重組菌耦合表面活性劑強化纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種木質(zhì)纖維素?zé)捴粕镆掖歼^程中的纖維素酶回收方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素制備生物乙醇是發(fā)展綠色、可持續(xù)能源最具潛力的生產(chǎn)路線之一，也是解決資源、環(huán)境和能源問題最為行之有效的方法之一。以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇過程中，需使用纖維素酶，纖維素酶成本約占總生產(chǎn)成本的50%，已成為纖維素乙醇商業(yè)化進程的主要障礙。纖維素酶活力低、耗量大和成本高是其成本持續(xù)居高的主要原因。因此，為大幅降低纖維素酶成本，纖維素酶高效回收再用工藝的開發(fā)已成為解決這一問題的重要途徑。
[0003]纖維素酶包括外切β -1, 4-葡聚糖酶(CBH)、內(nèi)切β -1, 4_葡聚糖酶(EG)和纖維二糖酶(CB)。重吸附法回收纖維素酶因其工藝簡單、設(shè)備要求低和成本低廉，已廣泛地應(yīng)用在纖維素酶回收再用工藝中，但該回收方法主要適用于發(fā)酵液中游離酶的回收。在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，木質(zhì)纖維素糖化發(fā)酵通常在高底物濃度下進行，以得到高濃度乙醇滿足工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟性要求(> 4%)。高濃度木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵后，在固相中分布的纖維素酶含量顯著增加，僅僅回收發(fā)酵液中的纖維素酶將極大地降低酶回收效率，發(fā)酵殘渣上吸附酶的回收再用尤為重要。發(fā)酵液(重吸附法)和發(fā)酵殘渣上纖維素酶回收主要是針對CHB和EG;CB由于缺乏吸附端，很難在上述過程中實現(xiàn)有效回收。因此，在酶回收后再用過程中通常需要額外補加與纖維二糖酶(CB)作用相同的葡萄糖苷酶以獲得高乙醇產(chǎn)率和高纖維素轉(zhuǎn)化率。然而，在工業(yè)上常用黑曲霉菌株生產(chǎn)葡萄糖苷酶，它價格昂貴，其在再用過程的補加顯著增加了纖維素乙醇生產(chǎn)的酶成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的，在利用回收的纖維素酶實現(xiàn)木質(zhì)纖維素制備生物乙醇時，需補加β -葡萄糖苷酶和纖維素酶回收效率低的不足，提供一種重組菌耦合表面活性劑強化纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種重組菌耦合表面活性劑強化纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，包括以下步驟:
[0007]I)原料預(yù)處理:將粉碎后的木質(zhì)纖維素預(yù)處理，低溫烘干；
[0008]2)配制混合物:按比例將2.5-10g步驟I)得到的木質(zhì)纖維素與50mL含有Tween80的營養(yǎng)液混合得到混合物I ;
[0009]3)同步糖化發(fā)酵:將混合物I置于反應(yīng)器中，在45_50°C下，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加10-50FPU纖維素酶，預(yù)酶解12-24小時；降溫至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹閘g/L-5g/L，在30-37°C發(fā)酵72-168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0010]4)纖維素酶回收再用:在發(fā)酵液中加入與步驟2)相同質(zhì)量的預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素，4-250C下吸附60-120min，固液分離，得到液體和固體，所述液體經(jīng)精餾分離得到乙醇，固體和發(fā)酵殘澄混合，加入與步驟2)含有Tween80的營養(yǎng)液相同體積的含有Tween80的營養(yǎng)液混合，得混合物；
[0011]5)再次同步糖化發(fā)酵:將步驟4)得到的混合物置于反應(yīng)器中，在45_50°C下，預(yù)酶解12-24小時；降溫至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹閘g/L-5g/L，在30-37°C發(fā)酵72-168小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0012]6)重復(fù)步驟4)-5);含有Tween80的營養(yǎng)液中Tween80的濃度為0.5g/L_20g/L。
[0013]木質(zhì)纖維素優(yōu)選為粉碎后的玉米芯、甘蔗渣、玉米秸桿、麥桿、稻草、木肩、廢紙或柳枝稷。
[0014]步驟(I)預(yù)處理的方法優(yōu)選為稀酸預(yù)處理、堿法預(yù)處理、機械預(yù)處理、生物預(yù)處理、氨浸預(yù)處理、硫酸-氫氧化鈉耦合預(yù)處理或硫酸-氨水耦合預(yù)處理，最好是硫酸-氨水耦合預(yù)處理。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0016](I)本發(fā)明的方法由于采用了能分泌葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌，避免纖維素酶回收再利用過程中昂貴的葡萄糖苷酶的補加，極大地降低了乙醇生產(chǎn)的纖維素酶用量和成本；
[0017](2)發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣中纖維素酶共回收顯著提高了高底物濃度下同步糖化發(fā)酵后的酶回收效率；
[0018](3)添加表面活性劑Tween80進一步強化纖維素酶的回收效率；
[0019](4)該方法工藝簡單、操作方便、成本低廉，易于建立起經(jīng)濟可行的纖維素酶回收工藝，在乙醇工業(yè)化生產(chǎn)中有非常重要的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0020]圖1為實施例1中纖維素酶回收再用效果圖。
[0021]圖2為實施例2中纖維素酶回收再用效果圖。
[0022]具體實施方法
[0023]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0024]下面的實施例是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對權(quán)利要求作任何限定。
[0025]本發(fā)明各實施例采用的能分泌葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌是以中國專利號201110034926.9，發(fā)明名稱為:編碼β -葡萄糖苷酶的基因及重組表達(dá)載體及重組釀酒酵母表達(dá)菌株及應(yīng)用公開的“重組釀酒酵母”為例，但并不以此為限定，凡是能分泌β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌均可用于本發(fā)明。
[0026]各實施例中用于可以分泌編碼葡萄糖苷酶的重組酵母菌的擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基:
[0027]含有Tween80的營養(yǎng)液:在pH = 4.9，50mM檸檬酸鈉緩沖液中添加了終濃度為 0.5g/L 的(NH4)2ΗΡ04，0.025g/L 的 MgSO4.7H20，1.0g/L 的酵母膏，40mg/L 的四環(huán)素和Tween80o
[0028]實施例1
[0029]—種重組菌耦合表面活性劑強化纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，包括以下步驟:
[0030]I)原料預(yù)處理:將粉碎后的玉米芯(木質(zhì)纖維素)通過硫酸-氨水耦合的方法預(yù)處理，低溫烘干；
[0031]2)配制混合物:將5g步驟I)得到木質(zhì)纖維素與50mL含有Tween80的營養(yǎng)液混合得到混合物I ;
[0032]3)同步糖化發(fā)酵:將混合物I置于搖瓶中，在50°C下，在搖瓶中添加纖維素酶，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加纖維素酶30FPU (纖維素占木質(zhì)纖維素的質(zhì)量比為70% )，預(yù)酶解12小時；降溫至30°C，添加擴大培養(yǎng)后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹?g/L，在30°C發(fā)酵96小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0033]4)纖維素酶回收再用:在發(fā)酵液中加入5g預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素，20°C下吸附120min，固液分離，得到液體和固體，所述液體經(jīng)精餾分離得到乙醇，固體和發(fā)酵殘渣混合，加入50mL含有Tween80的營養(yǎng)液混合，得混合物；
[0034]5)再次同步糖化發(fā)酵:將步驟4)得到的混合物置于搖瓶中，在50°C下，預(yù)酶解12小時；降溫至30°C，添加擴大培養(yǎng)后的能分泌β -葡萄糖苷酶的重組釀酒酵母表達(dá)菌使?jié)舛葹?g/L，在30°C發(fā)酵96小時，固液分離，得到發(fā)酵液和發(fā)酵殘渣；
[0035]6)重復(fù)I次步驟4) -5);含有Tween80的營養(yǎng)液中Tween80的濃度為5g/L。
[0036](在重復(fù)步驟4)時，步驟4)的發(fā)酵液是上一次反應(yīng)步驟5)獲得的發(fā)酵液)
[0037]以乙醇濃度和纖維素酶生產(chǎn)能力為考察指標(biāo)，評價纖維素酶回收及利用效率，如圖1所示。
[0038]第一次同步糖化發(fā)酵，即步驟I)-3)，從步驟3)獲得的發(fā)酵液取微量檢測乙醇濃度；
[0039]第二次同步糖化發(fā)酵，即步驟5)，從步驟5)獲得的發(fā)酵液取微量檢測乙醇濃度；
[0040]第三次，即重復(fù)I次步驟4) -5)，從重復(fù)I次的步驟5)獲得的發(fā)酵液取微量檢測乙醇濃度；
[0041 ] 測發(fā)酵液中乙醇的濃度:三次所得乙醇濃度依次為33.05g/L、29.98g/L和28.36g/L，產(chǎn)醇能力回收率為90.7%和85.8%。
[0042]實驗證明，用稻草、木肩、廢紙或柳枝稷替代本實施例的玉米芯，其它同本實施例，其效果與本實施例的效果相似。
[0043]實驗證明，稀酸預(yù)處理、機械預(yù)處理、生物預(yù)處理替代本實施例的硫酸-氨水耦合預(yù)處理其它同本實施例，其效果與本實施例的效果相似。
[0044]實施例2
[0045]重組菌耦合表面活性劑強化纖維素酶回收再用制備生物乙醇的方法，包括以下步驟:
[0046]I)原料預(yù)處理:將粉碎后的玉米秸桿(木質(zhì)纖維素)通過氨浸的方法預(yù)處理，低溫烘干；
[0047]2)配制混合物:將5g步驟I)得到木質(zhì)纖維素與50mL含有Tween80的營養(yǎng)液混合得到混合物I ;
[0048]3)同步糖化發(fā)酵:將混合物I置于搖瓶中，在45°C下，在搖瓶中添加纖維素酶，按木質(zhì)纖維素中纖維素的量計算，每g纖維素添加纖維素酶30FPU，預(yù)酶解24小時；降溫至35°C，添加