一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用途。所述鷹嘴豆蛋白粉的含量大于90wt％；鷹嘴豆低聚肽粉的肽含量不低于80wt％，其中85％以上肽分子量小于1500Dalton。所述方法包括將帶皮的鷹嘴豆粉碎并與有機溶劑混合處理；堿提酸沉法提取蛋白質；分離純化等步驟。所述蛋白粉和低聚肽粉可用于治療或預防自由基過多引起的癥狀。本發(fā)明的制備方操作簡便，高收率低成本，產品質量穩(wěn)定，工藝綠色環(huán)保，適合大規(guī)模生產。
【專利說明】
一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明提供種高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制備工藝，屬于生物工程 植物蛋白深加工領域。
【背景技術】
[0002] 鷹嘴豆（Cicer arietinum L)，為蝶形花科草本植物，別名桃爾豆、雞豆、雞心豆 等，是印度和巴基斯坦的重要的蔬菜之一，在歐洲食用鷹嘴豆也十分普遍，也是維吾爾醫(yī)常 用藥材。維吾爾族用它治療支氣管炎、黏膜炎、霍亂、便秘痢疾、消化不良、腸胃氣脹、毒蛇咬 傷、糖尿病、性欲降低、皮膚瘙癢、高脂血癥、中暑等疾病。在中醫(yī)上，鷹嘴豆可以調節(jié)濕度， 有止瀉、解毒、壯身等作用。鷹嘴豆所含的營養(yǎng)成分非常豐富，無論是從種類，還是數量上， 都大大超過其他豆類。它含有18以上的氨基酸(含人體必須但自身不能合成的全部8種氨基 酸），多種營養(yǎng)元素和微量元素，如:鈣、羅、鋅、鎂、磷等。特別是每百克鷹嘴豆所含的鈣高達 350毫克，磷320毫克，高于大部分豆類，鐵的含量達47毫克，比其它豆類高出90%，維生素 C、 B1、B2含量高達12毫克，膳食纖維含量更高于其它。據報道，鷹嘴豆含有豐富的蛋白質，高達 20%，其中球蛋白和清蛋白分別占總蛋白的42.16%和39.76%。球蛋白和清蛋白是人體非 常重要的營養(yǎng)物質，可以起到提升免疫力的作用。
[0003] 鷹嘴豆蛋白因其氨基酸組成均衡、生物利用率高和抗營養(yǎng)因子低而被作為植物蛋 白的重要來源。目前對于鷹嘴豆蛋白的分離純化、營養(yǎng)價值、功能性質以及其被水解后制成 具有抑制血管緊縮素-I轉移酶(ACE)、抗氧化、抗腫瘤以及抗過敏活力的鷹嘴豆肽方面均有 報道。張濤等人將鷹嘴豆粉碎去皮并使用石油醚脫脂制備得到純度為90%以上的鷹嘴豆蛋 白，石油醚的使用在工業(yè)大規(guī)模生產中不易實現，殘留在產品中的石油醚影響人體健康;我 們實驗中發(fā)現使用冷榨或者熱榨方法將去皮后的鷹嘴豆脫脂后，再使用堿提酸沉法制備蛋 白質的純度(60%左右)很不理想。專利CN 104789629A公開了將鷹嘴豆浸泡去皮烘干粉碎， 使用堿提酸沉法獲得蛋白質，再使用兩步酶解獲得的蛋白酶解液，最后經兩次陶瓷膜純化 獲得低聚肽粉，獲得的蛋白質和低聚肽的最高含量均不超過80%;將鷹嘴豆浸泡后種皮由 于非常堅韌很難去除，因此在大型生產中去皮也很難實現；由于陶瓷膜膜表面積較小，造成 純化時膜通量下降較快，延長了膜純化時間，增加了生產成本。專利CN 104761617A中發(fā)明 人使用C18反相柱層析制備鷹嘴豆多肽，反相柱層析的成本高，在實際生產中不易實現。專 利CN 103525891B中將鷹嘴豆蛋白酶解液滅活離心后未將酶解液中的雜質徹底清除，直接 使用6kDa和2kDa的超濾膜進行純化，這樣容易造成超濾膜阻塞引起膜效率下降，同時發(fā)明 人沒有測定肽的分子量和純度。專利CN 103168913B和CN 103194517B使用多種復合酶多步 酶解獲得鷹嘴豆多肽，未進行純化步驟，可見制備的只是粗肽。專利CN 103172706B和CN 102391361B公開了鷹嘴豆多肽的制備方法，工藝包括脫脂、蛋白酶水解、凝膠層析分離，凝 膠層析色譜的使用由于高成本，不能用于大規(guī)模生產。專利CN 102028036A將鷹嘴豆自然發(fā) 酵，再進行酶解獲得多肽，自然發(fā)酵容易造成其它菌種的影響，不夠穩(wěn)定。專利CN 101962399A和CN101602799A公開的蛋白和多肽的制備工藝均用磷酸鹽緩沖液提取、硫酸銨 沉淀，但存在蛋白利用率低、制備多肽的效率偏低的缺點。綜上所述，以上專利大多存在原 料利用率低，工藝復雜，難以應用于大規(guī)模生產的缺點。
[0004] 為解決上述技術問題，本專利提供了適合大規(guī)模生產的高純度鷹嘴豆蛋白粉的制 備工藝，同時也提供了獲得比原蛋白在營養(yǎng)、功能性及生物活性上更加優(yōu)良、純度較高的鷹 嘴豆低聚肽粉的制備方法。本專利彌補了高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉在制備工藝上 的欠缺。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制備工藝，將鷹嘴豆 粉碎后，使用特殊技術獲得高純度鷹嘴豆蛋白粉，并且通過一定工藝酶解后，獲得純度較高 的低聚肽粉。該生產方法是經過長期的生產實踐和科學研究而總結出來的，該工藝的特點 在于工藝簡單、經濟、綠色環(huán)保，尤其適用于大規(guī)模生產。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一種鷹嘴豆低聚肽粉，其采用GB/T22492-2008附錄B中 的多肽測定法和GB/T 22492-2008附錄A中的肽相對分子質量分布的測定法，肽含量不低于 80wt%，其中85%以上肽分子量小于1500Da 1 ton，其分子量分布如下所示：
[0007] 分子量Dalton分布
[0009]本發(fā)明的目的在于提供所述鷹嘴豆低聚肽粉的制備方法，包括下述步驟:將帶皮 的鷹嘴豆粉碎并與有機溶劑混合處理;使用堿提酸沉法得到蛋白沉淀物;蛋白沉淀物酶解； 分離純化得到低聚肽粉;優(yōu)選地，所述的堿提酸沉法可以為逆流提取法或者普通提取法。 [0010] 優(yōu)選地，包括下述步驟：
[0011] (1)將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機 溶劑按質量比為1:3~1:10混合，室溫攪拌20~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理 1~2次，最后離心過濾后得到豆渣；
[0012] (2)將步驟（1)中的豆渣與其質量比為1:5~1:20的純化水混合，調節(jié)pH至8~10， 室溫提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液；
[0013] (3)調節(jié)（2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉 淀物1~2次，得到蛋白沉淀物；
[0014] (4)將步驟(3)中的蛋白沉淀物中加入體積比為1:5~1:15的純化水，攪拌均勻復 溶，將蛋白復溶液加熱至40~55 °C，加入鷹嘴豆粉質量的Ο . 1~1 %蛋白酶，攪拌酶解4~6h 后，煮沸滅活10~30min，離心，上清液即為蛋白酶解液；
[0015] (5)將步驟(4)中的蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5μπι的微濾膜進行過濾，透過液 再經2000~20000Dalton超濾膜處理后，將超濾膜透過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆 低聚肽粉，所述微濾膜和超濾膜均為卷式膜。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明將鷹嘴豆粉碎、過篩，使用堿提酸沉法提取蛋白質，離心過濾，得到 蛋白沉淀物;將蛋白沉淀物加水復溶、酶解，依次經過微濾膜與超濾膜高效分離純化、濃縮， 最后將蛋白復溶液和酶解濃縮液干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉和乳白色鷹嘴豆低聚肽粉。 鷹嘴豆蛋白的收率不少于8%，含量大于90wt% ;鷹嘴豆低聚肽粉的收率在5~7%，肽含量 不低于80wt%，其中85%以上肽分子量小于1500Dalton。
[0017] 優(yōu)選地，所述的濃縮方法可以為膜濃縮、減壓濃縮或常壓濃縮;所述的干燥方法可 以為噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥或冷凍干燥。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種鷹嘴豆蛋白粉，其是通過下述方法制備得到：
[0019] (1)將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機 溶劑按質量比為1:3~1:10混合，室溫攪拌20~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理 1~2次，最后離心過濾后得到豆渣；
[0020] (2)將步驟（1)中的豆渣與其質量比為1:5~1:20的純化水混合，調節(jié)pH至8~10， 室溫提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液；
[0021] (3)調節(jié)(2)中濾液的pH為3~5,離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉 淀物1~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。
[0022] 優(yōu)選地，得到高純度白色鷹嘴豆蛋白粉，產率可達8%以上，含量為90wt %以上； [0023]優(yōu)選地，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產率可達5~7 %，并測得肽含量在80wt %以 上，90 %以上分子量分布在1500Dalton以下，其分子量分布如下所不：
[0024] 分子量Dalton分布
[0026]所述步驟（1)中的有機溶劑可以為醇類、脂類、醚類、烷烴類的一種或者它們的混 合物，優(yōu)選地使用乙醇溶液。
[0027]所述乙醇溶液配制使用的乙醇為食品級乙醇，乙醇溶液體積濃度為50%以上，優(yōu) 選地使用體積濃度為90 %以上的乙醇溶液。
[0028]優(yōu)選地，所述蛋白酶選自食品級的中性蛋白酶（酶活力多20萬u/g)、木瓜蛋白酶 (酶活力多40萬u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力多30萬u/g)、堿性蛋白酶(酶活力多20萬u/g)、胃 蛋白酶(酶活力多50萬u/g)、胰酶(酶活力多3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地 使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者它們的混合物。
[0029]所述的蛋白粉的檢測方法為國家標準GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法。
[0030]所述的多肽含量檢測方法為國家標準GB/T 22492-2008附錄B中的多肽測定法。 [0031]所述的多肽相對分子量分布的檢測方法為國家標準GB/T22492-2008附錄A中的肽 相對分子質量分布的測定法。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其含有本發(fā)明所述的鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉， 藥物或食品上可接受的助劑。
[0033] 所述的組合物的劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒 劑、口服溶液或口服混懸液。
[0034] 所述的鷹嘴豆低聚粉可用于制備治療或預防自由基過多引起的癥狀的藥物、食品 或保健品的應用。
[0035]所述的鷹嘴豆低聚肽粉的抗氧化活性使用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除 法、超氧陰離子自由基清除法(SRSA)以及Fe3+還原能力法(FRAP)四種方法得以驗證，測試 結果表明鷹嘴豆低聚肽粉具有較好的抗氧化活性。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0037] 1、鷹嘴豆浸泡后種皮由于非常堅韌很難去除，難以進行工業(yè)化生產。本發(fā)明所述 制備方法中，將粉碎的鷹嘴豆與有機溶劑混合處理，使得鷹嘴豆不需提起去皮，適合于工業(yè) 化生產。
[0038] 2、現有技術中的方法一般需要經過多次酶解，且生產一個產品需要3種以上的酶 才能實現，由于生產前需要對酶活力逐一測定，因此增加了成本。本發(fā)明的制備工藝中僅使 用一種酶，通過一次酶解即可完成;另外，本發(fā)明也沒有使用現有技術中經常使用的凝膠色 譜柱，降低了成本，有利于工業(yè)化生產。
[0039] 3、現有技術進行純化時，一般采用的膜材質為陶瓷管式膜，比表面積小，單位時間 內膜的流速下降快，造成過膜時間長，生產成本高。本發(fā)明所述方法使用了卷式膜，膜面積 大，單位時間內流速下降比管式膜慢很多，從而節(jié)約了過膜時間，降低了成本。
[0040] 4、本發(fā)明的方法同時制備得到了蛋白粉和低聚肽粉，肽含量在80wt%以上，與現 有技術中的肽粉相比具有更強的自由基清楚能力。
[0041] 5、本發(fā)明所得低聚肽粉未經活性碳脫色，即可直接得到乳白色肽粉。
【附圖說明】
[0042] 圖1:中性蛋白酶制得肽粉液相色譜圖；
[0043] 圖2:木瓜蛋白酶制得肽粉液相色譜圖。 實施例
[0044] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。應該理解的是，本發(fā)明實施例所述方法 僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構思前提下對本發(fā)明制備方 法的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例中用到的所有原料和溶劑均購自 Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents 公司。
[0045] 實施例1:
[0046] 將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質量比為1:3混合，室溫攪拌30min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質量比為1:8的純化水混合，調節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;沉淀物經冷凍干燥后，得到白色鷹嘴豆蛋白 粉，產率為8.4%，含量為91.6wt%。
[0047] 實施例2:
[0048]將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為90%乙醇溶液按質量比為1:5混合，室溫攪拌30min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質量比為1:10的純化水混合，調節(jié)pH至9,室 溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調節(jié)濾液的pH為3.5,離心棄去上清 液，再使用pH為3.5純化水清洗蛋白沉淀物兩遍;沉淀物經冷凍干燥后，得到白色鷹嘴豆蛋 白粉，產率為8.2%，含量為92.7wt%。
[0049] 實施例3:
[0050]將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質量比為1:3混合，室溫攪拌30min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質量比為1:8的純化水混合，調節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;在清洗后的蛋白沉淀物中加入體積比為1: 5 的純化水，攪拌均勻復溶，將蛋白復溶液加熱至45°C，加入鷹嘴豆粉質量的0.2 %中性蛋白 酶(酶活力為40萬u/g)，攪拌酶解4h后，煮沸滅活10min，離心，上清液即為蛋白酶解液;將蛋 白酶解液使用孔徑為〇. 5μπι的微濾膜進行過濾，透過液再經5000Dalton超濾膜處理后，其透 過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產率可達6.3%，并測得肽含量為81.4%， 至少97.33%以上分布在1500Dalton分子量以下，如表1所示。
[0051]表1中性蛋白酶所制備得鷹嘴豆肽粉的分子量分布
[0053] 實施例4:
[0054] 將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質量比為1:3混合，室溫攪拌30min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質量比為1:8的純化水混合，調節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;在清洗后的蛋白沉淀物中加入體積比為1: 5 的純化水，攪拌均勻復溶，將蛋白復溶液加熱至50°C，加入鷹嘴豆粉質量的0.5%木瓜蛋白 酶(酶活力為50萬u/g)，攪拌酶解6h后，煮沸滅活lOmin，離心，上清液即為蛋白酶解液;將蛋 白酶解液使用孔徑為〇. 5μπι的微濾膜進行過濾，透過液再經5000Dalton超濾膜處理后，其透 過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產率可達5.2%，并測得肽含量為83.0%， 至少89.57%以上分布在1500Dalton分子量以下，如表2所示。
[0055] 表2木瓜蛋白酶所制備得鷹嘴豆肽粉的分子量分布
[0058] 對比實施例（專利CN104789629A所提供的方法）：
[0059] 將鷹嘴豆用溫水浸泡16小時，去皮，37°C烘干20h，打碎成粉狀，過60目篩，得到鷹 嘴豆粉，將lkg鷹嘴豆粉與10L水混合均勻，30°C保溫攪拌30min，用10 %氫氧化鈉溶液調pH 為10，離心收集上清液;調節(jié)所述上清液用1:1的鹽酸將pH調至4，30 °C攪拌30min，離心收集 沉淀，攪拌、離心，將沉淀與水按質量比為1:4混合后，再次在30°C攪拌30min，離心，收集沉 淀，得到鷹嘴豆蛋白沉淀物;將鷹嘴豆蛋白按質量體積比為1:10,加水2L攪拌均勻，用10% 氫氧化鈉調pH值為10，加入堿性蛋白酶進行第一次酶解，堿性蛋白酶的用量為200u/g，酶解 時間為60min，得到第一酶解液;調節(jié)所述第一酶解液的pH為7,加入中性蛋白酶和風味蛋白 酶復合酶進行第二次酶解，中性蛋白酶用量為200u/g，風味蛋白酶用量為100u/g，酶解時間 為300min;將酶解液溫度升至95°C，維持15min，然后冷卻至室溫，離心分離，收取上清液，制 得酶解液;酶解液經5000rpm轉速進行離心，將上清液用500nm陶瓷膜進行粗濾，收集透過 液，再用50nm陶瓷膜進行精濾，透過液濃縮后，加入3g活性炭，脫色30min，過濾除去活性炭， 最后經噴霧干燥制成肽粉，產率為4.6%，并測得肽含量為74.3%。通過本對比實驗可知，鷹 嘴豆經浸泡后，豆皮堅韌很難去除，使用此方法進行大規(guī)模生產較難實現;酶解時至少需要 3種蛋白酶，酶活力需逐一測定，因而大規(guī)模生產時增加了成本;陶瓷膜為管式膜，比表面積 小，單位時間內膜的流速下降快，造成過膜時間長，因而大規(guī)模生產時成本高;使用活性炭 脫色時，活性炭會吸附一部分肽，造成產率不高;此方法的產品的低聚肽含量較低，仍有提 尚的空間。
[0060] 生物活性實施例1:
[0061 ] FRAP Fe3+還原能力測定實驗
[0062] l、FeCl3溶液（20mmol/L):準確稱取FeCl3 · 6H20固體108mg于20mL的棕色容量瓶 中，加15mL蒸餾水超聲溶解后，蒸餾水定容。
[0063] 2、三吡啶三吖嗪（TPTZ，10mmol/L):準確稱取三吡啶三吖嗪固體62.47mg于20mL的 棕色容量瓶中，加40mmol/L的HC1 15mL超聲溶解后，用40mmol/L的HC1定容。
[0064] 3、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.3mol/L):準確稱取無水乙酸鈉24.6g于1000mL的容量 瓶中，加蒸餾水700mL超聲溶解后，加入冰乙酸80mL，震蕩混勻后，蒸餾水定容。
[0065] 4、FRAP工作液:0.3mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液、10mmol/L的三吡啶三吖嗪溶液和 20mmol/L的FeC13溶液以10:1:1的比例混合即得。
[0066] 5、供試品溶液的配制:精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加 入15mL蒸餾水，超聲溶解后，用蒸餾水定容，搖勻，即得。
[0067] 6、FeS〇4標準曲線的繪制：精密稱取FeS〇4 · 7H20 27.8mg于50mL棕色容量瓶中，加 30mL蒸餾水，超聲5min，蒸餾水定容，搖勻，即得2mmol/L的FeS04溶液。精密移取0.5mL、2mL、 41111^、6111]^、81111^于1〇1111^掠色容量瓶中，蒸饋水定容，得11]11]1〇1/]^、4_〇1/]^、8_〇1/]^、121]11]1〇1/1^和 16mmol/L的FeS〇4溶液。分別準確吸取200yL上述FeS04溶液至25mL比色管中，加入6mL FRAP 工作液，600yL的蒸餾水，混勻，37 °C水浴中反應10min，于593nm處測定其吸光度并繪制標準 曲線。
[0068] 7、樣品的測定:精密移取供試品溶液200yL于25mL比色管中，加入600yLFRAP工作 液，600yL蒸餾水，混勾后，37 °C水浴中反應10min，于593nm處測定其吸光度。根據標準曲線 計算其還原能力，測定結果如表3所示：
[0069]表3鷹嘴豆低聚粉還原能力的測定結果
[0071]由表3可知，兩種酶制備所得的鷹嘴豆低聚肽粉均具有較強的還原能力，中性蛋白 酶酶解產品活性略高。
[0072] 生物活性實施例2:
[0073] 1、DPPH自由基清除實驗
[0074] 1. 1DPPH乙醇溶液的配制：精密稱取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL 乙醇，超聲30s，用乙醇定容至刻度，搖勾，待用。本品須現配現用。
[0075] 1.2供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于50mL棕色容量瓶中， 加入30mL乙醇，超聲5min，用乙醇定容至刻度，搖勾，即得。
[0076] 1.3操作步驟:準確吸取2mL供試品溶液和2mL DPPH溶液混合均勻;準確吸取2mL供 試品溶液和2mL乙醇混合均勻;準確吸取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均勻，室溫放置30min， 在515nm波長處測定吸光度，并根據以下計算公式計算自由基清除率：
[0077] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0078] 其中，Ai表示待測溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
[0079] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0080] A0表示DPPH和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0081] 2、SRSA超氧陰離子自由基清除實驗
[0082] 2.10.1 moL/L PBS緩沖液(pH7.4)的配制：稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸二氫鉀 2.4g，三水合磷酸氫二鉀23. lg，置于1000mL燒杯中，加入600mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽 酸或氫氧化鈉調節(jié)pH至7.2，轉移至1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。 [0083] 2.2150ymoL/L NBT溶液的配制：準確稱取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加 入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0084] 2.360ymoL/L PMS溶液的配制：準確稱取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加 入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0085] 2.4468ymoL/L NADH溶液的配制：準確稱取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中， 加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0086] 2.5供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中， 加入15mL PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0087] 2.6工作液的配制:取lmL 0.1moL/L PBS緩沖液(ρΗ7·4)于容量瓶中，加入lmL 150 ymoL/L NBT溶液，加入2mL 468ymoL/L NADH溶液，加入lmL 60ymoL/L PMS溶液，攪拌均勻， 25°C下反應5min，與560nm波長處測定其吸光度值。
[0088] 2.7操作步驟:準確吸取0.5mL供試品溶液和5mL上述工作溶液混合均勻;準確吸取 0.5mL供試品溶液和5mL蒸餾水混合均勻;準確吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸餾水混合均 勻，立即在560nm處測定吸光度，并根據以下公式計算自由基清除率：
[0089] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0090] 其中，Ai表示待測溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
[0091 ] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0092] A0表示SRSA和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0093] 3、ABTS+自由基清除實驗
[0094] 3.1PBS緩沖液的配制:稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，十二水合磷 酸氫二鈉3.62g，置于lOOOmL燒杯中，加入800mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉 調節(jié)pH至7.4，轉移至lOOOmL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。
[0095] 3.2ABTS+貯存溶液的配制：精密稱取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入 15mL蒸餾水，超聲5min，用蒸餾水定容至刻度，搖勾。精密稱取過硫酸鉀76mg左右，置于2mL 棕色容量瓶中，加入lmL蒸餾水，超聲使其溶解，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確吸取352yL 過硫酸鉀溶液加入至ABTS溶液中，搖勻，靜置過夜。
[0096] 3.3ABTS+工作溶液的配制：精確吸取貯存溶液lmL，加入65mL左右PBS緩沖液，搖 勻。
[0097] 3.4供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中， 加入15mL PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0098] 3.5操作步驟:準確吸取0.5mL供試品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均勻；準確吸 取0.5mL供試品溶液和5mL PBS緩沖液混合均勻；準確吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS 緩沖液混合均勻，立即在734nm處測定吸光度，并根據以下公式計算自由基清除率：
[0099] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0100] 其中，Ai表示待測溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
[0101 ] A j表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0102] A0表示ABTS和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0103] 分別配制不同濃度的中性蛋白酶解產品和木瓜蛋白酶酶解產品、對比實施例酶解 產品進行DPPH、SRSA以及ABTS+自由基清除實驗，并測定其IC 5Q值，結果如表4所示：
[0104] 表4鷹嘴豆低聚粉自由基清除實驗結果
[0106]由表4可知，兩種酶制備所得的鷹嘴豆低聚肽粉均有較好的自由基清除活性。在 DPPH自由基清除實驗中，中性蛋白酶酶解產品自由基清除能力明顯強于木瓜蛋白酶酶解產 品，而SRSA超氧陰離子實驗中，木瓜蛋白酶酶解產品超氧陰離子清除效果顯著高于中性蛋 白酶酶解產品。兩種酶解產品對ABTS自由基清除能力相當?？梢娒附鈺r酶的種類影響產品 低聚肽的生物活性。此外生物活性結果顯示對比實施例的酶解產品比本發(fā)明所述方法制備 所得的酶解產品活性弱，可見產品中肽的含量影響其生物活性。
【主權項】
1. 一種鷹嘴豆低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附錄B中的多肽測定法和 GB/T 22492-2008附錄A中的肽相對分子質量分布的測定法，肽含量不低于80wt%，其中 85%以上肽分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下所不： 分子量Dal ton分布數均分子量范圍：13~2050 重均分子量范圍：13~2260。2. 權利要求1所述鷹嘴豆低聚肽粉的制備方法，其特征在于包括下述步驟:將帶皮的鷹 嘴豆粉碎并與有機溶劑混合處理;使用堿提酸沉法得到蛋白沉淀物;蛋白沉淀物酶解;所述 的堿提酸沉法可以為連續(xù)逆流提取法或者普通提取法。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機溶劑 按質量比為1:3~1:10混合，室溫攪拌20~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質量比為1:5~1: 20的純化水混合，調節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3) 調節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物； (4) 將步驟(3)中的蛋白沉淀物中加入體積比為1:5~1:15的純化水，攪拌均勻復溶，將 蛋白復溶液加熱至40~55°C，加入鷹嘴豆粉質量的0.1~1 %蛋白酶，攪拌酶解4~6h后，煮 沸滅活10~30min，離心，上清液即為蛋白酶解液； (5) 將步驟(4)中的蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5μπι的微濾膜進行過濾，再經2000~ 20000Dalton超濾膜處理后，將超濾膜透過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，所 述微濾膜和超濾膜均為卷式膜。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的濃縮方法選自膜濃縮、減壓濃 縮或常壓濃縮;所述的干燥方法選自噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥或冷凍干燥。5. -種鷹嘴豆蛋白粉，其特征在于是通過下述方法制備得到： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機溶劑 按質量比為1:3~1:10混合，室溫攪拌20~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質量比為1:5~1: 20的純化水混合，調節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3)調節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。6. 權利要求5所述鷹嘴豆蛋白粉的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機溶劑 按質量比為1:3~1:10混合，室溫攪拌20~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質量比為1:5~1: 20的純化水混合，調節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3) 調節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。7. 根據權利要求3或6所述的制備方法，其特征在于:所述的酶解使用的蛋白酶選自食 品·級的中性蛋白酶(酶活力多20萬u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力多40萬u/g)、菠蘿蛋白酶(酶 活力彡30萬u/g)、堿性蛋白酶(酶活力彡20萬u/g)、胃蛋白酶(酶活力彡50萬u/g)、胰酶(酶 活力多3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一 種或者它們的混合物。8. 根據權利要求3或6所述的制備方法，其特征在于:所述的有機溶劑選自醇類、脂類、 醚類、烷烴類的一種或者它們的混合物，優(yōu)選乙醇溶液;所述乙醇溶液配制使用的乙醇為食 品級乙醇，乙醇溶液體積濃度為50%以上，優(yōu)選體積濃度為90%以上的乙醇溶液。9. 一種組合物，其特征在于:含有權利要求1所述的鷹嘴豆低聚肽粉或含有權利要求5 所述的鷹嘴豆蛋白粉，以及藥物或食品上可接受的助劑。10. 根據權利要求8所述的組合物，其特征在于:其劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、 腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。11. 權利要求1所述的鷹嘴豆低聚肽粉可以用于制備治療或預防自由基過多引起的癥 狀的藥物、食品或保健品的用途。
【文檔編號】A23L33/18GK105949290SQ201610369735
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】王昭日, 楊勝杰, 劉明川, 劉敏, 楊進平, 洪達, 金志強
【申請人】杏輝天力（杭州）藥業(yè)有限公司