一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明中將熒光基團7?(N,N?二乙基氨基)香豆素?3?羧酸琥珀酰亞胺酯通過能夠被基質(zhì)金屬蛋白酶II(MMP?2)切割的多肽鏈連接淬滅基團4?[4?(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N?丁二酰亞胺酯，構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。以人肝癌7402細胞和人正常肝細胞LO?2為研究對象，通過細胞成像實驗檢測7402和LO?2細胞的MMP?2表達水平。體外實驗(MMP?2,MMP?1及其他物種對探針的熒光響應(yīng))顯示了探針對MMP?2的靶向性，細胞成像結(jié)果顯示人肝癌細胞7402細胞的MMP?2表達水平高于人正常肝細胞LO?2。
【專利說明】
一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及肝癌細胞檢測技術(shù)，具體涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針及其制備方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌的發(fā)病率在全球惡性腫瘤中占第5位，死亡率居第三位，在我國是最常見的惡 性腫瘤之一。肝癌起病隱匿、發(fā)展速度快，死亡率較高，嚴重威脅人們的生命健康。手術(shù)切除 治療是目前最為有效的治療方式，但是大部分患者在確診時已是晚期，從而失去了手術(shù)治 療的機會。目前肝癌的主要篩查方法有甲胎蛋白AFP和實時超聲檢查，但是漏診率高且價格 昂貴。肝癌的早期診斷能夠很大程度上提高患者的5年生存率。因此，發(fā)展靈敏度高、特異性 強的早期診斷方法以及開發(fā)價格更為低廉、檢測更加方便的熒光探針已經(jīng)成為目前癌癥研 究的熱點，這對癌癥的早期診斷和預(yù)后有著重要的意義。本發(fā)明中將熒光基團7-(N，N_二乙 基氨基）香豆素-3-羧酸琥?自酰亞胺酯（Coumarin-Osu)通過能夠被MMP-2切割的多肽鏈 (GPLGVRGKGG)連接淬滅基團4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亞胺酯(Dabcyl-〇su)，構(gòu)建焚光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)探針。通 過細胞成像實驗進行肝癌的檢測，將有望用于肝癌的篩查、診斷和預(yù)后判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針及其制備方法和 應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:制備熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針的制備方法，熒光基團7-(N，N_ 二乙基氨基）香豆素-3-羧酸酯連接淬滅基團4-[4_(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰 亞胺酯，構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。具體合成路線如下：
[0006] 本發(fā)明的進一步改進包括：
[0007] 所述熒光基團7-(N，N_二乙基氨基)香豆素-3-羧酸酯通過能夠被MMP2切割的多肽 鏈連接淬滅基團4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亞胺酯。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供按照上述方法制得的探針。
[0009] 所述的探針，探針中甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴 氨酸_(甘氨酸-甘氨酸）多肽鏈可被聚乙二醇等官能團修飾，是以MMP-2為靶向的FRET熒光 探針。
[0010] 本發(fā)明進一步提供了上述的探針在制備檢測肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明進一步提供了上述的探針在制備檢測肝癌試劑中的應(yīng)用。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明證明了以MMP-2為靶向的FRET熒光探針能夠?qū)θ苏８渭毎鸏0- 2和人肝癌7402細胞進行熒光識別，該探針在生物檢測、細胞組織成像乃至活體研究方面表 現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖1以MMP-2為靶向的熒光探針的ESI-MS譜圖。
[0014] 圖2以MMP-2為靶向的熒光探針的HPLC譜圖。
[0015] 圖3探針對MMP-2的熒光響應(yīng)。
[0016] 圖4 MMP-2、MMP-1及其他相關(guān)物種對探針的熒光響應(yīng)。
[0017]圖5a是人肝癌7402細胞的熒光圖。
[0018]圖5b是人肝癌7402細胞的明場。
[0019]圖5c是人肝癌7402細胞的疊加圖。
[0020]圖5d是人正常肝細胞L0-2的熒光圖。
[0021]圖5e是人正常肝細胞L0-2的明場。
[0022]圖5f是人正常肝細胞L0-2的疊加圖。
【具體實施方式】
[0023 ]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明。
[0024] 實施例
[0025] 1材料與方法
[0026] 1.1細胞系及培養(yǎng)條件
[0027] 人肝癌細胞7402和人正常肝細胞L0-2購自中科院上海細胞庫，用含10 %FBS和青/ 鏈霉素(青霉素 l〇〇U/mL，鏈霉素100yg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 °C、5 %C02細胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。
[0028] 1.2主要試劑和材料
[0029] 4-(N，N_二乙基氨基）水楊醛，1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC · HC1)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、石油醚(60-90 °C)、四氫呋 喃(THF)、色譜純二甲基亞砜(DMS0)等。其余所用化學(xué)試劑均為分析純。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血 清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素等均有商業(yè)途徑獲得。
[0030] 1.3主要儀器
[0031]紫外可見分光光度計(UV-2550，日本島津公司），熒光光譜儀(FS5，愛丁堡公司，英 國），磁力加熱攪拌器（78-1，常州國華電器有限公司），ASCend?400核磁共振波譜儀 (Bruker，美國），Microtof-QIII?質(zhì)譜儀(Bruker，美國），精密pH計(上海雷磁儀器廠），高速 臺式冷凍離心機(Heraeus，德國），C02細胞培養(yǎng)箱(SHELLAB5215-2,美國），多功能電子天平 (FA1004A，上海精天電子儀器有限公司），-80°C超低溫冰箱(702REL#3，F(xiàn)orma公司，美國）， 超凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（SD-1238HA2-B，上海福 瑪設(shè)備有限公司），共聚焦顯微鏡(FV10SW，01ymp Us，日本）。
[0032] 1.4熒光探針的制備
[0033] 1.4.1 7-(N，N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸琥珀酰亞胺酯(產(chǎn)物3)的制備
[0034] 將3 · 8648g 4-(N，N-二乙基氨基）水楊醛（化合物1，0 · 02mol，分子量=193 · 24)、 6.4068g丙二酸二乙酯（0.04mol，分子量=160.17)和2mL哌啶溶解于60mL無水乙醇，回流6 小時。旋蒸除去乙醇溶劑，再加入60mL 10 %NaOH溶液，回流15分鐘。冷卻到室溫，反應(yīng)液用 pH = 2的鹽酸在冰浴的條件下酸化，得到桔黃色晶狀沉淀。過濾，洗滌，真空干燥，得到 4.16528的7-0，^二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(化合物2)，產(chǎn)率79.71%。1^ = 〇.6(乙酸乙 酯hm.p. :220-221°C。
[0035] 0 · 2876g的EDC( 1 · 5mmol)、0 · 161 lg的NHS( 1 ·4mmol)溶于4mL的DMF中。0 · 2560g的香 豆酸(0.98mmol)也溶于4mL的DMF中，逐滴加入到上述溶液中。室溫攪拌48小時，倒到150mL 冰水中，抽濾，得到〇 · 3060g的化合物3，產(chǎn)率87 · 13 % ,Η NMR(DMS〇-d6，400MHz): δ8 · 800( 1H, s),7.729(lH,d),6.854(lH,d),6.602(lH,s),3.530(4H,q),2.873(4H,s),1.158(6H,t) ? ESI-MS:理論值[M+Na] +: 381 · 1063,實測值：381 · 1073;理論值[2M+Na] +: 739 · 2227,實測值 739.2224.
[0036] 1.4.2以MMP-2為靶向的FRET熒光探針(化合物9)的制備
[0037]以MMP-2為靶向的FRET熒光探針的制備過程如式1所示。首先通過偶聯(lián)和去保護反 應(yīng)制備化合物4，F(xiàn)moc肽在DMF/DIEA溶液在TBTU催化下通過標(biāo)準固相多肽合成化合物5?；?合物 5 通過 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Lys(dde)-〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Arg(pbf)-〇H、Fmoc-Pr〇-OH和Fmoc-Leu-ΟΗ系列反應(yīng)后，再與Dabcy 1-Osu反應(yīng)4小時，得到化合物6。然后，加入5 %的 水合肼的DMF溶液，再與化合物3反應(yīng)4小時，得到化合物7。通過以TFA/TIS/H20( 95 :5: 5)試 劑裂解化合物7,得到化合物8?；衔?再與氨基修飾的水溶性的PEG通過EDC/NHS反應(yīng)偶 聯(lián)，得到以MMP-2為靶向的FRET熒光探針(化合物9)。
[0038]化合物1-9的具體為：
[0039] 化合物1:4- (N，N-二乙基氨基)水楊醛
[0040]化合物2:7-(N，N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸
[0041]化合物3:7-(N，N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸琥珀酰亞胺酯
[0042]化合物4:甘氨酸-氯化三苯甲基樹脂
[0043]化合物5:甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基二 氫苯并呋喃-5-磺酰基)_甘氨酸-賴氨酸_(甘氨酸-甘氨酸-氯化三苯甲基樹脂)-2-(4,4_二 甲基-2,6-二羰基環(huán)己亞基）甲基
[0044] 化合物6:4- [ 4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈 氨酸-精氨酸(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?-甘氨酸-賴氨酸-(甘氨酸-甘氨 酸-氯化三苯甲基樹脂)-2_(4，4-二甲基-2，6-二羰基環(huán)己亞基）甲基
[0045] 化合物7:4-[4_(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈 氨酸-精氨酸(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?-甘氨酸-賴氨酸-(甘氨酸-甘氨 酸-氯化三苯甲基樹脂)-7_(N，N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸
[0046] 化合物8:4- [ 4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈 氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴氨酸_(甘氨酸-甘氨酸)-7_(N，N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸
[0047] 化合物9:4-[4_(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈 氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴氨酸_(甘氨酸-甘氨酸-聚乙二醇)-7_(N，N-二乙基氨基)香豆素-3_羧酸
[0049] 式1以MMP2為靶向的FRET熒光探針即化合物9的制備
[0050] 1.5 MMP-2，MMP-1及其他物種對MMP-2靶向探針的響應(yīng)
[0051 ] 1.5.1 MMP-2的激活及熒光響應(yīng)
[0052]將75yL APMA(5mM)和75yL MMP-2(160mM)混合并于37°C反應(yīng)3小時，以激活MMP2的 活性。然后將150yL已激活的MMP-2(80mM)加入到150yL探針溶液中（20μΜ)于37°C反應(yīng)180分 鐘。每次測試后混合溶液立即放于恒溫振蕩器中。
[0053] 1.5.2 MMP-1的激活及熒光響應(yīng)
[0054] 將75yL APMA(5mM)和75yL MMP-l(160mM)混合并于37°C反應(yīng)3小時，以激活MMP-1 的活性。然后將150yL已激活的MMP-1 (80mM)加入到150yL探針溶液中（20μΜ)于37 °C反應(yīng)180 分鐘。每次測試后混合溶液立即放于恒溫振蕩器中。
[0055] 1.5.3 MMP-2的選擇性實驗
[0056] MMP-2(10nM)及其他相關(guān)的可能引起干擾的生物學(xué)物種如MMP-l(10nM)，Mg2+，Na+， Fe3+，Cu2+，L-cysteine，L-tyrosine，L-glutathiose，N〇3-，Cl〇4-，Cl-和Br-(都是 10mM)與 20nM的探針在37 °C反應(yīng)3小時，之后于熒光儀上開始檢測。
[0057] 1.6細胞成像
[0058] 將MMP-2為靶向的熒光探針溶于PBS緩沖溶液中，配成2μΜ的探針溶液。將人肝癌細 胞7402，人正常肝細胞L0-2接種到共聚焦培養(yǎng)皿中，當(dāng)細胞飽和度超過80%后，加入探針溶 液，放入C02培養(yǎng)箱孵育3小時，然后用預(yù)冷的PBS溶液洗3次，接下來每個孔都加入lmL的PBS 緩沖溶液，最后于共聚焦顯微鏡下觀察熒光。
[0059] 2.結(jié)果
[0060] 2.1以MMP-2為靶向的熒光探針的表征
[00611 制備的MMP-2熒光探針通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和高效液相色譜法(HPLC)表征 (圖1和圖2)。高效液相色譜法(HPLC)表明探針在11.287分鐘出峰，純度為95.7512 %。
[0062] 2.2 MMP-2，MMP-1及其他物種對靶向MMP-2探針的響應(yīng)
[0063] 2.2.1 MMP-2對探針的響應(yīng)
[0064] 為了探討MMP-2對探針的熒光響應(yīng)，測試了MMP-2和探針作用時隨著時間變化的熒 光光譜。如圖3所示，開始時探針在480nm處的熒光很弱。然而，隨著反應(yīng)時間延長，探針的熒 光強度明顯增強，在反應(yīng)時間約3小時時熒光強度約增加了 10倍并趨于平衡。
[0065] 2.3 MMP-2的選擇性
[0066] 如圖4所示，MMP-2探針（20nM)與其他相關(guān)的生物學(xué)物種如MMP-l(10nM)、Mg 2+、Na+、 Fe3+、Cu2+、L-cysteine、L-tyrosine、L-glutathiose、N〇3-、Cl〇4-、C1-和 Br-(都是 10mM)孵育 3 小時后，其熒光光譜沒有明顯的變化，基本沒有響應(yīng)，只有MMP2的熒光明顯增加，增強了約 10倍。
[0067] 2.4細胞成像結(jié)果
[0068]將人正常肝細胞L0-2和人肝癌7402細胞分別與熒光探針在37°C孵育3小時后，于 共聚焦顯微鏡下觀察細胞成像。如圖5所示，圖5A-C:人肝癌7402細胞的熒光圖、明場和疊加 圖；圖5D-F:人正常肝細胞L0-2的熒光圖、明場和疊加圖。人肝癌7402細胞表現(xiàn)出強烈的綠 色熒光，而人正常肝細胞L0-2幾乎沒有熒光，說明人肝癌7402細胞中的MMP-2高于人正常肝 細胞L0-2。
[0069] 3.結(jié)論
[0070] 肝癌是最常見的癌癥之一，嚴重威脅著人類的健康。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多 途徑、多階段、長時間作用的結(jié)果。導(dǎo)致肝癌發(fā)生的危險因素主要是肝硬化，HBV、HCV病毒感 染、酗酒、吸煙、黃曲霉毒素、氯乙烯、糖尿病和遺傳疾病等，研究顯示這些因素均顯著提升 肝癌的風(fēng)險。
[0071] MMP-2位于人類染色體16q21，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，結(jié)構(gòu)基因總長度 為72kD，是MMPs家族中的一個重要成員，也稱IV型膠原酶或明膠酶，是一種鋅離子依賴的蛋 白水解酶，MMP-2的作用底物主要為IV型膠原，其次還有V、VII、IX、X型膠原及纖維連接素和 彈性蛋白等，被認為在腫瘤轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮著重要作用。MMP-2能夠降解多種細胞外基質(zhì)， 在人體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理和病理學(xué)功能。正常條件下，MMP-2的表達較低，而在炎癥刺激 或病理條件下其表達才會升高，參與惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移、炎癥、急性冠狀動脈綜合征、類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。大量研究結(jié)果顯示MMP-2的高表達與肝癌相關(guān)，且其表達水平與腫 瘤的惡性程度有密切的關(guān)系，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，癌細胞的增殖等過程。
[0072]本發(fā)明中通過體外實驗，分別測試了 MMP-2，MMP-1等物種對探針的熒光響應(yīng)。當(dāng)激 活的MMP-2與探針作用時，隨著時間的變化，熒光不斷增強，在3小時左右趨于平衡。而同樣 條件下，當(dāng)MMP-1與探針相互作用時，隨著時間的增強，熒光幾乎沒有變化。其他生物學(xué)相關(guān) 離子與探針反應(yīng)3小時，熒光幾乎無變化。上述結(jié)果顯示探針只對MMP-2有響應(yīng)，而對其他物 種幾乎沒有響應(yīng)。進行了以MMP-2為靶向的FRET熒光探針對人肝癌7402細胞和正常人肝細 胞L0-2的細胞成像實驗。人肝癌7402細胞表現(xiàn)出強烈的綠色熒光，而人正常肝細胞L0-2幾 乎沒有熒光，表明人肝癌7402細胞中的MMP-2高于人正常肝細胞L0-2。上述結(jié)果說明本發(fā)明 所制備的以基質(zhì)金屬蛋白酶IKMMP-2)為靶向的PEG修飾的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針可用于 檢測肝癌細胞。
[0073] 綜上所述，本發(fā)明證明了以MMP-2為靶向的FRET熒光探針能夠?qū)θ苏８渭毎鸏0-2和人肝癌7402細胞進行熒光識別，該探針在生物檢測、細胞組織成像乃至活體研究方面表 現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。
[0074]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等效物界定。
【主權(quán)項】
1. 制備熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針的制備方法，其特征在于，其合成路線如下式所示：9 Π Μ2. 制備熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針的制備方法，其特征在于，將熒光基團7-(Ν，Ν-二乙基氨 基)香豆素-3-羧酸琥珀酰亞胺酯連接淬滅基團4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二 酰亞胺酯，構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光基團7-(N，N-二乙基氨基）香豆 素-3-羧酸琥珀酰亞胺酯通過能夠被MMP-2切割的多肽鏈連接淬滅基團4-[4-(二甲基氨基） 苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亞胺酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，探針中甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈 氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴氨酸_(甘氨酸-甘氨酸)多肽鏈可被聚乙二醇等官能團修飾。5. 按照權(quán)利要求1-4任一項所述方法制得的探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于，是以MMP-2為靶向的FRET熒光探針。7. 如權(quán)利要求5所述的探針在制備檢測肝癌藥物中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求5所述的探針在制備檢測肝癌試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/06GK105949281SQ201610294889
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】何廣杰, 楊璐, 千新來, 原志慶, 李靜, 馮思佳, 趙二趁
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院