專利名稱：無(wú)纖維素酶的酶組合物及用于生產(chǎn)其的宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，該細(xì)胞為芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含含有失活 的bglC基因的基因組、以及用于產(chǎn)生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)為蛋白酶。本發(fā)明還提供使 用所述細(xì)菌細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的方法、以及含有至少一種洗滌劑 添加劑蛋白質(zhì)的無(wú)纖維素酶組合物。
背景技術(shù)：
外源多肽的表達(dá)和重組產(chǎn)生是廣泛使用的技術(shù)。人們熟知，可以用編碼目的外 源多肽的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用于表達(dá)和產(chǎn)生大量的所需多肽。在一些應(yīng)用中，該方法用于 產(chǎn)生比來(lái)源生物中天然產(chǎn)生的量更多的多肽。事實(shí)上，外源核酸序列的表達(dá)以及內(nèi)源序 列的過(guò)表達(dá)已經(jīng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中廣泛使用。在一些情況下，不期望的產(chǎn)物隨目的蛋白質(zhì)一起產(chǎn)生。例如，在產(chǎn)生重組酶 (例如蛋白酶、淀粉酶等)時(shí)，可能還產(chǎn)生其他不期望的酶(如纖維素酶)。盡管分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程已取得進(jìn)展，但仍需要可以用于減少(如果不是 消除的話)這些不期望活性的方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于產(chǎn)生洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，該細(xì)胞為芽孢桿菌屬細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含含有失活的bglC基 因的基因組，以及用于產(chǎn)生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。在一些優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)為蛋白酶。本發(fā)明還提供使用所述細(xì) 菌細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的方法以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白 質(zhì)的無(wú)纖維素酶組合物。本發(fā)明提供重組的芽孢桿菌屬物種宿主細(xì)胞，其包含含有失活的bglC基因的基 因組，其中該細(xì)胞還包含用于產(chǎn)生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。在一些優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述失活的bglC基因含有缺失、插入、替換或重排。在另一些優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述芽孢桿菌屬物種細(xì)胞為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌 (B.halodurans)的細(xì)胞。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì) 是選自蛋白酶、淀粉酶、果膠酸裂合酶和脂肪酶的酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中， 該酶為蛋白酶。在一些更特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在另 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述bglC基因編碼與SEQIDN0 2具有至少80%同一性的多 肽。本發(fā)明還提供包含培養(yǎng)基和重組芽孢桿菌屬物種宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述 宿主細(xì)胞包含含有失活的bglC基因的基因組，其中所述細(xì)胞還包含用于產(chǎn)生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述失活的bgic基因含有缺 失、插入、替換或重排。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芽孢桿菌屬物種細(xì)胞為地衣 芽孢桿菌(B.Iicheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜 堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)的細(xì)胞。在另一些優(yōu)選的實(shí)
施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是選自蛋白酶、淀粉酶、果膠酸裂合酶、酰 基轉(zhuǎn)移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶為蛋白酶。在 一些更特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述bglC基因編碼與SEQ ID NO: 2具有至少80%同一性的多肽。本發(fā)明還提供包括在適于產(chǎn)生所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的條件下維持細(xì) 胞培養(yǎng)物的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基中回收所述分泌型洗滌劑 添加劑蛋白質(zhì)。在另一些實(shí)施方案中，該方法還包括將所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì) 與洗衣洗滌劑(laundry detergent)組合。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述洗滌劑添加劑 蛋白質(zhì)是枯草桿菌蛋白酶。 本發(fā)明還提供通過(guò)本文所述方法產(chǎn)生的無(wú)纖維素酶的蛋白質(zhì)或酶組合物。在一 些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含由芽孢桿菌屬物種產(chǎn)生的分泌型洗滌劑添加劑蛋 白質(zhì)，并且其特征在于該組合物不具有可檢測(cè)的纖維素酶活性。本發(fā)明還提供包含通過(guò)本文所述方法產(chǎn)生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的無(wú)纖 維素酶洗衣洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，所述無(wú)纖維素酶的洗衣洗滌劑包含纖維素性聚 合物(cellulosic polymer)。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)宿主細(xì)胞的方法，其包括將第一重組核酸引入芽孢桿菌 屬物種細(xì)胞中，以使該重組核酸與該細(xì)胞的bglC基因重組；以及向該細(xì)胞中引入第二重 組核酸，以提供分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核 酸插入bglC基因中。在另一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸造成bglC基因的至少一個(gè)部 分的缺失。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)為枯草桿菌蛋 白酶。附圖
簡(jiǎn)述在結(jié)合附圖閱讀后將能夠充分理解以下詳細(xì)描述的某些方面。需要強(qiáng)調(diào)的是， 根據(jù)一般實(shí)踐，附圖的多個(gè)特征未按比例繪制。相反，多個(gè)特征的尺寸為清楚起見(jiàn)而主 觀地進(jìn)行了放大或縮小。附圖中包括以下各圖圖IA-B提供了用于構(gòu)建含有失活的bglC基因的芽孢桿菌宿主細(xì)胞的策略。圖2顯示在兩種具有失活的blgC基因的枯草芽孢桿菌菌株(即“宿主A”和 “宿主B”)及兩種具有失活的bglS基因的枯草芽孢桿菌菌株(即“宿主C”和“宿主
D” )的培養(yǎng)物上清液上進(jìn)行的粘度測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果。流體粘度以厘泊(即cP)來(lái)衡量。圖3顯示在兩種產(chǎn)生重組枯草桿菌蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)物上清 液上進(jìn)行的粘度測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果。菌株MDT-05-28具有失活的bglC基因，而菌株 MTD-04-250含有野生型bglC基因。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于產(chǎn)生洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，所述細(xì)胞為芽孢桿菌屬細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞含有包含失活的bglC基因的基因組以及用于產(chǎn)生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。在一些優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是蛋白酶。本發(fā)明還提供使用該細(xì)菌 細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的方法以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì) 的無(wú)纖維素酶組合物。除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白質(zhì)純化、 蛋白質(zhì)工程、蛋白質(zhì)及DNA測(cè)序及重組DNA領(lǐng)域中通常使用的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù) 均屬于本領(lǐng)域的 技術(shù)范疇。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并描述于大量教科書及 參考文獻(xiàn)中(參閱如 Sambrook 等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual “， 第二版(Cold Spring Harbor)，[1989])；以及 Ausubel 等， “Current Protocols in MolecularBiology" [1987])。本文的上文和下文中提到的所有專利、專利申請(qǐng)、文章和出 版物均明確地以參考方式并入本文。此外，本文中提供的標(biāo)題不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞降南拗?，所?方面和實(shí)施方式可以通過(guò)參考說(shuō)明書整體而得。因此，緊接下面定義的術(shù)語(yǔ)將基于整個(gè) 說(shuō)明書作更全面地定義。然而，為了便于理解本發(fā)明，下文定義了多個(gè)術(shù)語(yǔ)。定義除非本文中另外指明，否則本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的含義。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第二版，John Wileyand Sons，NY (1994)以及 Hale 禾Π Marham， The Harper Collins Dictionaryof Biology, Harper Perennial, NY (1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員 提供了許多本文所用術(shù)語(yǔ)的一般詞典。盡管與本文所述方法和材料相似或等同的任何方 法和材料均可用于實(shí)施本發(fā)明，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。因此，下文定義的術(shù) 語(yǔ)將參考說(shuō)明書整體得以更完整的描述。同時(shí)，本文使用的名詞均包括復(fù)數(shù)含義，除非 其上下文明確表示不是這樣。因此，例如，提到“宿主細(xì)胞”時(shí)包括多個(gè)這樣的宿主細(xì) 胞。同樣，提到“基因”時(shí)包括多個(gè)這樣的候選試劑，提到“細(xì)胞”時(shí)包括對(duì)一個(gè)或 多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同方案的提及，依此類推。數(shù)值范圍包含定義該范圍的數(shù)值。事實(shí)上，本說(shuō)明書全文中給出的每個(gè)最高 數(shù)值界限均旨在包括每個(gè)較低的數(shù)值界限，如同本文中明確寫出了這些較低數(shù)值界限那 樣。本說(shuō)明書全文中給出的每個(gè)最低數(shù)值界限將包括每個(gè)較高的數(shù)值界限，如同本文中 明確寫出了這些較高數(shù)值界限那樣。本說(shuō)明書全文中給出的每個(gè)數(shù)值范圍均包括落入這 些較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每個(gè)較窄的數(shù)值范圍，如同這些較窄的數(shù)值范圍均在本文中明確寫 出那樣。當(dāng)給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)該理解，也具體地公開了該范圍的上限與下限之間間隔 下限單位之十分之一的每個(gè)中間值，除非其上下文明確指明不是這樣。這些較小范圍的 上限及下限可獨(dú)立地包括或不包括在該范圍中，并且這些包括一個(gè)、兩個(gè)端點(diǎn)或不包括 端點(diǎn)的較小范圍也包含在本發(fā)明中，并排除所述范圍中任何具體排除的界限。當(dāng)所述范 圍包括一個(gè)或兩個(gè)端點(diǎn)時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)包含在內(nèi)的端點(diǎn)的范圍也包括在本發(fā)明中。引用的所有文獻(xiàn)均通過(guò)參考并入本文的相關(guān)部分中，對(duì)任何文獻(xiàn)的引用都不應(yīng) 理解為承認(rèn)它是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)理解為承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有資 格作為在先發(fā)明而先于這些出版物。本文提及的所有專利和出版物(包括這些專利和出 版物中公開的所有序列)均通過(guò)引用方式明確并入本文中。
盡管與本文所述相似或等同的任何適宜的方法和材料均可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā) 明，但現(xiàn)將描述示例性和優(yōu)選的方法和材料。除非另外指明，否則核酸以5’至3’的方向從左向右書寫，而氨基酸序列則以 氨基至羧基的方向從左向右書寫。本文中提供的標(biāo)題不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤?方式的限制，所述方面和實(shí)施方式可以通過(guò)參考說(shuō)明書整體而得。應(yīng)該理解，本發(fā)明不 受限于所描述的具體方法、方案和試劑，它們可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們的情況而 改變。因此，下文定義的術(shù)語(yǔ)應(yīng)參考說(shuō)明書整體作更完整地定義。本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組”指在宿主細(xì)胞中不天然存在的多核苷酸或多肽。重組 分子可含有通過(guò)以非天然方式連接在一起的兩個(gè)或更多個(gè)天然序列。重組細(xì)胞含有重組 多核苷酸或多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源”指天然彼此不相關(guān)的元件。例如，如果宿主細(xì)胞產(chǎn)生 異源蛋白，則該蛋白不是該宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。類似地，與異源編碼序列有效 連接的啟動(dòng)子是指與在野生型宿主細(xì)胞中通常不與其有效連接的編碼序列有效連接的啟 動(dòng)子。當(dāng)用于多核苷酸或蛋白質(zhì)時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“同源”指宿主細(xì)胞中天然存在 的多核苷酸或蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用。本文使用的“信號(hào)序列”是蛋白質(zhì)N端部分存在的氨基酸序列，其有利于將該 蛋白質(zhì)的成熟形式分泌到細(xì)胞之外。信號(hào)序列的定義是功能性定義。成熟形式的胞外蛋 白質(zhì)缺少信號(hào)序列，該信號(hào)序列在分泌過(guò)程中被切除。本文使用的“編碼序列”是編碼多肽的DNA區(qū)段。本文使用的“失活的基因”是基因組中的基因座，其在失活前能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì) (即能夠轉(zhuǎn)錄成可翻譯產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽的RNA)。對(duì)于編碼酶的基因而言，當(dāng)其不能轉(zhuǎn)錄及 翻譯成全長(zhǎng)的催化活性蛋白質(zhì)時(shí)，是失活的?？赏ㄟ^(guò)改變基因轉(zhuǎn)錄所需的序列而失活基 因，例如改變RNA加工(如polyA尾添加)所需的序列，或改變翻譯所需的序列。失 活的基因的實(shí)例包括但不僅限于缺失的基因、含有缺失區(qū)域的基因、含有重排區(qū)域的基 因、含有失活點(diǎn)突變或移碼的基因，以及含有插入的基因。此外，還可以使用反義或任 何其他可以消除基因表達(dá)的方法來(lái)失活基因。本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”包括單鏈或雙鏈的DNA、RNA,并包括經(jīng)化學(xué)修飾的 DNA或RNA。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換使用。本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指設(shè)計(jì)用于將核酸引入一種或多種宿主細(xì)胞的多核苷 酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體在不同宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。該術(shù)語(yǔ)旨在包括但不 僅限于克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、盒等。本文使用的“表達(dá)載體”指包含與適宜的控制序列有效連接的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的 DNA構(gòu)建體，所述控制序列能在合適的宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)該蛋白的表達(dá)。在一些實(shí)施方案 中，這樣的控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA的任選的操縱基因序 列、編碼mRNA上的適宜核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序 列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指起始 下游核酸轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”指以允許元件在功能上相關(guān)的方式排列元件。例 如，如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與該編碼序列有效連接。本文使用的術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”指這樣的蛋白質(zhì)，其能在宿主中表達(dá)從而便于選 擇含有引入的核酸或載體的宿主。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不僅限于抗微生物劑(如潮霉 素、博來(lái)霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢(shì)(如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì))的基因。本文使用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)自”涵蓋術(shù)語(yǔ)“源于”、“得自”或者“可得自”以及 “分離自”。本文使用的“非病原性”生物是對(duì)人和/或其他動(dòng)物無(wú)致病性的生物。本文使 用的術(shù)語(yǔ)“回收”、“分離”和“分開”指將蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸從至少一種 與其天然相關(guān)的組分中移出。當(dāng)用于細(xì)胞時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)基因”指該細(xì) 胞具有非天然(例如異源的)核酸序列，所述非天然核酸序列整合進(jìn)其基因組中或以附加 型質(zhì)粒的形式存在，并歷經(jīng)多代而維持。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括 轉(zhuǎn)錄和翻譯。在將核酸序列插入細(xì)胞的上下文中，本文使用的術(shù)語(yǔ)“引入”指“轉(zhuǎn)染”、 “轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并包括將核酸序列整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，其中核酸可整合進(jìn)
細(xì)胞基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或者瞬時(shí)表 達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜交”指核酸鏈通過(guò)本領(lǐng)域已知的堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合 的過(guò)程。如果一個(gè)核酸與參照核酸序列在中等至高嚴(yán)格雜交及洗滌條件下彼此特異地 雜交，則認(rèn)為該核酸能與參照核酸序列“選擇性地雜交”。中等和高嚴(yán)格雜交條件為 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(參閱如Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology.第三版， Wiley&Sons, Hoboken, NJ[1995]；以及 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor，NY[2001])。高嚴(yán)格條件的一個(gè)實(shí)例包括在約42°C 在 50% 甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt 氏液、0.5 % SDS 和 100 μ g/ml 變性載體 DNA 中 雜交，其后在室溫以2XSSC和0.5% SDS洗滌兩次，其后42°C以0.1 XSSC和0.5% SDS 再洗滌兩次。本文使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素性聚合物”指包含至少一個(gè)1，4-i3-D糖苷鍵的纖維 素、半纖維素或者改性的纖維素或半纖維素聚合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素”指包含通過(guò)β-1，4鍵連接的葡萄糖殘基的多糖聚 合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“半纖維素”指包含至少一個(gè)通過(guò)β-(1-4)鍵連接的非葡萄糖 糖殘基(如木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、糖醛酸或半乳糖醛酸或木聚糖) 的多糖聚合物。半纖維素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚 糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖和半乳甘露聚糖。本文使用的“纖維素酶”指水解纖維素、地衣及谷物β-D-葡聚糖中的1， 4-β -D-糖苷鍵的酶。本文所述的纖維素酶具有據(jù)IUMBM酶命名法描述為EC 3.2.1.4的 活性。本文所述纖維素酶的系統(tǒng)名為1，4-(1，3 1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。 本文使用的術(shù)語(yǔ)“芽孢桿菌屬物種”(或芽孢桿菌)(例如芽孢桿菌宿主細(xì) 胞)指任何芽孢桿菌屬物種，包括但不僅限于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢 桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪 芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、而 鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、巨大 芽孢桿菌(B.megaterium) > 疑結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans) > B.lautus和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，以及它們的亞種。本文使用的“無(wú)纖維素酶的芽孢桿菌”指經(jīng)遺傳改造的芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其 不分泌可檢測(cè)量的纖維素酶。如下文將詳細(xì)討論的，在某些實(shí)施方案中，無(wú)纖維素酶的 芽孢桿菌菌株可含有失活的bglC基因。本文使用的“等同的未改變的芽孢桿菌菌株”指這樣的宿主菌株，其除了 bglC 基因未改變(即為野生型)外在其他方面與無(wú)纖維素酶的芽孢桿菌菌株相同。本文使用的“培養(yǎng)”指在適宜條件下在液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物細(xì)胞 群。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)指發(fā)酵性重組生產(chǎn)目的外源蛋白或其他期望的終產(chǎn)物(一 般在容器或反應(yīng)器中生產(chǎn))。本文使用的“洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)”指待加入洗衣洗滌劑中的蛋白質(zhì)。洗滌劑 添加劑蛋白質(zhì)可以是酶(如蛋白酶、淀粉酶、果膠酸裂合酶、脂肪酶、?；D(zhuǎn)移酶、芳 基酯酶或不具有酶活性的蛋白質(zhì))。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，葡聚糖水解酶 (即具有據(jù) IUMBM 酶命名法描述為 EC3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.72、EC 3.2.1.136 的活性的酶)被特別排除在術(shù)語(yǔ)“洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)”之外。在另一些特別優(yōu)選的實(shí) 施方案中，木聚糖酶(即具有據(jù)IUMBM酶命名法描述為EC 3.2.1.75的活性的酶)也被特 別排除在術(shù)語(yǔ)“洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)”之外。說(shuō)明書全文中還可出現(xiàn)其他術(shù)語(yǔ)定義。在詳細(xì)描述示例性實(shí)施方案之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不受限于描述的具體實(shí)施 方案，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然是可以變化的。還應(yīng)該理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施 方案的目的，并不旨在限制。宿主細(xì)胞如上述，本發(fā)明提供了產(chǎn)生降低(如不可檢測(cè)的)水平的纖維素酶的芽孢桿菌 宿主細(xì)胞。一般而言，本發(fā)明的芽孢桿菌宿主細(xì)胞一般產(chǎn)生少于等同的野生型芽孢桿菌 宿主細(xì)胞的纖維素酶的約50% (例如少于約40%、少于約30%、少于約20%或少于約 10%)的纖維素酶。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明細(xì)胞產(chǎn)生的纖維素酶少于等同的芽孢桿 菌宿主細(xì)胞的纖維素酶的約5%。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素酶是檢測(cè)不到 的(即，該芽孢桿菌宿主細(xì)胞是無(wú)纖維素酶的芽孢桿菌宿主細(xì)胞)。纖維素酶活性旨在 通過(guò)任何適宜的已知方法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)用剛果紅染色含有纖維素的LP瓊脂平板(參 閱如 Wolf 等，Microbiol.，141 281-290[1995]；以及 Carder，Anal.Biochem., 153 75-9[1986])和/或使用粘度測(cè)定試驗(yàn)(如下文更為詳細(xì)的描述)來(lái)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)減少細(xì)胞的bglC基因產(chǎn)物表達(dá)來(lái)產(chǎn)生纖維素酶生產(chǎn)量 減少的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。在這樣的實(shí)施方案中，可以使用任何適宜方法減少芽孢桿菌宿主細(xì)胞中的bgic表達(dá)，上述方法包括但不僅限于例如使用反義分子或核酶的方法。在 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)失活細(xì)胞中的bgic基因來(lái)減少bgic的表達(dá)。幾種芽孢桿菌bgic基因的DNA序列以及這些基因所編碼的蛋白質(zhì)已經(jīng)測(cè)定，并 保存于NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中。以下提供該序列ATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACGTGTTTATTGATTACGTTATTGACA ATGGGCGGCATGATAGCTTCGCCGGCATCAGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCC AAGAATGGCCAGCTTAATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGT ACAGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAA GACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTAT ACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAGCG GTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATGATGGCATATCTTAAATGAC GGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTCAAG CCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAACGGGATG TGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATCCGCAA AAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGATGTGAAT GATCTGCGATGAC CAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATTTTTATGCCG GCACGCACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCAAAGGAGCAC CTATTTTTTGTGACGAGTGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGGTGTATTCCTT GATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATTAGCTGGGTGAAC TGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATATCCTCGCTTTAAAGCCGGGGGCATCTAAAACA GGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTAGAGAAAACATTC TCGGCACCAAAGATTCGACGAAGGACATTCCTGAACGCCATCAAAGATAAACCCACA CAGGAAAATGGTATTTCTGTACAGTACAGAGCAGGGGATGGGAGTATGAACAGCAAC CAAATCCGTCCGCAGCTTCAAATAAAAAATAACGGCAATACCACGGTGATTTAAAGAT GTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCCAAAACTTTGACTGTGAC TACGCGCAGATTGGATGCGGCAATGTGACACACAAGTTTGTGACGTTGCATAAACCA AGCAAGGTGCGATACCTATCTGGAACTTGGATTTAAAAACGGAACGTTGGCACCGGG AGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTCCGTCTTCACAATGATGACTGGAGCAATTATGCA CAAAGCGGCGATATTCCTTTTTAAATCAAATACGTTTAAAACAACGAAAAAAATCACA TTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATTAG (SEQ ID NO 1)以下為SEQ ID NO: 1編碼的氨基酸序列。MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGK AVQLKGISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGYIDNPSVKNKV KEAVEAAKELGIYVIWHILNDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGD VNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADDQLKDANVMYALHFYA GTHGQFLRDKANYALSKGAPIFVEGTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISWVNWN LSDKQESSSALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQEN GISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTDLDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIG CGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN(SEQ ID NO 2)此外，已經(jīng)鑒定了纖維素酶的幾個(gè)保守性結(jié)構(gòu)域以及大量保守性氨基酸，這使得人們可以通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定其他芽孢桿菌bgic基因及蛋白。在一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌bglC基因包含與上文提供的保存于NCBI Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的bglC序列(SEQ ID NO: 1)至少70% (例如至少80%、至少90%、至少 95%,至少97%或至少98%)的序列同一性。在再一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌bglC基因 在嚴(yán)格條件下與保存于NCBIGenbank數(shù)據(jù)庫(kù)的bglC序列或SEQ ID NO 1雜交。在另 一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌bglC基因編碼與保存于NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的bglC序列或 SEQ ID NO 2具有至少70%的序列同一性(例如至少80%、至少90%、至少93%、至 少95%、至少97%或至少98%的序列同一性)的多肽。保存于NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的 示例性bglC蛋白及核苷酸序列包括GID 3100136(地衣芽孢桿菌)、GID 52348343(地 衣芽孢桿菌)、GID 42491106 (解淀粉芽孢桿菌)和GID 50812243 (枯草芽孢桿菌)。 上述Genbank登錄號(hào)(包括其中的核酸及蛋白質(zhì)序列以及這些序列的注釋)均通過(guò)參考整 體并入本文中。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，芽孢桿菌宿主細(xì)胞為任何以下物種地衣芽孢桿菌、 遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、 嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(B.pumilus)，蘇云金芽 孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞包括但不僅限于 美國(guó)專禾 IJ 5,264,366 和 4,760,025 (RE 34,606)中所述的那些，以及 1A6 (ATCC 39085)、 168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753 至 PB1758、PB3360、JH642、 1A243 (ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DEIOO (ATCC39,094)、 GX4931、PBT 110 和 PEP 211 菌株(參閱如 Hoch 等，Genetics73 215_228[1973]；美國(guó) 專利 No.4,450,235 ；美國(guó)專利 No.4,302,544 以及 EP 0134048 (還參閱 Palva 等，Gene 19 81-87 [1982]；以及 Fahnestock 禾Π Fischer, J.Bacteriol.，165 796_804[1986]；和 Wang 等，Gene 69: 39_47[1988])。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包括含有表達(dá)盒(即啟動(dòng)子、編碼洗滌劑添加劑 蛋白質(zhì)的多核苷酸以及轉(zhuǎn)錄終止子)的重組核酸，其中所述表達(dá)盒足以使芽孢桿菌宿主 細(xì)胞產(chǎn)生洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述重組核酸被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基 因組中，而在另一些實(shí)施方案中，所述重組核酸存在于獨(dú)立于基因組之外的自主復(fù)制的 載體中。在一些實(shí)施方案中，編碼洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的多核苷酸為在芽孢桿菌宿主細(xì) 胞中表達(dá)該蛋白質(zhì)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌宿主細(xì)胞被改造成使蛋白質(zhì)表達(dá)最大 化。因此，在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在至少一個(gè)以下基因中含有失活改變degU、 degS、degR 和 / 或 degQ (參閱 Msadek 等，J.Bacterid.，172 824_834[1990]；禾Π Olmos 等，Mol.Gen.Genet.，253 562_567[1997])。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì) 胞為帶有degU32 (Hy)突變的枯草芽孢桿菌。在另一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌宿主細(xì) 胞在以下基因中含有突變和/或缺失scoC4(參閱Caldwell等，J.Bacteriol，.183 7329-7340[2001]) ； spoIIE (參閱 Arigoni 等，MoLMicrobiol., 31: 1407_1415[1999])； oppA 或 opp 操縱子中的其他基因(參閱 Perego 等，MoLMicrobiol., 5 173_185[1991])。事實(shí)上，可以想到，opp操縱子中任何與oppA基因突變導(dǎo)致相同表型的突變都將可用于 本發(fā)明的改變的芽孢桿菌菌株的一些實(shí)施方案中。在一些實(shí)施方案中，這些突變單獨(dú)出 現(xiàn)，而在另一些實(shí)施方案中，存在突變的組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的芽 孢桿菌可得自已在一個(gè)或多個(gè)上述基因中包含了突變的芽孢桿菌宿主菌株。在另一些實(shí) 施方案中，本發(fā)明的改變的芽孢桿菌可以進(jìn)一步被改造以包含一個(gè)或多個(gè)上述基因的突 變。使用任何便利的方法構(gòu)建的芽孢桿菌宿主細(xì)胞均可用于本發(fā)明，包括通過(guò)在細(xì) 胞的bgic基因中進(jìn)行插入、缺失、替換、移碼、點(diǎn)突變和/或重排來(lái)改變?cè)揵gic基因序 列而構(gòu)建的細(xì)胞，可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，待改變的基因部分在編碼區(qū)中， 或者在表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件中。在一些實(shí)施方案中，基因的該調(diào)節(jié)或控制序列是 啟動(dòng)子序列或其功能性部分(即基因表達(dá)所必需的部分)。這樣的基因失活方法為本領(lǐng)域 所熟知(參閱如 Wolf 等 Microbiol.，141 281-290 [1995])。在一些實(shí)施方案中，如下構(gòu)建宿主細(xì)胞將重組核酸引入芽孢桿菌細(xì)胞中， 以 使該重組核酸與細(xì)胞基因組中的bglC基因重組；將第二種重組核酸引入細(xì)胞中，以提供 分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，將核酸插入bglC基因中，而在 另一些實(shí)施方案中，該核酸造成bglC基因的至少一部分缺失。用于將多核苷酸序列引入芽孢桿菌細(xì)胞的合適方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 (參閱如 Ferrari 等，“Genetics, “ in Harwood等(ed.)，Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989]，57-72 頁(yè);還參閱 Saunders 等，J。Bacteriol., 157 718-726[1984] ； Hoch 等， J.Bacteriol.，93 1925_1937[1967] ； Mann 等，Curr.Mierobiol., 13 131_135[1986]； 以及 Holubova，F(xiàn)oliaMicrobiol.，30 97[1985] ； Chang 等，Mol.Gen.Genet，168 11-115 ； [1979] ； Vorobjeva 等，F(xiàn)EMS Microbiol丄ett.，7 261_263[1980] ； Smith 等， Appl.Env.Microbiol., 51: 634[1986] ； Fisher 等，Arch.Microbiol.，139 213_217[1981]； 以及 McDonald，J.Gen.Microbiol., 130 203[1984])。事實(shí)上，諸如轉(zhuǎn)化等方法，包括 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和congression、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合，是本領(lǐng)域已知的，并且適用于本發(fā) 明。如上文指出的，除了產(chǎn)生水平降低(例如檢測(cè)不到)的纖維素酶以外，本發(fā)明提 供還包含用于產(chǎn)生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸的芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中分 泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是從細(xì)胞中分泌出來(lái)并將添加入洗衣洗滌劑中的蛋白質(zhì)(例如 酶)。示例性的洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)包括但不僅限于蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶)、α-淀 粉酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、裂合酶、?；D(zhuǎn)移酶、芳基酯酶和脂肪酶等。在一些實(shí) 施方案中，洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)可由與該洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的來(lái)源菌株相同的菌株表 達(dá)。酶枯草桿菌蛋白酶(即胞外堿性絲氨酸蛋白酶)是特別有意義的。任何合適的枯 草桿菌蛋白酶均可用于本發(fā)明(參閱如Siezen，Protein Sci., 6 501-523[1997] ； Bryan, Biochim.Biophys.Acta，1543 203_222[2000] ； Maurer, Curr.Op, Biotechnol., 2004 15 330-334[2004]；以及 Gupta，Appl.Mierobiol.Biotechnol., 59 15-32[2002])。在一些實(shí)
施方案中，目的枯草桿菌蛋白酶具有據(jù)IUMBM酶命名法描述為EC 3.4.4.16的活性。
在一些實(shí)施方案中，這樣的枯草桿菌蛋白酶具有可見(jiàn)于野生型基因組的氨基酸 序列(即該枯草桿菌蛋白酶是天然存在的枯草桿菌蛋白酶)，而在另一些實(shí)施方案中， 所述枯草桿菌蛋白酶是天然存在的枯草桿菌蛋白酶的變體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述變體枯草桿菌蛋白酶包含與野生型基因組所編碼的枯草桿菌蛋白酶具有至少80 %、 至少90%、至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列。示例性枯草桿菌蛋白酶包括 但不僅限于ALCANASE (Novozymes)、FNA (Genencor), SAVINASE (Novozymes)、PURAFECT (Genencor)、KAP (Kao)、EVERLASE (Novozymes)、 PURAFECT OxP (Genencor) > FN4 (Genencor)、BLAP S (Henkel) > BLAP X (Hen kel) > ESPERASE (Novozymes)、KANNASE (N ovozymes)禾口 PROPERASE (Genencor)。在另一些實(shí)施方案中，所述枯草桿菌蛋白酶包括但不僅 限于枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草 桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147或枯草桿菌蛋白酶309 (參閱如EP414279B ； W089/06279 ；和 Stahl 等、J.Bacteriol.、159 811_818[1984])。其他可用于本發(fā)明的 枯草桿菌蛋白酶和其他蛋白酶包括但不僅限于以下文獻(xiàn)中所述的那些WO 99/20770 ； WO 99/20726 ； WO 99/20769 ； W089/06279 ； RE 34,606 ；美國(guó)專利 No.4,914,031 ； 美國(guó)專利No.4,980,288 ；美國(guó)專利No.5,208,158 ；美國(guó)專利No.5,310,675 ；美國(guó)專利 No.5,336,611 ；美國(guó)專利No.5,399,283 ；美國(guó)專利No.5,441,882 ；美國(guó)專利No.5,482,849 ； 美國(guó)專利No.5,631,217 ；美國(guó)專利No.5,665,587 ；美國(guó)專利No.5,700,676 ；美國(guó)專利 No.5,741,694 ；美國(guó)專利No.5,858,757 ；美國(guó)專利No.5,880,080 ；美國(guó)專利No.6,197,567 ； 以及美國(guó)專利No.6,218,165。洗滌劑和洗滌劑添加劑蛋白質(zhì) 在一些實(shí)施方案中，使用宿主細(xì)胞制備蛋白質(zhì)組合物和洗衣洗滌劑，其中在一 些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述洗滌劑含有至少一種纖維素性聚合物。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞以提供至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì) 進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用任何適宜的方法(如沉 淀、離心、親和、過(guò)濾或任何其他本領(lǐng)域已知方法)從培養(yǎng)基中回收所述分泌型洗滌劑 添加劑蛋白質(zhì)。例如，可以使用親和層析(Tilbeurgh等，F(xiàn)EBS Lett.，16: 215 [1984])； 離子交換層析法(Goyal 等，Bio.Technol.，36: 37[1991] ； Fliess 等，Eur.J.Appl.Microbiol. Biotechnol., 17: 314[1983] ； Bhikhabhai 等，J.AppLBiochem., 6 336[1984]；禾口 Ellouz 等，Chromatogr.，396 307[1987])，包括使用具高分辨力的材料進(jìn)行的離子交換層析 (參閱如 Medve 等，J.Chromatogr.A 808 153[1998])；疏水相互作用層析(Tomaz 禾口 Queiroz, J.Chromatogr.A 865 123 [1999]；兩相分配(Brambauer 等，Bioseparation 7 287[1999])；乙醇沉淀；反相HPLC ； 二氧化硅或陽(yáng)離子交換樹脂(如DEAE)上的層 析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；和凝膠過(guò)濾(例如SEPHADEX G_75)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，不經(jīng)從培養(yǎng)基的其他組分中純化而使用洗滌劑添加 劑蛋白質(zhì)。在一些這樣的實(shí)施方案中，簡(jiǎn)單地濃縮所述培養(yǎng)基，接著不經(jīng)進(jìn)一步從培養(yǎng) 基組分中純化該蛋白質(zhì)而進(jìn)行使用。
與含有未改變(如野生型)bglC基因的等同芽孢桿菌宿主細(xì)胞相比，使用本發(fā)明 宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組合物一般含有減少的纖維素酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的纖維素酶含量通過(guò)在將該組合物加入纖維素性聚 合物溶液(例如含有羧甲基纖維素(CMC)的溶液)后測(cè)量該溶液的粘度改變來(lái)評(píng)估。 這樣的方法是熟知的(參閱如 Manning，Biochem.Biophys.Meth.，5 189-202 [1981]；禾口 Sheperd, Biochem.J., 193 67_74[1981])?？捎糜诒景l(fā)明的一種示例性粘度測(cè)定試驗(yàn)在
下文的實(shí)施例中提供。 在包含本發(fā)明蛋白質(zhì)組合物的一些實(shí)施方案中，與使用具有未改變bglC基因 的芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的等同蛋白質(zhì)組合物造成的減少相比，本發(fā)明組合物能夠造成少于 80% (例如少于50%、少于30%、少于20%或少于10%)的纖維素性材料溶液粘度減 少。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)組合物不使纖維素性材料溶液的粘度產(chǎn)生可檢測(cè) 的降低，在這種情況下該蛋白質(zhì)組合物被認(rèn)為是“無(wú)纖維素酶”的蛋白質(zhì)組合物。無(wú)纖維素酶的蛋白質(zhì)組合物可用于多種情況，包括但不僅限于洗衣洗滌劑，特 別是含有纖維素性聚合物的洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明無(wú)纖維素酶的蛋白 質(zhì)組合物的洗衣洗滌劑包含約至80% (例如5%至50%)(以重量計(jì))的表面活性劑。 在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑，而在另一些實(shí)施方案中， 它是陽(yáng)離子型表面活性劑，在另一些實(shí)施方案中，它是陰離子型表面活性劑，在另一些 實(shí)施方案中，它是兼性離子表面活性劑，在另一些實(shí)施方案中，它包含這些表面活性劑 的任何組合(例如陰離子及非離子型表面活性劑的混合物)。示例性表面活性劑包括但不 僅限于烷基苯磺酸鹽(ABS)，包括直鏈烷基苯磺酸鹽和直鏈烷基磺酸鈉、烷基苯氧基聚 乙氧基乙醇(例如壬基苯氧基乙氧基化物或壬基酚)、二乙醇胺、三乙醇胺和單乙醇胺。 可用于洗衣洗滌劑的表面活性劑的其他描述提供于美國(guó)專利No.3,664,961、3,919,678、 4,222,905 和 4,239,659。包含本發(fā)明無(wú)纖維素酶的酶的洗衣洗滌劑可以以任何形式(如固體、液體、凝 膠等)使用。在一些實(shí)施方案中，所述洗衣洗滌劑還包含緩沖劑，例如碳酸鈉、碳酸 氫鈉或洗滌劑助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、酶、酶穩(wěn)定劑、增泡劑、抑泡劑、防晦暗 齊IJ、抗腐蝕劑、污物助懸劑、污物釋放劑、殺菌劑、ρΗ調(diào)節(jié)劑、非助洗劑堿性源、螯合 齊 、有機(jī)或無(wú)機(jī)填充劑、溶劑、水溶助長(zhǎng)劑、熒光增白劑、染料或香料。如上文所述，在一些實(shí)施方案中，洗衣洗滌劑含有纖維素性聚合物(如纖維素 聚合物)或改性的纖維素聚合物。合適的纖維素性聚合物包括但不僅限于陰離子修飾的 纖維素、非離子修飾的纖維素、陽(yáng)離子修飾的纖維素、兼性離子修飾的纖維素及其混合 物，以及纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙 基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其任何混合物。在一 些實(shí)施方案中，改性的纖維素醚聚合物(參閱如美國(guó)專利Νο.6,833,347)或其他纖維素性 聚合物(參閱如美國(guó)專利5,009,800和4,661,267)可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，洗 衣洗滌劑含有以重量計(jì)約0.1%至8% (例如約0.5%至4%或約至3%)的纖維素性聚 合物。實(shí)驗(yàn)以下實(shí)施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了關(guān)于如何實(shí)施和使用本發(fā)明的完整公 開及描述，并且不旨在限制本發(fā)明人所認(rèn)為的其發(fā)明的范圍，且也不意味著以下實(shí)驗(yàn)是 所進(jìn)行的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)盡力保證所用數(shù)字(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差也應(yīng)考慮在內(nèi)。除非另外指明，否則分?jǐn)?shù)為按重量計(jì)分?jǐn)?shù)，分子量 為重量平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。在以下實(shí)驗(yàn)公開內(nèi)容中，使用了以下縮寫V (攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))； H20(水)；aa(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；gm(克)； yg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；yl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫 米)；nm(納米)；μιη和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM和uM(微摩 爾)；U (單位)；V(伏特)；MW (分子量)；sec (秒)；min (分鐘)；h和hr (小時(shí))； OD28tl (280nm 的光密度)；OD4tl5 (405nm 的光密度)；OD6tltl (600nm 的光密度)；PAGE (聚 丙烯酰胺凝膠電泳)；LAS (月桂基磺酸鈉)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲 基)氨基甲烷)。實(shí)施例1構(gòu)建bglC::壯觀霉素菌株
缺失bglC基因的一般策略示于圖IA-B中。簡(jiǎn)言之，通過(guò)PCR擴(kuò)增bglC基因 側(cè)翼的上游及下游DNA片段，并在載體中連接在一起。通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶消化打開 該插入片段，并將側(cè)翼為IoxP位點(diǎn)的壯觀霉素盒連接進(jìn)去。通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶消化 將所得質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化進(jìn)芽孢桿菌中。通過(guò)用引入的抗微生物劑標(biāo)記(壯觀霉素) 進(jìn)行選擇，通過(guò)雙交換事件實(shí)現(xiàn)了目的基因的置換。對(duì)于bglC的情況，以壯觀霉素抗性 基因置換編碼區(qū)，之后使用識(shí)別側(cè)翼IoxP位點(diǎn)的Cre重組酶，將該壯觀霉素抗性基因環(huán) 出ο利用WO 03/083125所述策略及表1所述引物，使用PCR技術(shù)，構(gòu)建DNA構(gòu)建體。
表1.引物
~引物中的~~~ ‘ ρη rn
引物名，J制性位引物序列
BgiC SacI UFIUF SacI "acaaatGAGCTCgctggagcattggatggcgcaUcc3
BglC BamHl UR BamHI TgatctGGATCCccttcgcatcattttggctctacac— 4
BglC BamHl DF BamHl AaaactGGATCCgggaacagaaccaaattagttaagc5
bglC Sail DR__SailatggtaGTCGACgcaaaogcggctaoaatatggctca6
bglC Uout chk___ttccgcggagggccggcctactata__7
bglC Dout chk___catattcacaatgcgatggtagagg_ 8
bglC DF chkdel__Ttatgcacaaagcggcgattattcc9
SPECchkUR: _ Atctcttgccagtcacgttacg— IQ
bglS xba UF__Xba__ggagtgTCTAGAactgaccagcttccgtctttccctg__11
Bg!S BamHl UR BamHl ActaacGGATCCcctgtaactatcatcatcttccctc12
BgIS BamHl DF BamHl CaaaaaGGATCCgccaaatgtgaaagagcctgctgca13
bglS Sac DR__Sac__agaggtGAGCTCaccgctgattcccgctatgatcgcc__14
bglS Uout chk___Caatatacacaatacagtgctgaaagc__IS
bglS Drout chk___Gcgggaatagcgatgcttggttcgg__ 6
bglS DF chk del___Gatgaacttgtggaatggcacgggt__17
PloxBamUF—"T^GACGGTATCGATAAGCTGGATCCATAAC — 18 ~
ploxBamPRGCCTAGGATGCATATGGGATCCGCATAAC'ITC “ 19限制性位點(diǎn)按如下命名XbaI為 TCTAGA (SEQ ID NO 20) ； BamHI 為 GGATCC (SEQ ID NO 21) ； SacI 為 GAGCTC (SEQ ID NO 22) ； Asp718為 GGTACC (SEQ ID NO 23) ； PstI 為 CTGCAG (SEQ ID NO 24)，HindIII 為 AAGCTT (SEQ ID NO 25)。在該方法中，使用150 μ L Eppendorf管進(jìn)行IOOyL PCR反應(yīng)，所述管中含有 84μ L7jc> 10 μ L PCR緩沖液、IyL每種引物(即，BglC SacI UF和BglC BamHl UR，或 者IoxPBamHlF和IoxPBamHlR)、2 μ L dNTP、1 μ L DNA模板(例如野生型芽孢桿菌染
色體或?qū)φ召|(zhì)粒)和1 μ L DNA聚合酶。所使用的DNA聚合酶包括Taq Plus高保真聚合 酶和Herculase (Stratagene)。反應(yīng)使用以下程序在Hybaid PCRExpress熱循環(huán)儀中進(jìn)行。
首先將樣品在94°C加熱5分鐘，接著冷卻至50°C保持。在該點(diǎn)加入DNA聚合酶。25個(gè) 擴(kuò)增循環(huán)各由95°C 1分鐘、50°C 1分鐘和72°C 1分鐘構(gòu)成。最終的72°C 10分鐘確保完 全延伸。將樣品保持在4°C至分析。該反應(yīng)獲得了側(cè)翼DNA盒(各約Ikb)以及5’和 3’末端帶有BamHI限制性位點(diǎn)的IoxP壯觀霉素盒。PCR完成后，將每個(gè)反應(yīng)物各10 μ L在Invitrogen 1.2%瓊脂糖E-凝膠上以60伏 電泳30分鐘，以檢查正確大小條帶的存在。本文所述所有凝膠電泳法均使用這些條件。 如果存在條帶，則根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用Qiagen QIAQUICK PCR純化試劑盒來(lái)純 化剩余的反應(yīng)物，接著用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇?duì)進(jìn)行切割。消化在37°C進(jìn)行1小時(shí)，20yL 反應(yīng)物由9 μ L /K、2 μ L10XBSA、2 μ L適當(dāng)?shù)腘EB限制性緩沖液(根據(jù)2000-01 NEB 目錄和技術(shù)資料)、5 μ L模板和1 μ L每種限制性酶組成。例如，用SacI和BamHI在 NEB (New England BioLabs)限制性緩沖液B中切割bglC上游片段。通過(guò)凝膠電泳純化經(jīng) 消化的片段并根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用QiagenQIAQUICK 凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用Takara連接試劑盒或者使用T4 DNA連接酶(反應(yīng)內(nèi)容 每種插入片段各5 μ L、1 μ L經(jīng)切割的pUC19質(zhì)粒、3 μ LT4DNA連接酶緩沖液和1 μ L Τ4 DNA連接酶)，在兩個(gè)步驟中將片段連接進(jìn)質(zhì)粒載體中。首先，將經(jīng)切割的上游及下游 片段在15°C過(guò)夜連接進(jìn)先已經(jīng)SacI消化并凝膠純化的pUC19質(zhì)粒(參閱如Yanisch-Reman 等，Gene33: 103-119 [1985])多接頭中的單限制性酶切位點(diǎn)中，在共有的BamHI位點(diǎn) 連接以重新形成環(huán)狀質(zhì)粒。使用生產(chǎn)商的One Shot轉(zhuǎn)化方案將此重新環(huán)化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn) Invitrogen的感受態(tài)“Top 10”大腸桿菌細(xì)胞中。 在以1.5%瓊脂(LA)加50 μ g/ml羧芐青霉素固化的、含有X_gal (Sigma)用于 藍(lán)白篩選的、Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。挑取克隆并在37°C在5mL Luria Bertani培養(yǎng)液(LB)加50 μ g/ml羧芐青霉素中培養(yǎng)過(guò)夜，使用Qiagen的QIAQUICK 小量制備試劑盒分離質(zhì)粒。使用SacI進(jìn)行的限制性分析證實(shí)了 2kb插入片段的存在。在 如上述消化反應(yīng)(以額外的1 μ L水代替第二種限制性酶)中用BamHI切割經(jīng)證實(shí)帶有該 插入片段的質(zhì)粒以將其線性化，用1 μ L小牛腸或蝦的磷酸酶在37°C處理1小時(shí)以防止再 環(huán)化，并連接經(jīng)BamHI消化的側(cè)翼為IoxP位點(diǎn)的壯觀霉素抗性盒。將這種連接混合物轉(zhuǎn) 化進(jìn)大腸桿菌Top 10細(xì)胞中，并在含有100 μ g/ml壯觀霉素的LA平板上選擇菌落。如 上述通過(guò)以BamHI進(jìn)行限制性分析來(lái)證實(shí)所分離質(zhì)粒中的標(biāo)記插入。在轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢 桿菌中之前，用ScaI將質(zhì)粒線性化，以確保雙交換事件。實(shí)施例2粘度測(cè)定試驗(yàn)在含有50mL適于生產(chǎn)枯草桿菌蛋白酶的培養(yǎng)基的250ml帶擋板錐形瓶中培養(yǎng)細(xì)胞(參閱 Christianson 等，Anal.Biochem.，223 119_129[1994]；以及 Hsia 等，Anal.
Biochem.，242 221-227 [1996])。用50 μ L的8小時(shí)5mL培養(yǎng)物接種該培養(yǎng)基，并 在37°C培養(yǎng)40小時(shí)同時(shí)以250 RPM搖動(dòng)。培養(yǎng)宿主A(_bglC)、宿主B(_bglC)、宿主 C (-bglS)和 Host D (-bglS)培養(yǎng)物 48 小時(shí)。在37小時(shí)時(shí) 從每個(gè)搖瓶中取Iml樣品。離心除去細(xì)胞，對(duì)60 μ L上清液進(jìn)行粘 度測(cè)定試驗(yàn)。在t = 0、t = 22小時(shí)和t = 120小時(shí)時(shí)測(cè)量粘度。使用水作為對(duì)照。使用以下方法測(cè)量粘度對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，將2ml體積的纖維素性材料(羧甲 基纖維素)在深低溫小瓶中分散。將60 μ L樣品加入2ml體積的纖維素性材料中。輕柔 混合后，在適當(dāng)?shù)念A(yù)定時(shí)間(例如孵育20小時(shí))取樣進(jìn)行分析。就分析而言，將500 μ L 樣品和底物吸入粘度計(jì)(BrookfieldLV DVIII Cone&Plate粘度計(jì)，帶有設(shè)置為25°C的CP40 水浴)的樣品杯中，并將粘度計(jì)編程以便SSN(設(shè)置速度)為16 RPM，WTI(等待時(shí)間) 設(shè)置為30秒(Rheocalc軟件)。30秒后，顯示摘要單。這些測(cè)定的結(jié)果在圖2提供。對(duì)于接觸纖維素性材料的對(duì)照、宿主A(-bglC) 和宿主B(-bglC)樣品而言，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未觀察到粘度下降，表示樣品中不存在纖維素 酶活性。如粘度的下降所表示的，具有缺失的bglS基因組序列的宿主菌株顯示出顯著的 纖維素酶活性。實(shí)施例3構(gòu)建產(chǎn)生蛋白酶的bglC::壯觀霉素菌株在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了以下菌株產(chǎn)生枯草桿菌蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株以及帶 有插入失活的bglC的相同菌株。如下構(gòu)建待測(cè)試的菌株。用來(lái)自產(chǎn)生枯草桿菌蛋白酶的菌株的染色體DNA轉(zhuǎn)化 SC6 菌株(spoIIE，amyE，aprE Pxyl comK)。在含有氯霉素(5 μ g/ml)和 1.6% 脫脂乳 的L瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。通過(guò)含有脫脂乳的平板上產(chǎn)生的暈圈來(lái)證實(shí)枯草桿菌蛋白 酶的存在。所得菌株MDT04-250用來(lái)自具有插入失活的bglC基因的菌株的染色體DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在含有壯觀霉素(100 μ g/ml)的L瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。通過(guò)對(duì)氯霉素 (5 μ g/ml)和壯觀霉素(100 μ g/ml)的抗性來(lái)證實(shí)新菌株MDT05-28。為獲得蛋白酶， 擴(kuò)增這兩種菌株，這通過(guò)將其依次在含有氯霉素(10 μ g/ml)然后含有氯霉素(25 μ g/ml) 的L瓊脂平板上培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行。在250mL帶擋板的錐形瓶中，在含有25ml LB (Difco)、葡 萄糖(0.1% )和氯霉素(25μιη/ιη1)的搖瓶中培養(yǎng)這些經(jīng)擴(kuò)增的菌株。將搖瓶在37°C孵 育同時(shí)以280rpm搖動(dòng)，在OD55tl為0.8時(shí)，將ImL培養(yǎng)物與0.5ml 30%甘油混合并冷凍 于_70°C。以解凍管中的30 μ L接種250ml三角瓶中的40ml FNII培養(yǎng)基。每個(gè)菌株使 用兩瓶。將搖瓶在280rpm搖動(dòng)下以37°C孵育數(shù)天，收集上清液樣品進(jìn)行粘度測(cè)試和枯 草桿菌蛋白酶分析。在培養(yǎng)過(guò)程中在不同時(shí)間(如16、48和68小時(shí))后從液體培養(yǎng)物中收獲上清 液，并在25°C在含有0.3 mM N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對(duì)硝基苯胺(Vega Biochemicals)、0.1M Tris, pH 8.6的溶液中如前述測(cè)定枯草桿菌蛋白酶(參閱Estell等， J.Biol.Chem.，260 6518_6521[1985])。該測(cè)定法測(cè)量由于對(duì)硝基苯胺的水解和釋放導(dǎo)致 的每分鐘410nm吸光度的提高。這些菌株以相等的速率產(chǎn)生相等量的枯草桿菌蛋白酶。在接種后16、48或68小時(shí)時(shí)自親本菌株MDT04-250或bglC::spec菌株(MDT05-28)的搖瓶中取上清液樣品，并與纖維素底物(4.5ml 5% CMC+0.5ml上清液)孵 育1、24或48小時(shí)。通過(guò)纖維素底物的粘度下降來(lái)衡量纖維素酶對(duì)纖維素底物的活性， 上述粘度下降根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)使用軟件通過(guò)流變儀測(cè)量(如上文所述)。數(shù)據(jù)以對(duì)照 (dH20)讀數(shù)的百分比來(lái)表示。得自MDT05-28搖瓶的樣品未顯示纖維素底物的粘度降 低，而來(lái)自MDT04-250的所有樣品都快速地降低纖維素底物的粘度。這表明bglC的失 活阻止了對(duì)纖維素底物的活性。這些測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果示于圖3。這些結(jié)果顯示，具有已 破壞的bglC基因的表達(dá)枯草桿菌蛋白酶的宿主芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)物上清液未顯示顯著 的纖維素酶活性。盡管已經(jīng)舉例說(shuō)明和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言很明顯的是，可以進(jìn)行多種其他改變和修改，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此， 所附的權(quán)利要求書旨在涵蓋所有這些在本發(fā)明范圍之內(nèi)的改變和修改。本說(shuō)明書中提及的所有專利及出版物代表了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。 所有專利及出版物均以參考方式并入本文，其程度等同于每篇單個(gè)出版物均具體且單獨(dú) 地指明以參考方式并入。
盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言很明顯的 是，可以對(duì)所公開的實(shí)施方案進(jìn)行多種修改，而且這些修改均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分清楚，本發(fā)明非常適應(yīng)于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的并獲得所描述 的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)以及其內(nèi)在的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文所述的組合物和方法代表優(yōu)選實(shí)施方案， 是示例性的，并且不意在限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯的是，可以 對(duì)本文所述發(fā)明進(jìn)行多種替換和修改，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。適宜地，本文示例性描述的發(fā)明可以在缺少本文未具體公開的任何要素、限制 條件的情況下實(shí)施。所使用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述用語(yǔ)而非限制，這些術(shù)語(yǔ)及表述的使 用并不旨在排除所示及所述特征的任何等同方案或其部分，而是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明 要求保護(hù)的范圍之內(nèi)可以有多種修改。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案 和任選特征進(jìn)行了具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本文所公開的概念進(jìn)行修改和改 變，這些修改和改變均被認(rèn)為在后附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了寬泛和一般性的描述。落入公開的上位概念之內(nèi)的每種下 位概念及亞組均構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括附條件或負(fù)向限制因素的、對(duì)本發(fā)明的 上位描述，以從該上位概念中除去任何主題，無(wú)論該被排除的主題是否在本文中具體提 及。
權(quán)利要求
1.重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其包含含有失活的bgic基因的基因組，其中所述細(xì)胞還 包含用于產(chǎn)生分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。
2.權(quán)利要求1的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述失活的bglC基因包含缺失、插 入、替換或重排。
3.權(quán)利要求1的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞為地衣芽孢桿 菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、嗜堿芽孢桿菌 (B.alkalophilus)或耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)為選自 蛋白酶、淀粉酶、果膠酸裂合酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。
5.權(quán)利要求4的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述酶是蛋白酶。
6.權(quán)利要求5的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
7.權(quán)利要求1的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中所述bglC基因編碼與SEQID NO 2 具有至少80%同一性的多肽。
8.細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含 培養(yǎng)基；和權(quán)利要求1的重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞。
9.一種方法，其包括在適于產(chǎn)生所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的條件下維持權(quán)利要求8的細(xì)胞培養(yǎng)物。
10.權(quán)利要求9的方法，還包括從所述培養(yǎng)基中回收所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，還包括將所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)與洗衣洗滌劑組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是枯草桿菌蛋白酶。
13.通過(guò)權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的無(wú)纖維素酶的蛋白質(zhì)組合物。
14.權(quán)利要求13的無(wú)纖維素酶的蛋白質(zhì)組合物，其中所述組合物包含由芽孢桿菌產(chǎn) 生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)，并且其特征在于該組合物不具有可檢測(cè)的纖維素酶活 性。
15.包含通過(guò)權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的無(wú)纖維素酶的洗 衣洗滌劑。
16.權(quán)利要求15的無(wú)纖維素酶的洗衣洗滌劑，其中所述洗滌劑含有纖維素性聚合物。
17.構(gòu)建細(xì)胞的方法，其包括a)將第一重組核酸引入芽孢桿菌細(xì)胞中，以使所述重組核酸與所述細(xì)胞的bglC基因 重組；和b)將第二重組核酸引入所述細(xì)胞中，其提供所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的表達(dá)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸插入到所述bglC基因中。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸造成所述bglC基因的至少一個(gè)部分缺失。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是枯草桿菌蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為芽孢桿菌屬細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含含有失活的bglC基因的基因組以及用于產(chǎn)生至少一種分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的重組核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌型洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)是蛋白酶。本發(fā)明還提供使用所述細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的方法，以及含有至少一種洗滌劑添加劑蛋白質(zhì)的無(wú)纖維素酶的組合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102016028SQ200780037346
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2007年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月6日
發(fā)明者M·A·塞爾溫 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司