2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種2?苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法及應用。本發(fā)明利用重組酶ARO8、ARO10和ADH1這三種重組酶構成共反應體系，將微生物體內(nèi)Ehrlich途徑需要多步連續(xù)反應、多種酶參與才能合成2?苯乙醇這樣復雜的代謝過程，簡化為在體外的同一反應體系內(nèi)進行，從而減少了環(huán)境污染、縮短了反應流程。進一步地，本發(fā)明采用戊二醛作為交聯(lián)劑，將三種重組單酶進行無載體共固定化，制備共交聯(lián)酶聚集體(Combi?CLEAs)，體外合成目標產(chǎn)物，從而在上述有益效果的基礎上進一步實現(xiàn)酶的循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本，本發(fā)明填補了多酶體外制備2?苯乙醇的技術空白，為生物制備2?苯乙醇提供重要的借鑒。
【專利說明】
2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物合成技術領域，更具體地，設及一種2-苯乙醇的非細胞合成生物 學制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 2-苯乙醇（2斗116]17161:11日]1〇1,2斗6)又稱0-苯乙醇（0斗116]17161:11日]1〇1)，化學名2- 苯基乙醇（2-Phenylethyl alcohol，2-PEA)，分子量 122.16，結構式為：
[0003]
[0004] 2-苯乙醇是一種具有淡雅細膩玫瑰氣味的芳香醇，天然存在于許多植物的精油 中，2-苯乙醇香氣輕柔甜和，頗受人們歡迎，是目前全球使用量僅次于香蘭素的第二大香料 成分，廣泛應用于食品、化妝品、煙草和日化用品領域，它不僅是所有玫瑰香型香氣的基本 組分，而且因其具有協(xié)合及增效作用，成為多種香型配方所需的組分，是具有很高價值的香 料物質;在醫(yī)藥上，2-苯乙醇是傳統(tǒng)的抑菌劑。
[0005] 目前，全球2-苯乙醇的年產(chǎn)量近萬噸，基本上都是采用廉價的化工原料苯或苯乙 締化學合成，僅有很少一部分從玫瑰油中提取?；瘜W合成所使用的原料大多對人體健康和 環(huán)境有巨大危害，而且所合成的產(chǎn)品2-苯乙醇中常含有氣味不良、難W除去的雜質，如聯(lián)二 苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，嚴重影響產(chǎn)品質量。隨著消費觀念的改變，人們越來越崇尚"綠 色"、"天然"的食品和添加劑。在歐美國家，能被標記為"天然"的調(diào)味劑和芳香劑必須是采 用物理方法從天然材料中提取和酶催化或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的。若從玫瑰中提取天然2-苯 乙醇，每5t玫瑰鮮花僅能萃取玫瑰精油化g，生產(chǎn)成本極其昂貴，無法大規(guī)模生產(chǎn)。國際上天 然2-苯乙醇基本都是W微生物轉化k苯丙氨酸生產(chǎn)，主要集中在法國、德國、日本等發(fā)達國 家，但生產(chǎn)量遠不能滿足消費需求。
[0006] 2-苯乙醇的一個重要的生產(chǎn)途徑是采用微生物發(fā)酵，該途徑方法原料和合成過程 綠色環(huán)保、反應條件溫和、產(chǎn)物安全、生產(chǎn)周期短、可大規(guī)模生產(chǎn)。微生物菌體內(nèi)2-苯乙醇的 生物合成有Ξ條途徑:第一條途徑是從頭合成的莽草酸途徑，廣泛存在于微生物體內(nèi)，但代 謝途徑長、支路多、存在多種抑制，2-苯乙醇產(chǎn)量極低;第二條是心苯丙氨酸脫簇生成苯乙 胺、去氨基還原生成2-苯乙醇，此途徑較少發(fā)生;第Ξ條是化rl ich途徑，心苯丙氨酸通過轉 氨作用生成苯丙酬酸、再脫簇形成苯乙醒、最后還原生成2-苯乙醇。Ehrlich途徑是微生物 合成2-苯乙醇的首選途徑，是分別在芳香族氨基轉氨酶、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶巧中酶 的作用下進行的，研究者們已在基因水平上對其進行了深入的研究，重點研究編碼巧巾酶的 結構基因及其轉錄和調(diào)控方式。
[0007] 生物界所有物質代謝都由多酶共同作用來完成，運些不同的酶能高度有序地自組 裝形成多酶復合體(multienzyme complexes，MECs)參與反應，通過提高中間產(chǎn)物在不同酶 之間的轉運濃度，實現(xiàn)高效催化化opez-Gallego et al.,2010;Schoffelen et al.,2012; Zhang, 2011)。但是多酶共反應后存在酶分離回收困難、重復利用率低、穩(wěn)定性較差等問題， 也存在2-苯乙醇的產(chǎn)量一直較低，成本增加，香氣品質受到影響等較多缺點。
[0008] 目前尚未發(fā)現(xiàn)多酶體外制備2-苯乙醇的相關研究和文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備技術的 不足，擬利用多酶復合體高效催化的運一優(yōu)點，在體外人工制備多酶反應體系，即將高效表 達化rlich途徑的巧巾酶巧巾重組酶置于一個適宜的反應體系中，構建巧巾重組酶體外共反應 制備2-苯乙醇的最優(yōu)反應體系，不經(jīng)過生物體內(nèi)復雜的代謝系統(tǒng)，直接體外制備目標產(chǎn)物 2-苯乙醇，建立一種2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法。
[0010] 本發(fā)明的目的通過W下技術方案予W實現(xiàn)：
[0011] 提供一種2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，是在同一反應體系內(nèi)通過重組 轉氨酶IAR08、苯丙酬酸脫簇酶AR010和醇脫氨酶ADH1組成的共催化體系催化轉化，1^-苯丙 氨酸經(jīng)由苯丙酬酸、苯乙醒，轉化為2-苯乙醇;其中，所述反應體系內(nèi)，是心苯丙氨酸和草酷 乙酸為底物，重組酶 AR08、AR010 和 ADH1 按酶活力 ^1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1 或 1:0.25:2 (U/U/U)配比確定，加入量為10化L，在pH值為5.5~7.5、Mgh濃度為1.0~5mM的反應體系中， 水浴溫度為30~40°C條件下，反應轉化4~7min后，W等體積的乙臘終止反應，即制得2-苯 乙醇。
[0012] 本發(fā)明創(chuàng)造性地總結得到由重組芳香族轉氨酶I、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶組 成的游離多酶體系，能苯丙氨酸和草酷乙酸為底物，體外制備2-苯乙醇，具有催化效率 高、操作簡單、不需提純中間產(chǎn)物等優(yōu)點。
[0013] 在所述游離多酶體系條件下，優(yōu)選k苯丙氨酸和草酷乙酸地摩爾比為0.75:1。
[0014] 優(yōu)選AR08、AR010和A畑1W1:0.25: UU/U/U)配比。優(yōu)選Mgh濃度為 1.0~2.5mM;進 一步優(yōu)選為1.5mM。優(yōu)選地，水浴溫度為33~40°C ;進一步優(yōu)選為37°C，優(yōu)選在37°C水浴反應 5min。優(yōu)選地袖值為5.5~6.5;進一步優(yōu)選地，所述抑值為6。最優(yōu)選地，在所述游離多酶體 系條件下，所述k苯丙氨酸和草酷乙酸的摩爾比為0.75:1，重組酶AR08、AR010和AD化按酶 活力W1:0.25:1配比，加入量為lOOyL，pH值6.0、Mgh濃度為1.5mM，37°C水浴5min后W等體 積的乙臘終止反應即得。
[0015] 所述多酶體系在實際應用中還未能完全解決中間體性質不穩(wěn)定引起的產(chǎn)率不夠 高、反應后酶分離回收存在一定困難，重復利用率低，穩(wěn)定性較差等不足，為進一步完善本 發(fā)明技術方案，本發(fā)明進一步將所述巧中重組酶同時固定在同一個載體中，提高酶的穩(wěn)定性 和重復利用率，增加反應的局部濃度W提高產(chǎn)品的得率。在實際研究試驗過程中，只有科學 確定酶作用的最適溫度、最適pH、酶的共固定化比例、固定化次序等各個因素的作用效果和 機制W及相互之間影響制約的規(guī)律和關系，才能總結出所述3中重組酶的共固定化技術方 案。
[0016] 因此本發(fā)明提供一種優(yōu)選的技術方案是先將所述重組轉氨酶IAR08、苯丙酬酸脫 簇酶AR010和醇脫氨酶ADH1通過共固定方法制得共催化體系Combi-化EAs，然后利用Combi- 0^43對心苯丙氨酸進行催化轉化，經(jīng)由苯丙酬酸、苯乙醒，轉化為2-苯乙醇。
[0017] 在共固定技術方案條件下，其中，所述反應體系內(nèi)，是^心苯丙氨酸和草酷乙酸為 底物，優(yōu)選抑值為5.0、Mgh濃度為1.0~5mM，水浴溫度為40°C，反應轉化時間為5min。
[0018] 所述共催化體系Combi-化EAs的制備方法為：將AR08、AR010和ADHl按照1:1:1、1: 0.5:1或1:0.25:1配比后，經(jīng)沉淀劑硫酸錠沉淀后形成多酶聚集體，加入戊二醒對多酶聚集 體進行交聯(lián)，制得多酶共固定體系;其中，硫酸錠的飽和度為60~90%，pH值為4~6,戊二醒 的加入量按照其終濃度為0.05~0.25 % (V/V)確定。
[0019]優(yōu)選地，沉淀劑硫酸錠的飽和度70%。優(yōu)選地，沉淀劑硫酸錠的pH值為5優(yōu)選地， AR08、AR010和ADH1的酶配比為1: 0.5 :1。優(yōu)選地，所述戊二醒的加入量按照其終濃度為 0.1%(V/V)確定。優(yōu)選地，所述交聯(lián)的溫度為20~35°C，進一步優(yōu)選30°C。優(yōu)選地，所述交聯(lián) 的時間為30~150min，進一步優(yōu)選120min。
[0020] 本發(fā)明所述Combi-化EAs具有優(yōu)良的重復操作性，重復使用4次后，仍能維持66% 的初始酶活。
[0021] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0022] 本發(fā)明提供了一種新的2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，利用3種重組酶 構成共反應體系，將微生物體內(nèi)化rlich途徑需要多步連續(xù)反應、多種酶參與才能合成2-苯 乙醇運樣復雜的代謝過程，簡化為在體外的同一反應體系內(nèi)進行，從而減少了環(huán)境污染、縮 短了反應流程。進一步地，本發(fā)明采用戊二醒作為交聯(lián)劑，將3種重組單酶進行無載體共固 定化，制備共交聯(lián)酶聚集體(Combi-CLEAs)，體外合成目標產(chǎn)物，從而在上述有益效果的基 礎上進一步實現(xiàn)酶的循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明填補了多酶體外制備2-苯乙醇的技 術空白，為生物制備2-苯乙醇提供重要的借鑒，為制備天然2-苯乙醇提供創(chuàng)新思路。
【附圖說明】
[0023] 圖1多酶體系催化k苯丙氨酸合成2-苯乙醇的路線示意圖。圖2依次添加 Ξ種酶后 的高效液相色譜檢測2-苯乙醇結果。圖3Ξ酶共反應的高效液相色譜檢測2-苯乙醇結果。圖 4Ξ酶共反應的反應產(chǎn)物2-苯乙醇經(jīng)氣相質譜聯(lián)用分析結果。圖5Ξ酶共反應的反應產(chǎn)物2- 苯乙醇經(jīng)離子質譜分析結果。圖6Ξ酶共反應的反應時間對多酶活力的影響情況。圖7Ξ酶 共反應的多酶配比對反應的影響情況。圖8Ξ酶共反應的Mgh濃度對多酶活力的影響情況。 圖9Ξ酶共反應的溫度對多酶活力的影響情況。圖10Ξ酶共反應的抑值對多酶活力的影響 情況。圖11Ξ酶共反應的底物濃度對多酶活力的影響情況。圖12優(yōu)化Ξ酶共反應條件下高 效液相色譜測定2-苯乙醇結果。圖13Ξ酶共固定中沉淀劑對多酶聚集體活力的影響情況。 圖14Ξ酶共固定中硫酸錠飽和度對多酶聚集體活力的影響情況。圖15Ξ酶共固定中抑對多 酶聚集體活力的影響情況。圖16Ξ酶共固定中多酶配比對Combi-化EAs活力的影響情況。圖 17Ξ酶共固定中戊二醒濃度對Comb i -化EAs活力的影響情況。圖18Ξ酶共固定中交聯(lián)溫度 對Combi-CLEAs活力的影響情況。圖19Ξ酶共固定中交聯(lián)時間對Combi-CLEAs活力的影響情 況。圖20Ξ酶共固定中溫度對共固定化多酶和游離多酶活力的影響情況。圖21共固定化多 酶和游離多酶的溫度穩(wěn)定性。圖22 pH對共固定化多酶和游離多酶活力的影響。圖23底物配 比對共固定化多酶和游離多酶活力的影響。圖24共固定化多酶和游離多酶的膽存穩(wěn)定性。 圖25共固定化多酶的操作穩(wěn)定性。圖26 Aro8基因的克隆鑒定結果。圖27 ArolO基因的克隆 鑒定結果。圖28 ADH1基因的克隆鑒定結果。圖29表達載體p32-YT0801-Aro8電泳分析圖。圖 30表達載體p32-YT0801-Arol0電泳分析圖。圖31表達載體P32-DV10-A化1電泳分析圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例進一步說明本發(fā)明。下述實施例僅用于示例性說明，不能理 解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲 得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規(guī)使用的方法和設 備。
[0025] 實施例1
[0026] 主要試劑:重組芳香族氨基轉氨酶I、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶，常規(guī)市購或參 照現(xiàn)有技術文獻構建或者參照本發(fā)明實施例5方法構建?；瘜W標準品苯丙氨酸、草酷乙 酸、2-苯乙醇，購自美國Sigma-Al化i ch公司。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。主要 儀器:數(shù)顯恒溫水浴鍋皿-2(江蘇常州國華電器有限公司），恒溫金屬浴C皿-100(江蘇杭州 博日科技有限公司），精密抑計P服-3C(上海精密科學儀器有限公司），Mettler-Toledo電子 天平AB204-N(上海Mettler-Toledo儀器有限公司），超聲破碎儀(寧波科技有限公司），液相 色譜儀(上海天美公司），氣相色譜質譜儀GC-MSQP2010Plus(日本島津公司）。
[0027] 圖1顯示了心苯丙氨酸轉化為2-苯乙醇的過程。在同一反應體系內(nèi)，依次通過重組 轉氨酶IAR08、苯丙酬酸脫簇酶AR010和醇脫氨酶ADH1的轉化，1^-苯丙氨酸經(jīng)由苯丙酬酸、苯 乙醒，轉化為2-苯乙醇。所有反應體系都為0.5mL，緩沖液中包含O.OlmM的憐酸化唉醒、 0.2mM的焦憐酸硫胺素和0.1 mM的NADPH。
[0028] 1.多酶共反應的活性測定：苯丙氨酸和草酷乙酸為底物，冊LC檢測多酶共用 的催化活性。反應體系總體積50化L，含有：lOmM k苯丙氨酸，lOmM草酷乙酸，0.5mM Mg2+， 0.OlmM憐酸化多醒，0.1 mM焦憐酸硫胺素，0.1 mM NADPH，AR08、AR010和ADHIS種重組酶各10 yL。加入酶液混合均勻，開始計時，33 °C反應3min，加入50化L乙臘終止反應，過濾上清液， HPLC測定2-苯乙醇的含量。
[0029] 反應分兩組:第一組按第Ξ章單酶的作用時間依次加入Ξ種酶，即AR08作用lOmin 后，加入AR010充分反應30min，最后加入AD化作用3min;第二組同時加入Ξ種重組酶，混合 均勻后反應3min。測定兩組中2-苯乙醇的含量。
[0030] 多酶共反應的酶活力定義:在最適條件下，每分鐘每毫升多酶混合液所催化生成 的2-苯乙醇的皿〇1量。酶活單位為皿ol/(min · mL)。
[0031] 2. 2-苯乙醇測定條件：
[0032] 儀器:天美液相色譜儀；色譜柱:Phenomenex lima C18 250mmX4.6mm;參照方法， 流動相為乙臘-水（50/50，￥八），使用前經(jīng)0.224111微孔濾膜過濾并超聲脫氣；檢測波長為 216]11]1;流速1.〇1]11/1]11]1;柱溫為室溫。2〇41定量環(huán)定量。
[0033] 3. 2-苯乙醇的GC-MS檢ii條件
[0034] 儀器采用6(：-159?2010?11130，柱子(0.25臟10,30111)，分流進樣。升溫程序:進樣溫 度250°C，初始溫度40°C，保留5min，4.0°C/min升至。C，再W30.0°C/min加熱到250°C保留 5min。
[0035] 4.多酶共反應的反應條件確定驗證和試驗方法
[0036] (1)多酶共反應的時間：分別測定在不同反應時間下多酶的酶活，測得重組酶 AR08、AR010、A畑1的酶活分別為：0.87、0.22和1.75皿ol/(min · mL)(測定方法參照現(xiàn)有常 規(guī)）dW最大酶活為100%，結果用相對酶活表示。
[0037] (2)多酶共反應的酶配比：在設計多酶配比時，固定其中一個重組酶的量，例如固 定AR08的量，按照酶活力對酶W不同比例搭配：1:1:1，1:0.5 :1，1:0.25 : 2，1:0.25 :1，1: 0.25:0.5,1:0.15:0.5和1:0.15:0.25,分別測定不同配比下的酶活，W最大酶活為100%， 結果用相對酶活表示。
[003引（3)多酶共反應的Mg2+濃度:設定反應體系中不同的Mg2+終濃度，測定不同條件下 的酶活。例如分別設Mg2+終濃度為0、0.3、0.5、0.6、1.0、1.5和2. OmM，不同條件下的酶活測定 結果用相對酶活表示，W測定的最大酶活為100%。
[0039] (4)多酶共反應的最適溫度:分別測定多酶在30°C、33°C、35°C、37°C和40°C共反應 時的酶活，W最大酶活為100%，結果用相對酶活表示。
[0040] (5)多酶共反應的最適pH:將Ξ種重組酶AR08、AR010、ADH1依酶活力W不同配比， 加入不同pH的0.1M憐酸鋼緩沖液中，混合均勻，4°C放置30min，在最適條件下反應，測定酶 活。pH體系分別為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，結果用相對酶活表示，W測定的最大酶活為 100%。
[0041] (6)底物濃度對酶活性的影響：測定在底物k苯丙氨酸與草酷乙酸的不同摩爾比 條件下的多酶酶活，結果用相對酶活表示，W最大酶活為100%。為免寶述，本實施例分別W 底物k苯丙氨酸與草酷乙酸的的摩爾比為〇.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1進行說 明。所有獨立實驗重復至少Ξ次。
[0042] 5.試驗結果：
[0043] (1)多酶共反應的活性鑒定:本實施例WAR08酶促反應的底物心苯丙氨酸和草酷 乙酸作為起始底物，WADH1的催化產(chǎn)物2-苯乙醇作為終產(chǎn)物，在同一體系內(nèi)共同反應，檢測 Ξ酶共用的催化活性，W驗證Ξ酶共用體外合成2-苯乙醇的可行性。反應同時設二組:第一 組按單酶的作用時間依次加入Ξ種酶(AR08在30°C時的反應時間為lOmin，而AR010和ADH1 的作用時間分別為30min和3min);第二組同時加入Ξ種重組酶反應3min。參照2-苯乙醇標 準品，用HPLC檢測反應產(chǎn)物，第一組只有底物峰及其他中間產(chǎn)物雜峰，沒有檢測到反應產(chǎn)物 的存在，分析是因為形成的中間產(chǎn)物不穩(wěn)定所致;第二組在與標準品2-苯乙醇出峰時間相 同的位置，即4.650min處出現(xiàn)了一個小峰，且底物峰面積減少，顯示體系生成了目標產(chǎn)物2- 苯乙醇，濃度為11.51μΜ，見圖巧日圖3所示。表明AR08、AR010和A畑1共同存在于反應體系時， 具有催化活性。
[0044] 對Ξ酶共反應體系的反應產(chǎn)物進一步進行GC-MS檢測，在32.563min處發(fā)現(xiàn)有目標 產(chǎn)物2-苯乙醇的存在，見圖4所示，對該峰進行進行離子碎片分析，通過比對，進一步證實產(chǎn) 物為2-苯乙醇，見圖5所示。結果表明AR08、AR010和40^立酶共反應，能成功催化底物心苯 丙氨酸轉化為2-苯乙醇。
[0045] (2)多酶共反應的時間精確確定
[0046] 單酶體系的反應時間各不相同，AR08在30°C時的反應時間為lOmin，而AR010和 ADH1的作用時間分別為30min和3min。本發(fā)明研究分析多酶共反應得到的中間產(chǎn)物性質不 穩(wěn)定，如果酶作用時間過長，易聚合變稠甚至被氧化，因此有必要考察多酶體系的最佳共反 應時間。
[0047] W等摩爾的心苯丙氨酸和草酷乙酸為底物，反應體系中Mgh濃度為0.5mM，加入酶 活力相等的Ξ種重組酶，在33°C下反應不同時間，用HPLC方法測定反應液中2-苯乙醇的含 量，計算相對酶活，得出Ξ酶體系的反應時間為5min，見圖6所示。
[0048] (3)多酶共反應的酶配比精確確定試驗
[0049] 在多酶反應體系中，1^-苯丙氨酸依次經(jīng)轉氨酶I、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶的催 化，生成2-苯乙醇，因 Ξ種酶的酶活W及酶促反應速度不同，為使心苯丙氨酸的轉化率達到 最大，本實施例進一步確定Ξ種酶的最佳比例。由于轉氨酶IAR08是反應的第一個酶，因而 在討論多酶配比問題時，固定AR08的酶量，按照酶活力對Ξ種酶W不同比例搭配，共測定7 種不同比例的反應。所有反應體系都為0.5mL，包含有0.0 ImM的憐酸化唉醒、0.2mM的焦憐酸 硫胺素、O.lmM的NADPHW及0.5mM的Mg2\33°C水浴5min后，HPLC測定2-苯乙醇的含量，計算 相對酶活。圖7所示為本發(fā)明主要的實驗結果顯示圖。若AR08不足，則產(chǎn)生的苯丙酬酸濃度 低，2-苯乙醇的產(chǎn)率也低;若AR08過量而AR010和ADH1不足，則苯丙酬酸濃度增大，易導致產(chǎn) 物抑制，對心苯丙氨酸的轉化率產(chǎn)生影響；因此，合適的多酶配比有利于產(chǎn)物的形成。由圖7 可知，Ξ酶按照酶活力W1:0.25:1配比的活力最大;而分別:1:1、1:0.5:1和1:0.25:2配 比的酶活雖然較1:0.25:1次之，但同樣可W是保障足夠的活力，只是說明此Ξ組的AR010和 ADH1酶量已飽和或者過量;而1:0.25:0.5、1:0.15:0.5和1:0.15:0.25配比時的酶活較低， 說明此Ξ組中AD化和AR010酶量不足。因此多酶共反應時，AR08、AR010和A畑1:1:1(U/U/ U)、l :0.5:1(U/U/U)和1:0.25: 2(U/U/U)或 1:0.25:1(U/U/U)為優(yōu)選，進一步地，^1:0.25:1 (U/U/U)為最佳配比。
[0050] (4)多酶共反應的Mgh濃度確定試驗
[0051] 本發(fā)明人研究分析因為Mgh是帶二個正電荷的儀離子，可參與酶的催化活性，使得 Mgh具有比酸更強的催化作用，有利于酶活性中屯、的形成和空間結構的穩(wěn)定。此外，Mg2+通 過靜電屏蔽負電荷，可促進反應的進行。但同時，較高濃度的Mgh對酶具有抑制作用，本發(fā)明 人研究分析認為是Mg2+與富電子中屯、形成配位鍵，阻斷了底物與酶的活性中屯、結合。與此同 時，本發(fā)明人大量前期實驗總結AR08單酶催化體系中Mgh濃度為0.6mM，AR010體系的Mgh為 0.5mM，而5mM Mgh有利于AD化的活性，進一步證實了本發(fā)明人的研究分析結論。因此，按一 定比例相互構成的多酶反應體系必須考慮Mgh的最佳濃度范圍。根據(jù)Ξ種重組單酶作用的 適宜Mgh濃度范圍，測定若干組不同Mgh濃度的反應。圖8中顯示了其中6組不同Mgh濃度的 反應結果。AR08/AR010/ADH1依酶活力W1:0.25:1配比，33 °C水浴5min，測定各組相對酶活。 由圖8可知，當反應體系內(nèi)不添加 Mg叫寸，重組酶AR08和AR010不能發(fā)揮其催化活性;Mgh濃 度在1.0~2.5mM范圍時，多酶活性一直維持較高且穩(wěn)定的水平，沒有很明顯的變化;Mgh濃 度繼續(xù)增大至化.OmM時，酶活力稍下降，表明酶的活性受到Mgh的抑制;Mgh濃度為1.5mM時， 多酶體系的催化活力最大。
[0052] (5)多酶共反應的最適溫度確定試驗
[0化3] 試驗總結，重組酶AR08、AR010和ADH1的最適溫度分別為30 °C、37°C和35 °C，圖9顯 示了在不同溫度下反應的酶活力變化情況。多酶反應體系中，AR08/AR010/ADH1依酶活力W 1:0.25:1配比，Mgh濃度為1.5mM，水浴5min后加入等體積乙臘終止反應。
[0054] 結果顯示，在30~40°C的溫度范圍內(nèi)，溫度對Ξ酶體系的活性影響不很明顯。30°C 是AR08的最適溫度，但對AR010和A畑1活性稍有影響，多酶體系的相對酶活為75% ;40°C對 Ξ種重組酶都有影響，多酶體系的相對酶活降為65%。多酶共用的最適反應溫度與AR010的 最適溫度一致，都為37°C，分析總結認為AROlO是Ξ酶體系的關鍵酶，在30~40°C溫度范圍 內(nèi)發(fā)揮更強的作用。
[0055] (6)多酶共反應的最適pH確定試驗
[0056] 試驗總結Ξ個重組單酶的最適pH有差異，分別為7.0、6.0、6.0,因此本發(fā)明人分 析，Ξ者構成的多酶體系的最適抑，會受到Ξ種單酶體系抑差異的影響，為此，進行了不同 的試驗，在抑5.5~7.5范圍內(nèi)調(diào)節(jié)抑，研究立酶體系的最適抑。圖10的試驗結果是WMgh濃 度為1.5mM、AR08/AR010/A畑1依酶活力:0.25:1配比、37°C水浴5min等條件下進行說明。 試驗總結結合圖10可看出，多酶體系的最適pH范圍為5.5~6.5，pH6.0時的相對酶活最大。 在抑5.5~7.5范圍內(nèi)，多酶的催化活性沒有大幅下降，最低的相對活性能保持66%左右。
[0057] (7)底物濃度對酶活性的影響試驗
[005引研究總結底物k苯丙氨酸和草酷乙酸的濃度配比會影響AR08對底物的轉化率，繼 而影響AR010和ADH1的轉化率。因此，在保持底物草酷乙酸濃度為1 OmM不變的情況下，對底 物心苯丙氨酸和草酷乙酸采用不同的摩爾比，在Ξ酶共反應的最適條件下保持5min后，測 定2-苯乙醇的含量，計算相對酶活，結果如圖11所示。由圖11可W看出，1^-苯丙氨酸與草酷 乙酸摩爾比低于0.75:1時，多酶共反應的相對酶活隨心苯丙氨酸配比的增加而增大；當進 一步增大底物k苯丙氨酸的濃度時，多酶活力沒有明顯的變化，一直維持在最高水平，說明 k苯丙氨酸濃度已達到飽和狀態(tài);摩爾比從1.5:1增大到2:1時，相對酶活小幅下降到96%， 是因為k苯丙氨酸的抑制作用所致。由此可見，k苯丙氨酸與草酷乙酸的摩爾比為0.75:1 時，相對酶活最大。
[0059] 實施例2最適條件下多酶共反應合成2-苯乙醇
[0060] 本實施例儀器、試劑和檢測方法等參照實施例1。Wレ苯丙氨酸和草酷乙酸為底 物，研究了重組芳香族氨基轉氨酶IAR08、苯丙酬酸脫簇酶AR010和醇脫氨酶ADH1，共同作用 于同一體系合成2-苯乙醇的最適條件，所有反應體系都為0.5mL，包含O.OlmM的憐酸化唉 醒、0.2mM的焦憐酸硫胺素和0.1 mM的NADPH。
[0061] W摩爾比為0.75:1的心苯丙氨酸和草酷乙酸為底物，按照前述最佳條件合成2-苯 乙醇。重組酶AR08、AR010和A畑1按酶活力W1:0.25:1配比，加入量為10化L，在抑6.0、Mgh濃 度為1.5mM的反應體系中，37 °C水浴5min后，W等體積的乙臘終止反應，用HPLC測定2-苯乙 醇的含量，為40.92μΜ，見圖12所示。在本發(fā)明最佳的多酶共反應條件下，2-苯乙醇濃度達到 較高的值。重組多酶的酶活力為0.082皿olAmin · mU。
[0062] 實施例3Ξ酶共固定體系參與的共反應試驗
[0063] 主要試劑:重組芳香族氨基轉氨酶I、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶常規(guī)市購或參照 領域常規(guī)技術構建，或者參照本發(fā)明實施例5方法構建。化學標準品苯丙氨酸、草酷乙 酸、2-苯乙醇，購自美國Sigma-Al化ich公司。其他試劑常規(guī)市購，W上化學試劑均為國產(chǎn)分 析純或色譜純。主要儀器:數(shù)顯恒溫水浴鍋皿-2(江蘇常州國華電器有限公司），電熱鼓風干 燥箱101A-3S(廣東廣州富民測控科技有限公司），恒溫金屬浴C皿-100(江蘇杭州博日科技 有限公司），伊萊克斯冷藏冰凍箱BCD-263C(伊萊特（中國）有限公司），Eppendorf離屯、機 5810R(德國Eppendorf公司），精密pH計PHS-3C(上海精密科學儀器有限公司），Mettler- Toledo電子天平AB204-N(上海Mettler-Toledo儀器有限公司），超聲破碎儀(寧波科技有限 公司），液相色譜儀(上海天美公司）。一、試驗方法：
[0064] 酶活力測定方法：苯丙氨酸和草酷乙酸為底物，冊LC檢測共固定化多酶 (Combi-化EAs)的催化活性。反應體系總體積50化L，含有：lOmMレ苯丙氨酸，lOmM草酷乙 酸，1.5mM Mg2%0.0ImM憐酸化多醒，0.1 mM焦憐酸硫胺素，0.1 mM NADPH，共固定化多酶30化。 加入酶液混合均勻后，開始計時，最適溫度下反應5min，迅速加入50化L乙臘終止反應，上清 液用22μπι濾膜過濾后，HPLC測定216nm波長的吸光值，計算2-苯乙醇的含量。
[0065] Ξ酶共固定體系CombiHXEAs的酶活力定義:在最適條件下，每分鐘每毫升Combi- CLEAs混合液所催化生成的2-苯乙醇的皿〇1量。酶活單位為皿ol/(min · mL)。
[0066] 2-苯乙醇測定條件同實施例1。
[0067] 酶活力回收率計算:酶活力回收率是指Combi-化EAs所表現(xiàn)的活力占初始游離多 酶液總活力的百分數(shù)。
[006引
[0069] 1.共固定化多酶(Comb i -CLEAs)制備
[0070] 多酶聚集體的制備：重組轉氨酶I、苯丙酬酸脫簇酶和醇脫氨酶按酶活力Wl: 0.25:1比例混合，取10化L混合酶液裝于試管內(nèi)，向其中緩慢滴加9(Κ)化沉淀劑，同時邊滴加 邊輕微攬拌，每隔30min取樣一次，在8000巧m下低溫離屯、5min，取上清液測定酶活，直至所 有蛋白被沉淀。
[0071] 多酶聚集體的交聯(lián):在加入沉淀劑的多酶聚集體懸浮液中緩慢加入一定濃度的交 聯(lián)劑戊二醒，持續(xù)輕微攬拌，在一定溫度下交聯(lián)一定時間，400化pm離屯、lOmin，棄上清，W ImL pH7.0的憐酸氨二鋼/憐酸二氨鋼緩沖液洗涂沉淀后離屯、，ImL緩沖液重懸沉淀，于4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0072] 2.多酶共固定化條件研究
[0073] 沉淀劑種類的確定：分別采用90 %硫酸錠、90 %異丙醇、90 %下醇、60 % PEG6000、 90%乙醇、90%丙酬、90%叔下醇和90%乙臘作為沉淀劑，取100化^1:0.25 :UU:U:U)比例 混合混合的多酶液，分別加入90化L上述沉淀劑，25°C沉淀30min，8000巧m離屯、5min，洗涂， W ImL pH7.0的憐酸氨二鋼/憐酸二氨鋼緩沖液重懸沉淀，測定各酶活，計算酶活回收率。
[0074] 沉淀劑飽和度的確定：取lOOliL混合酶液，向其中緩慢加入900化飽和度分別為 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 % 和90 % 的抑7.0的硫酸錠溶液，25°C沉淀30min，測 定各酶活，計算酶活回收率。
[0075] 沉淀pH的確定：取100化混合酶液，緩慢加入900yL，pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0和8.0的飽和硫酸錠溶液，25 °C沉淀30min，測定各酶活，計算酶活回收率。
[0076] 多酶配比的確定：參照實施例1，固定第一個酶AR08的酶量，按照酶活力，AR08、 AR010和ADH1 分別Wl:l:l，l:0.5:l，l:0.25:2，l:0.25:l，l:0.25:0.5，l:0.15:0.5和 1: 0.15:0.25的比例配制多酶混合液，各取10化L混合酶液，向其中緩慢加入90化L飽和硫酸錠 溶液，25°C沉淀30min，測定各酶活，計算酶活回收率。
[0077] 交聯(lián)劑濃度的確定:按照前述最佳條件制備多酶聚集體懸浮液，向其中加入終濃 度分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.25%、0.50%和0.75%的戊二醒溶液并稍加攬拌，251： 交聯(lián)120min后，4000巧m離屯、lOmin，用10mLpH7.0的憐酸鹽緩沖液洗涂沉淀3次，最后WlmL 此緩沖液重懸沉淀，測定各酶活，計算酶活回收率。
[0078] 交聯(lián)劑溫度的確定:制備多酶聚集體懸浮液，并加入合適濃度的戊二醒溶液，分別 在0°C、10°C、25°C、35°C和45°C下交聯(lián)120min，離屯、，洗涂，W ImL緩沖液重懸沉淀，測定各酶 活，計算酶活回收率。
[0079] 交聯(lián)時間的確定：制備多酶聚集體懸浮液，加入戊二醒溶液，在最適溫度下，分別 交聯(lián)30、60、90、120和150min，離屯、，洗涂，W ImL緩沖液重懸沉淀，測定各酶活，計算酶活回 收率。
[0080] 3.采用響應面分析方法驗證本發(fā)明多酶共固定化條件
[0081 ] 根據(jù)單因素實驗結果，采用Box-Behnken試驗設計，對影響Combi-化EAs活性的顯 著因素進行3因素3水平設計。各因素編碼及水平見表1所示。
[0082] 根據(jù)相應的試驗表進行試驗后，對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方 項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最 佳值。
[0083] 表1Box-Belmken響應面設計試驗因素水平和編碼
[0084]
[0085] 4.從共固定化多酶(Combi-CLEAs)酶學性質研究確定本發(fā)明工藝參數(shù)
[0086] (1 )Combi-CLEAs的最適溫度：分別測定Combi-CLEAs在30°C、33°C、35°C、37°C、40 °C、45°C和50°C溫度下的酶活，結果用相對酶活表示，W測定的最大酶活為100%。^游離多 酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)為對照。
[0087] (2)Combi-化EAs的溫度穩(wěn)定性:將Combi-化EAs分別置于 10°C、30°C、50°C、70°C和 90°C下保溫化，測定剩余酶活。測定結果用相對酶活表示，W未保溫的酶活為100%。W游離 多酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)為對照。
[008引（3) Combi-CLEAs的最適抑:將Combi-化EAs加入不同抑的緩沖溶液中，混合均勻，4 °C放置30min，在最適溫度條件下反應，測定酶活。抑體系分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0，其中pH3.0~5.0為0.1M醋酸鋼緩沖液，pH6.0~7.0為0.1M憐酸鋼緩沖液，pH8.0為 0.1M Tris-HCl緩沖液;PH9.0為0.05M Gly-NaOH緩沖液。結果用相對酶活表示，W測定的最 大酶活為100 %。W游離多酶AR08: AR010: A畑1的最佳配比1:0.25:UU:U: U)為對照。
[0089] (4)底物濃度對Combi-化EAs活性的影響：測定仿111扣-〇^43在心苯丙氨酸與草酷 乙酸的摩爾比分別為0.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1條件下的酶活，結果用相對酶 活表示，W測定的最大酶活為100 %。W游離多酶AR08: AR010: ADH1的最佳配比1:0.25: UU: U:U)為對照。
[0090] (5)Combi-CLEAs的膽存穩(wěn)定性:取Combi-CLEAs分別置于4°C冰箱保存40d，每隔一 定時間取出等量酶液測定酶活，W測定的最大酶活為100%，結果用相對酶活表示。W游離 多酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)為對照。
[0091] (6)Combi-化EAs的操作穩(wěn)定性:取等量游離多酶和Combi-化EAs分別作用心苯丙 氨酸，終止反應后濾出酶液繼續(xù)下一批次反應，測定每批反應的酶活，W測定的最大酶活為 100%，結果用相對酶活表示。
[0092] 二、試驗結果
[0093] 1.多酶共固定化條件研究結果
[0094] (1)沉淀劑種類的選擇
[00M]利用中性鹽、水溶性有機溶劑和非離子型高聚物沉淀游離酶是制備化EAs的第一 步，沉淀劑種類不同，誘導出的酶構象也不同，隨后的交聯(lián)反應定格方式也不同，最終的交 聯(lián)酶聚集體的活性差異極大。因此沉淀劑的種類對酶活有很大影響。經(jīng)過針對性研究篩選 和對比試驗，本實施例向等量的多酶液中分別加入不同8種沉淀劑（（NH4)2S〇4、叔下醇、 PEG6000、異丙醇、正下醇、乙醇、丙酬、乙臘），測得各種聚集體的酶活如圖13所示，圖13中， CK:游離酶;A:90%(NH4)2S04;B:90%叔下醇；C:60%PEG6000;D:90%異丙醇；E:90%正下 醇;F:90%乙醇;G:90%丙酬;H:90%乙臘）。從圖13中可W看出，各種沉淀劑對混合多酶的 沉淀效果各有差異，W硫酸錠和叔下醇作為沉淀劑最終所得到的酶聚體的活性較高，酶活 回收率達到68%。硫酸錠是一種中性鹽，在溶液中能破壞蛋白質的水化層而使蛋白質凝集 沉淀。叔下醇是一種水溶性有機溶劑類蛋白沉淀劑，沉淀的原理主要是有機溶劑能降低水 溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，削弱溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，增加帶電 質點間的相互作用，增加蛋白質分子之間的相互吸引，致使蛋白質顆粒間容易凝集;其次， 運種極性有機溶劑能與水互溶，脫去蛋白質分子周圍的水化層，破壞蛋白質分子的水膜而 是蛋白發(fā)生沉淀。PEG 6000是一種不帶電荷的直鏈聚合物，主要通過空間位置排斥作用W 及很強的親水性，來破壞蛋白質分子表面的水化層，使酶聚集或脫水而沉淀。本文W60% PEG 6000制備的聚集體相對酶活只有43%，可能是PEG濃度不高、對酶的空間排斥作用不強 所致，此外，PEG溶液的粘度大，影響操作，試驗重復性不好。其它有機溶劑如丙酬、乙臘的沉 淀效果都比較好，但是酶活不高，運是因為運些有機溶劑在沉淀過程中對酶活的影響很大， 造成酶部分失活。因此，經(jīng)過分析和試驗驗證，本發(fā)明選取硫酸錠作為制備Combi-化EAs的 沉淀劑。
[0096] (2)沉淀劑飽和度的確定
[0097] 本實施例研究了沉淀劑濃度對多酶聚集體活性的影響。W不同飽和度的硫酸錠對 多酶混合液沉淀30min，離屯、后測定各聚集體活性，W等量的游離多酶酶活回收率為100%， 結果如圖14所示。隨著沉淀劑濃度的升高，被沉淀的蛋白量也增多，因而多酶聚集體的活性 呈上升趨勢;沉淀劑濃度越大，酶蛋白的沉淀越完全，聚集體中的酶活越高。當硫酸錠飽和 度從20%增加到40%，多酶的沉淀速度最快，聚集體相對活性從18%顯著增加到58% ;隨著 硫酸錠飽和度的繼續(xù)增大，相對酶活逐漸升高；當其飽和度為90%時，絕大部分多酶被沉淀 下來，相對酶活達到最大，但70%、80%和90%Ξ種飽和度的相對酶活差異不顯著，從制備 成本考慮，沉淀劑的最終飽和度為70 %。
[0098] (3)沉淀抑的確定
[0099] 用不同pH的硫酸錠沉淀劑制備多酶聚集體，測定酶活，W等量的游離多酶酶活回 收率為100%，結果如圖15所示。由圖15可知，隨著pH值的升高，酶活呈先上升再下降的變化 趨勢;pH4.0~6.0范圍內(nèi)的相對酶活較高，處于67 %~77 %之間；當抑5.0時，聚集體活力最 大，運是因為重組酶4308、41?010和4的11的等電點分別為5.81、4.91和5.06，因而在抑5.0附 近沉淀最完全。運些在水溶液中被硫酸錠沉淀下來的酶聚集體，酶分子之間通過非共價鍵 結合在一起，當酶聚集體置于水相反應體系中時，聚集體因不穩(wěn)定而發(fā)生分解，酶分子重新 溶解在水中，酶分子的空間構象受到破壞，從而影響酶活力，從前述試驗結果看出，即使在 完全沉淀的條件下，聚集體的最大相對酶活也不足80%，因此，為了避免聚集體的再次溶 解，在多酶發(fā)生沉淀后需采用一定濃度的交聯(lián)劑進行交聯(lián)。
[0100] (4)多酶配比的確定
[0101] 在確定多酶配比時，固定第一個酶AR08的酶量，按照酶活力對Ξ種酶W不同比例 搭配，并在25°C用pH5.0、70%飽和度的硫酸錠沉淀30min，離屯、后在各聚集體中加入適量戊 二醒進行交聯(lián)，制備Combi-CLEAs，測定其酶活，W等量的游離多酶酶活回收率為100%，結 果如圖16所示。多酶配比不同，酶的活力不同；AR08:AR010:ADH1為1:0.5:1(U/U/U)時，相對 酶活最大，運與前述游離Ξ酶聯(lián)用時的最佳配比有一定偏差，可能是Ξ酶W1:0.5:1配比 時，分子直徑、空間構象不同的Ξ種重組酶形成的交聯(lián)聚集體顆粒大小合適，底物分子容易 擴散進入聚集體內(nèi)部，且酶分子間距離比游離酶更近，AR08產(chǎn)生的苯丙酬酸易被AR010原位 脫簇、苯乙醒易被A畑1原位脫氨，因此，W1:0.5:1配比的酶液制備的Combi-化EAs獲得了最 高的活力。
[0102] (5)交聯(lián)劑濃度的確定
[0103] 戊二醒是適合于本發(fā)明固定化體系，其對酶的交聯(lián)主要是通過醒基和酶分子表面 的胺基發(fā)生反應，得到不溶性的酶交聯(lián)聚集體。但戊二醒的用量對制備的酶交聯(lián)聚集體有 不同的影響。AR08、AR010和ADH1按照酶活力W1:0.5 :1配比后，經(jīng)70 %飽和度硫酸錠沉淀 后，加入不同體積的戊二醒對多酶聚集體進行交聯(lián)，使溶液中戊二醒的終濃度分別為： 0.05%、0.10%、0.15%、0.25%、0.50%和0.75%(V/V)，制得各種Combi-CLEAs，測定其酶 活，結果如圖17所示。由圖17可知，隨著戊二醒濃度的增加，酶活力呈先小幅上升再持續(xù)下 降的變化趨勢，在戊二醒濃度為0.10 %時，相對酶活達到最高;戊二醒濃度由0.50 %增加到 0.75%時，相對酶活急劇下降了30%。表明在一定范圍內(nèi)，戊二醒用量增大，得到的Combi- CLEAs的量也增多，酶活力增大，但是戊二醒用量過大，會引起對酶的過度交聯(lián)，導致酶活性 的嚴重損失。運是因為戊二醒主要通過交聯(lián)作用來降低酶的流失量，在低濃度時，僅有少量 的酶分子能夠發(fā)生交聯(lián)，得到的不溶性的交聯(lián)酶聚集體量很少，有大量的酶沒有被交聯(lián)，在 洗涂過程中泄漏、流失，因而酶活力低;但是當濃度過高時，戊二醒與酶分子自身的氨基酸 發(fā)生多位點結合，使蛋白質的高級結構發(fā)生一定程度的破壞，不僅造成了酶活力的損失，而 且形成結構緊密的聚集體使得底物分子很難接近酶的活性中屯、，從而影響酶分子活性中屯、 的有效性，因此體現(xiàn)出較低的酶活力。
[0104] (6)交聯(lián)溫度的確定
[0105] 溫度也是影響多酶交聯(lián)聚集體活力的一個重要因素。在多酶聚集體中加入終濃度 為0.10 %的戊二醒進行交聯(lián)，分別置于0、10、20、25、30、35、45 °C下交聯(lián)反應120min，測定各 Combi-CLEAs的活力，計算相對酶活。從圖18中可W看出，溫度從(TC升高到30°C時，酶活力 不斷增大;在20~30°C范圍內(nèi)的酶活增大顯著;30°C時，相對酶活最大，達到74%。隨著溫度 的繼續(xù)升高，酶活力損失增大，45°C時，Combi-化EAs的相對活力降為43%。因此制備多酶交 聯(lián)聚集體的最適溫度選為30°C。
[0106] (7)交聯(lián)時間的確定
[0107] 交聯(lián)時間影響多酶聚集體的活性。終濃度為0.10%的戊二醒在30°C下交聯(lián)多酶聚 集體的時間分別為30、60、90、120和150111111，測定各(：〇111扣-化643的活力，計算相對酶活。結 果如圖19所示，隨著交聯(lián)時間的增加，Combi-CLEAs的相對酶活也平穩(wěn)增大，運是因為交聯(lián) 時間越長，交聯(lián)越徹底，多酶交聯(lián)聚集體的量越多，酶的活力越大；當超過120min時酶活開 始下降，交聯(lián)150min時，相對酶活下降到41%，運是因為交聯(lián)時間過長，過多的戊二醒覆蓋 酶的部分活性部位，影響酶活力;此外，交聯(lián)時間過久，戊二醒易發(fā)生聚合和氧化等反應，從 而影響酶活和交聯(lián)效果。因此，交聯(lián)時間對Combi-CLEAs的穩(wěn)定性和活性非常重要，故確定 120min為合適的交聯(lián)時間。
[0108] Ξ、多酶共固定化條件的響應面研究驗證試驗
[0109] 1 .Box-Benhnken試驗結果與分析
[0110] 本發(fā)明采用Box-Behnken試驗設計，W(NH4)2S04為沉淀劑，選取多酶配比為1: 0.5:1、沉淀抑為5.0、交聯(lián)時間為120min，對影響多酶化EAs活性的顯著因素進行3因素3水 平的設計，W3次試驗所得酶活力回收率的平均值為響應值(Y)，具體試驗設計和結果如表2 所示。
[0111] 表SBox-Belmken試驗設計及其結果
[0112]
[0113]
[0114] (2)二次回歸擬合及方差分析
[0115] 應用統(tǒng)計軟件SAS 8.0(Statistics Analysis System)對表2的數(shù)據(jù)進行二次多 項回歸擬合，統(tǒng)計學上的顯著性由T檢驗確定，決定系數(shù)和變異系數(shù)由F測驗決定。由Box- Behnken試驗數(shù)據(jù)擬合得到響應值(Y)與各因子(A，B，C)之間的二次回歸方程為：
[0116] Υ = -1〇24.29+17.18A+519.85B+31.61C+8.63AB-0.079AC+11.78BC-0.1 1A2- 7488.50B2-0.47C2
[0117] 對上述二元回歸方程進行顯著性分析及方差分析，結果見表3。
[0118] 表SBox-Belmken試驗設計回歸方程的方差分析
[0119]
[0120]
[0121] 各因素與響應值之間線性關系的顯著性由F值檢驗來判定，概率P(F>Fa)的值越 小，則說明變量的顯著性越高。失擬項化ack of fit)是用來評估方程可靠性的一個重要數(shù) 據(jù)，如果顯著，表明方程模擬不好;如果不顯著，表明方程模擬比較好，可W很好地分析W后 的數(shù)據(jù)，即可W用該回歸方程代替真實試驗點對實驗結果進行分析和預測。由表3可知，模 型的顯著水平為〇.〇〇〇1(<〇.01)，表明模型對響應值(酶活力回收率)的影響極顯著，該模型 在統(tǒng)計學上有意義。交聯(lián)溫度影響極顯著，3因素對酶活力回收率的影響顯著性為交聯(lián)溫度 〉硫酸錠飽和度〉戊二醒濃度;交互項A(硫酸錠濃度)與B(戊二醒濃度）、A(硫酸錠濃度)與C (交聯(lián)溫度)交互作用顯著，說明運3個因素都是Combi-CLEAs制備過程中的關鍵控制因素； 二次項A2、B2、C2影響極顯著。失擬項P = 0.631100.05)，沒有顯著性意義，說明數(shù)據(jù)中沒有 異常點，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當。
[0122] 表4模型的可信度分析 「01231
[0124] 由表4可W看出，相關系數(shù)R2 = 0.9864，說明響應值的變化有98.64%來源于所選 Ξ個變量。校正決定系數(shù)R2(Ad j) = 0.9688(〉0.80)，說明96.88 %的實驗數(shù)據(jù)的變異性可用 此模型解釋;而較低的變異系數(shù)C.V. % (5.54%)表明，模型中僅有5.54%變異不能由該模 型解釋，即有94.45%的變異可W由由該模型來解釋，表明該模型是高度顯著的。信噪比 Adeq Precision大于4比較合理，該模型信噪比為19.485,表明模型能很好反映真實的實驗 值。綜上分析，該回歸方程可W較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可W利用其確 定Comb i -CLEAs的最佳制備條件。
[0125] 3.驗證試驗
[01%]根據(jù)Box-Behnken設計模型分析得知，多酶共固定化條件優(yōu)化工藝參數(shù)為：（NH4) 2SO4飽和度為71.57 %，戊二醒濃度為0.10 %，交聯(lián)溫度為28.55°C。在此條件下，酶活回收率 預測值為67.29%。為了確定建立的模型與試驗結果是否相符，根據(jù)實際操作，將固定化工 藝參數(shù)修正為(NH4)2S04飽和度為72 %，交聯(lián)溫度為29 °C，戊二醒濃度仍為0.10 %;在此參數(shù) 下，進行了3組實驗，得到的酶活回收率為65.76±3.27%，與模型預測值接近。所擬合數(shù)據(jù) 模型很好地與本發(fā)明實際方案具有較好的吻合度。
[0127] 4.共固定化多酶酶學性質研究試驗
[0128] (1)溫度對共固定化多酶活性的影響
[0129] 高溫下酶的活性構象發(fā)生解離，是酶活性降低或喪失的根本原因，而固定化技術 通過酶分子之間或酶與載體之間的各種共價鍵的連接，可有效減少運種構象的解離。因此 大多數(shù)酶經(jīng)固定化后，最適溫度較游離酶會有所提高。本實驗分別測定了不同溫度下 Combi-CLEAs和游離酶的活性，結果如圖20所示。由圖20可知，游離酶的最適溫度為37°C， Combi-CLEAs的最適溫度有小幅升高，為40°C;且Combi-CLEAs的適宜作用溫度范圍較游離 酶寬，在37~50°C范圍內(nèi)，其相對酶活力都保持在最高酶活的86% W上。表明交聯(lián)固定化技 術提高了酶的催化溫度。其原因是交聯(lián)劑戊二醒形成的交聯(lián)酶聚集體結構比較致密，對酶 的活性基團有一定的保護作用。從圖中也可看出，隨度著溫度的進一步升高，固定化酶和游 離酶的活性都逐漸降低，因此，除了確定其最適溫度，還應考慮固定化酶的熱穩(wěn)定性。
[0130] (2)共固定化多酶的溫度穩(wěn)定性
[0131] 熱穩(wěn)定性是考察固定化酶性能的一個重要指標。對固定化酶和游離酶在不同溫度 下處理化，測定其剩余酶活性，結果如圖21所示。圖中可W看出，隨著溫度提高，Combi- CLEAs和游離多酶的活性均呈下降趨勢，但游離酶的活性下降幅度更大;在50°C保溫化后， Combi-CLEAs的相對酶活仍保持在80%，而游離酶僅50% ;90°C處理化后，前者剩余活力為 25%，后者不足10%。由此可見，共交聯(lián)酶聚體運種固定化方法能有效提高酶的熱穩(wěn)定性， 明顯降低熱失活程度。其原因是游離酶形成化EAs后，空間結構發(fā)生變化，部分活性基團被 包埋在聚集體內(nèi)部，從而受到了保護，因此耐熱性有所增強;此外，較高的溫度有利于底物 分子擴散至聚集體內(nèi)部與酶發(fā)生反應。
[0132] (3)p取?共固定化多酶活性的影響
[0133] 酶的活力易受環(huán)境抑的影響，只有在一定抑下，酶才能表現(xiàn)最大活力。由于載體對 微環(huán)境中離子強度的影響，固定化酶的最適抑值往往會發(fā)生漂移。本實施例測定了抑3.0 ~9.0的緩沖液中Combi-CLEAs和游離多酶的活性，結果見圖22。由圖可知，Combi-CLEAs的 最適抑為5.0，游離多酶的最適pH為6.0，Combi-CLEAs向酸性偏移了一個單位，其適宜作用 pH范圍也向酸偏移。可能是因為交聯(lián)過程中，戊二醒分子中的醒基與酶分子中的氨基發(fā)生 了親核反應，使得蛋白質分子側鏈基團的負電荷增多，外部溶液中的抑必須向酸性偏移才 能中和運些負電荷。
[0134] (4)底物濃度對共固定化多酶活性的影響
[0135] 研究底物的濃度配比影響共固定化多酶(Combi-CLEAs)活性時，保持底物草酷乙 酸濃度為lOmM不變的情況下，對底物心苯丙氨酸和草酷乙酸采用不同的摩爾比，在Combi- CLEAs的最適條件下保持5min后，測定酶活，結果如圖23所示。由圖可見，底物配比對共固定 化多酶和游離多酶的影響一致，當k苯丙氨酸與草酷乙酸摩爾比低于0.75:1時，二者的相 對酶活都隨k苯丙氨酸濃度的增加而增大，但固定化多酶的相對酶活稍高；當?shù)孜锬柋?超過1.5:1時，因心苯丙氨酸的抑制，二者活力稍有下降，固定化多酶下降速度稍快。由此可 見，k苯丙氨酸與草酷乙酸的摩爾比為ο. 75:1時，固定化多酶和游離多酶的相對酶活最大。
[0136] (5)共固定化多酶的膽存穩(wěn)定性
[0137] 酶的膽存穩(wěn)定性對其商業(yè)化應用非常重要。將游離多酶和共固定化多酶化EAs置 于4°C冰箱保存40d，每隔一定時間測定酶活，結果如圖24所示。在膽存的前l(fā)Od內(nèi)，兩者的活 力都沒有明顯變化;20d后，固定化酶維持98%的活性，游離酶活性為95% ;40d后，酶活力都 有所下降，但Combi-CLEAs的下降趨勢比游離酶緩慢，兩者活性分別維持初始酶活的87%和 70%。表明固定化酶的膽存穩(wěn)定性較好，運主要是因為Combi-CLEAs制備過程中的沉淀和交 聯(lián)步驟對酶有提純作用，避免了雜蛋白造成酶的水解。此外，酶分子W多點共價交聯(lián)形式牢 牢鎖定在一個區(qū)域內(nèi)，避免了酶W游離態(tài)形式泄漏到溶液中。
[0138] (6)共固定化多酶的操作穩(wěn)定性
[0139] 可重復利用性也是衡量固定化酶性能的一個重要指標。在每一批次反應結束后， 將Combi-CLEAs濾出繼續(xù)下一批次反應，結果見圖25。固定化多酶在重復使用4次后，底物的 轉化率為23%，維持了 66%的初始酶活，而游離酶因為難W回收，使用1次后酶活只保留了 4%，說明Combi-CLEAs具有較好的重復操作性;連續(xù)使用8次后，固定化多酶活力下降幅度 極大，僅剩19%的活力，主要原因是多次重復影響其穩(wěn)定性，其次是Combi-CLEAs顆粒細小、 影響回收。
[0140] 實施例4多酶共固定體系應用于共反應制備2-苯乙醇
[0141] 依響應面分析得出的最優(yōu)工藝參數(shù)，進行多酶共固定，按照最佳條件合成2-苯乙 醇。Combi-CLEAs加入量為10化L，在抑5.0、40 °C水浴5min后，W等體積的乙臘終止反應，用 HPLC測得2-苯乙醇的含量為28.61μΜ。共固定化多酶的酶活力為0.057皿olAmin · mU。
[0142] 實施例5優(yōu)化的Ξ種重組酶的構建方法
[0143] W下構建方法中沒有特別說明的均為參照本領域常規(guī)技術，沒有說明的生物材料 均為市購或本領域常規(guī)使用的生物材料。
[0144] 一、從釀酒酵母的不同菌株中克隆得到了 W化rlich途徑合成2-苯乙醇的3個關鍵 酶的11個基因。
[0145] (1)3個芳香族氨基轉氨酶I基因。其DNA序列長度為1503bp，相對分子質量大小為 56.2kD，理論等電點為5.81。3個基因的66扣曰114登錄號分別為雌422721.1、雌422722.1和 KC422723.1〇
[0146] (2)3個苯丙酬酸脫簇酶基因。其DNA序列長度為1908bp，相對分子質量大小為 71.4kD，理論等電點為6.10。其中2個基因在〇6扣曰扯中注冊，登錄號分別為雌422719.1和 KC422720.1〇
[0147] (3)5個醇脫氨酶基因。分別為:2個醇脫氨酶A化1基因、1個醇脫氨酶A化2基因、1個 醇脫氨酶Adh3基因和1個醇脫氨酶Sfal基因。其中，A化1和Adh2基因的DNA序列長度都為 1047bp，相對分子質量大小約為36.8kD，DV10-A化1基因的理論等電點為6.07，EC1118-A化1 和DV10-A化2理論等電點都為6.21。6(：1118-4化1基因和0￥10-4化2的66扣曰證登錄號分別為 KC491732.1和雌491733.1。￥1'0801-4化3基因的0魁序列長度為112869，相對分子質量大小 為40.4kD，理論等電點為8.65，其Genbank登錄號為KC422718.1 sYTOSOl-Sfal基因的DNA序 列長度為lieibp，相對分子質量大小為41kD，理論等電點為6.51，其Genbank登錄號為 KC491734.1。
[0148] 材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株和大腸桿菌化scherichia coli)菌株DH5a，常規(guī)菌株，可W使用其他實驗室常規(guī)實驗使用的菌株，本實施例使用的菌 株為本實驗室常規(guī)保存的實驗用菌株?？寺≥d體pGEM-T Easy Vector，Promega公司產(chǎn)品。
[0149] TakaRaEx Taq酶購自大連寶生物工程有限公司；普通瓊脂凝膠DNA回收試劑盒和 質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司;常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0150] 根據(jù)已報道的目的基因序列信息，利用primer 5和oligo 6.0設計特異性引物，由 上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列信息見表5。
[0151] 表巧I物序列信息表
[0152]
[0153]
[0154] 釀酒酵母的培養(yǎng)及總DNA的提?。?br>[01巧]分別從不同釀酒酵母菌株中提取基因組DNA，參照蝸牛酶過夜處理法（王萍等， 2008;趙宏宇等，2011)。W釀酒酵母總DNA為模板，利用上述特異性引物進行PCR反應擴增目 的基因的DNA全長片段，PCR擴增反應體系為：
[0156]
[0157] PCR 反應參數(shù)：94°C 預變性 5min，94°C 變性 453,46。(：退火453,72。(：延伸9〇3;共33個 循環(huán);72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物4°C下保存。
[0158] 目的片段PCR擴增產(chǎn)物的回收:擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的 條帶，用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。
[0159] PCR產(chǎn)物的連接：回收的PCR產(chǎn)物與載體T-easy Vector連接，重組質粒轉化大腸桿 菌E.coli D冊α。連接反應體系如下；
[0160]
[0161] 連接混合物在4°C下連接過夜，轉化大腸桿菌感受態(tài)D冊a(&Cl2法）。
[0162] 連接產(chǎn)物的轉化和大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備參照現(xiàn)有常規(guī)技術。
[0163] 連接產(chǎn)物的轉化包括W下步驟：
[0164] 步驟一:大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
[0165] (1)從37°C培養(yǎng)1加的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到裝有l(wèi)OOmL LB培養(yǎng)基的 250mLS角瓶中，于37°C劇烈搖動化(220巧m)。
[0166] (2)在無菌條件下將大腸桿菌轉移到一個無菌、一次性使用的預冷的50mL離屯、管 中，冰上放置lOmin。
[0167] (3)于4°C用GS3轉頭W4000巧m，離屯、lOmin收集細胞。
[0168] (4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
[0169] (5)Wl0mL用冰預冷的0.1M CaCb重懸每份沉淀，冰浴30min后，再W4000巧m離屯、 lOmin收集細胞。
[0170] (6)棄盡上清，并W2mL冰預冷的0.1M CaCb重懸沉淀，4°C放置，7化W內(nèi)使用；或 在0.1M化C1盛礎上添加甘油至終濃度20%，分裝后于-70°C保存，長期備用。
[0171 ]步驟二:大腸桿菌感受態(tài)細胞的鑒定
[0172] (1)吸取10化L感受態(tài)細胞的懸浮液，加入化L不帶目的基因的質粒(抗Amp)，混勻， 冰浴30min。同時作空白對照一個，即另外吸取10化L感受態(tài)細胞的懸浮液，不加質粒。
[0173] (2) 42 °C水浴放置90s，快速轉移到冰上，使細胞迅速冷卻1~2min。
[0174] (3)加入400化的LB液體，37°C水浴恢復5min，轉入37°C搖床200rpm振蕩培養(yǎng) 45min。
[0175] (4)在lOOmL冷卻至46°C的LB固體培養(yǎng)基中，加入200化的Amp(50ygAiL)，混合均 勻，注入平皿。
[0176] (5)加入 100μLΧ3)，均勻涂布。
[0177] (6)待驚干后，倒置平板，37°C培養(yǎng)過夜，觀察結果。
[0178] (7)不加質粒的對照無菌落產(chǎn)生;加質粒的有均勻密布的菌落產(chǎn)生。說明感受態(tài)細 胞有較好的轉化能力，且無抗Amp的雜菌。
[0179] 步驟Ξ:連接產(chǎn)物的轉化
[0180] (1)從-70°C冰箱中取2(Κ)化感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置于冰 上；
[0181] (2)加入連接混和液10化，輕輕搖勻，冰上放置30min;
[0182] (3)42°C水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3~5min;
[0183] (4)加入ImL不含Amp的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)比，使細菌恢復正常生 長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Amp+);
[0184] (5)將上述菌液搖勻后取100化均勻涂布于含Amp+的篩選平板上，正面向上放置 0.化W便液體被吸收；
[0185] (6)待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置平板，于37°C培養(yǎng)16~24h;
[0186] (7)待菌落充分顯色后，挑取帶重組質粒的克隆（白斑)作培養(yǎng)，用無菌牙簽在LB固 體培養(yǎng)基中挑轉化后的白色單菌落，接種到2mL含有抗生素氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°(：振蕩培養(yǎng)8~12}1。
[0187] 重組質粒的提取:參照說明書用TIANGEN質粒小提試劑盒對轉化菌株進行重組質 粒提取。
[0188] 重組質粒的酶切鑒定:酶切反應體系為：
[0189]
[0190] 37 °C保溫化，進行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0191] PCR鑒定和酶切鑒定無誤的克隆攜帶菌株，由北京六合華大基因科技股份有限公 司廣州分公司測序。
[0192] 核酸序列比對在NCBI BLAST化ttp://blast .ncbi .]11111.]1化.邑〇￥)上進行，氨基酸 序列比對在邸I-BLAST化ttp://www. ebi .ac.址)上進行，核酸序列分析用麗assist 2.0和 NCBI Spidey完成，核酸與氨基酸序列繪制用DNAMAN完成，蛋白質結構與功能的預測在 Swissprot化t1:p: //www. expasy. ch/sprot/)網(wǎng)站上提供鏈接的平臺上進行。
[0193] 本實施例分別提取17個不同釀酒酵母菌株的總DNA，WAR08F和AR08R為引物進行 PCR擴增，結果從3個酵母菌株中得到的PCR產(chǎn)物大小都約為1500bp，與預期相符。轉化 E.coli D冊α，提取陽性重組質粒，經(jīng)EcoRI酶切鑒定，插入片段大小約1500bp，與預期目標 基因接近，見圖26所示。其中圖26中，左(a)為Aro8基因 PCR產(chǎn)物的電泳分析結果;右圖（b)為 重組質粒的酶切鑒定結果。M:Maker虹；1 ~3:￥1'0801-4'〇8、6(：1118-4'〇8和0￥10-4'〇8的口〇? 產(chǎn)物；1〇~3〇:重組質粒；li~33:1〇~3〇號質粒的酶切產(chǎn)物。
[0194] 本實施例提取17株不同釀酒酵母菌株的總DNA，WAR010F和AR010R為引物進行PCR 擴增。結果從3株酵母菌株中得到的PCR產(chǎn)物大小都約為1900bp，與預期相符。回收PCR產(chǎn)物， 轉化D冊α感受態(tài)細胞，在含Amp+的LB平板上進行藍白斑篩選。提取陽性重組質粒，EcoRI酶 切鑒定。酶切結果顯示電泳條帶清晰，插入片段大小約1900bp，與預期目標基因接近，見圖 27所示，圖中，左圖（a)為ArolO基因 PCR產(chǎn)物的電泳分析;右圖（b):重組質粒的酶切鑒定。M: Maker虹；1~3:YT0801-Arol0、ECm8-Arol0和DV10-Arol0的PCR產(chǎn)物；l日~3日：重組質粒；ll ~33:1〇~3〇號質粒的酶切產(chǎn)物。
[0195] 本實施例提取17個不同釀酒酵母菌株的總DNA，進行PCR擴增。從2株酵母中得到與 Adhl基因大小相符的PCR產(chǎn)物(約1050bp)，由1株酵母得到與Adh2基因大小相符的PCR產(chǎn)物 (約1050bp)，由1株酵母得到與A化3基因大小相符的PCR產(chǎn)物(約1150bp)，由1株酵母得到與 Sf曰1基因大小相符的PCR產(chǎn)物（約1150bp)?；厥誔CR產(chǎn)物，轉化E. CO1 i D冊α，進行藍白斑篩 選，提取陽性重組質粒，經(jīng)EcoRI酶切鑒定，插入片段大小都與預期目標基因接近，見圖28所 示。圖28中，左圖（a)為PCR產(chǎn)物的電泳分析;右圖（b)為重組質粒的酶切鑒定，Μ: Maker虹；1 ~5: DV10-A化 1、EC1118-A化 1、DV10-A化 2、YT0801-A化 3和 YT0801-Sf 曰1 的PCR產(chǎn)物；1〇 ~5〇: 重組質粒;h~5s: 1〇~5〇號重組質粒的酶切產(chǎn)物。
[0196] 二、利用大腸桿菌化2UDE3)分別對3個關鍵酶基因所編碼的蛋白進行原核表達， 經(jīng)SDS-PAGE檢測，3種蛋白的分子量大小與采用生物信息學方法預測的大小基本一致。
[0197] (1)將YT0801-Aro8基因克隆到表達載體祀T-32a( + )上，構建了芳香族氨基轉氨酶 I基因工程菌株。30°C下，經(jīng)IPTG誘導化，工程菌株能表達重組酶AR08。經(jīng)純化，融合蛋白 AR08的濃度為462.3mg/L。經(jīng)SDS-PAGE檢測，其分子大小約為70kDa。
[0198] (2)將YT0801-Arol0基因克隆到表達載體祀T-32a( + )上，構建了苯丙酬酸脫簇酶 基因工程菌株。28 °C下，經(jīng)IPTG誘導化，工程菌株能表達重組酶AR010。經(jīng)純化，融合蛋白 AR010的濃度為202.2mg/L。經(jīng)SDS-PAGE檢測，其分子大小約為90kDa。
[0199] (3)將DV10-A化1基因克隆到表達載體祀T-3 2a (+)上，構建了醇脫氨酶基因工程菌 株。28 °C下，經(jīng)IPTG誘導3h，工程菌株能表達重組酶ADH1。經(jīng)純化，融合蛋白ADH1濃度為 252.6mg/L。經(jīng)SDS-PAGE檢測，其分子大小為61kDa。
[0200] 材料:質體轉化受體菌E.coli D冊cuE.coli BL2UDE3)由中山大學生命科學院劉 玉煥教授饋贈，也可W采用本領域常規(guī)使用的該種受體菌。PMD18-T載體購自Promega公司， 祀T-32a( + )載體由中山大學生命科學院劉玉煥教授饋贈，也可W采用本領域常規(guī)使用的該 載體。
[0201] 氨節(jié)青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖巧（IPTG)、5-漠 -4-氯-3-嗎I噪-β-D-半乳糖 巧(X-gal)、；^甲基氨基甲燒(Tris)、丙締酷胺(Acrylamide)、甲叉雙丙締酷胺(BIS)、β- 琉基乙醇、漠酪藍(ΒΡΒ)、瓊脂糖、瓊脂粉均為進口分裝，購自北京普博欣生物科技有限公 司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒購于天根生化科技有限公司；蛋白純化樹 脂化S · bind resin及純化柱購于Merck公司（德國）；各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、低 分子量蛋白標準，購自寶生物（大連）工程有限公司。DNAMarker虹、化b plus DNA Ladder (MD113)
[0202] 、蛋白質Marker,購自天根生化科技(北京)有限公司。心苯丙氨酸、草酷乙酸、天冬 氨酸、苯丙酬酸、苯乙醒、2-苯乙醇等化學標準品購自美國Sigma-Al化ich公司。其他化學試 劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。
[0203] 培養(yǎng)基：LB(Lur ia-Bertani )培養(yǎng)基（1000ml): lOg膜蛋白腺，5g酵母提取物， lOgNaCl，抑自然（固體培養(yǎng)基需另加入20g瓊脂粉），12rC下滅菌15min。冷卻至室溫加入氨 節(jié)青霉素到培養(yǎng)基中，終濃度為Ig/ULB培養(yǎng)基-X-gal-IPTG(lOOOml): lOg膜化蛋白腺，5g 酵母提取物，lOg化Cl，抑自然，20g瓊脂粉，121°C下滅菌15min。冷卻至室溫加入10化L的氨 節(jié)青霉素（lOOmg/mL)，在培養(yǎng)基中加入10化的IPTG( 24mg/mL)，200化的X-gal (20mg/mL)。 [0204] (1)引物設計
[020引根據(jù)目的序列兩端的已知序列信息，設計PCR擴增引物，如表6所示。
[0206] 表6引物序列信息表
[0207]
[020引引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。DNA測序由華大基因有限公司完成。
[0209] (2)克隆基因的PCR擴增
[0210] W提取的克隆質粒為模板，進行PCR擴增反應，反應體系如下：
[0211]
[0212] YT0801-Aro8基因 PCR反應參數(shù)：94°C預變性5min，94°C變性45s，59°C退火45s，72 。(:延伸90s;共33個循環(huán);72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物4°C保存。
[0213] YT0801-Arol0 基因 PCR 反應參數(shù)：94°C 預變性 5min，94°C 變性 453,60°(：退火453,72 。(:延伸120s;共35個循環(huán);72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物4°C保存。
[0214] DV10-A 化 1 基因 PCR 反應參數(shù):94°C 預變性 5min，94°C 變性 45s，58°C 退火 45s，72°C 延伸60s;共33個循環(huán);72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物4°C保存。
[0215] (3 )PCR擴增產(chǎn)物的回收、連接與轉化
[0216] PCR擴增產(chǎn)物回收后，在4°C下連接PMD18-T載體過夜，轉化E.coli D冊α。連接反應 體系如下：
[0219] (4)重組質粒的雙酶切鑒定與序列測定[0220] 提取重組質粒，進行雙酶切鑒定，酶切體系如下：
[0217]
[021 引
[0221]
[0222] 本實施例所設及的含Aro8基因的重組質粒用EcoR I和趾0 I酶切鑒定，含ArolO和 A化1基因的重組質粒用BamH I和化0 I酶切鑒定，產(chǎn)物應為大小兩個片段，將酶切鑒定無誤 的重組質粒測序。
[0223] (5)載體祀T-32a( + )和重組質粒的連接與轉化
[0224] 雙酶切載體祀T-32a( + )和重組質粒，37°C水浴化，電泳。酶切體系如下：
[0225]
[0226] 用瓊脂糖凝膠分別回收小、大DM片段，建立連接體系，插入片段的量與載體的量 視片段的大小及其DNA濃度而定，一般采取比例3:1。加入T4連接酶(350UAiL，1.0yL)及連接 酶緩沖液（1.0化），W去離子水補充體系至10化，輕彈混勻，16°C連接過夜，轉化E.coli D冊 曰，提取重組質粒，經(jīng)雙酶切鑒定和序列測定。根據(jù)基因的來源，表達載體質粒分別命名為 p32-YT0801-Aro8、p32-YT0801-Arol0 和 P32-DV10-A化 1。電泳分析如圖 29、圖 30 和圖 31 所 示。并將此重組質粒進行測序鑒定，測序結果與目的基因序列完全一致。表明表達載體p32- YT0801-Aro8、p32-YT0801-Arol0 和 P32-DV10-A化 1 已構建成功。圖29中，M:Maker虹；1:質 粒;2:酶切產(chǎn)物。圖30中，~6:質粒；1〇,5〇:1號和5號質粒的酶切產(chǎn)物。圖31中，1~ 5:質粒；1〇2，2〇，4〇: 1、2和4號質粒的酶切產(chǎn)物。
[0227] (6)表達載體的轉化:表達載體質粒轉化表達菌株大腸桿菌E.coli化2UDE3)。提 取重組質粒，經(jīng)雙酶切鑒定。
[022引重組蛋白的誘導表達及純化：
[0229] (1)重組蛋白的誘導表達，主要包括W下步驟：（1)取保存的重組陽性克隆子于含 有10化g/mLAmp的LB平板劃線，37°C培養(yǎng)過夜。（2)挑取單菌落，接種到含有l(wèi)(K)yg/mLAmp的 15mL液體LB培養(yǎng)基中，37 °C，200r/m培養(yǎng)過夜。（3)取50化L菌液轉接到含有Amp的50mLLB培 養(yǎng)基中（1:100)，37°C，200巧m擴大培養(yǎng)至0D為0.8(約2.化），添加 lOOmM的IPTG至其終濃度 為ImM。在一定溫度下誘導表達一定時間。（4)8000巧m離屯、15min，分別收集菌體和上清液，- 20°C保存?zhèn)溆?。?)超聲破碎并進行蛋白電泳，觀察蛋白表達情況。
[0230] (2)重組蛋白的提取:用PBS洗涂菌體2~3次，按原菌液體積~1/10的比例加入 裂解液，進行菌體重懸。采用冰浴超聲破碎菌體，超聲條件是功率400W，超聲3s，間隔2s，破 碎60次。12000巧m離屯、5min，將上清用離屯、管收集，進行SDS-PAGE分析。
[0231] (3)重組蛋白的純化，主要包括W下步驟：（1)將lmL50%Ni-NTA化S · bind樹脂懸 液加入到4mLl XNi-NTA結合緩沖液中，輕柔混勻。（2)待樹脂自然沉降后，用槍頭吸取4mL上 清，加入4mL制備好的上清液，輕柔混勻，4°C結合60min。
[0232] (3)將裂解液Ni-NTAHis · Bind樹脂混合物加入下端封閉的空色譜柱中，除去下端 封閉蓋子，收集流出液(穿過峰），保存，用于SDS-PAGE電泳分析。（4似4mLlXNi-NTA漂洗緩 沖液漂洗兩次，收集漂洗組分，用于SDS-PAGE電泳分析。（5) W0.5mLl X Ni-NTA洗涂緩沖液 洗脫目的蛋白4次，將洗脫組分分為4部分收集，并進行SDS-PAGE電泳分析各保存組分，最后 確定目的蛋白。（4)重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析:本發(fā)明中重組蛋白的電泳分析，根據(jù)其 分子量選用8%的SDS-PAGE(〉10kDa)的電泳方案。電泳凝膠的配方，電泳參數(shù)及凝膠的染 色、脫色方法均參照標準實驗方法進行。
[0233] (5)參考奧斯伯的方法(1998)測定重組蛋白的濃度：
[0234] 重組蛋白AR08濃度的測定:制作牛血清標準曲線，方程為Υ = 0.0009Χ-0.0086,方 程校正系數(shù)為0.9967,線性擬合較好。測定上清總蛋白和純化后目的蛋白的濃度，分別為 1149.2mg/L和462.3mg/L，目的蛋白占總蛋白的40.2 %。
[0235] 重組蛋白AR010濃度的測定：測定上清液總蛋白和純化后AR010蛋白的吸光度值， 根據(jù)BSA標準曲線，計算得知總蛋白和純化后AR010的濃度，分別為789.9mg/L和202.2mg/L， 目的蛋白占總蛋白的25.6%。
[0236] 重組蛋白ADH1濃度的測定：測定上清液總蛋白和純化后ADH1蛋白的吸光度值，根 據(jù)BSA標準曲線，計算得知總蛋白和純化后AD化的濃度，分別為880.1 mg/L和252.6mg/L，目 的蛋白占總蛋白的28.7%。
[0237] Ξ、鑒定了巧巾重組酶的生物活性，并分別研究重組酶的酶學性質。
[0238] (1)經(jīng)HPLC和LC-MS檢測，重組酶AR08具有芳香族轉氨酶I的正常生物活性，能夠催 化心苯丙氨酸生成苯丙酬酸。AR08的最適溫度和最適抑分別為30°C和7.0,熱穩(wěn)定性較好。 其催化活性需要Mgh的參與，F(xiàn)e3+、Fe2+和加2+抑制其活性。低濃度甲醇和DMS0等有機溶劑對 其酶活具促進作用。在30°C、pH7.0條件下，重組酶AR08作用于^phe的米氏常數(shù)Km為 6.577mM，最大反應速率Vmax為10.352μΜ/π?η;作用于草酷乙酸的米氏常數(shù)Km為15.779mM，最 大反應速率Vmax為16.863μΜ/π?η。最適條件下的酶活力為0.87皿olAmin · mL)。
[0239] (2)經(jīng)GC-FID和GC-MS檢測，重組酶AR010具有苯丙酬酸脫簇酶的正常生物活性，能 夠催化苯丙酬酸生成苯乙醒。AR010的最適溫度和最適抑分別為37°CW及6.0,熱穩(wěn)定性良 好。AR010需WThPP和Mgh作為輔助因子，Cu2+和Mn2+對酶活有促進作用，F(xiàn)e 3+等金屬離子抑制 酶活。甲醇等有機溶劑都抑制其酶活。在37°C、pH6.0條件下，重組AR010作用于苯丙酬酸的 Km為8.239mM，最大反應速率Vmax為2.994μΜ/π?η。最適條件下的酶活力為0.22μπιο 1/(min · mL)。
[0240] (3)經(jīng)冊LC和LC-MS檢測，重組醇脫氨酶AD化具有該酶的正常生物活性，能夠將苯 乙醒還原為2-苯乙醇。ADH1的最適溫度和最適抑分別為35°C和6.0,對熱敏感。Zn2+和Mgh促 進其活性，而化等金屬離子抑制其活性。有機溶劑甲醇和低濃度的乙醇也能促進酶活。在 PH6.0和35°C條件下，ADH1作用于苯乙醒的米氏常數(shù)Km為3.612mM，最大反應速率Vmax為 18.587yM/min。最適條件下的酶活力為1.75皿ol/(min · mL)。
【主權項】
1. 一種2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，是在同一反應體系內(nèi)通 過重組轉氨酶I AR08、苯丙酮酸脫羧酶AR010和醇脫氫酶ADH1組成的共催化體系催化轉化 L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸經(jīng)由苯丙酮酸、苯乙醛轉化為2-苯乙醇;其中，所述反應體系內(nèi)，是 以L-苯丙氨酸和草酰乙酸為底物，重組酶AR08、AR010和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、 1:0.5:1或1:0.25:20J/U/U)配比確定，在pH值為5.5~7.5、Mg 2+濃度為1.0~5mM的反應體系 中，水浴溫度為30~40°C條件下，反應轉化4~7min后，以等體積的乙腈終止反應，即制得2-苯乙醇。2. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述L-苯 丙氨酸和草酰乙酸的摩爾比為0.75:1。3. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述 AR08、AR010 和 ADH1 的配比為1:0 · 25:1。4. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述Mg2+ 濃度為1 · 〇~2 · 5mM;優(yōu)選為1 · 5mM。5. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述水浴 溫度為33~40°C ;反應時間為5min。6. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述pH值 為5.5~6.5;優(yōu)選所述pH值為6。7. 根據(jù)權利要求1所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，是先將所 述重組轉氨酶I AR08、苯丙酮酸脫羧酶AR010和醇脫氫酶ADH1通過共固定方法制得共催化 體系Combi-CLEAs，然后利用Combi-CLEAs對L-苯丙氨酸進行催化轉化，經(jīng)由苯丙酮酸、苯乙 醛轉化為2-苯乙醇。8. 根據(jù)權利要求7所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述反應 體系內(nèi)，pH值為5.0、Mg2+濃度為1.0~5mM，水浴溫度為40°C，反應轉化時間為5min。9. 根據(jù)權利要求7所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述共催 化體系 Combi-CLEAs的制備方法為:將AR08、AR010 和ADH1按照1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:1配 比后，經(jīng)沉淀劑硫酸銨沉淀后形成多酶聚集體，加入戊二醛對多酶聚集體進行交聯(lián)，制得多 酶共固定體系；其中，硫酸銨的飽和度為60~90 %，pH值為4~6，戊二醛的加入量按照其終 濃度為〇. 05~0.25 %確定。10. 根據(jù)權利要求9所述2-苯乙醇的非細胞合成生物學制備方法，其特征在于，所述沉 淀劑硫酸銨的飽和度70% ;沉淀劑硫酸銨的pH值為5;AR08、AR010和ADH1的酶配比為1:0.5: 1;所述戊二醛的加入量按照其終濃度為〇. 1 %確定;所述交聯(lián)的溫度為20~35°C ;所述交聯(lián) 的時間為30~150min。
【文檔編號】C12N11/18GK106011184SQ201610464256
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】林俊芳, 郭麗瓊, 劉曉蓉, 云帆
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學