專利名稱：Na/K-ATP酶表達(dá)作為癌癥治療的指示劑的制作方法
Na/K-ATP酶表達(dá)作為癌癥治療的指示劑交叉參考相關(guān)申請本申請要求2008年10月四日提交的美國臨時(shí)申請NO. 61/109，386(將其公開內(nèi)容通過參考并入本文)的利益。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究的聲明本發(fā)明是在由衛(wèi)生和人類服務(wù)部美國公共衛(wèi)生署國家一般醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供的國立衛(wèi)生研究院基金HL-36573和HL-67963下由政府資助進(jìn)行的，因此政府在本發(fā)明中具有權(quán)利。參考經(jīng)由EFS-WEB提交的序列表本申請將通過USPTO EFS-WEB服務(wù)器電子提交，如被授權(quán)并且示于MPEP$1730 II. B. 2 (a) (A)中的，并且該電子提交包括電子地提交的序列(SEQ ID)表。該序列表的完整內(nèi)容出于所有目的通過參考并入本文。序列表在電子提交的.txt文件上名稱如下2009 年 10 月 23 日生成的 420_50446_SEQ_LIST_D2009-09. txt，大小為 2，092 字節(jié)。本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域和工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)哇巴因(ouabain)誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶表達(dá)的變化決定細(xì)胞生長調(diào)控。此外，哇巴因誘導(dǎo)的PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活是哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP 酶上調(diào)的關(guān)鍵因素。此外，雷帕霉素(或與雷帕霉素相似的藥物)對(duì)PI3-K/Akt/mT0R途徑的抑制還可使哇巴因應(yīng)答從生長刺激變成生長抑制。
背景技術(shù)：
Na/K-ATP酶(P型ATP酶家族的成員)經(jīng)發(fā)現(xiàn)為能量轉(zhuǎn)換離子泵(energy transducing ion pump)。其將Na+和K+運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜并且維持動(dòng)物細(xì)胞的離子穩(wěn)態(tài)(ion homeostasis)。最近的研究顯示，Na/K-ATP酶還可以是可授予配體結(jié)合進(jìn)入蛋白激酶級(jí)聯(lián)的激活的重要受體。具體地，Na/K-ATP酶與Src相互作用，這產(chǎn)生至少兩個(gè)重要的細(xì)胞調(diào)控。首先，其使Src保持在無活性狀態(tài)。因此Na/K-ATP酶可充當(dāng)天然的負(fù)Src調(diào)節(jié)劑。其次，該相互作用形成強(qiáng)心留類固醇(Na/K-ATP酶的一組詳盡表征的配體)的功能性受體復(fù)合物。 強(qiáng)心甾類固醇(Cardiotonic steroids,CTS)包括強(qiáng)心內(nèi)戊酯類(例如，哇巴因)和蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯(bufadienolides)(例如，MBG-海蟾蜍毒素(marinobufagenin))。雖然CTS是已知的心臟藥物，但它們中的一些現(xiàn)已被鑒定為內(nèi)源性類固醇激素。CTS與受體復(fù)合物的結(jié)合激活了 Na/K-ATP酶-結(jié)合的Src。隨后被激活的Src反式激活其他酪氨酸激酶，然后它們一起募集并且進(jìn)一步磷酸化多個(gè)膜蛋白和可溶性蛋白，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)激酶級(jí)聯(lián)的激活和第二信使的產(chǎn)生。最終，該信號(hào)傳導(dǎo)事件鏈將以細(xì)胞特異性方式改變細(xì)胞功能和細(xì)胞生長。 例如，本發(fā)明者和其他研究人員已證明哇巴因誘導(dǎo)的ERK和PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物以及體內(nèi)細(xì)胞生長刺激的原因。CTS抑制許多癌細(xì)胞的細(xì)胞生長長期以來也得到公認(rèn)。特別重要的是表明CTS治療在患乳腺癌的婦女中的有益效果的研究。相一致地，最近的體外和體內(nèi)研究已鑒定了幾種展示抗癌活性的新型CTS化合物。例如夾竹桃苷在美國作為人癌癥的抗癌藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。雖然哇巴因抑制Na/K-ATP酶的泵功能，但重要地要指出，哇巴因的生長抑制作用可在既不引起細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的顯著改變也不影響細(xì)胞活力的劑量上發(fā)生。相反，與其對(duì)細(xì)胞生長刺激的作用一樣，哇巴因通過激活蛋白激酶和產(chǎn)生第二信使而誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制。例如，最近的報(bào)導(dǎo)顯示這些無毒性濃度的哇巴因刺激Src，從而導(dǎo)致EGFR/ERK途徑的激活和細(xì)胞周期抑制劑ρ2Γ ρ(周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑)表達(dá)的誘導(dǎo)以及細(xì)胞生長停滯。因此，理解決定細(xì)胞響應(yīng)CTS刺激的不同命運(yùn)的分子機(jī)制變得重要起來，以便可開發(fā)抑制或刺激細(xì)胞生長的方法。目前，Na/K-ATP酶是CTS的唯一已知的受體。以前的研究已顯示CTS誘導(dǎo)Na/ K-ATP酶的內(nèi)吞作用和通過受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)其細(xì)胞表達(dá)。因?yàn)镹a/K-ATP酶具有抽泵和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，所以本發(fā)明者在本文中認(rèn)為，細(xì)胞Na/K-ATP酶量的變化可對(duì)細(xì)胞生長具有顯著的影響。本發(fā)明者在本文中現(xiàn)已顯示細(xì)胞Na/K-ATP酶在哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長調(diào)控中的作用，并且發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的細(xì)胞量的方法?？紤]上述問題，很顯然在本領(lǐng)域需要靶向新發(fā)現(xiàn)的Na/K-ATP酶/Src受體復(fù)合物以允許CTS例如哇巴因、地高辛(digoxin)和洋地黃毒苷(digitoxin)抑制或刺激細(xì)胞生長的方法。這樣的方法也可有助于開發(fā)日益更有效的、副作用更少的治療劑、診斷劑或預(yù)防試齊LU根據(jù)本發(fā)明，正好提供了這樣的方法。發(fā)明概述在第一廣泛的方面，在本文中提供了確定癌癥患者是否可從強(qiáng)心留類固醇(CTS) 治療中獲得治療益處的方法，包括確定患者的癌細(xì)胞是否已失去增加Na/K-ATP酶的細(xì)胞合成的能力，其中Na/K-ATP酶合成的喪失標(biāo)示著患者可能從CTS治療中受益。在某些實(shí)施方案中，所述方法可用于意欲接受洋地黃治療的癌癥患者的診斷和/ 或預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括確定癌細(xì)胞中哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶表達(dá)的變化是否與哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長調(diào)控直接相關(guān)。 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括檢測癌細(xì)胞中PI3-激酶的激活，其中PI3-激酶的激活影響癌細(xì)胞中哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶的上調(diào)。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括測量細(xì)胞中Na/K-ATP酶表達(dá)的變化。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使用Western印跡或3H-哇巴因結(jié)合測定法進(jìn)行測量。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于確定細(xì)胞是否對(duì)強(qiáng)心留類固醇(CTS) 治療易感的方法，包括確定細(xì)胞是否保持補(bǔ)充(Mplete)細(xì)胞中減少的Na/K-ATP酶的能力。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括確定細(xì)胞是否缺乏補(bǔ)償哇巴因誘導(dǎo)的Na/K ATP 酶損失的機(jī)制。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在本文中提供了調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的細(xì)胞合成的方法，包括施用有效量的Na/K-ATP酶抑制劑例如強(qiáng)心留類固醇CTS以調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的表觀生物學(xué)活性。
在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于治療患者的方法，包括單獨(dú)地或與 mTOR抑制劑和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinisitide 3-kinase，PI3-K)抑制劑的靶中的至少一個(gè)組合地給患者施用有效量的Na/K-ATP酶抑制劑。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了配制于藥學(xué)上可接受的賦形劑中并且適合用于人患者的藥物制劑，其中包含Na/K-ATP酶抑制劑與mTOR抑制劑和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制劑的靶中的至少一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述Na/K-ATP酶抑制劑是強(qiáng)心留類固醇(CTS)。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于治療癌癥患者的試劑盒，其單獨(dú)地或與減少Na/K-ATP酶表達(dá)的組合物組合地包括Na/K-ATP酶抑制劑。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了鑒定不太可能響應(yīng)強(qiáng)心留類固醇(CTS)療法的癌癥患者的方法，所述方法包括從癌癥患者獲得生物樣品，其中所述生物樣品包含癌細(xì)胞；和測定Na/K-ATP酶的水平或活性，其中與正常健康受試者中發(fā)現(xiàn)的Na/K-ATP酶水平或活性相比較具有NF Na/K-ATP酶水平或活性的變化的患者表示該患者不太可能對(duì)CTS 療法起反應(yīng)。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了診斷癌癥或?yàn)榛加衅渲杏赏郯鸵蛴|發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的表達(dá)發(fā)生改變的癌癥的患者提供預(yù)后的方法，所述方法包括將癌癥樣品與特異性結(jié)合作為由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一部分的蛋白質(zhì)的抗體接觸，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3_K/Akt/mT0R途徑；以及確定樣品中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)是否被改變，從而診斷癌癥或提供癌癥的預(yù)后。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了鑒定抑制其中由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生變化的癌癥的化合物的方法，所述方法包括以下步驟將表達(dá)由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的細(xì)胞與化合物接觸，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑；以及測定所述化合物對(duì)所述多肽的作用；從而鑒定抑制癌癥的化合物。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了鑒定抑制難治性癌癥的化合物的方法，所述方法包括將表達(dá)由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的細(xì)胞與所述化合物接觸， 其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑；以及測定所述化合物對(duì)多肽的作用；從而鑒定抑制所述難治性癌癥的化合物。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了治療或抑制受試者的癌癥的方法，所述癌癥具有改變的由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，所述方法包括給受試者施用治療有效量的一種或多種調(diào)節(jié)由由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的抑制劑，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3_K/Akt/mT0R 途徑。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了治療或抑制受試者的難治性癌癥的方法， 包括給受試者施用治療有效量的一種或多種由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3_K/Akt/mT0R途徑。在某些實(shí)施方案中，難治性癌癥具有改變的由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的表達(dá)，并且所述難治性癌癥通過如下步驟進(jìn)行診斷將癌癥樣品與特異性結(jié)合作為由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分的蛋白質(zhì)的抗體接觸；和確定所述蛋白質(zhì)的表達(dá)在該樣品中是否被改變，從而診斷癌癥或提供癌癥的預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，將一種或多種調(diào)節(jié)劑與另一種癌癥療法同時(shí)施用。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括在不同的時(shí)間點(diǎn)上多次測定表達(dá)水平的模式， 從而允許監(jiān)控受試者中癌癥的進(jìn)展。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括估計(jì)給定的癌癥治療模式在受試者中的成功概率。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的方法，包括在細(xì)胞中引起由哇巴因或其他強(qiáng)心藥(CTS)誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶表達(dá)的變化。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的方法，包括通過將細(xì)胞與具有足以引起哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶上調(diào)的量的CTS接觸，以誘導(dǎo)細(xì)胞中PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活來調(diào)節(jié)細(xì)胞中Na/K-ATP酶的表達(dá)。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了用于估計(jì)CTS療法在接受此種CTS療法的患者中的功效的方法，包括監(jiān)控Na/K-ATP酶在這樣的患者中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，患者患有癌癥。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括在癌癥的治療中將有效量的雷帕霉素和CTS療法一起施用。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥包括乳腺癌并且所述CTS療法包括施用約1至約50nM哇巴因、地高辛或洋地黃毒苷。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了在有需要的細(xì)胞中補(bǔ)充功能性Na/K-ATP 酶的質(zhì)膜庫的方法，包括在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶(α )的哇巴因敏感型 α 1同種型的上調(diào)。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括施用至少一種足以在癌細(xì)胞中減少質(zhì)膜Na/ K-ATP酶并且引起哇巴因誘導(dǎo)的生長抑制的CTS。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感的方法，包括施用足以在細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長的有效量的雷帕霉素。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了通過PI3-K/Akt/mT0R-依賴性翻譯機(jī)制在有此需要的細(xì)胞中增加Na/K-ATP酶的表達(dá)的方法，其包括以低濃度施用哇巴因或其他 CTS。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了在有需要的細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的Na/ K-ATP酶的上調(diào)的方法，包括抑制細(xì)胞中的PI3-K/Akt/mT0R途徑。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括施用有效量的一種或多種PI3-K抑制劑或mTOR 抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括施用雷帕霉素或其類似物。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了恢復(fù)細(xì)胞生長的方法，包括施用足以抑制P21-調(diào)控蛋白表達(dá)的有效量的哇巴因。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制的適合用于在人中治療癌癥的藥物制劑，其包含與PI3-K/AKt/mT0R途徑的抑制劑組合的哇巴因或其他CTS。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中提供了治療癌癥患者的試劑盒，其中包含與 PI3-K/AKt/mT0R途徑的抑制劑組合的哇巴因或其他CTS，各試劑以預(yù)先測量的劑量配制給患者施用。當(dāng)根據(jù)附圖閱讀時(shí)，根據(jù)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本申請中的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然易見。附圖概述本專利或申請文件可包含一個(gè)或多個(gè)彩色制作的附圖和/或一張或多張照片。具有彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾埞_案的復(fù)印件在請求和支付必需的費(fèi)用后
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圖1A-1C 哇巴因?qū)Σ煌?xì)胞的細(xì)胞生長的作用。圖IA 將LLC-PKl細(xì)胞、BT20細(xì)胞和DU145細(xì)胞在96孔板上傳代培養(yǎng)(10，000個(gè)細(xì)胞/孔)并且進(jìn)行血清饑餓。在用不同濃度的哇巴因處理M小時(shí)后，加入MTT試劑。在溫育90分鐘后通過加入100 μ 1/孔由ATCC提供的去垢劑溶解細(xì)胞，然后測量0D570。圖IB 將上述3個(gè)細(xì)胞系在12孔板上傳代培養(yǎng)(50，000個(gè)細(xì)胞/孔)并且進(jìn)行血清饑餓。在哇巴因處理后，用胰蛋白酶處理3個(gè)孔的對(duì)照和哇巴因處理的細(xì)胞，在指定的時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)。圖IC 使LLC_PK1、BT20和DU145細(xì)胞血清饑餓過夜，然后用哇巴因處理M小時(shí)。 收集細(xì)胞裂解物，使用Western印跡探測p21eip。*ρ < 0. 05，< 0. Ol0圖2A-2C 長期哇巴因處理差異地在LLC-H(1、BT20和DU145細(xì)胞中調(diào)節(jié)Na/K-ATP 酶的表達(dá)和膜豐度圖2A 利用Western印跡法測量的長期哇巴因治療調(diào)節(jié)的Na/K_ATP酶α 1表達(dá)。圖2Β 用IOnM哇巴因處理LLC-PK1和ΒΤ20細(xì)胞M小時(shí)，然后使用Western印跡法就Na/K-ATP酶β 1測定細(xì)胞裂解物。圖2C:用哇巴因預(yù)處理LLC-H(1、BT20和DU145細(xì)胞72小時(shí)。洗滌細(xì)胞，如本文中所述進(jìn)行3H-哇巴因。*p < 0. 05，**p < 0. 01圖3A和;3B 由siRNA導(dǎo)致的Na/K-ATP酶的減少使細(xì)胞對(duì)洋地黃誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感圖3A 用不同濃度的哇巴因處理對(duì)照細(xì)胞(Pll)和Na/K-ATP酶敲低細(xì)胞(A4-11 和PY17) 16小時(shí)，利用MTT測定法測量細(xì)胞生長。圖;3B 用不同洋地黃化合物處理Na/K-ATP酶敲低細(xì)胞(PY17)，然后利用MTT測定法測量細(xì)胞生長。圖4A-4C 由siRNA導(dǎo)致的Na/K-ATP酶的減少通過p21cip的誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期圖4A 通過將細(xì)胞在12孔板中傳代培養(yǎng)(50，000個(gè)細(xì)胞/孔)來測量P11、PY17 和AAC-19細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線，并且用胰蛋白酶處理每一種細(xì)胞類型3個(gè)孔，然后在指定的時(shí)間點(diǎn)上計(jì)數(shù)，將數(shù)據(jù)針對(duì)接種的細(xì)胞數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化。圖4B 將Pl 1、PY17和AAC-19細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，使用抗p21cip抗體通過Wfestern印跡法對(duì)其進(jìn)行分析。代表性^iestern印跡顯示了 p21cip在3個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)。圖4C:如本文中所述測量細(xì)胞周期。簡而言之，將P11、PY 17和AAC-19在10-cm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)M小時(shí)。用胰蛋白酶處理細(xì)胞，將其懸浮于檸檬酸鹽緩沖液中，然后進(jìn)行PI 染色。然后利用流式細(xì)胞術(shù)測量細(xì)胞周期。圖5 哇巴因不影響Na/K-ATP酶α 1 mRNA水平。用IOnM哇巴因處理LLC-PK1、 BT20和DU145細(xì)胞M小時(shí)。如實(shí)驗(yàn)方法部分中所述提取總RNA，將其用于RT-PCR以探測 Na/K-ATP 酶 α 1。圖6A-6C 哇巴因通過內(nèi)吞作用加速Na/K-ATP酶降解圖6A:用IOnM哇巴因處理LLC-PKl細(xì)胞、BT20細(xì)胞和DU145細(xì)胞6小時(shí)，然后用冷甲醇固定。將Na/K-ATP酶α 進(jìn)行免疫染色，使用Leica共聚焦顯微鏡使其可視。紅色箭頭指示內(nèi)吞的包含Na/K-ATP酶α 1的囊泡。圖6Β 將LLC-PKl細(xì)胞血清饑餓M小時(shí)，然后用10 μ g/ml環(huán)己酰亞胺(CHX)處理2小時(shí)，接著加入IOnM哇巴因。將無任何處理的細(xì)胞或只用CHO處理的細(xì)胞用作對(duì)照。 在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，將其在RIPA緩沖液中裂解。加載等量的蛋白質(zhì)以通過Western 印跡法分析Na/K-ATP酶。顯示來自4個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性Wfestern印跡和定量數(shù)據(jù)。將每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的Na/K-ATP酶α 1量針對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)上的對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖6C:如圖框B中一樣處理ΒΤ20細(xì)胞，測定所述細(xì)胞的Na/K-ATP酶α 。*ρ < 0. 05。圖7A-7D 哇巴因通過激活ΡΙ3激酶上調(diào)Na/K-ATP酶的表達(dá)和細(xì)胞生長圖7A 用IOnM雷帕霉素或50 μ M LY294002預(yù)處理LLC-PKl細(xì)胞30分鐘。然后將哇巴因IOnM加入培養(yǎng)基，進(jìn)行另外M小時(shí)。使用Western印跡法分析細(xì)胞裂解物的Na/ K-ATP 酶 α 1。圖7 將LLC-PKl和ΒΤ20細(xì)胞與哇巴因一起溫育15分鐘，然后分析細(xì)胞裂解物的磷酸化的Akt (pAkt)。圖7C:將DU145細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓，然后用哇巴因或IOnM IGF處理15分鐘。通過Western印跡法探測pAkt。圖7D 用IOnM雷帕霉素或50 μ M LY294002預(yù)處理LLC-PKl細(xì)胞30分鐘，然后將其與哇巴因一起再溫育M小時(shí)。然后使用MTT測定法測量細(xì)胞生長。圖8A-8D :Na/K-ATP酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是哇巴因處理后其補(bǔ)充所必需的圖8A 在500nM禾Π 1 μ M哇巴因處理72小時(shí)后，SYF細(xì)胞和SYF-Src細(xì)胞的Na/ K-ATP酶表達(dá)水平。圖8B 在5和IOnM哇巴因處理72小時(shí)后對(duì)照細(xì)胞(Pll)和小窩蛋白_1敲低細(xì)胞(C2-9)的Na/K-ATP酶α 1表達(dá)水平的測量。圖8C 用不同濃度的哇巴因處理C2-9細(xì)胞15分鐘。分析細(xì)胞裂物的pAkt。圖8D 進(jìn)行MTT測定法以比較Pll與C2-9細(xì)胞之間響應(yīng)哇巴因處理的細(xì)胞生長。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶表達(dá)的變化決定其生長調(diào)節(jié)。本發(fā)明還部分地基于以下發(fā)現(xiàn)哇巴因誘導(dǎo)的PI3-K/Akt/mT0R/mT0R途徑的激活是哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶上調(diào)的關(guān)鍵因素，以及雷帕霉素對(duì)PI3-K/Akt/mT0R/mT0R途徑的抑制可將哇巴因應(yīng)答從生長刺激變成生長抑制。本發(fā)明還部分地基于以下發(fā)現(xiàn)哇巴因和其他強(qiáng)心留類固醇還可與雷帕霉素和雷帕霉素樣藥物一起用于治療癌。本發(fā)明還部分地基于以下發(fā)現(xiàn)Na/K-ATP酶的表達(dá)可用于評(píng)估某些癌癥或個(gè)體患者的洋地黃治療的功效，并且可用于靶向Na/K-ATP酶開發(fā)新型抗癌治療劑。本發(fā)明還可部分地基于以下發(fā)現(xiàn)通過除了雷帕霉素以外的方法抑制Na/K-ATP 酶也可使細(xì)胞對(duì)哇巴因和其他強(qiáng)心留類固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。本發(fā)明還部分地基于以下發(fā)現(xiàn)哇巴因?qū)?xì)胞生長的刺激或抑制作用取決于細(xì)胞是否可激活PI3-K/Akt/mT0R途徑和補(bǔ)充細(xì)胞Na/K-ATP酶以抗哇巴因誘導(dǎo)的該酶的內(nèi)吞作用和隨后降解。本發(fā)明還部分地基于以下發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對(duì)PI3_K/Akt/mT0R途徑的抑制可以使哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶耗盡和細(xì)胞生長抑制致敏。本發(fā)明還部分地基于本發(fā)明者的以下發(fā)現(xiàn)通過除了哇巴因外的方法減少細(xì)胞 Na/K-ATP酶還可刺激細(xì)胞周期抑制劑p21cip的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制。本發(fā)明還部分地基于本發(fā)明者的以下發(fā)現(xiàn)這些發(fā)現(xiàn)表明哇巴因通過改變Na/ K-ATP酶的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞生長。下列部分更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的不同方面和實(shí)施方案。哇巴因以細(xì)胞特異性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和Na/K-ATP酶表達(dá)。哇巴因可以以細(xì)胞特異性方式刺激或抑制細(xì)胞生長。為了理解這些相反調(diào)控的分子機(jī)制，本發(fā)明者首先比較哇巴因?qū)蓚€(gè)人上皮衍生癌細(xì)胞系(BT20和DU145)和一個(gè)豬腎上皮細(xì)胞系(LLC-PKl)的細(xì)胞生長的影響。如圖IA中所顯示的，MTT測定法顯示1至50nM 的哇巴因刺激LLC-PKl細(xì)胞的細(xì)胞生長。這些發(fā)現(xiàn)與觀察到的哇巴因?qū)ζ渌I上皮細(xì)胞的作用一致。相反地，本發(fā)明者未能檢測到哇巴因?qū)θ橄侔〣T20或前列腺癌DU145細(xì)胞的任何刺激作用。然而，10-50nM哇巴因引起細(xì)胞生長的顯著抑制(圖1A)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這些觀察，本發(fā)明者測定10和50nM哇巴因?qū)?xì)胞生長的作用作為時(shí)間的函數(shù)。如圖IB中所描述的，哇巴因以時(shí)間依賴性的方式增加LLC-PKl細(xì)胞的數(shù)目， 從而確認(rèn)了哇巴因?qū)Υ祟惣?xì)胞的生長刺激作用。相反地，相同的處理顯著減少了 BT20細(xì)胞的數(shù)目。事實(shí)上，10和50nM哇巴因似乎分別足以完全阻止DU145和BT20細(xì)胞的生長。因?yàn)橥郯鸵蛟谌巳橄侔㎝DA-MB-435細(xì)胞中通過刺激細(xì)胞周期抑制劑P21-的表達(dá)來抑制細(xì)胞生長，所以本發(fā)明者在ΒΤ20和LLC-PKl 細(xì)胞中測量哇巴因?qū)Ζ?1-表達(dá)的作用。如圖IC中所描述的，雖然IOnM哇巴因在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中刺激細(xì)胞周期抑制劑Ρ21-的表達(dá)，但其在LLC-PKl細(xì)胞中不能刺激所述抑制劑的表達(dá)。由于Na/K-ATP酶是哇巴因的唯一已知的受體，因此本發(fā)明者接著測試哇巴因是否影響Na/K-ATP酶的表達(dá)。Western印跡分析顯示全部3個(gè)細(xì)胞系均表達(dá)Na/K-ATP酶的哇巴因敏感性α 1同種型(α )。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，α 2和α 3同種型的表達(dá)檢測不到 (數(shù)據(jù)未顯示)。有趣地，哇巴因?qū)Ζ?表達(dá)的作用也是細(xì)胞特異性的。雖然哇巴因在M 小時(shí)或72小時(shí)的接觸后在LLC-PKl細(xì)胞中引起α 1表達(dá)的誘導(dǎo)，但其在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中都減少α 1的細(xì)胞量(圖2Α)。雖然在LLC-PKl和DU145細(xì)胞中哇巴因?qū)Ζ?1表達(dá)的作用在M小時(shí)的接觸后都達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，但在ΒΤ-20細(xì)胞中在哇巴因接觸后72小時(shí)注意到α 表達(dá)的進(jìn)一步降低。因?yàn)橥郯鸵蛞种芃DA-MB-435細(xì)胞的生長，所以本發(fā)明者還在將這些細(xì)胞與5ηΜ哇巴因接觸M 小時(shí)后測量了哇巴因?qū)Ζ?表達(dá)的影響。檢測到α 表達(dá)的顯著降低(對(duì)照的82 士 2%，Ν = 3，Ρ<0.05)。因此，哇巴因誘導(dǎo)的α 表達(dá)的變化明確地與其對(duì)細(xì)胞生長的作用相關(guān)。β 1亞基不僅在功能性Na/K-ATP酶的形成中而且還在緊密連接的形成和腫瘤細(xì)胞生長的抑制中起著重要作用。因此，本發(fā)明者評(píng)估哇巴因是否影響LLC-PKl和癌細(xì)胞系中的β 1表達(dá)。用IOnM哇巴因處理細(xì)胞M小時(shí)，利用Western印跡法測量細(xì)胞中β 1的量。如圖2Β中所描述的，哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中但不在ΒΤ-20中引起β 1表達(dá)的適度增加。為了評(píng)估α 1表達(dá)的這些變化的功能性結(jié)果，本發(fā)明者測量了質(zhì)膜中功能性Na/ K-ATP酶的數(shù)目。將細(xì)胞與不同濃度的哇巴因接觸72小時(shí)，然后使其經(jīng)歷3Η-哇巴因結(jié)合。 重要地要指出，該測定法測量在72小時(shí)處理的過程中未被哇巴因占據(jù)的Na/K-ATP酶的數(shù)目。如圖2C中所描述的，高至IOnM的哇巴因幾乎不改變LLC-PKl細(xì)胞中結(jié)合位置的數(shù)目。 這些數(shù)據(jù)顯示哇巴因誘導(dǎo)的α 的上調(diào)正好足以補(bǔ)充功能性Na/K-ATP酶的質(zhì)膜庫。相反地，哇巴因在BT20和DU145細(xì)胞中都引起表面活性Na/K-ATP酶的顯著減少(圖2C)。結(jié)合起來，本發(fā)明者在本文中現(xiàn)已顯示質(zhì)膜Na/K-ATP酶的減少可能是哇巴因誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的生長抑制的關(guān)鍵因素。Na/K-ATP酶的減少減緩細(xì)胞生長并且使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。由于LLC-PKl細(xì)胞和兩個(gè)癌細(xì)胞系來源于不同物種，因此為了確定細(xì)胞Na/ K-ATP酶的減少是否是哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制的關(guān)鍵因素，本發(fā)明者在本文中測量了 Na/K-ATP酶的分等級(jí)敲低對(duì)LLC-PKl細(xì)胞的細(xì)胞生長的作用。與對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的 LLC-PKl (P-Il)細(xì)胞相比較，敲低A4-11和PY17細(xì)胞分別表達(dá)約40%和10%的Na/K-ATP 酶。如圖3A中所顯示的，P-Il細(xì)胞在響應(yīng)哇巴因刺激中表現(xiàn)如親本LLC-PKl細(xì)胞一樣。濃度為1至IOnM的哇巴因刺激細(xì)胞生長。相反地，A4-11和PY17細(xì)胞表現(xiàn)如BT20和 DU145細(xì)胞一樣。未檢測到生長刺激。相反，通過siRNA介導(dǎo)的機(jī)制產(chǎn)生Na/K-ATP酶表達(dá)的減少足以使此類細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感(圖3A)。例如，IOnM哇巴因在 PY-17細(xì)胞中引起細(xì)胞生長的30%以上的減少。此外，哇巴因的生長抑制作用明確地與Na/ K-ATP酶的細(xì)胞量相關(guān)。為了測試哇巴因的該生長抑制作用是否適用于其他強(qiáng)心甾類固醇，本發(fā)明者在本文中測量了地高辛、洋地黃毒苷和海蟾蜍毒素MGB對(duì)PY-17細(xì)胞的細(xì)胞生長的作用。如圖 3B中所描述的，此類化合物引起與哇巴因產(chǎn)生的生長抑制相似的生長抑制。為了進(jìn)一步檢查Na/K-ATP酶減少在細(xì)胞生長調(diào)控中的作用，本發(fā)明者比較了穩(wěn)定細(xì)胞系Ρ-11、ΡΥ_17和AAC-19、大鼠α 1拯救的ΡΥ-17細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線。如圖4Α中所顯示的，Na/K-ATP酶敲低PY-17細(xì)胞生長比對(duì)照P_11細(xì)胞慢得多，然而大鼠Na/K_ATP酶 α 1的重新引入恢復(fù)了 AAC-19細(xì)胞的細(xì)胞生長。因?yàn)橥郯鸵蛟谌税┘?xì)胞中刺激p21cip的表達(dá)和抑制細(xì)胞生長(圖1)，因此本發(fā)明者在本文中確定細(xì)胞Na/K-ATP酶的敲低是否影響該細(xì)胞周期抑制劑的表達(dá)。p21cip的表達(dá)在對(duì)照P-Il細(xì)胞中相當(dāng)?shù)?圖4B)。Na/K-ATP酶的敲低在PY-17細(xì)胞中引起該細(xì)胞周期抑制劑的顯著誘導(dǎo)。此外，通過敲入大鼠α 1拯救PY-17細(xì)胞足以在AAC-19細(xì)胞中減少 p21cip的表達(dá)。相一致地，本發(fā)明者還在PY-17細(xì)胞中檢測到比在P-Il和AAC-19細(xì)胞中更多的G0/G1細(xì)胞(圖4C)。哇巴因?qū)Ζ?1 mRNA沒有作用。為了探測哇巴因誘導(dǎo)的α 1的細(xì)胞特異性調(diào)控的分子機(jī)制，本發(fā)明者在用IOnM哇巴因處理細(xì)胞后使用半定量RT-PCR測量α 1 mRNA。如圖5中所描述的，哇巴因在LLC-PK1、 BT20和DU145細(xì)胞中對(duì)α 1 mRNA的水平?jīng)]有作用。因此，哇巴因誘導(dǎo)的α 1蛋白的變化可能是通過翻譯/翻譯后機(jī)制。哇巴因刺激Na/K-ATP酶的內(nèi)吞作用和降解。哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中刺激Na/K-ATP酶的內(nèi)吞作用。如果哇巴因也在BT20和 DU145細(xì)胞中刺激內(nèi)吞作用，那么這可在這些細(xì)胞中導(dǎo)致增加的Na/K-ATP酶的降解和α 1 蛋白的減少。為了測試該作用，將細(xì)胞與IOnM哇巴因接觸，然后就α 進(jìn)行免疫染色。大部分α 1如在LLC-PKl細(xì)胞中一樣在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中存在于質(zhì)膜中(圖6Α)。在M 小時(shí)的哇巴因接觸后，在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中積累了許多α 1陽性囊泡。為了確定哇巴因誘導(dǎo)的內(nèi)吞作用是否也導(dǎo)致增加的Na/K-ATP酶的降解，用環(huán)己酰亞胺(蛋白質(zhì)合成抑制劑)預(yù)處理LLC-PKl細(xì)胞和BT-20細(xì)胞1小時(shí)，然后將其與IOnM 哇巴因接觸6、16和M小時(shí)。如圖6B和圖6C中所描述的，哇巴因處理在BT-20和LLC-PKl 細(xì)胞中都產(chǎn)生更多的α 1亞基降解。哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中但不在ΒΤ-20和DU145細(xì)胞中激活A(yù)kt。本發(fā)明者和其他研究人員已證明哇巴因刺激PI3-K/Akt/mT0R途徑。mTOR的激活可增加許多mRNA的翻譯。因?yàn)橥郯鸵蛟贚LC-PKl細(xì)胞中不增加al mRNA，所以本發(fā)明者確定哇巴因誘導(dǎo)的α 1的上調(diào)是否對(duì)ΡΙ3-Κ(磷脂酰肌醇-3-激酶)和mTOR的抑制劑敏感。 如圖7A中所顯示的，利用PI3-K抑制劑LY^4002或mT0R(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶)抑制劑雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞完全消除了哇巴因誘導(dǎo)的α 1亞基的上調(diào)。LY^4002和雷帕霉素減少α 1的基礎(chǔ)表達(dá)。此外，在雷帕霉素存在的情況下，哇巴因治療實(shí)際上導(dǎo)致α 1表達(dá)的進(jìn)一步減少。然而不希望受理論束縛，本發(fā)明者現(xiàn)認(rèn)為雷帕霉素可阻止哇巴因誘導(dǎo)的α 表達(dá)但不阻止哇巴因誘導(dǎo)的α 1內(nèi)吞作用和降解。為了測試Akt/mTOR途徑的激活是否是α 1表達(dá)的哇巴因誘導(dǎo)細(xì)胞特異性調(diào)控的關(guān)鍵因素，本發(fā)明者接著在3個(gè)不同的細(xì)胞系中測量哇巴因?qū)kt的作用。如圖7Β和圖7C 中所顯示的，雖然哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中刺激Akt磷酸化，但其在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中都不能刺激Akt磷酸化。為了確保Akt途徑在癌細(xì)胞中是完整的，本發(fā)明者將DU145細(xì)胞與IGF接觸并且測量Akt的激活。如圖7C中所顯示的，IGF在DU145細(xì)胞中引起Akt的顯著刺激。相一致地，當(dāng)在ΡΥ-17細(xì)胞中重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)，哇巴因未顯示對(duì)Akt磷酸化的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
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雷帕霉素使LLC-PKl細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。上述數(shù)據(jù)表明，PI3_K/Akt/mT0R的激活是哇巴因誘導(dǎo)的α 1上調(diào)的關(guān)鍵因素。因?yàn)棣?1的補(bǔ)充是哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長刺激所必需的，因此本發(fā)明者確定雷帕霉素對(duì)mTOR 的抑制是否可在LLC-PKl細(xì)胞中將哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長轉(zhuǎn)變成生長抑制。如圖7D所顯示的，雷帕霉素的加入足以在LLC-PKl細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長。此外，其還使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。例如，IOnM哇巴因足以在用該抑制劑預(yù)處理的 LLC-PKl細(xì)胞中引起細(xì)胞生長的顯著抑制。Src和小窩蛋白1的參與。Na/K-ATP酶通過與Src形成受體復(fù)合物而從質(zhì)膜微囊(caveolae)發(fā)出信號(hào)。為了進(jìn)一步理解哇巴因誘導(dǎo)的α 上調(diào)的分子機(jī)制，本發(fā)明者首先闡明Src的作用。將SYF 細(xì)胞(其中Src家族激酶Src、Yes和Fin被敲除)接觸哇巴因，進(jìn)行M小時(shí)。因?yàn)檫@些細(xì)胞來自小鼠，所以在實(shí)驗(yàn)中使用0.5和Ι.ΟμΜ哇巴因。如圖8Α中所描述的，Src的敲除完全阻止哇巴因誘導(dǎo)的α 表達(dá)。相一致地，當(dāng)利用c-Src拯救SYF細(xì)胞時(shí)，哇巴因能夠引起 3倍的α 表達(dá)的誘導(dǎo)。為了測試小窩蛋白1和質(zhì)膜微囊的參與，本發(fā)明者建立了由于小窩蛋白1特異性 siRNA的表達(dá)而與親本LLC-PKl細(xì)胞相比較而言表達(dá)約20%小窩蛋白1的小窩蛋白1敲低 LLC-PKl細(xì)胞系(C2-9細(xì)胞)。如圖8Β中所顯示的，小窩蛋白1的敲低完全消除了哇巴因誘導(dǎo)的α 表達(dá)的增加。相一致地，哇巴因不能刺激這些細(xì)胞中的Akt (圖8C)。此外，小窩蛋白1的敲低不僅消除了哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長刺激，而且還使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感(圖8D)。哇巴因刺激Na/K-ATP酶的內(nèi)吞作用和降解。 哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中刺激Na/K-ATP酶內(nèi)吞作用。如果哇巴因在BT20和DU145 細(xì)胞中也刺激內(nèi)吞作用，那么這可導(dǎo)致增加的Na/K-ATP酶的降解和這些細(xì)胞中α 1蛋白的減少。將細(xì)胞與IOnM哇巴因接觸，然后就α 1進(jìn)行免疫染色。大多數(shù)α 1如在LLC-PKl細(xì)胞中一樣在ΒΤ20和DU145細(xì)胞中存在于質(zhì)膜中(圖9Α)。在6小時(shí)的哇巴因接觸后，ΒΤ20 和DU145細(xì)胞中積累了許多α 陽性囊泡。為了確定哇巴因誘導(dǎo)的內(nèi)吞作用是否也導(dǎo)致增加的Na/K-ATP酶的降解，用環(huán)己酰亞胺(一種蛋白質(zhì)合成抑制劑)預(yù)處理LLC-PKl細(xì)胞和 BT-20細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)，然后將其與IOnM哇巴因接觸6、16和M小時(shí)。如圖9B和圖9C中所顯示的，哇巴因處理在BT-20和LLC-PKl細(xì)胞中均產(chǎn)生更多的α 1亞基降解。哇巴因在LLC-PKl中但不在ΒΤ-20和DU145細(xì)胞中激活A(yù)kt。哇巴因刺激PI3-K/Akt/mT0R途徑。mTOR的激活可增加許多mRNA的翻譯。因?yàn)橥郯鸵虿辉黾覮LC-PKl細(xì)胞中的α 1 mRNA，所以本發(fā)明者測試哇巴因誘導(dǎo)的α 1的上調(diào)是否對(duì)ΡΙ3-Κ和mTOR的抑制劑敏感。如圖10A中所顯示的，利用PI3-K抑制劑LY^4002或mTOR 抑制劑雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞完全消除了哇巴因誘導(dǎo)的α 亞基的上調(diào)。有趣地，LY294002 和雷帕霉素都減少α 的基礎(chǔ)表達(dá)。此外，在雷帕霉素存在的情況下，哇巴因處理實(shí)際導(dǎo)致α 表達(dá)的進(jìn)一步降低。然而不希望受理論束縛，本發(fā)明者在本文中現(xiàn)認(rèn)為雷帕霉素可阻止哇巴因誘導(dǎo)的α 表達(dá)，但不阻止哇巴因誘導(dǎo)的α 內(nèi)吞作用和降解。為了測試Akt/ mTOR途徑的激活是否參與哇巴因誘導(dǎo)的al表達(dá)的細(xì)胞特異性調(diào)控，本發(fā)明者在本文中測量了哇巴因在3個(gè)不同的細(xì)胞系中對(duì)Akt的作用。雖然哇巴因在LLC-PKl細(xì)胞中刺激Akt磷酸化，但其不能在BT20和DU145細(xì)胞中刺激Akt磷酸化。為了確保Akt途徑在癌細(xì)胞中是完整的，本發(fā)明者此處將DU145細(xì)胞與IGF接觸，并且測量Akt的激活。IGF在DU145細(xì)胞中引起顯著的Akt激活。相一致地，當(dāng)在PY-17細(xì)胞中重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)，哇巴因未顯示對(duì)Akt磷酸化的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。雷帕霉素使LLC-PKl細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。上述數(shù)據(jù)表明PI3_K/Akt/mT0R的激活是哇巴因增加al的表達(dá)所必需的。因?yàn)?al的補(bǔ)充是哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長刺激所必需的，因此本發(fā)明者在本文中確定了雷帕霉素對(duì)mTOR的抑制將在LLC-PKl細(xì)胞中使哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長轉(zhuǎn)變成生長抑制。如圖IOD 中所顯示的，雷帕霉素的加入足以在LLC-PKl細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。此外，其還使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。例如，IOnM哇巴因足以在用抑制劑預(yù)處理的 LLCPKl細(xì)胞中引起細(xì)胞增殖的顯著抑制。討論哇巴因?qū)?xì)胞生長的刺激或抑制作用取決于細(xì)胞是否可激活A(yù)kt/mTOR途徑和補(bǔ)充細(xì)胞Na/K-ATP酶以抗哇巴因誘導(dǎo)的所述酶的內(nèi)吞作用和隨后的降解。雷帕霉素對(duì)Akt/mTOR途徑的抑制使得哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶的耗盡和細(xì)胞生長抑制敏化。通過除了哇巴因外的方法減少細(xì)胞Na/K-ATP酶也可刺激細(xì)胞周期抑制劑p21cip 的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明哇巴因通過改變Na/K-ATP酶的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞生長。哇巴因?qū)a/K-ATP酶的翻譯上調(diào)取決于PI3-K/Akt/mT0R途徑Na/K_ATP酶是將 ATP轉(zhuǎn)化成跨膜離子梯度的重要離子泵。其還與Src相互作用以形成受體復(fù)合物。雖然Na/ K-ATP酶提供強(qiáng)心甾類固醇的結(jié)合位置，但Na/K-ATP酶結(jié)合的Src卻用作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白， 將配體結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白激酶級(jí)聯(lián)的刺激和第二信使的產(chǎn)生。雖然哇巴因以細(xì)胞特異性的方式對(duì)細(xì)胞生長展示刺激和抑制兩種作用，但在兩種類型的細(xì)胞中都已記錄了近端信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(例如，Src和ERK)的激活。此外，哇巴因在可用哇巴因刺激或抑制的細(xì)胞中誘導(dǎo)Na/ K-ATP酶的內(nèi)吞作用和隨后的降解。本發(fā)明者在本文中認(rèn)為哇巴因激活的下游事件必須在其響應(yīng)哇巴因的生長走向相反方向的細(xì)胞中明顯分向不同方向。據(jù)此，本發(fā)明者現(xiàn)已觀察到哇巴因刺激PI3-K/Akt/ mTOR途徑，從而在LLC-PKl細(xì)胞中導(dǎo)致Na/K-ATP酶的翻譯上調(diào)和細(xì)胞生長刺激。相反地， 哇巴因不能激活人癌細(xì)胞例如BT20、MDA-MB-43k和DU145細(xì)胞以及在Na/K-ATP酶敲低細(xì)胞中的PI3-K/Akt/mT0R途徑和補(bǔ)充Na/K-ATP酶(圖7)。因此，PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活可能是哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長刺激的關(guān)鍵因素。這與由其他研究人員在幾個(gè)細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物中報(bào)導(dǎo)的哇巴因誘導(dǎo)的PI3_K/Akt/mT0R途徑的激活一致。此外，該激活似乎還是哇巴因刺激這些細(xì)胞的生長所必需的。質(zhì)膜微囊使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件區(qū)室化。具體地，通過耗盡小窩蛋白1或膽固醇使質(zhì)膜微囊破裂可顯著改變胰島素/IGF誘導(dǎo)的PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活。相一致地，Cavl敲除引起體內(nèi)胰島素抗性。此外，小窩蛋白1和/或Na/K-ATP酶的表達(dá)在許多癌細(xì)胞系中顯著降低。具體地，小窩蛋白1的表達(dá)在BT20細(xì)胞中幾乎不存在，而Na/K-ATP酶的表達(dá)在 DU145細(xì)胞中顯著減少。因?yàn)樾「C蛋白1和Na/K-ATP酶對(duì)于質(zhì)膜微囊的形成都很重要，所以本發(fā)明者在本文中現(xiàn)認(rèn)為小窩蛋白1或Na/K-ATP酶的減少在這些細(xì)胞中可促成哇巴因結(jié)合與PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活解偶聯(lián)。相一致地，如圖8中所顯示的，本發(fā)明者在本文中發(fā)現(xiàn)小窩蛋白1或Na/K-ATP酶的敲低在LLC-PKl細(xì)胞中確實(shí)消除了哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長應(yīng)答。此外，其還阻止哇巴因誘導(dǎo)的Akt的激活。細(xì)胞內(nèi)Na+的巨大增加足以刺激Na/K-ATP酶的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和上調(diào)其表達(dá)。當(dāng)將細(xì)胞與產(chǎn)生50%以上Na/K-ATP酶抑制的低細(xì)胞外K+或哇巴因濃度接觸時(shí)該現(xiàn)象發(fā)生。很明顯，這不可能是1至IOnM哇巴因籍以增加LLC-PKl細(xì)胞中Na/K-ATP酶表達(dá)的分子機(jī)制。首先，I-IOnM的哇巴因不影響LLC-PKl細(xì)胞中的細(xì)胞Na+濃度。其次，哇巴因誘導(dǎo)的上調(diào)與低 K+的不同，因?yàn)槲礄z測到al mRNA的變化。在另一方面，PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活可刺激許多mRNA的翻譯調(diào)控。不希望受理論束縛，但本發(fā)明者在本文中現(xiàn)認(rèn)為低濃度的哇巴因通過PI3_K/Akt/ mTOR-依賴性翻譯機(jī)制增加Na/K-ATP酶的表達(dá)。本發(fā)明者在本文中顯示利用LY^4002或雷帕霉素抑制PI3-K/Akt/mT0R途徑足以阻止哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶的上調(diào)。作為離子泵，Na/K-ATP酶維持正常的跨細(xì)胞膜的Na+和K+梯度。通過敲除Na/ K-ATP酶或通過完全抑制該酶導(dǎo)致的這些梯度的顯著變化對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞是致死的。因此，細(xì)胞Na/K-ATP酶的適度減少可能可引起細(xì)胞生長抑制。本發(fā)明者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過SiRNA敲低Na/K-ATP酶足以刺激的表達(dá)，從而導(dǎo)致 LLC-PKl細(xì)胞的生長抑制。相一致地，通過表達(dá)大鼠α 1拯救這些細(xì)胞足以抑制p21cip的表達(dá)并且恢復(fù)細(xì)胞生長。有趣地，在許多類型的細(xì)胞中，已知哇巴因和其他強(qiáng)心留類固醇與 Na/K-ATP酶的結(jié)合誘導(dǎo)酶的內(nèi)吞作用和降解。在功能上，哇巴因誘導(dǎo)(甚至被低濃度的哇巴因誘導(dǎo)的)的內(nèi)吞作用可導(dǎo)致在一段時(shí)間內(nèi)Na/K-ATP酶的顯著減少，如果其不通過α 表達(dá)的上調(diào)補(bǔ)償?shù)脑?。原則上，該下調(diào)可足以解釋哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯。該概念受到低濃度的哇巴因在一段時(shí)間內(nèi)能夠誘導(dǎo)p21cip表達(dá)并且抑制乳腺癌細(xì)胞的生長的事實(shí)支持。很明顯，利用雷帕霉素阻止哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶的補(bǔ)充消除了 LLC-PKl細(xì)胞中哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長刺激。其也使這些細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感。結(jié)合起來，很清楚細(xì)胞Na/K-ATP酶的量對(duì)于細(xì)胞生長控制是很重要的。70年代后期和80年代早期的流行病學(xué)研究指出了在乳腺癌患者中使用洋地黃藥物的潛在有益性。多年來，洋地黃藥物例如地高辛和洋地黃毒苷以及該類化合物的新型衍生物的功效已在細(xì)胞培養(yǎng)物中和動(dòng)物模型中得到證明。值得注意地，在美國和歐洲正在進(jìn)行I期和II期臨床試驗(yàn)以測試作為抗癌藥物的此類新型化合物。因?yàn)榇祟惢衔镞€具有良好記錄的對(duì)各種細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長刺激作用，所以很重要的是鑒定負(fù)責(zé)該相反生長調(diào)控的異向途徑。為此，本發(fā)明者在本文中現(xiàn)顯示哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶的表達(dá)的變化決定其生長調(diào)控。此外，本發(fā)明者將哇巴因誘導(dǎo)的PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活鑒定為哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶上調(diào)的關(guān)鍵因素。此外，本發(fā)明者顯示雷帕霉素(一種廣泛使用的藥物)對(duì) PI3-K/Akt/mT0R途徑的抑制可將哇巴因應(yīng)答從生長刺激變成生長抑制。Na/K-ATP酶的表達(dá)可用于評(píng)估某些癌癥或個(gè)體患者的洋地黃療法的功效。此外， 這些結(jié)果表明了靶向Na/K-ATP酶對(duì)于開發(fā)新型抗癌治療劑是有用的。此外，這些結(jié)果還表明雷帕霉素在癌癥的洋地黃療法中的治療效用。
示例性實(shí)施方案下列實(shí)施例僅用于舉例說明目的，并且絕不應(yīng)當(dāng)解釋為在本發(fā)明的任何方面是限定性的。材料細(xì)胞培養(yǎng)基、牛血清白蛋白和胰蛋白酶購自hvitrogen(Burlington，ON)； Optitran硝酸纖維素膜來自khleicher &khuell (Keene，NH)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL) super signal i式齊[J 盒(Enhanced chemiluminescence (ECL) super signalkit)購自 Pierce (Rockford, IL)。單克隆抗 α 1 抗體(α 6F)獲自 DevelopmentalStudies Hybridoma Bank (University of Iowa)?？筽21cipl抗體、抗Src單克隆抗體和所有第二辣根過氧化物酶綴合的抗體來自Santa Cruz (Santa Cruz，CA)。多克隆抗Akt和抗pAkt at Ser473 抗體來自Cell Signaling (Danvers，MA)。MTT測定試劑盒購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA)。3H_ 哇巴因來自 NEN Life Science Products(Boston, MA)。細(xì)胞培養(yǎng)豬腎上皮細(xì)胞(LLC-PK1細(xì)胞)、人乳腺癌細(xì)胞(BT-20細(xì)胞)和人前列腺癌細(xì)胞(DU145細(xì)胞)獲自ATCC并且在5% CO2潮濕培養(yǎng)箱中在10%胎牛血清(FBS)、 100個(gè)單位/ml青霉素和100g/ml鏈霉素存在的情況下維持在達(dá)爾伯克氏改良尹格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium，DMEM)或RPMI 1640 培養(yǎng)基(針對(duì)DU145 細(xì)胞)中。Na/K-ATP酶敲低(A4-11和PY17)和小窩蛋白_1敲低(C2-9)細(xì)胞衍生自LLC-PK1 細(xì)胞并且被培養(yǎng)在DMEM中。除非另外指出，否則在實(shí)驗(yàn)之前將細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓M小時(shí)。Western印跡分析用PBS洗滌細(xì)胞，將其溶解在經(jīng)改良且冰冷的RIPA緩沖液中。 然后以14，OOOrpm離心細(xì)胞裂解物，將上清液用于蛋白質(zhì)測定并進(jìn)行Western印跡分析。將膜在室溫下用在 TBS-T(Tris-HCl IOmM, NaCl 150mM, Tween 20,0. 05% ；pH 8.0)中的 4% 牛奶封閉1小時(shí)，然后用特異性探針進(jìn)行探測。使用ECL試劑盒檢測蛋白質(zhì)信號(hào)，然后使用 Bio-Rad GS-670 成像光密度儀(imaging densitometer)進(jìn)行定量。用于測量細(xì)胞增殖的MTT測定將細(xì)胞于100 μ 1培養(yǎng)基中以10，000個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在12小時(shí)的血清饑餓后，將細(xì)胞與不同濃度的哇巴因接觸M 小時(shí)。向每一個(gè)孔中加入IOyl MTT試劑(溴化3-G，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑「)，進(jìn)行90分鐘。用去垢劑溶解甲δ晶體，在570nm處測量OD值。細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞周期測量將細(xì)胞于Iml培養(yǎng)基中以50，000/孔在12孔板中傳代培養(yǎng)，進(jìn)行M小時(shí)。然后將細(xì)胞血清饑餓M小時(shí)，用不同濃度的哇巴因處理進(jìn)行指定的時(shí)間。在每一個(gè)指定的時(shí)間點(diǎn)上，用胰蛋白酶處理3個(gè)孔的對(duì)照或處理的細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)。為了進(jìn)行細(xì)胞周期測量，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，將其重懸浮于檸檬酸鹽緩沖液(8.55% 蔗糖、1. 18%檸檬酸鈉、5% DMS0, pH 7.6)中，用碘化丙錠(PI)染色。然后利用流式細(xì)胞儀分析染色的細(xì)胞。3H-哇巴因結(jié)合為了測量哇巴因?qū)a/K-ATP酶的細(xì)胞表面表達(dá)的作用，將細(xì)胞培養(yǎng)在12孔板中，用哇巴因處理72小時(shí)。之后，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，將其進(jìn)行3H-哇巴因結(jié)合測定。簡而言之，將細(xì)胞在不含K+的Kreb' s溶液(NaCl 137mM ；KCl OmM ；CaC 12 2. 8mM ；NaH2PO4 0. 6mM ；MgSO4 1. 2mM ；葡萄糖；IOmM ；Tris 15mM ；pH 7. 4)中溫育 15 分鐘，然后在37°C與IOOnM 3H-哇巴因接觸30分鐘。在溫育結(jié)束時(shí)，用冰冷的不含K+的Kreb' s 溶液洗滌細(xì)胞3次，將其溶解在0. IM NaOH-O. 2% SDS中，就3H-哇巴因在閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。在5mM未標(biāo)記的哇巴因存在的情況下測量非特異性結(jié)合，然后將其從總結(jié)合中扣除。將平行的板用于計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。將3H-哇巴因結(jié)合數(shù)據(jù)計(jì)算為每細(xì)胞的結(jié)合位置數(shù)。共聚焦成像和免疫細(xì)胞化學(xué)將LLC-PK1、BT20和DU145細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓M 小時(shí)，在蓋玻片上用哇巴因(IOnM)處理6小時(shí)。用冰冷的甲醇固定細(xì)胞15分鐘，用來自 Invitrogen的信號(hào)增強(qiáng)劑(Signal Enhancer)進(jìn)行封閉。然后將單克隆抗Na/K-ATP酶α 1 抗體與細(xì)胞在4°C下一起溫育過夜。在3次洗滌后，加入Alexa 488-綴合的第二抗小鼠抗體，在室溫下溫育2小時(shí)。洗滌蓋玻片，封片，然后使用Leica共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。定量RT-PCR 將細(xì)胞接種在6-cm培養(yǎng)皿中，在匯合達(dá)到90%后進(jìn)行血清饑餓M 小時(shí)。然后用IOnM哇巴因處理細(xì)胞對(duì)小時(shí)。使用TRIzol提取總RNA，將其進(jìn)行定量RT-PCR 分析。使用下列方案在AB7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行測定1個(gè)循環(huán)(在95°C下進(jìn)行6分鐘)， 40個(gè)循環(huán)(在95°C下進(jìn)行30秒，在52°C下進(jìn)行30秒，在72°C下進(jìn)行30秒，和在85°C下進(jìn)行1分鐘)，然后進(jìn)行解離期以確保單個(gè)產(chǎn)物。反應(yīng)物在25 μ 1的總體積中，包括1. 25pl的 Sybr Green(Invitrogen)、0. 125pl 的DNA聚合酶(Denville)、2. 5pl ^dNTP(Invitrogen)、 IOng的cDNA。以5 μ M的濃度使用引物，序列為人GAPDH，5' _GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT[SEQ ID NO :1]禾口3' -TCCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAG[SEQ ID NO 2]；人Na/K-ATP 酶 al，5 ‘ -TGTCCAGAATTGCAG [SEQ ID NO 3]禾口3' -TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT[SEQ ID NO 4]；豬GAPDH，5' _ATGCTGGTGCTGAGTTCGTGG[SEQ ID NO :5]禾口3' -AGATGATGACCCTTTTGGCTCC[SEQ ID NO :6]；禾口豬Na/K-ATP 酶 al，5‘ -ATCTCTGCTTCGTTGGGCTCATCT[SEQ ID NO 7]禾口3' -AATGGCTTTGGCTGTGATGGGATG[SEQ ID NO :8]。利用比較閾值(Ct)法(Δ Δ ct)計(jì)算相對(duì)Na/K-ATP酶al基因的表達(dá)。為了標(biāo)準(zhǔn)化cDNA的差異量，將GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM，并且使用Mudent' s t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。ρ < 0. 05 被視為有顯著性。示例性治療方法本發(fā)明的方法優(yōu)于本領(lǐng)域內(nèi)已知的聯(lián)合治療，因?yàn)槠湓试S常規(guī)抗癌劑以更低的劑量產(chǎn)生更大的效應(yīng)。在某些非限定實(shí)施例中，當(dāng)與哇巴因組合使用時(shí)， 抗癌劑或常規(guī)抗癌劑的組合的有效劑量(ED50)可以是單獨(dú)抗癌劑的ED50的至多1/2。此外，在某些非限制性的實(shí)施方案中，當(dāng)與CTS例如哇巴因、地高辛或洋地黃毒苷組合使用時(shí)此種抗癌劑或此種抗癌劑的組合的治療指數(shù)(Tl)可以是單獨(dú)的常規(guī)抗癌劑方案的TI的至少2倍。治療方法在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明方法組合哇巴因與其他療法例如化學(xué)療法和/或放射療法，包括電離輻射、Y射線或粒子束。施用和治療本發(fā)明的方法還可包括起初給受試者施用抗腫瘤劑以使受試者中的贅生性細(xì)胞能夠耐抗腫瘤劑，隨后施用有效量的本發(fā)明的任意組合物，其有效地選擇性誘導(dǎo)此類細(xì)胞的終末分化、細(xì)胞生長停滯和/或凋亡，或治療癌癥或提供化學(xué)預(yù)防。劑量和給藥日程表(Dosage Schedule)可根據(jù)多種因素包括品種(type)、物種、年齡、體重、性別和待治療的癌癥類型；待治療的癌癥的嚴(yán)重度(即，分期)；施用途徑；患者的腎和肝功能；以及使用的具體化合物或其鹽來選擇給藥方案。本領(lǐng)域普通醫(yī)生或獸醫(yī)可容易地確定和開具例如治療、預(yù)防、抑制(完全或部分地)或阻止疾病的進(jìn)展所需的藥物的有效量。適當(dāng)?shù)膭┝康姆窍薅ㄐ詫?shí)例可包括每天一次、每天二次或每天三次、連續(xù)地(每一天)或間歇地(例如，每周3至5天)口服施用約25至4000mg/m2的總?cè)談┝?。例如?可以以日總劑量施用組合物，或?qū)⑵浞殖啥鄠€(gè)日劑量例如每天兩次和每天3次來施用。此外，施用可以是連續(xù)的，即每一天，或是間歇的。如本文中所使用的術(shù)語“間歇的”或“間歇地”意指以定期或不定期的間隔停止和開始。例如，間歇施用可以是每周施用 1至6天，或其可意指周期性施用(例如，每天一次施用，進(jìn)行2至8個(gè)連續(xù)的周，然后進(jìn)入停藥期，長達(dá)一周不施用)或其可意指隔日施用。此外，可按照任意規(guī)定的日程表施用組合物，連續(xù)進(jìn)行數(shù)周，然后進(jìn)入停藥期。例如，可按照任一個(gè)開具的方案施用組合物進(jìn)行2至8周，然后停藥1周，或每天兩劑，每周進(jìn)行3至5天。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，本文中描述的不同劑量和給藥方案僅闡述特定的實(shí)施方案，其不應(yīng)當(dāng)被解釋為限定本發(fā)明的寬范圍。劑量和給藥方案的任意排列、 變化和組合包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。藥物組合物可將本發(fā)明的化合物和其衍生物、片段、類似物、同源物、藥學(xué)上可接受的鹽或水合物與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑一起摻入適合用于口服施用的藥物組合物。此類組合物通常包含治療有效量的本文中描述的任意化合物和藥學(xué)上可接受的載體。 優(yōu)選地，有效量是有效地選擇性誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)馁樕约?xì)胞的終末分化并且低于在患者中引起
毒性的量的量。通常用作載體或稀釋劑的任何惰性賦形劑可用于本發(fā)明的制劑，例如，樹膠、淀粉、糖、纖維素材料、丙烯酸酯或其混合物。組合物還可包含崩解劑(例如，交聯(lián)羧甲纖維素鈉)和潤滑劑(例如，硬脂酸鎂)，此外還可包含選自粘合劑、緩沖劑、蛋白酶抑制劑、表面活性齊 、增溶劑、增塑劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、增粘劑、甜味劑、成膜劑或其任意組合的一種或多種添加劑。此外，本發(fā)明的組合物可以以控制釋放或立即釋放(immediate release)制劑的形式存在?？煽诜┯盟幬锝M合物，因而其以適合于口服施用的形式配制，即配制為固體或液體制劑。適當(dāng)?shù)墓腆w口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、粒劑、小丸等。適當(dāng)?shù)囊后w口服劑型包括溶液、懸浮液、分散體、乳劑、油等。如本文中所使用的，“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括可與藥物施用相容的任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，例如無菌無熱原水。適當(dāng)?shù)妮d體描述于最新版本的Remington' s Pharmaceutical Sciences，本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)參考書，其通過參考并入本文。此類載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、 finger' s solution、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還可使用脂質(zhì)體和非水性媒介物例如不揮發(fā)油。此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性化合物不相容，否則涵蓋其在所述組合物中的應(yīng)用。還可將補(bǔ)充的活性化合物摻入組合物。
固體載體/稀釋劑的非限定性實(shí)例包括但不限于樹膠、淀粉(例如，玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉)，糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纖維素材料(例如，微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。液體制劑、藥學(xué)上可接受的載體的非限定性實(shí)例可以是水溶液或非水溶液、懸浮液、乳劑或油。非水性溶液的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。油的實(shí)例是石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花子油和魚肝油。溶液或懸浮液還可包括下列成分無菌稀釋劑例如注射用水，鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇類、甘油， 丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖劑例如乙酸鹽類、檸檬酸鹽類或磷酸鹽類，和用于調(diào)整張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。此外，組合物還可包含粘合劑(例如，阿拉伯膠、玉蜀黍淀粉、明膠、卡波姆、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮)、崩解劑(例如，玉蜀黍淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、交聚維酮、瓜爾膠、淀粉羥乙酸鈉、 ft~im0gel)、不同pH和離子強(qiáng)度的緩沖劑(例如，tris-HCI，乙酸鹽，磷酸鹽)、防止吸收至表面的添加劑例如白蛋白或明膠、去垢劑(例如，Tween 20,Tween 80,Pluronic F68、膽汁酸鹽)、蛋白酶抑制劑、表面激活劑(例如，月桂基硫酸鈉)、滲透促進(jìn)劑、增溶劑(例如，甘油、聚乙二醇)、助流劑(例如，二氧化硅膠體)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、 丁酸化羥基茴香醚)、穩(wěn)定劑(例如，羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、增粘劑(例如，卡波姆、二氧化硅膠體、乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如，蔗糖、阿司帕坦、檸檬酸)、調(diào)味劑(例如，薄荷油、水楊酸甲酯或桔子調(diào)味料(orange flavoring))、防腐劑(例如，硫柳汞、 苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸類)、潤滑劑(例如，硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉)、 流動(dòng)助劑(flow-aid)(例如，二氧化硅膠體)、增塑劑(例如，鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如，卡波姆、羥丙基纖維素、十二烷基硫酸鈉)、聚合物包衣(例如，泊洛沙姆或poloxamines)、包衣和成膜劑(例如，乙基纖維素、丙烯酸酯類、聚甲基丙烯酸酯類) 和/或佐劑。在某些實(shí)施方案中，可用可保護(hù)化合物以防止從身體快速清除的載體例如控制釋放制劑(包括植入劑和微型膠囊化遞送系統(tǒng))來配制活性化合物?？墒褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。用于制備此類制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。還可從Alza Corporation和 Nova Pharmaceuticals, Inc.商購獲得材料。還可將脂質(zhì)體懸浮液(包括利用針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體靶向感染的細(xì)胞的脂質(zhì)體)用作藥學(xué)上可接受的載體。此類材料可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行制備。特別有利地以劑量單位形式配制口服組合物以易于施用和劑量的均一。如本文中使用的劑量單位形式是指適合作為用于待治療的受試者的單位劑量的物理上分開的單位； 每一個(gè)單位包含經(jīng)計(jì)算與需要的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的說明書決定于并且直接取決于活性化合物的獨(dú)特特征和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果以及配制這樣的活性化合物用于個(gè)體治療的領(lǐng)域內(nèi)所固有的限制。
可將藥物組合物連同施用說明書一起裝入容器、包裝或或分配器。例如，可在治療的第一天靜脈內(nèi)施用化合物，在第二天和此后所有連續(xù)的天口服施用。為了阻止疾病進(jìn)展或穩(wěn)定腫瘤生長，可施用本發(fā)明的化合物。包含活性化合物的藥物組合物的制備在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，例如通過混合、?；驂浩椒▉磉M(jìn)行。通常將活性治療成分與藥學(xué)上可接受的并且與所述活性成分相容的賦形劑混合。為了進(jìn)行口服施用，將活性成分與常規(guī)用于該目的的添加劑例如媒介物、穩(wěn)定劑或惰性稀釋劑混合，然后通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化成用于施用的適當(dāng)形式，例如如上所述的片劑、 包衣片、硬或軟膠囊、水性、醇性或油性溶液等。給患者施用的哇巴因的量小于可在患者中引起毒性的量。在某些實(shí)施方案中，給患者施用的化合物的量小于使患者血漿中的化合物的濃度等于或超過該化合物的毒性水平的量。優(yōu)選，患者血漿中的所述化合物的濃度維持在約ΙΟηΜ。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者血漿中的所述化合物濃度維持在約25nM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者血漿中的所述化合物濃度維持在約50nM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者血漿中所述化合物的濃度維持在約10至50ηΜ之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的實(shí)施中應(yīng)當(dāng)給患者施用的化合物的最佳量將取決于使用的具體化合物和待治療的癌癥的類型。體外方法本發(fā)明還提供了體外方法，所述方法通過將細(xì)胞與有效量的含有哇巴因或其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物的組合物接觸來選擇性誘導(dǎo)贅生性細(xì)胞的終末分化、細(xì)胞生長停滯和/或細(xì)胞凋亡，從而抑制此類細(xì)胞的增殖。雖然可體外實(shí)施本發(fā)明的方法，但預(yù)期選擇性誘導(dǎo)贅生性細(xì)胞的終末分化、細(xì)胞生長停滯和/或凋亡等的方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括體內(nèi)接觸細(xì)胞，即通過給需要治療的具有贅生性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的受試者施用所述化合物來進(jìn)行接觸。因此，本發(fā)明還提供了如下方法，所述方法通過給受試者施用含有有效量的哇巴因或其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物來選擇性誘導(dǎo)受試者的贅生性細(xì)胞的終末分化、細(xì)胞生長停滯和/或凋亡，從而抑制此類細(xì)胞在受試者中增殖。雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可進(jìn)行各種改變并且可用等同物替代其組成部分而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多變動(dòng)以使特定的情況或材料適合本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。因此，本發(fā)明無意限定于本文中公開的用于進(jìn)行本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而是本發(fā)明將包括落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.確定癌癥患者是否可從強(qiáng)心留類固醇(CTQ治療中獲得治療益處的方法，包括確定患者的癌細(xì)胞是否已失去增加Na/K-ATP酶的細(xì)胞合成的能力，其中Na/K-ATP酶合成的喪失標(biāo)示著所述患者可能從CTS治療中獲益。
2.權(quán)利要求1的方法，其用于對(duì)意欲接受洋地黃治療的癌癥患者進(jìn)行診斷和/或預(yù)后。
3.權(quán)利要求1的方法，其包括確定癌細(xì)胞中哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶表達(dá)變化是否與哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長調(diào)控直接相關(guān)。
4.權(quán)利要求1的方法，其包括檢測癌細(xì)胞中影響癌細(xì)胞內(nèi)哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶上調(diào)的PI 3激酶的激活。
5.權(quán)利要求1的方法，其包括測量細(xì)胞中Na/K-ATP酶表達(dá)的變化。
6.權(quán)利要求1的方法，其包括使用Western印跡法或3H-哇巴因結(jié)合測定法進(jìn)行測量。
7.用于確定細(xì)胞是否對(duì)強(qiáng)心留類固醇(CTQ治療易感的方法，其包括確定所述細(xì)胞是否保持補(bǔ)充細(xì)胞中減少的Na/K-ATP酶的能力。
8.權(quán)利要求7的方法，其包括確定細(xì)胞是否缺乏補(bǔ)償哇巴因誘導(dǎo)的Na/KATP酶損失的機(jī)制。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
10.調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的細(xì)胞合成的方法，包括施用有效量的Na/K-ATP酶抑制劑例如強(qiáng)心甾類固醇CTS以調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的表觀生物學(xué)活性。
11.一種治療患者的方法，其包括單獨(dú)地或與mTOR抑制劑和/或磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3-K)抑制劑的靶中的至少一種組合地給所述患者施用有效量的Na/K-ATP酶抑制劑。
12.—種配制在藥學(xué)上可接受的賦形劑中并且適合用于人患者的藥物制劑，其中包含與mTOR抑制劑和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制劑的靶中的至少一種相組合的Na/ K-ATP酶抑制劑。
13.權(quán)利要求的藥物制劑，其中所述Na/K-ATP酶抑制劑是強(qiáng)心留類固醇(CTS)。
14.用于治療癌癥患者的試劑盒，其單獨(dú)地或與減少Na/K-ATP酶表達(dá)的組合物相組合地包含Na/K-ATP酶抑制劑。
15.用于鑒定不太可能對(duì)強(qiáng)心留類固醇(CTQ療法產(chǎn)生反應(yīng)的癌癥患者的方法，所述方法包括從癌癥患者獲得生物樣品，其中所述生物樣品包含癌細(xì)胞；和測定Na/K-ATP酶的水平或活性，其中與正常健康受試者中發(fā)現(xiàn)的Na/K-ATP酶水平或活性相比較而言具有NF Na/ K-ATP酶水平或活性的變化的患者表示該患者不太可能對(duì)CTS療法產(chǎn)生反應(yīng)。
16.診斷癌癥或?yàn)榛加芯哂杏赏郯鸵蛴|發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的表達(dá)改變的癌癥的患者提供預(yù)后的方法，所述方法包括將癌癥樣品與特異性結(jié)合作為由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一部分的蛋白質(zhì)的抗體接觸，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑；以及確定所述樣品中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)是否被改變，從而診斷癌癥或提供癌癥的預(yù)后。
17.鑒定抑制具有改變的由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的癌癥的化合物的方法， 所述方法包括步驟將表達(dá)由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的細(xì)胞與化合物接觸，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑；以及測定所述化合物對(duì)所述多肽的作用；從而鑒定抑制癌癥的化合物。
18.鑒定抑制難治性癌癥的化合物的方法，所述方法包括將表達(dá)由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的細(xì)胞與化合物接觸，其中所述分子信號(hào)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑；以及測定所述化合物對(duì)所述多肽的作用；從而鑒定抑制該難治性癌癥的化合物。
19.治療或抑制受試者的癌癥的方法，其中所述癌癥具有改變的由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的一種或多種調(diào)節(jié)由由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽成員的抑制劑，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑。
20.治療或抑制受試者的難治性癌癥的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的一種或多種由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑，其中所述分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mT0R途徑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述難治性癌癥具有改變的由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的表達(dá)，并且所述難治性癌癥通過如下步驟進(jìn)行診斷將癌癥樣品與特異性結(jié)合作為由哇巴因觸發(fā)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一部分的蛋白質(zhì)的抗體接觸；和確定所述樣品中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)是否被改變，從而診斷或提供癌癥的預(yù)后。
22.權(quán)利要求20的方法，其中將所述一種或多種調(diào)節(jié)劑與另一種癌癥療法同時(shí)施用。
23.本文權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括在不同的時(shí)間點(diǎn)上多次測定表達(dá)水平的模式，從而監(jiān)控受試者中癌癥的進(jìn)展。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法還包括估計(jì)給定的癌癥治療模式在受試者中的成功概率。
25.用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的方法，包括在細(xì)胞中引起哇巴因或其他強(qiáng)心藥(CTS)誘導(dǎo)的 Na/K-ATP酶表達(dá)的變化。
26.用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的方法，包括通過將細(xì)胞與具有足以引起哇巴因誘導(dǎo)的Na/ K-ATP酶上調(diào)的量的CTS接觸，以誘導(dǎo)所述細(xì)胞中PI3-K/Akt/mT0R途徑的激活，由此調(diào)節(jié)細(xì)胞中Na/K-ATP酶的表達(dá)。
27.用于評(píng)估CTS療法在接受此種CTS療法的患者中的功效的方法，包括監(jiān)控在這樣的患者中Na/K-ATP酶的表達(dá)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述患者患有癌癥。
29.權(quán)利要求觀的方法，其還包括在癌癥的治療中將有效量的雷帕霉素和CTS療法一起施用。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述癌癥包括乳腺癌并且CTS療法包括施用約1至約 50nM哇巴因、地高辛或洋地黃毒苷。
31.在有需要的細(xì)胞中補(bǔ)充功能性Na/K-ATP酶的質(zhì)膜庫的方法，包括影響所述細(xì)胞中哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶哇巴因敏感型α 1同種型(α )的上調(diào)。
32.權(quán)利要求31的方法，包括施用至少一種足以在癌細(xì)胞中減少質(zhì)膜Na/K-ATP酶并且引起哇巴因誘導(dǎo)的生長抑制的CTS。
33.使細(xì)胞對(duì)哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制敏感的方法，包括施用足以在細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長的有效量的雷帕霉素。
34.通過PI3-K/Akt/mT0R-依賴性翻譯機(jī)制在有需要的細(xì)胞中增加Na/K-ATP酶的表達(dá)的方法，其包括以低濃度施用哇巴因或其他CTS。
35.在有需要的細(xì)胞中阻止哇巴因誘導(dǎo)的Na/K-ATP酶上調(diào)的方法，包括抑制所述細(xì)胞中的 PI3-K/Akt/mT0R 途徑。
36.權(quán)利要求35的方法，其包括施用有效量的一種或多種PI3-K抑制劑或mTOR抑制劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其包括施用雷帕霉素或其類似物。
38.用于恢復(fù)細(xì)胞生長的方法，其包括施用足以抑制調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的有效量的哇巴因。
39.在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制的并且適合用于在人中治療癌癥的藥物制劑，其中包含與PI3-K/AKt/mT0R途徑的抑制劑相組合的哇巴因或其他CTS。
40.用于治療癌癥患者的試劑盒，其中包括與PI3-K/AKt/mT0R途徑的抑制劑相組合的哇巴因或其他CTS，各自以預(yù)先測量的劑量配制用以給患者施用。
41.用于將細(xì)胞中的哇巴因應(yīng)答從生長刺激改變成生長抑制的方法，其包括施用足以抑制所述細(xì)胞中的PI3-K/Akt/mT0R途徑的量的雷帕霉素或其類似物。
全文摘要
公開了用于調(diào)控Na/K-ATP酶的表達(dá)的方法和其用途，包括在癌癥的診斷/預(yù)后和治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102227635SQ200980147180
公開日2011年10月26日 申請日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者J·田, Z·謝 申請人:托萊多大學(xué)