2之間，121 °C高壓蒸汽滅菌30分鐘。(5)補料培養(yǎng)基
可溶性碳源A 14 20%,秸桿微晶纖維素2 8%，玉米漿1. O 2. 0%，(NH4)2SO4 O. 4 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· I O. 2%，余量為水，制成混合漿料，121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘。纖維素酶作為一種復(fù)合酶，又是誘導(dǎo)酶，木霉生產(chǎn)纖維素酶通常受到底物的誘導(dǎo)，純的纖維素雖為較好的誘導(dǎo)物，但其價格貴，難以工業(yè)化應(yīng)用于纖維素酶的生產(chǎn)；而微晶纖維素，纖維含量高，是一種廣泛應(yīng)用的輔料；價格低廉，也可作為纖維素酶的誘導(dǎo)物利用，但其水溶性差，不易被菌體直接利用?？扇苄蕴荚碅是纖維二糖的結(jié)構(gòu)類似物，能夠迅速誘導(dǎo)纖維素酶的合成，且誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力高于纖維二糖，然而隨著A作為可溶性糖的不斷消耗，其誘導(dǎo)能力減弱，菌株產(chǎn)酶能力將下降。本發(fā)明以可溶性碳源的A和難溶性的秸桿微晶纖維素同時作為碳源和誘導(dǎo)物利用，既能滿足菌株生長所需速效碳源和長效碳源的雙重供應(yīng)，又能協(xié)同誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達大幅提高纖維素酶的發(fā)酵水平。本發(fā)明采用流加培養(yǎng)技術(shù)，以特定的流速加入誘導(dǎo)產(chǎn)酶的補料培養(yǎng)基，可避免因誘導(dǎo)物作為碳源被消耗而引起產(chǎn)酶能力的下降，從而持續(xù)不斷的提高菌株的產(chǎn)酶能力。本發(fā)明采用的底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)，酶活力達200IU/ml。本發(fā)明提供的方法對提高纖維素酶活力、降低纖維素酶的應(yīng)用成本具有顯著的作用，可操作性強，且在開發(fā)利用秸桿等天然纖維質(zhì)資源的同時，無環(huán)境污染，是促進秸桿乙醇產(chǎn)業(yè)化的有效手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施方式
本發(fā)明以可溶性碳源A和微晶纖維素做為纖維素酶的誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)產(chǎn)酶；采用流加補料方式，不斷補充A物質(zhì)及微晶纖維素以實現(xiàn)底物對產(chǎn)酶的持續(xù)誘導(dǎo)，從而提高菌株產(chǎn)酶能力，降低單位酶的生產(chǎn)成本。目前研究表明各種同聚或異聚二糖是真菌產(chǎn)纖維素酶的較好誘導(dǎo)物，以β_1、2或β_1、4糖苷鍵連接的二糖具有較高的誘導(dǎo)能力，但對于纖維素酶的誘導(dǎo)物及其誘導(dǎo)機理仍未有確定性結(jié)論。具體實施中，控制流加時機及補料培養(yǎng)基的組成、以及流加量確定對整個誘導(dǎo)過程具有決定性作用。培養(yǎng)過程條件控制參照以下具體實例
實施例1
⑴培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基秸桿微晶纖維素4. 0%，葡萄糖1. 0%，麩皮1. 0%，玉米漿1. 5%，(NH4) 2S04O. 6%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 08%, MgSO4 · 7H20 O. 1%，MnSO4O. 02 %，F(xiàn)eSO4O. 02 %，ZnSO4 · 7H20O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 04%，余量為水。補料培養(yǎng)基可溶性碳源A 16%，秸桿微晶纖維素5%，2· 0%玉米衆(zhòng)，(NH4) 2S04O. 4%, KH2PO4 O. 4%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 2%，余量為水。⑵將液體菌種，按8% (V/V)接種于50L發(fā)酵罐，起始pH 5. O，攪拌速度300rpm，發(fā)酵溫度29°C下通氣培養(yǎng)，發(fā)酵48h后，以4. 0L/h*m3速率進行連續(xù)流加補料，直至發(fā)酵結(jié)束；發(fā)酵過程通過流加氨水調(diào)節(jié)pH在4. 2 4.8 ;發(fā)酵時長達90-168h，停止發(fā)酵，發(fā)酵液中纖維素酶酶活力(FPA)為202. 6IU/ml ;將發(fā)酵液過濾即得粗酶液。實施例2 ⑴培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基秸桿微晶纖維素5. 0%，葡萄糖O. 8%，麩皮1. 0%，玉米漿1. 2%，(NH4) 2S04O. 4%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 08%, MgSO4 · 7H20 O. 1%，MnSO4O. 02 %，F(xiàn)eSO4O. 02 %，ZnSO4 · 7H20O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 08%，余量為水。補料培養(yǎng)基可溶性碳源A 18%，秸桿微晶纖維素6%，玉米漿1. 6%，(NH4) 2S04
O.4%, KH2PO4 O. 4%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 2%,余量為水。
⑵將液體菌種，按10% (V/V)接種于6m3發(fā)酵罐，起始pH 4. 8，攪拌速度150rpm，發(fā)酵溫度30°C下通氣培養(yǎng)，發(fā)酵50h后，以6. 4L/h*m3速率進行連續(xù)流加補料，直至發(fā)酵結(jié)束；發(fā)酵過程通過流加氨水調(diào)節(jié)pH在4. 4 4. 8 ;發(fā)酵時長達124h，停止發(fā)酵，發(fā)酵液中纖維素酶酶活力(FPA)為192. 60IU/ml ;將發(fā)酵液過濾即得粗酶液。與未采用誘導(dǎo)調(diào)控比較酶活力提聞130%。實施例3 ⑴培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基秸桿微晶纖維素5. 5%，葡萄糖O. 5%，麩皮O. 5%，玉米漿1. 5%，(NH4)2S04 O. 4%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 06%, MnSO4O. 04%, FeSO4O. 04%，ZnSO4 · 7H20 O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 08%。補料培養(yǎng)基可溶性碳源A 14%，秸桿微晶纖維素8%，玉米漿2. 0%，(NH4) 2S04
O.6%, KH2PO4 O. 5%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 1%，余量為水。⑵將液體菌種，按10%· (V/V)接種于60m3發(fā)酵罐，起始pH 4. 8，攪拌速度lOOrpm，發(fā)酵溫度30°C下通氣培養(yǎng)，發(fā)酵40h后，以7. 8L/h*m3速率進行連續(xù)流加補料，直至發(fā)酵結(jié)束；發(fā)酵過程通過流加氨水調(diào)節(jié)pH在4. 4 4.8 ;發(fā)酵時長達86-144h，停止發(fā)酵，發(fā)酵液中纖維素酶酶活力(FPA)為196. 60IU/ml ;將發(fā)酵液過濾即得粗酶液。與未采用誘導(dǎo)調(diào)控比較酶活力提高150%。
權(quán)利要求
1.一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，其特征在于以綠色木霉作為纖維素酶生產(chǎn)菌，以可溶性碳源A和不溶性秸桿微晶纖維素作為誘導(dǎo)物進行代謝過程調(diào)控，通過控制培養(yǎng)基組成、PH調(diào)控、誘導(dǎo)物流加等手段生產(chǎn)高活性纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，其特征在于液體發(fā)酵工藝步驟是⑴菌種制備選用綠色木霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培養(yǎng)、搖瓶擴大培養(yǎng)或種子罐擴大培養(yǎng)，制備所需液體菌種；(2)發(fā)酵培養(yǎng)將綠色木霉的液體菌種，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8 10%接種，28 30°C下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)至40 60h后以流加補料的方式，流加以可溶性碳源A和不溶性秸桿微晶纖維素作為誘導(dǎo)物的補料培養(yǎng)基，流加速率4. O 28. 0L/h*m3發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束；整個培養(yǎng)過程采用流加氨水調(diào)控發(fā)酵pH在4. 2 4. 8 ;發(fā)酵時長為900 168h ;發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液過濾即得粗酶液，粗酶液可直接使用或經(jīng)濃縮后使用。
3.如權(quán)利要求2所述的一種利用誘導(dǎo)底物調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，其特征在于所述液體發(fā)酵工藝的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為稻桿微晶纖維素4. O 6. 0%,葡萄糖O. 5 1.0%,麩皮 O. 5 1. 0%,玉米漿1. 5 2. 0%, (NH4) 2S04 O. 3 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%,CaCl2 O. 05 O. 08%,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 1%,MnSO4O. 02 O. 04%,FeSO4O. 02 O. 04%，ZnSO4 · 7Η20 O. 04 O. 08%，Cocl2 · 6 H2O O. 04 O. 08%，余量為水。
4.如權(quán)利要求2所述的一種利用誘導(dǎo)底物調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，其特征在于所述液體發(fā)酵工藝的補料培養(yǎng)基配方為可溶性碳源A 14 20%，秸桿微晶纖維素4 8%,玉米漿1. O 2. 0%, (NH4) 2S04 O. 4 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· I O. 2%，余量為水。
5.如權(quán)利要求2所述的一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，其特征在于所述的補料時機及補料速率的確定發(fā)酵培養(yǎng)至40 60h以流加補料的方式,流加以可溶性碳源A和秸桿微晶纖維素作為誘導(dǎo)物的補料培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基的流加速率為4. O ,28. 0L/h*m3 發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用底物誘導(dǎo)調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的方法，即以綠色木霉作為纖維素酶生產(chǎn)菌，以可溶性碳源A和不溶性秸稈微晶纖維素作為誘導(dǎo)物進行代謝過程調(diào)控，通過控制培養(yǎng)基組成、pH調(diào)控、通風比、誘導(dǎo)物流加方式等手段生產(chǎn)高活性纖維素酶；本發(fā)明提供的方法對提高纖維素酶活力、降低纖維素酶的應(yīng)用成本具有顯著的作用，可操作性強，且在開發(fā)利用秸稈等天然纖維質(zhì)資源的同時，無環(huán)境污染，是促進秸稈乙醇產(chǎn)業(yè)化的有效手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/885GK103045566SQ20121054226
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者趙子高, 王林風, 閻振麗 申請人:河南天冠纖維乙醇有限公司