一種田菁酶法制備半乳甘露低聚糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于糖生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種田菁酶法制備半乳甘露低聚糖的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 田菁是中國特有的一種耐澇、耐鹽堿、耐貧瘠一年生灌木狀草本豆科植物。在沿 海灘涂開發(fā)中，田菁是新墾鹽堿地的先鋒植物，在鹽堿地上種植田菁，可以顯著降低土壤鹽 分，耕層鹽分平均下降30-50%。但田菁的綜合利用水平較低，目前莖葉主要作為綠肥植物 或粗飼料、部分種子用于生產(chǎn)田菁膠，附加值不高，制約了農(nóng)民種植田菁的積極性。田菁種 子內(nèi)胚乳主要成分為半乳甘露聚糖，是生產(chǎn)高附加值糖工程產(chǎn)品半乳甘露低聚糖的優(yōu)質(zhì)原 料。將田菁中的半乳甘露聚糖通過生物催化技術(shù)轉(zhuǎn)化為半乳甘露低聚糖，可以大幅度提高 田菁的經(jīng)濟(jì)價值，從而激發(fā)農(nóng)民種植田菁的積極性。
[0003] 來源于田菁的半乳甘露低聚糖是由2-10個甘露糖通過0 -1，4-糖苷鍵形成直鏈、 半乳糖以a-1，6-糖苷鍵形成支鏈的一種低聚合度糖類。半乳甘露低聚糖是功能性低聚糖 的一種，它具有對雙歧桿菌等腸道有益菌高選擇性的增殖效應(yīng)，阻斷、抑制病原菌在消化道 中的定植和誘生免疫因子等功效，是一種優(yōu)良的食品和飼料添加劑。
[0004] 目前研宄較多的半乳甘露低聚糖制備方法主要是酶法，利用e -甘露聚糖酶選擇 性降解半乳甘露聚糖，獲得半乳甘露低聚糖。自然界中，絕大多數(shù)微生物在分泌甘露聚 糖酶的同時也分泌0-甘露糖苷酶。在甘露聚糖的酶法降解機(jī)理中，0-甘露聚糖酶的作 用是隨機(jī)切斷甘露聚糖分子中的0 -1，4-糖苷鍵，生成甘露低聚糖，隨后生成的甘露低聚 糖在甘露糖苷酶作用下被降解成單糖。因此，在甘露聚糖酶法降解制備甘露低聚糖反 應(yīng)體系中，甘露糖苷酶活力越低，則甘露聚糖水解生成的甘露低聚糖被甘露糖苷酶 降解的就越少，甘露低聚糖的得率越高。即用于降解甘露聚糖制備甘露低聚糖的甘露 聚糖酶必須是低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶（酶液中甘露糖苷酶活力應(yīng)盡 可能低）。低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶的制備，可通過產(chǎn)酶微生物誘變、轉(zhuǎn)基 因技術(shù)、調(diào)控發(fā)酵等手段獲得，也可通過物理拆分的方法從0 _甘露聚糖酶酶液中拆分除 去0-甘露糖苷酶組分。
[0005] 在已有的文獻(xiàn)報道中，半乳甘露低聚糖的酶法制備均是采用甘露聚糖酶水解 從植物中提取的半乳甘露聚糖的方法。即首先采用熱水抽提等方法從植物中提取半乳甘露 聚糖，然后以提取的半乳甘露聚糖為底物經(jīng)甘露聚糖酶水解制備半乳甘露低聚糖。但 半乳甘露聚糖是一種水溶性多糖，其水溶液粘度大，因此如果直接以半乳甘露聚糖為酶反 應(yīng)底物，一方面，高粘度的反應(yīng)體系影響酶反應(yīng)的傳質(zhì)和反應(yīng)效率，另一方面，高粘度的反 應(yīng)體系增加了攪拌器的動力消耗，同時，當(dāng)以半乳甘露聚糖作為酶反應(yīng)底物時，底物濃度受 到限制，只能保持在較低水平，導(dǎo)致反應(yīng)體系中產(chǎn)物濃度較低，增加了后續(xù)產(chǎn)物分離純化的 成本。例如，20g/L的半乳甘露聚糖溶液粘度高達(dá)750cps，要繼續(xù)提高半乳甘露聚糖的濃度 十分困難。因此，降低以甘露聚糖為底物的酶反應(yīng)體系的粘度是酶法降解甘露聚糖制備甘 露低聚糖研宄中需要重點突破的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種田菁酶法制備 半乳甘露低聚糖的方法，具有工藝簡單、有利于提高酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物濃度，以及降低酶 解反應(yīng)攪拌能耗等優(yōu)點。
[0007] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] -種田菁酶法制備半乳甘露低聚糖的方法，酶解底物為直接機(jī)械粉碎后的田菁種 子。
[0009] 一種田菁酶法制備半乳甘露低聚糖的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)風(fēng)干田菁種子機(jī)械粉碎至20-100目；
[0011] (2)將粉碎后的田菁種子與低e-甘露糖苷酶活力的e-甘露聚糖酶混合，加入 水，加入pH緩沖液或酸、堿，混合至固液重量比1:3-50,控制pH值4-6,反應(yīng)體系中每克半 乳甘露聚糖的甘露聚糖酶用量為10-100U，于45-55°C的條件下反應(yīng)12h以上；
[0012] (3)酶水解反應(yīng)結(jié)束后，水解物于100°C下處理lOmin使甘露聚糖酶失活；
[0013] (4)水解物固液分離，清液即為半乳甘露低聚糖溶液。
[0014] 所述的低甘露糖苷酶活力的甘露聚糖酶是通過微生物發(fā)酵制備，或從 0 _甘露聚糖酶系中通過物理方法拆分除去部分或全部0 _甘露糖苷酶組分后獲得。
[0015] 所述的0 _甘露聚糖酶是由里氏木霉（T. reesei)、黑曲霉（A. niger)等真菌或枯 草芽孢桿菌（B. subtilis)等細(xì)菌分泌的甘露聚糖酶。
[0016] 所述的低0-甘露糖苷酶活力的0-甘露聚糖酶中，0-甘露聚糖酶活力甘 露糖苷酶活力不小于1〇〇。
[0017] 本發(fā)明的方法，以富含半乳甘露聚糖的田菁種子粉碎后直接作為酶反應(yīng)的底物， 使水溶性的半乳甘露聚糖在酶反應(yīng)過程中主要以固相的方式存在于田菁種子顆粒中，避免 了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，在酶反應(yīng)過程中逐漸溶出的或存在于固 相中的半乳甘露聚糖被體系中的甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露低聚糖，從而保 證了整個反應(yīng)過程中體系的低粘度，有利于提高底物和產(chǎn)物濃度，降低酶解反應(yīng)的攪拌能 耗并簡化了工藝流程。
[0018] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出的以田菁種子粉碎后直接作為酶反應(yīng)底 物，避免了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，同時在酶反應(yīng)過程中逐漸溶出 的或存在于固相中的半乳甘露聚糖被體系中的甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露 低聚糖，從而保證了整個反應(yīng)過程中體系的低粘度。具有工藝簡單、有利于提高酶反應(yīng)的底 物和產(chǎn)物濃度，以及降低酶解反應(yīng)攪拌能耗等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0019] 圖1是含20g/L半乳甘露聚糖的田菁種子酶水解歷程結(jié)果圖；
[0020] 圖2是含60g/L半乳甘露聚糖的田菁種子酶水解歷程結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實施例是為說明而非限制本發(fā) 明。本領(lǐng)域中任何普通技術(shù)人員能夠理解這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明，可做適當(dāng) 的修改而不違背本發(fā)明的實質(zhì)和偏離本發(fā)明的范圍。
[0022] 實施例1里氏木霉合成低0 _甘露糖苷酶活力的0 _甘露聚糖酶
[0023] (1)產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成（g/L):葡萄糖1.0,微晶纖維素25.0,硫酸銨4. 72,尿素 2. 15,磷酸二氫鉀2. 0,無水氯化鈣0. 3,七水硫酸鎂0. 3,七水硫酸亞鐵0. 005,七水硫酸錳 0. 0016,七水硫酸鋅0. 0014,氯化鈷0. 002。培養(yǎng)基用0. 05mol/L的檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH 值 4. 8。
[0024] (2)產(chǎn)酶條件：向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)36h的里氏木霉種子，接種量為10%，于 溫度26-32°C、搖床轉(zhuǎn)速150-250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)4d，離心，取上清測定0 -甘露聚糖酶活力和 0 -甘露糖苷酶活力。
[0025] (3) 甘露聚糖酶活力測定：25mL刻度試管中加入0.9mL用pH 5.0的檸檬酸-磷 酸氫二鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為5. Og/L的洋槐豆膠底物溶液，50 °C預(yù)熱5min，加入 0. lmL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，于50°C下反應(yīng)30min，立即加入3. OmL DNS試劑，煮沸7min，冷卻 后定容至25mL，搖勻，在540nm下測定水解后產(chǎn)生的還原糖。以每分鐘水解底物產(chǎn)生1 y mol 還原糖（以甘露糖計）的酶量定義為1個0 _甘露聚糖酶活力單位（U)。
[0026] (4) 0 -甘露糖苷酶活力測定：
[0027] 在15mL試管中加入0. lmL適當(dāng)稀釋的酶液和0. 9mL lmmol/L的對硝基苯 酚-0-D-吡喃甘露糖苷（pNPM)溶液（預(yù)先50°C預(yù)熱5min)，于50°C下保溫lOmin，立即加 入2. OmL lmol/L的似20)3溶液終止反應(yīng)，加入10mL蒸餾水，搖勻，于400nm下測定釋放的 對硝基苯酚吸光度。以每分鐘水解PNPM釋放1 y mol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個 0 -甘露糖苷酶酶活力單位（U)。
[0028] 結(jié)果表明，里氏木霉以微晶纖維素為碳源合成甘露聚糖酶，培養(yǎng)4d，甘露 聚糖酶活力為3. 80U/mL、0 -甘露糖苷酶活力為0? 03U/mL。0 -甘露聚糖酶活力：0 -甘露 糖苷酶活力=126.7, 甘露聚糖酶活力遠(yuǎn)高于甘露糖苷酶活力，可用于半乳甘露低 聚糖的制備。
[0029] 實施例2固液重量比為1:13.02的田菁種子（含20g/L半乳甘露聚糖）酶解制備 半乳甘露低聚糖
[0030] 以下實施例中，甘露糖和半乳糖濃度采用高效液相離子交換色譜法測定。色譜條 件如下：色