一種納米纖維素載體固定化β-甘露聚糖酶制備低聚甘露糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種納米纖維素載體固定化β-甘露聚糖酶制備低聚甘露糖的方法，屬于低聚甘露糖制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]聚甘露糖是由2?10個(gè)甘露糖通過β-l，4糖苷鍵聚合而成的低聚糖，又稱甘露寡糖。它可有效促進(jìn)生物體內(nèi)以雙歧桿菌為代表的腸道益生菌群的增殖，并具有抑制體內(nèi)病原菌生長、減少有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、防止便秘、保護(hù)肝臟、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理功能，是新一代功能性食品。目前低聚甘露糖的制備通常都是利用高溫水解、酸水解或者堿水解，酶法水解雖然也有報(bào)道，但條件還不夠成熟。酶法生產(chǎn)低聚甘露糖主要受制于生產(chǎn)所用的關(guān)鍵酶的催化效率較低、酶的生產(chǎn)和使用成本較高，以及底物的粘度過大難以實(shí)現(xiàn)高濃度的生產(chǎn)等。
[0003]酶作為生物催化劑，具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、對底物具有高度的選擇性，活性可控等優(yōu)點(diǎn)。但在自由狀態(tài)的游離酶具有不穩(wěn)定性，在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及部分有機(jī)溶液中容易導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化，甚至是蛋白變性，其催化活性降低甚至完全喪失。即使在反應(yīng)最適條件下，也往往會很快失活。另外，自由酶混入反應(yīng)體系中，使得產(chǎn)品分離純化變得更加復(fù)雜，酶也因此難以重復(fù)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前傳統(tǒng)的固定化酶的載體大多采用常規(guī)薄膜、微粒或普通纖維等，存在固定量小，空間位阻大，而且酶法生產(chǎn)低聚甘露糖所用的酶催化效率較低、酶的生產(chǎn)和使用成本較高的問題，提供了一種納米纖維素載體固定化β-甘露聚糖酶制備低聚甘露糖的方法，本發(fā)明以納米纖維素材料為甘露聚糖酶載體得固定化酶，由于納米纖維素巨大的比表面積，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物頻繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用，以魔芋粉為原料，制成的固化酶為催化劑，水解得到的低聚甘露糖產(chǎn)率大、純度高，而且制備工藝簡單、成本低。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)取5?8g納米纖維素，將其浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉溶液中，攪拌混合15?20min后抽濾，將濾渣用去離子水洗滌3?5次再抽濾，將濾渣烘干，烘干后按1.5?2.5g/L加入質(zhì)量濃度10%高碘酸鈉溶液中，在40?50°C下置于搖床中避光振蕩30?40min，振蕩后過濾，得到濾渣放入質(zhì)量濃度0.2mol/L乙二醇中浸泡25?35min，洗除多余高碘酸鈉，浸泡后再將濾渣用去離子沖洗3?5次，烘干得改性納米纖維素；
(2)將pH6.5?8.0磷酸鹽緩沖液中按I?3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35?45°C水浴下攪拌至固體溶解，將溶液用超聲波在400?500W進(jìn)行破碎，破碎8?1s后隔3?5s再破碎，15?20min后得到破碎液放入冰箱中冷卻至4°C，取出立即加入分離機(jī)中，在5000?6000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離15?20min，收集上清液，得到甘露聚糖酶酶液；
(3)將步驟(I)得到的改性納米纖維素按0.1?0.3g/L加入到上述β-甘露聚糖酶酶液，溫度控制在4°C在恒溫?fù)u床中以200?300r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行振蕩I?2h，振蕩后放入冰箱中靜置固化10?12h，固化完全后過濾，將濾渣分別用pH6.5?8.0磷酸鹽緩沖溶液和去離子水沖洗I?3次，沖洗后冷凍干燥就可得到納米纖維素載體固化β-甘露聚糖酶；
(4)按質(zhì)量比3:5稱取50?80g魔芋粉加入到質(zhì)量濃度為85?90%的乙醇溶液中，在55?65°C水浴中進(jìn)行攪拌混合15?20min，得魔芋濁液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.0?5.0，調(diào)節(jié)后加入總質(zhì)量0.5?0.8%納米纖維素載體固化β-甘露聚糖酶，在55?65°C水浴下進(jìn)行攪拌反應(yīng)4?6h，反應(yīng)結(jié)束后把濾渣用水洗滌，得濾液和魔芋濁液合并，用質(zhì)量濃度15%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)濾液pH為7.5?8.5，調(diào)節(jié)后將濾液在50?60°C下真空濃縮至過飽和糖漿；
(5)向上述過飽和糖漿中加入0.1?0.3mg甘露糖晶體，室溫靜置20?22h，待有晶體析出時(shí)，在90?95°C的水浴下緩慢加入5?8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)無水乙醇溶液，有大量晶體析出，室溫靜置20?22h后抽濾，將得到的晶體干燥至恒重，即為低聚甘露糖。
[0006]本發(fā)明的應(yīng)用方法:本發(fā)明制得的低聚甘露糖可以應(yīng)用于食品中，例如替代飲料中白砂糖的30?60%，具有低熱值、低甜度、不引發(fā)齲齒、不增加血糖濃度效果；添加在奶油食品中，可將原來白砂糖的10?15%更換為低聚甘露糖，可提高產(chǎn)品的乳化性，而且食用起來避免油膩口感;將低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增強(qiáng)免疫力，抗病防病，改善腸道健康狀況的功能。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明以納米纖維素巨大的比表面積，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物頻繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用；
(2)本發(fā)明制成的固化酶為催化劑，水解得到的低聚甘露糖產(chǎn)率大、純度高，而且制備工藝簡單、成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0008]取5?8g納米纖維素，將其浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉溶液中，攪拌混合15?20min后抽濾，將濾渣用去離子水洗滌3?5次再抽濾，將濾渣烘干，烘干后按1.5?2.5g/L加入質(zhì)量濃度10%高碘酸鈉溶液中，在40?50°C下置于搖床中避光振蕩30?40min，振蕩后過濾，得到濾渣放入質(zhì)量濃度0.2mol/L乙二醇中浸泡25?35min，洗除多余高碘酸鈉，浸泡后再將濾渣用去離子沖洗3?5次，烘干得改性納米纖維素;將pH6.5?8.0磷酸鹽緩沖液中按I?3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35?45°C水浴下攪拌至固體溶解，將溶液用超聲波在400?500W進(jìn)行破碎，破碎8?1s后隔3?5s再破碎，15?20min后得到破碎液放入冰箱中冷卻至4°C，取出立即加入分離機(jī)中，在5000?6000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離15?20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液;將得到的改性納米纖維素按0.1?0.3g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，溫度控制在4°C在恒溫?fù)u床中以200?300r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行振蕩I?2h，振蕩后放入冰箱中靜置固化10?12h，固化完全后過濾，將濾渣分別用pH6.5?8.0磷酸鹽緩沖溶液和去離子水沖洗I?3次，沖洗后冷凍干燥就可得到納米纖維素載體固化β-甘露聚糖酶;按質(zhì)量比3:5稱取50?80g魔芋粉加入到質(zhì)量濃度為85?90%的乙醇溶液中，在55?65°C水浴中進(jìn)行攪拌混合15?20min，得魔芋濁液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.0?5.0，調(diào)節(jié)后加入總質(zhì)量0.5?0.8%納米纖維素載體固化甘露聚糖酶，在55?65°C水浴下進(jìn)行攪拌反應(yīng)4?6h，反應(yīng)結(jié)束后把濾渣用水洗滌，得濾液和魔芋濁液合并，用質(zhì)量濃度15%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)濾液pH為7.5?8.5，調(diào)節(jié)后將濾液在50?60°C下真空濃縮至過飽和糖漿；向過飽和糖漿中加入0.1?0.3mg甘露糖晶體，室溫靜置20?22h，待有晶體析出時(shí)，在90?95°C的水浴下緩慢加入5?8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)無水乙醇溶液，有大量晶體析出，室溫靜置20?22h后抽濾，將得到的晶體干燥至恒重，即為低聚甘露糖。
[0009]實(shí)例I
取5g納米纖維素，將其浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氫氧化鈉溶液中，攪拌混合15min后抽濾，將濾渣用去離子水洗滌3次再抽濾，將濾渣烘干，烘干后按1.5g/L加入質(zhì)量濃度10%高碘酸鈉溶液中，在40°C下置于搖床中避光振蕩30min，振蕩后過濾，得到濾渣放入質(zhì)量濃度0.2mol/L乙二醇中浸泡25min，洗除多余高碘酸鈉，浸泡后再將濾渣用去離子沖洗3次，烘干得改性納米纖維素;將pH6.5磷酸鹽緩沖液中按lmg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35°C水浴下攪拌至固體溶解，將溶液用超聲波在400W進(jìn)行破碎，破碎8s后隔3s再破碎，15min后得到破碎液放入冰箱中冷卻至4°C，取出立即加入分離機(jī)中，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離15min，收集上清液，得到甘露聚糖酶酶液;將得到的改性納米纖維素按0.lg/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，溫度控制在4°C在恒溫?fù)u床中以200r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行振蕩lh，振蕩后放入冰箱中靜置固化10h，固化完全后過濾，將濾渣分別用pH6.5磷酸鹽緩沖溶液和去離子水沖洗I次，沖洗后冷凍干燥就可得到納米纖維素載體固化β-甘露聚糖酶;按質(zhì)量比3:5稱取50g魔芋粉加入到質(zhì)量濃度為85%的乙醇溶液中，在55°C水浴中進(jìn)行攪拌混合15min，得魔芋濁液，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH為4.0，調(diào)節(jié)后加入總質(zhì)量0.5%納米