專利名稱：小花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及小花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離方法及所得產(chǎn)苦馬豆素菌株。
背景技術(shù)：
苦馬豆素屬多羥基吲哚里西啶類生物堿，是一種極強(qiáng)的a -甘露糖苷酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，導(dǎo)致糖蛋白合成異常及部分合成的低聚糖在 溶酶體內(nèi)聚積，引起細(xì)胞空泡變性，造成器官組織損害和功能障礙而中毒。但苦馬豆素有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗癌抗腫瘤、抗菌等藥理作用。值得一提的是，苦馬豆素的抗腫瘤活性已經(jīng)是近年來(lái)腫瘤后備藥物篩選的熱點(diǎn)。然而制約國(guó)內(nèi)苦馬豆素抗腫瘤藥物研發(fā)進(jìn)程的主要問(wèn)題是苦馬豆素來(lái)源十分困難，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們研究的需要。內(nèi)生菌是指在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的微生物。內(nèi)生菌與寄主之間為互利共生關(guān)系，一方面內(nèi)生菌為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)料，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，另一方面使得宿主植物對(duì)環(huán)境表現(xiàn)適應(yīng)性，對(duì)環(huán)境脅迫表現(xiàn)出一定的抗性(如抗干旱、抗病蟲(chóng)害等)，有的還對(duì)食草動(dòng)物表現(xiàn)出毒性，以維持其生存的需要。目前苦馬豆素的來(lái)源有三種途徑，第一種是從豆科黃芪屬、棘豆屬植物和苦馬豆屬植物，以及旋花科番薯屬、錦葵科黃花稔屬植物中提取。由于植物本身含苦馬豆素的量很低，提取率低，產(chǎn)量有限，難以滿足需求；第二種是通過(guò)人工合成途徑得到，合成產(chǎn)物存在同分異構(gòu)和手性結(jié)構(gòu)現(xiàn)象，使得分離很困難，產(chǎn)率低，并不適宜大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；第三種方法是從真菌菌絲體或發(fā)酵液中提取即生物合成。在目前獲取苦馬豆素的三種途徑中，人工合成途徑是人們研究的重點(diǎn)。自美國(guó)化學(xué)家Yasuda(1984)、Bennett (1989)等先后報(bào)道人工合成苦馬豆素以來(lái)，人們采用了不同的方法合成苦馬豆素，可分為以下四種①M(fèi)OOtOO(2001)的合成方法，關(guān)鍵步驟是使用氨水使二乙醒酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了 3倍，以保證目標(biāo)物質(zhì)只有一種對(duì)映異構(gòu)體。該法以2，3，5，6_ 二-0-甘露呋喃糖(2，3 :5，6-di-0-mannofuranose)為起始物，共需13步，產(chǎn)率為15%。②Trost (1999)和Katsuki (2000)報(bào)道的不對(duì)稱合成法，以二元醇為起始物，分別需要17步和11步，產(chǎn)率為13%和10%。③Pearson (2002)報(bào)道的改進(jìn)后的方法。以異抗壞血酸(D-isoascorbic acid)為起點(diǎn)，共需10步，產(chǎn)率為12 %。④Blechert (2002), Carretero (2000), Pyne (2002)等報(bào)道的以卩引哚里西唳順二輕基亮氨酸(syn-dihydroxylation)衍生物開(kāi)始，分別需要15步，18步和16步，產(chǎn)率分別為38%(以內(nèi)消旋二元醇開(kāi)始計(jì)算)，6. 5%和4.5%。中國(guó)科學(xué)院院士周維善等(1993)人工合成苦馬豆素也獲成功，但產(chǎn)率很低。從植物(主要是瘋草)中分離是目前提取苦馬豆素所常用的方法，但這種方法有很大的局限性，對(duì)草原植被造成破壞，且瘋草中苦馬豆素含量較低，不能作為大規(guī)模提取苦馬豆素的方法。前兩種方法(從植物中提取和化學(xué)合成)，由于產(chǎn)量低，不能滿足人們對(duì)苦馬豆素抗腫瘤活性研究及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的需要。因此，探索通過(guò)產(chǎn)量高、提取成本低且對(duì)環(huán)境沒(méi)有危害的微生物發(fā)酵途徑獲取苦馬豆素，就成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。這就是第三種方法從真菌菌絲體或發(fā)酵液中提取即生物合成。關(guān)于苦馬豆素的生物合成，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)申請(qǐng)的專利有6項(xiàng)即“生物發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝”(02114591. I)、“綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝”(200610043120. 5)、“白僵菌發(fā)酵生產(chǎn)苦馬豆素的工藝”(200710199249. X)、“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌及其制備方法和應(yīng)用”(200910021082. 7)、“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和應(yīng)用”(200910021858. 5)、“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其應(yīng)用”(200910021861. 7)，其存在的不足和缺陷是①“生物發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝”是由楊凌大農(nóng)生物技術(shù)有限公司申請(qǐng)，中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1396263，
公開(kāi)日2003年2月12日，發(fā)明創(chuàng)造的名稱為“生物發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝”，其所采用的微生物菌株是自行從自然界豆科植物中分離、篩選的可產(chǎn)生苦馬豆素的豆類絲核菌7-3菌株(代號(hào))。其存在的不足和缺陷是，在專利中沒(méi)有公開(kāi)豆類絲核菌7-3菌株的具體獲得方法和途徑，也沒(méi)有公開(kāi)該豆類絲核菌7-3菌株的具體生物學(xué)特性、標(biāo)準(zhǔn)、以及品質(zhì)鑒定方法。這樣使得同領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)法按說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容重復(fù)實(shí)現(xiàn)。②“綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝”是由西北農(nóng)林科技大學(xué)申請(qǐng)，專利申請(qǐng)?zhí)? 200610043120. 5，所提供的菌種是從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)。該專利保護(hù)的主要內(nèi)容是苦馬豆素的提取技術(shù)工藝,而不涉及綠僵菌本身的分離方法。綠僵菌在自然界中分布比較廣泛，目前可以從多種植物，包括土壤中分離得到，僅中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心保存的標(biāo)準(zhǔn)綠僵菌菌株就有幾十種之多，具體是哪一種專利中不清楚。③“白僵菌發(fā)酵生產(chǎn)苦馬豆素的工藝”是由楊凌天力生物技術(shù)有限公司申請(qǐng)，專利申請(qǐng)?zhí)?00710199249. X，所提供的菌種是從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)白僵菌(Beauveria bassiana Vuill)，編號(hào)為ACCC30112，也可以是其它渠道獲得的白僵菌。該專利保護(hù)的主要內(nèi)容也是苦馬豆素的提取技術(shù)工藝，而不涉及白僵菌本身的分離方法。白僵菌在自然界中分布比較廣泛，目前可以從多種植物，包括土壤中分離得到，僅中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心保存的標(biāo)準(zhǔn)綠僵菌菌株也有幾十種。④“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌及其制備方法和應(yīng)用”、“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和應(yīng)用”和“一種合成苦馬豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其應(yīng)用”3個(gè)專利共同的不足是沒(méi)有公開(kāi)菌株的種類，且所公開(kāi)的編號(hào)菌株苦馬豆素產(chǎn)量偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本專利具體涉及小花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌的分離方法及所得產(chǎn)苦馬豆素菌株層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum)。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。I)內(nèi)生真菌分離用去離子水洗去小花棘豆(采自內(nèi)蒙古阿拉善盟)表面的塵土，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、花分離，然后將葉、莖、花分別用紗布包扎，進(jìn)行表面消毒，表面消毒的程序?yàn)槭紫扔?5%的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量為I %的次氯酸鈉溶液浸泡3min，最后用滅菌的去離子水沖洗2次，每次lmin，將該去離子水接種于新制的PDA瓊脂培養(yǎng)基表面，觀察3d，看該培養(yǎng)基表面是否有真菌生長(zhǎng)，以此來(lái)檢驗(yàn)表面消毒的效果；用滅菌濾紙吸去經(jīng)表面消毒的植物組織上的水分，然后用滅菌的剪刀將葉、莖、花等分別剪成3mm大小的組織塊，然后將各組織塊接種于水瓊脂培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱中18°C培養(yǎng)；待組織塊周圍長(zhǎng)出適當(dāng)大小的菌落時(shí)，挑取邊緣菌絲接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱中18°C培養(yǎng)；若在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落仍未純化時(shí)，將其再次接種于新制的PDA培養(yǎng)基表面，重復(fù)此操作過(guò)程，直至得到純化的菌株。將分離得到的6株內(nèi)生真菌編號(hào)，分別接種于PDA試管斜面，于4°C中保存，24h后轉(zhuǎn)入-20°C長(zhǎng)期保存。2)薄層色譜法定性篩選產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌將分離得到的內(nèi)生真菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，采用I號(hào)培養(yǎng)液配方置20°C 25°C通氣發(fā)酵培養(yǎng)10 14天，收集菌絲體，干燥保存?zhèn)溆谩?nèi)生真菌菌絲體中苦馬豆素定 性檢測(cè)將干燥的內(nèi)生真菌菌絲用研缽研磨成粉末，用濾紙包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇75°C回流提取4小時(shí)，重復(fù)提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分別濃縮揮干，用去離子水將其溶解，加入5cm長(zhǎng)的DlOl大孔樹(shù)脂柱。先用去離子水洗脫樹(shù)脂柱，收集水洗脫液，并將其濃縮揮干。然后用甲醇將其溶解，制成待檢液；內(nèi)生真菌發(fā)酵液中苦馬豆素定性檢測(cè)回收并濃縮發(fā)酵液，用去離子水將其溶解，余下步驟同菌絲體苦馬豆素定性檢測(cè)。用毛細(xì)管將苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)生真菌菌絲待檢液和發(fā)酵待檢液分別點(diǎn)樣于GF254硅膠薄層板上，用￥_: Vw V水=70 26 2 2展開(kāi)劑上行法展開(kāi)。待展開(kāi)劑到達(dá)薄層板前沿時(shí)，將其取出揮干溶劑，在薄層板表面噴灑H202置110°C加熱lOmin，再將醋酐噴灑于娃膠板表面，置110°C加熱IOmin,最后噴灑Ehrlich’s試劑,置110°C加熱IOmin,然后觀察待檢樣品是否具有與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品的顏色和Rf值相同的斑點(diǎn)。初步判斷發(fā)酵液和菌絲體中是否含有苦馬豆素。XJ-H-I薄層色譜結(jié)果見(jiàn)表I。3)氣相色譜法定量測(cè)量苦馬豆素含量氣相色譜儀日本島津公司生產(chǎn)的GC-14C氣相色譜儀,威瑪龍色譜工作站。色譜條件SE30石英毛細(xì)管柱(30mX0. 25mm，0. 33iim)，柱溫280°C,進(jìn)樣口溫度300°C，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度280°C，載氣為氮?dú)?，流速?mL/min，進(jìn)樣量I y L，分流比30 I。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取一定量的苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品用吡啶配制成0. 0016 5. 102g/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，量取100 u L各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入20 i! L lmg/mL的內(nèi)標(biāo)(甲基化-a -D-甘露糖苷)溶液，混勻，最后加入40 ii L硅烷化(BSTFA+TMCS)試劑，置干燥器中室溫進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。以苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)X、以苦馬豆素的質(zhì)量濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，表示線性關(guān)系良好(圖I)。苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜峰保留時(shí)間為4. 83min(圖2)。苦馬豆素的質(zhì)量濃度在0. 013 I. 563g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。內(nèi)生真菌發(fā)酵液中苦馬豆素含量測(cè)定回收薄層色譜技術(shù)初步篩選出的產(chǎn)生苦馬豆素的內(nèi)生真菌(代號(hào)為XJ-H-1)的發(fā)酵待檢液離心，除去不溶物后揮干，用吡啶溶解，分別依次加入內(nèi)標(biāo)溶液和硅烷化試劑，置干燥器中室溫進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min，然后I y L進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜分析。內(nèi)生真菌菌絲體中苦馬豆素含量測(cè)定將經(jīng)薄層色譜技術(shù)初步篩選出的產(chǎn)生苦馬豆素的XJ-H-I內(nèi)生真菌菌絲體待檢液離心，除去不溶物后揮干，余下步驟同上。樣品溶液中苦馬豆素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品溶液中苦馬豆素的含量。XJ-H-I發(fā)酵液在該保留時(shí)間有色譜峰出現(xiàn)，出峰時(shí)間4. 86min，在說(shuō)明該菌可產(chǎn)生苦馬豆素(圖3)。將其峰面積值分別代入回歸方程計(jì)算得出苦馬豆素產(chǎn)量，XJ-H-I菌株發(fā)酵液為16. 7338mg/L。XJ-H-I菌絲體未檢測(cè)出與標(biāo)準(zhǔn)品相近峰，提示菌絲體中沒(méi)有苦馬豆素或含量極低。4)產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定將菌種接種于PDA培養(yǎng)基,待菌落長(zhǎng)至合適大小，肉眼觀察菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子形態(tài)與顏色等特征。在PDA培養(yǎng)基采用插片法提取自然生長(zhǎng)態(tài)菌絲，中性樹(shù)膠封片，置400倍顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)，并拍照記錄。根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)等特性參考《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步分類鑒定。XJ-H-I菌落菌 絲形態(tài)學(xué)鑒定見(jiàn)圖4。分子生物學(xué)鑒定在核糖體rDNA基因中，16SrDNA和28SrDNA基因間隔序列稱為ITS序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))，具有中度保守性，它的長(zhǎng)度和序列變化較大，將其擴(kuò)增物進(jìn)行序列分析，可用于對(duì)細(xì)菌、真菌、植物等不同生物型、種屬分類鑒定，是目前真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究的理想序列。因此，提取內(nèi)生真菌基因組DNA，采用ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )擴(kuò)增ITS序列，進(jìn)行ITS測(cè)定和比對(duì)，鑒定內(nèi)生真菌種屬。①內(nèi)生真菌總DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明提取真菌基因組DNA。②PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性3min，94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，35個(gè)循環(huán)；72°C保持10min，12°C保溫。③PCR產(chǎn)物回收用膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收純化。④載體連接及轉(zhuǎn)化按照PEASY-T3載體連接試劑盒，將PCR產(chǎn)物片段連接在pEASY_T3載體上，導(dǎo)入Trarnsl-Tl型感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有Amp的LB培養(yǎng)基平板上，置37°C培養(yǎng)12 16h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR，PCR反應(yīng)體系和條件同上。⑤目的基因測(cè)序?qū)⒕篜CR結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送交測(cè)序公司測(cè)序。⑥目的序列比對(duì)及構(gòu)建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將測(cè)序公司發(fā)回的序列人工剪切后于NCBI上進(jìn)行BLAST，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果選取同源性高的菌種，然后采用Mega4. 0軟件N-J法進(jìn)行聚類分析，自展次數(shù)1000次，構(gòu)建內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行種屬歸類。采用ITSl和ITS4通用引物擴(kuò)增出的目的片段長(zhǎng)度為500_750bp，包括部分的18SrDNA、28SrDNA序列和全部的ITSl、5. 8SrDNA和ITS4序列。擴(kuò)增出XJ-H-1的目的片段為558bp(圖5)。在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示XJ-H-I為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum),同源性高達(dá)99%。從XJ-H-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)可以看出，XJ-H-1與Fusarium proliferatum親緣關(guān)系較近，自檢支持率高達(dá)90 而與其他幾屬真菌的關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》的形態(tài)學(xué)描述，提示XJ-H-I為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)。XJ-H-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),見(jiàn)圖6。


圖I為薄層色譜定性鑒定圖；圖2為苦馬豆素濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線及苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖；圖3為XJ-J-I發(fā)酵液在苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)段(4.83±0.05min)出峰圖4為XJ-H-I菌落和顯微形態(tài)圖；圖5為XJ-H-I的5. 8S rDNA-ITS擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖；圖6為用NJ法構(gòu)建出小花棘豆中分離出的產(chǎn)苦馬豆素層出鐮刀菌的5. 8SrDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。5附圖表說(shuō)明I)薄層色譜定性鑒定從圖I可以發(fā)現(xiàn)XJ-H-1與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)Rf和顏色一致，即可初步確定待檢樣品中含有苦馬豆素，說(shuō)明這種內(nèi)生真菌可產(chǎn)生苦馬豆素。2)氣相色譜檢測(cè)圖2為苦馬豆素濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線及苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖，回歸方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜峰保留時(shí)間4. 83min。XJ-J-I發(fā)酵液在苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)段(4. 83 土0. 05min)出峰
4.85min(圖 3)。 3) XJ-H-I菌落及顯微結(jié)構(gòu)圖XJ-H-I菌落和顯微形態(tài)(圖4A，4B):該菌在PDA培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速度為7mm/d, 12天長(zhǎng)滿整個(gè)平板。培養(yǎng)基基質(zhì)反面為深黃色，菌落呈白色，蓬松凸起，棉絮狀，密集。菌絲顯微圖顯示XJ-H-I菌絲分隔清楚且多，直徑4-6 u m,其分生孢子梗較直，頂端呈臘腸形，未見(jiàn)明顯孢子。發(fā)酵液中形態(tài)學(xué)發(fā)酵液呈淡黃色，略渾濁，液面未見(jiàn)明顯氣泡。白色菌體云霧狀懸浮，后期菌體密實(shí)。4)圖5為XJ-H-I的5. 8S rDNA-ITS擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖。5)小花棘豆中分離出的層出鐮刀菌5.8SrDNA_ITS序列，下劃線為引物序列TCCGTAGGTGAACCTGCGG.hCATATCATThCCCAGTTThCAhCTCCCAhhCCCCTGTCAhCAThCCAhTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGCGGAGGA6) XJ-H-I系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建圖6是用NJ法構(gòu)建出小花棘豆中分離出的產(chǎn)苦馬豆素層出鐮刀菌的
5.8SrDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從XJ-H-I系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)可以看出，XJ-H-I與層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum)親緣關(guān)系較近，自檢支持率高達(dá)90%,而與其他幾屬真菌的關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》的形態(tài)學(xué)描述，提示XJ-H-I為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)。5本發(fā)明所得技術(shù)效果I)目前苦馬豆素的來(lái)源主要是從瘋草中提取，研究證實(shí)內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與寄主相同的次生代謝產(chǎn)物，這在自然界并非個(gè)別現(xiàn)象，瘋草中活性物質(zhì)-苦馬豆素的產(chǎn)生是由其內(nèi)的內(nèi)生真菌所致。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)西部草地瘋草類植物約有45種，主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、青海、新疆、西藏、陜西、寧夏、四川等西部省區(qū)，分布面積已超過(guò)1100萬(wàn)hm2，植物資源十分豐富。從我國(guó)眾多的瘋草品種中很可能分離到苦馬豆素高產(chǎn)菌株，這將為苦馬豆素的生物發(fā)酵提供豐富的菌種來(lái)源，本發(fā)明將推動(dòng)植物內(nèi)生真菌多樣性的研究及其發(fā)酵產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)。 2)本發(fā)明從瘋草(小花棘豆)中分離的產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌，其產(chǎn)生苦馬豆素的量遠(yuǎn)高于其他來(lái)源的菌株，且菌株分離比較容易。即使在保存菌種的過(guò)程中發(fā)生菌株變異，也可以重新從自然界瘋草中分離得到，保證了所得內(nèi)生真菌產(chǎn)苦馬豆素的持續(xù)性與穩(wěn)定性。3)本專利的優(yōu)點(diǎn)是從瘋草(小花棘豆)中分離出一種產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌，可以產(chǎn)生與寄主相同的此生代謝產(chǎn)物，苦馬豆素經(jīng)檢測(cè)，其生物發(fā)酵液中的苦馬豆素產(chǎn)量較高，為16. 7338mg/L。與現(xiàn)有產(chǎn)苦馬豆素菌種相比，其苦馬豆素產(chǎn)量較高，將為今后苦馬豆素工業(yè)化生產(chǎn)的奠定理論基礎(chǔ)，其發(fā)展前景廣闊。
具體實(shí)施例方式I)內(nèi)生真菌分離用去離子水洗去小花棘豆(采自內(nèi)蒙古阿拉善盟)表面的塵土，用滅菌的鑷子將植物的葉、莖、花分離，然后將葉、莖、花分別用紗布包扎，進(jìn)行表面消毒，表面消毒的程序?yàn)槭紫扔?5%的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量為I %的次氯酸鈉溶液浸泡3min，最后用滅菌的去離子水沖洗2次，每次lmin，將該去離子水接種于新制的PDA瓊脂培養(yǎng)基表面，觀察3d，看該培養(yǎng)基表面是否有真菌生長(zhǎng)，以此來(lái)檢驗(yàn)表面消毒的效果；用滅菌濾紙吸去經(jīng)表面消毒的植物組織上的水分，然后用滅菌的剪刀將葉、莖、花等分別剪成3mm大小的組織塊，然后將各組織塊接種于水瓊脂培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱中18°C培養(yǎng)；待組織塊周圍長(zhǎng)出適當(dāng)大小的菌落時(shí)，挑取邊緣菌絲接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基表面，置培養(yǎng)箱中18°C培養(yǎng)；若在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落仍未純化時(shí)，將其再次接種于新制的PDA培養(yǎng)基表面，重復(fù)此操作過(guò)程，直至得到純化的菌株。將分離得到的6株內(nèi)生真菌編號(hào)，分別接種于PDA試管斜面，于4°C中保存，24h后轉(zhuǎn)入-20°C長(zhǎng)期保存。2)薄層色譜法定性篩選產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌將分離得到的內(nèi)生真菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，采用I號(hào)培養(yǎng)液配方置20°C 25°C通氣發(fā)酵培養(yǎng)10 14天，收集菌絲體，干燥保存?zhèn)溆?。?nèi)生真菌菌絲體中苦馬豆素定性檢測(cè)將干燥的內(nèi)生真菌菌絲用研缽研磨成粉末，用濾紙包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇75°C回流提取4小時(shí)，重復(fù)提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分別濃縮揮干，用去離子水將其溶解，加入5cm長(zhǎng)的DlOl大孔樹(shù)脂柱。先用去離子水洗脫樹(shù)脂柱，收集水洗脫液，并將其濃縮揮干。然后用甲醇將其溶解，制成待檢液；內(nèi)生真菌發(fā)酵液中苦馬豆素定性檢測(cè)回收并濃縮發(fā)酵液，用去離子水將其溶解，余下步驟同菌絲體苦馬豆素定性檢測(cè)。用毛細(xì)管將苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)生真菌菌絲待檢液和發(fā)酵待檢液分別點(diǎn)樣于GF254硅膠薄層板上，用乂_: Vm V水=70 26 2 2展開(kāi)劑上行法展開(kāi)。待展開(kāi)劑到達(dá)薄層板前沿時(shí)，將其取出揮干溶劑，在薄層板表面噴灑H202置110°C加熱lOmin，再將醋酐噴灑于娃膠板表面，置110°C加熱IOmin,最后噴灑Ehrlich’S試劑，置110°C加熱IOmin,然后觀察待檢樣品是否具有與苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品的顏色和Rf值相同的斑點(diǎn)。初步判斷發(fā)酵液和菌絲體中是否含有苦馬豆素。XJ-H-I薄層色譜結(jié)果見(jiàn)表I。3)氣相色譜法定量測(cè)量苦馬豆素含量氣相色譜儀日本島津公司生產(chǎn)的GC-14C氣相色譜儀，威瑪龍色譜工作站。色譜條件SE30石英毛細(xì)管柱(30mX0. 25mm，0. 33iim)，柱溫280°C,進(jìn)樣口溫度300°C，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度280°C，載氣為氮?dú)?，流速?mL/min，進(jìn)樣量I y L，分流比30 I。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取一定量的苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品用吡啶配制成0. 0016 5. 102g/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，量取100 u L各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入20 i! L lmg/mL的內(nèi)標(biāo)(甲基化-a -D-甘露糖苷)溶液，混勻，最后加入40 ii L硅烷化(BSTFA+TMCS)試劑，置干燥器中室溫進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。 以苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)X、以苦馬豆素的質(zhì)量濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，表示線性關(guān)系良好(圖I)?？囫R豆素標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜峰保留時(shí)間為4. 83min(圖2)?？囫R豆素的質(zhì)量濃度在0. 013 I. 563g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。內(nèi)生真菌發(fā)酵液中苦馬豆素含量測(cè)定回收薄層色譜技術(shù)初步篩選出的產(chǎn)生苦馬豆素的內(nèi)生真菌(代號(hào)為XJ-H-1)的發(fā)酵待檢液離心，除去不溶物后揮干，用吡啶溶解，分別依次加入內(nèi)標(biāo)溶液和硅烷化試劑，置干燥器中室溫進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min，然后I y L進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜分析。內(nèi)生真菌菌絲體中苦馬豆素含量測(cè)定將經(jīng)薄層色譜技術(shù)初步篩選出的產(chǎn)生苦馬 豆素的XJ-H-I內(nèi)生真菌菌絲體待檢液離心，除去不溶物后揮干，余下步驟同上。樣品溶液中苦馬豆素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品溶液中苦馬豆素的含量。XJ-H-I發(fā)酵液在該保留時(shí)間有色譜峰出現(xiàn)，出峰時(shí)間4. 86min，在說(shuō)明該菌可產(chǎn)生苦馬豆素(圖3)。將其峰面積值分別代入回歸方程計(jì)算得出苦馬豆素產(chǎn)量，XJ-H-I菌株發(fā)酵液為16. 7338mg/L。XJ-H-I菌絲體未檢測(cè)出與標(biāo)準(zhǔn)品相近峰，提示菌絲體中沒(méi)有苦馬豆素或含量極低。4)產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定將菌種接種于PDA培養(yǎng)基,待菌落長(zhǎng)至合適大小，肉眼觀察菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子形態(tài)與顏色等特征。在PDA培養(yǎng)基采用插片法提取自然生長(zhǎng)態(tài)菌絲，中性樹(shù)膠封片，置400倍顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)，并拍照記錄。根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)等特性參考《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步分類鑒定。XJ-H-I菌落菌絲形態(tài)學(xué)鑒定見(jiàn)圖4。分子生物學(xué)鑒定在核糖體rDNA基因中，16SrDNA和28SrDNA基因間隔序列稱為ITS序列(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))，具有中度保守性，它的長(zhǎng)度和序列變化較大，將其擴(kuò)增物進(jìn)行序列分析，可用于對(duì)細(xì)菌、真菌、植物等不同生物型、種屬分類鑒定，是目前真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究的理想序列。因此，提取內(nèi)生真菌基因組DNA，采用ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )擴(kuò)增ITS序列，進(jìn)行ITS測(cè)定和比對(duì)，鑒定內(nèi)生真菌種屬。①內(nèi)生真菌總DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明提取真菌基因組DNA。②PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性31^11，941變性303，551退火30S，72°C延伸45S，35個(gè)循環(huán)；72°C保持10min，12°C保溫。③PCR產(chǎn)物回收用膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收純化。④載體連接及轉(zhuǎn)化按照PEASY-T3載體連接試劑盒，將PCR產(chǎn)物片段連接在pEASY_T3載體上，導(dǎo)入Transl-Tl型感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有Amp的LB培養(yǎng)基平板上，置37°C培養(yǎng)12 16h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR，PCR反應(yīng)體系和條件同上。⑤目的基因測(cè)序?qū)⒕篜CR結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送交測(cè)序公司測(cè)序。⑥目的序列比對(duì)及構(gòu)建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將測(cè)序公司發(fā)回的序列人工剪切后于NCBI上進(jìn)行BLAST，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果選取同源性高的菌種，然后采用Mega4. O軟件N-J法進(jìn)行聚類分析，自展次數(shù)1000次，構(gòu)建內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行種屬歸類。 采用ITSl和ITS4通用引物擴(kuò)增出的目的片段長(zhǎng)度為500_750bp，包括部分的18SrDNA、28SrDNA序列和全部的ITSl、5. 8SrDNA和ITS4序列。擴(kuò)增出XJ-H-1的目的片段為558bp(圖5)。在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示XJ-H-I為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)，同源性高達(dá)99%。從XJ-H-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)可以看出，XJ-H-1與Fusarium proliferatum親緣關(guān)系較近，自檢支持率高達(dá)90 而與其他幾屬真菌的關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》的形態(tài)學(xué)描述，提示XJ-H-I為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)。XJ-H-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),見(jiàn)圖6。
權(quán)利要求
1.小花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離方法，其特征在于，包括步驟 .1)小花棘豆中內(nèi)生真菌的分離 將小花棘豆表面滅菌，滅菌程序先用75%乙醇漂洗30 60s，無(wú)菌水清洗3次，0. 1%升汞溶液漂洗2 5min，無(wú)菌水沖洗，取最后一次沖洗所得無(wú)菌水滴入PDA培養(yǎng)基平板，.25°C培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)基表面有無(wú)菌落生長(zhǎng)，以此驗(yàn)證植物表面消毒是否徹底。將表面消毒徹底的樣品剪成0. 5cmX0. 5cm組織塊，植于PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)3 5d，待組織創(chuàng)緣菌絲長(zhǎng)出時(shí)，用接種針挑出菌絲并接入新的PDA培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)3 4次，得到純化菌株，并予以編號(hào)。按照上述方法分離純化得到的菌株，在棄除常見(jiàn)的青霉、黃曲霉、黑曲霉等雜菌后，分別接種于PDA試管斜面培養(yǎng)，于-20°C冰箱作長(zhǎng)期保存， PDA固體培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水IOOOmL ； . 2)內(nèi)生真菌生物發(fā)酵 取上述分離純化得到的菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板，25°C培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用打孔計(jì)量法分別接入I號(hào)液體培養(yǎng)液，25°C發(fā)酵培養(yǎng)14d。I號(hào)液體培養(yǎng)液配方蔗糖.26g，磷酸氫二鉀3g，硝酸鈉3g，硫酸鎂0. 5g，氯化鉀0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，酵母浸膏3g，水IOOOmL ； .3)發(fā)酵液及菌絲體中苦馬豆素定性、定量檢測(cè) 定性檢測(cè)采用薄層色譜法，收集發(fā)酵液，減壓濃縮至膏狀，酸堿處理，水飽和正丁醇萃取6 7次，收集正丁醇萃取液，減壓濃縮后用95%無(wú)水乙醇溶解制成待檢液備用，超聲協(xié)助乙醇萃取菌絲體中此生代謝產(chǎn)物，收集萃取液，余下步驟同發(fā)酵液，制成待檢液備用，采用薄層層析技術(shù)，用苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，待檢液用毛細(xì)管點(diǎn)于自制硅膠GF254薄層板上，置于V氣仿V_: V水=70 26 2 2展開(kāi)劑上行展開(kāi)，展開(kāi)結(jié)束后取出揮干，雙氧水/醋酐乙醇/對(duì)二甲氨基苯甲醛“三步顯色法”顯色，觀察待檢樣品在薄層板上的位置和斑點(diǎn)顏色，記錄顏色并計(jì)算Rf值； 定量檢測(cè)采用氣相色譜法，用吡啶溶解苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品并做梯度稀釋，加硅烷化試劑混合，室溫下作用20min，取樣進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，色譜條件為柱溫200°C，進(jìn)樣口溫度.3000C，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度280°C，載氣為氮?dú)?，載氣壓力200kPa，流速為2mL/min，進(jìn)樣量2 y L，分流比60 I (AT. SE-54型毛細(xì)管色譜柱，30mX0. 25mmX0. 25 u m,中科院蘭州化學(xué)物理研究所色譜技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心)。以苦馬豆素對(duì)應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)，苦馬豆素濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品中苦馬豆素含量； .4)產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定將菌種接種于PDA培養(yǎng)基，待菌落長(zhǎng)至合適大小，觀察菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況、孢子形態(tài)與顏色等特征，采用插片法提取PDA培養(yǎng)基中自然生長(zhǎng)態(tài)菌絲，中性樹(shù)膠封片，置400倍顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)，并拍照記錄。根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)等特征參考《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步分類鑒定； 分子生物學(xué)鑒定提取內(nèi)生真菌基因組DNA，采用真菌鑒定通用引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3，)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTAITGATATGC-3，)擴(kuò)增核糖體rDNA基因中的ITS序列，將目的序列于NCBI上進(jìn)行BLAST，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果選取同源性高的菌種，然后采用Mega4. 0軟件N-J法進(jìn)行聚類分析，自展次數(shù)1000次，構(gòu)建內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行種屬歸類，結(jié)合上述兩種方法鑒定內(nèi)生真菌種屬關(guān)系； 5)得出產(chǎn)苦 馬豆素內(nèi)生真菌通過(guò)上述方法鑒定出一株產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌，該菌為層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum),其發(fā)酵液中苦馬豆素產(chǎn)量為16. 7338mg/L。
全文摘要
小花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離方法。通過(guò)生物發(fā)酵法獲得本菌的菌絲體和發(fā)酵液，經(jīng)超聲萃取，溶劑萃取后采用薄層色譜和氣象色譜技術(shù)定量、定性檢測(cè)苦馬豆素。并通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌。結(jié)果顯示，分離出的6株內(nèi)生真菌中有一株內(nèi)生真菌可產(chǎn)生苦馬豆素，產(chǎn)量為16.7338mg/L。經(jīng)鑒定，該菌為層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum)。本發(fā)明與現(xiàn)有產(chǎn)苦馬豆素菌種相比，其苦馬豆素產(chǎn)量較高，生物發(fā)酵生產(chǎn)苦馬豆素不影響草地生態(tài)環(huán)境，為解決苦馬豆素來(lái)源問(wèn)題，并提供菌種支持，從而為今后苦馬豆素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)，其發(fā)展前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102732427SQ20101029590
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者劉媛, 劉彤, 劉生武, 盧圍, 胡波, 蘇東, 趙寶玉, 陳基萍, 陳燕 申請(qǐng)人:鄂爾多斯市普眾生物技術(shù)有限公司