提高纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素制備生物乙醇是發(fā)展綠色、可持續(xù)能源最具潛力的生產(chǎn)路線之一，也是解決資源、環(huán)境和能源問題最為行之有效的方法之一。然而，纖維素酶因其活力低、耗量大和成本高的特點(diǎn)，已成為纖維素乙醇商業(yè)化進(jìn)程的主要障礙。目前，通過菌種改造、酶定向進(jìn)化、改進(jìn)酶的穩(wěn)定性和耐受性等手段，纖維素酶活性和產(chǎn)量得以提高，纖維素乙醇生產(chǎn)過程的纖維素酶成本有所降低，但仍然無法滿足木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性要求。因此，為大幅降低纖維素酶成本，纖維素酶高效回收再用工藝的開發(fā)強(qiáng)化已成為解決這一問題的重要途徑。
[0003]纖維素酶回收再用主要包括外切β -1, 4-葡聚糖酶(CBH)、內(nèi)切β -1, 4_葡聚糖酶(EG)和纖維二糖酶(CB)三類酶的回收。其中，重吸附法回收纖維素酶工藝簡單、設(shè)備要求低，適于大規(guī)模操作，具有廣闊的工業(yè)化前景。木質(zhì)纖維素糖化發(fā)酵過程之后溶液中的CBH和EG可以通過重新吸附在新鮮纖維素底物上實現(xiàn)回收再用；而08由于缺乏吸附端無法通過重吸附法回收。因此，重吸附法回收纖維素酶時通常需要重新補(bǔ)加葡萄糖苷酶以獲得高乙醇產(chǎn)量。然而，在工業(yè)上常用黑曲霉菌株生產(chǎn)葡萄糖苷酶，價格昂貴，其在重吸附回收過程的補(bǔ)加顯著增加了纖維素乙醇生產(chǎn)的酶成本。目前，在纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)工藝中尚缺乏經(jīng)濟(jì)可行、簡單實用的方法實現(xiàn)纖維素酶回收再用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是針對在木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇過程中，通過重吸附法實現(xiàn)纖維素酶回收再用時，需要額外補(bǔ)加β -葡萄糖苷酶的不足，提供一種提高纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種提高纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，包括以下步驟:
[0007]I)原料預(yù)處理:將粉碎后的木質(zhì)纖維素預(yù)處理，低溫烘干；
[0008]2)配制混合物:按比例將2.5-10g步驟I)得到的木質(zhì)纖維素與50mL的營養(yǎng)液混合得到混合物I ;
[0009]3)同步糖化發(fā)酵:將混合物I置于反應(yīng)器中，在45_50°C下，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加10-50FPU纖維素酶，預(yù)酶解12-24小時；降溫至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹閘g/L-5g/L，在30-37°C發(fā)酵72-168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0010]4)纖維素酶回收再用:在發(fā)酵液中加入與步驟2)相同質(zhì)量的預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素，4-250C下吸附60-120min，固液分離，得到液體和固體，所述液體經(jīng)精餾分離得到乙醇，固體與步驟2)營養(yǎng)液相同體積的營養(yǎng)液混合，得混合物；
[0011]5)再次同步糖化發(fā)酵:將步驟(4)獲得的混合物置于反應(yīng)器中，在45-50°C下，添加葡萄糖苷酶，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加葡萄糖苷酶0-35CBU，使得β -葡萄糖苷酶加入量與步驟3)加入纖維素酶量的比值< 0.7，在45-50°C下，反應(yīng)12-24小時；降溫至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹閘g/L-5g/L，在30-37°C發(fā)酵72-168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0012]6)重復(fù)步驟 4)-5)。
[0013]木質(zhì)纖維素優(yōu)選粉碎后的玉米芯、甘蔗渣、玉米秸桿、麥桿、稻草、木肩、廢紙或柳枝稷。
[0014]步驟(I)預(yù)處理的方法優(yōu)選:稀酸預(yù)處理、堿法預(yù)處理、機(jī)械預(yù)處理、生物預(yù)處理、氨浸預(yù)處理、硫酸-氫氧化鈉耦合預(yù)處理或硫酸-氨水耦合預(yù)處理，最佳選擇為:硫酸-氨水耦合預(yù)處理。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0016](I)本發(fā)明的方法由于采用了分泌葡萄糖苷酶重組酵母菌，在相同纖維素酶使用量下，可以提高乙醇產(chǎn)量；
[0017](2)本發(fā)明的方法可以減少甚至避免補(bǔ)加價格昂貴的葡萄糖苷酶，極大地降低了酶用量和成本；
[0018](3)本發(fā)明的方法工藝簡單、操作方便、成本低廉，在乙醇工業(yè)化生產(chǎn)中有非常重要的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0019]圖1為實施例1中纖維素酶回收再用效果圖。
[0020]圖2為實施例2中纖維素酶回收再用效果圖。
[0021]具體實施方法
[0022]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]下面的實施例是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對權(quán)利要求作任何限定。
[0024]本發(fā)明各實施例采用的能分泌葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌是以中國專利號201110034926.9，發(fā)明名稱為:編碼β -葡萄糖苷酶的基因及重組表達(dá)載體及重組釀酒酵母表達(dá)菌株及應(yīng)用公開的“重組釀酒酵母”為例，但并不以此為限定，凡是能分泌β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌均可用于本發(fā)明。
[0025]各實施例中用于可以分泌編碼葡萄糖苷酶的重組酵母菌的擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基:
[0026]營養(yǎng)液:在pH = 4.9，50mM檸檬酸鈉緩沖液中添加了終濃度為0.5g/L的(NH4)2HPO4,0.025g/L 的 MgSO4.7H20，1.0g/L 的酵母膏，40mg/L 的四環(huán)素。
[0027]實施例1
[0028]一種提高纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，包括以下步驟:
[0029]I)原料預(yù)處理:將粉碎后的玉米芯(木質(zhì)纖維素)通過硫酸-氨水耦合的方法預(yù)處理，低溫烘干；
[0030]2)配制混合物:將2.5g步驟I)得到木質(zhì)纖維素與50mL營養(yǎng)液混合得到混合物I ;
[0031]3)同步糖化發(fā)酵:將混合物I置于搖瓶中，在50°C下，在搖瓶中添加纖維素酶，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加纖維素酶10FPU (纖維素占木質(zhì)纖維素的質(zhì)量比為70% )，預(yù)酶解12小時；降溫至30°C，添加擴(kuò)大培養(yǎng)后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹?g/L，在30°C發(fā)酵168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0032]4)纖維素酶回收再用:在發(fā)酵液中加入2.5g預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素，25°C下吸附60min，固液分離，得到液體和固體，所述液體經(jīng)精餾分離得到乙醇，固體與50mL營養(yǎng)液混合，得混合物；
[0033]5)再次同步糖化發(fā)酵:將步驟4)獲得的混合物置于搖瓶中，在50°C下，反應(yīng)12小時；降溫至30°C，添加擴(kuò)大培養(yǎng)后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹?g/L，在30°C發(fā)酵168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣。
[0034]以乙醇濃度和纖維素酶生產(chǎn)能力為考察指標(biāo)，評價纖維素酶回收及利用效率，如圖1所示。
[0035]第一次同步糖化發(fā)酵，即步驟I)-3)，從步驟3)獲得的發(fā)酵液取微量檢測乙醇濃度；
[0036]第二次同步糖化發(fā)酵，即步驟5)，從步驟5)獲得的發(fā)酵液取微量檢測乙醇濃度。
[0037]測發(fā)酵液中乙醇的濃度:乙醇濃度依次為16.57g/L和13.36g/L，產(chǎn)醇能力回收率分別為80.6%。
[0038]實驗證明，用甘蔗渣、稻草、木肩、廢紙或柳枝稷替代本實施例的玉米芯，其它同本實施例，其效果與本實施例的效果相似。
[0039]實驗證明，用酸預(yù)處理、堿法預(yù)處理、機(jī)械預(yù)處理、生物預(yù)處理替代本實施例的硫酸-氨水耦合預(yù)處理其它同本實施例，其效果與本實施例的效果相似。