專利名稱：一種土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
Dobbs C. G.和HinsonW. H.于1953年發(fā)現(xiàn)自然健康土壤可以在一定 程度上控制土壤真菌(特別是病原真菌)的生長與繁殖，即具備真菌拮抗 功能。自然健康土壤的這種真菌拮抗功能與土壤微生物參與的碳-氮循環(huán)等 功能一樣，是土壤質(zhì)量和生物學(xué)功能的又一重要生物學(xué)指標(biāo)，對抑制農(nóng)作 物土傳病害具有積極的生態(tài)學(xué)意義，目前正受到全世界土壤學(xué)家和土壤微 生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。
關(guān)于土壤真菌拮抗功能作用機(jī)理共有七種假說，包括(1)抗真菌抗生 素假說；(2) Fe離子鰲合竟?fàn)幖僬f；(3)氰化物毒性假說；(4)細(xì)胞壁降 解酶作用假說；(5)對代謝底物的營養(yǎng)竟?fàn)幖僬f；(6)生態(tài)占位假說；(7) 微生物寄生或偏害共生假說，其中抗生素假說得到了廣泛認(rèn)可。目前已經(jīng) 分離到一些可以抑制真菌生長的微生物菌株，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等， 其中一些細(xì)菌已經(jīng)用于生物控制土傳植物病原真菌，如熒光假單胞菌M18。 但是自然土壤中還存在很多未知抑真菌微生物以及它們分泌的化學(xué)物質(zhì)， 同時，DeB0er ( 2007 )等發(fā)現(xiàn)某些單獨(dú)無真菌拮抗功能的細(xì)菌混合培養(yǎng)物 卻可以很好地抑制真菌生長，而之前更有研究表明非拮抗微生物的存在可 以導(dǎo)致拮抗微生物的抗真菌抗生素產(chǎn)量增加。因此，土壤真菌拮抗不僅是 某些抑真菌微生物特有的功能，更是整個土壤微生物群落結(jié)構(gòu)共同作用的 結(jié)果。
口 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化以及某些特殊抗真菌微生物的存在對于土 壤真菌拮抗功能有著決定性的意義，研究微生物群落組成及鎖定抗真菌微 生物對于揭示土壤真菌拮抗功能至關(guān)重要。許多外界環(huán)境因素，如土壤類 型、肥料、耕作方式以及作物的種類等都可以影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。 連耕地和不耕地中土壤微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)有很大的區(qū)別，不同植 被類型土壤中微生物群落組成也有很大差異，如種植小麥和種植玉米的農(nóng) 田土中均有其特有的優(yōu)勢種群。在這些影響因素存在的情況下很難研究真 菌拮抗功能的真正影響因素。而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，幾乎找不到這些背景資料
(即土壤類型、耕作方式、作物種類、肥力水平等)完全相同，但是土壤 真菌拮抗功能有差異的土壤樣品

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法將采集的土樣高壓高溫，建立土壤抑
真菌能力逐漸降低的土壤真菌拮抗模型，通過如下步驟進(jìn)行構(gòu)建
1) 采集土壤樣品；
2) 高壓高溫處理土壤樣品；
3) 檢測真菌拮抗功能；
所述步驟l)中的土壤樣品為無植物病害的土壤；所述步驟2)將土壤 樣品分4份，l份為未處理的空白對照，另外3份分別在高壓滅菌鍋內(nèi)100 。C、 ll(TC和121匸處理4min;所述步驟3 )將高溫高壓處理后的土樣分別 接入禾谷鐮刀菌FusaWuffl grafflinearira的瓊脂糖菌絲塊，在25_28"培養(yǎng) 3-5天后檢測菌絲直徑，通過檢測菌絲直徑即得到土壤抑真菌能力逐漸降低 的土壤真菌拮抗模型。
所述步驟l)中土壤樣品通過叉花式釆樣法進(jìn)行樣品采集。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
1. 模型構(gòu)建方法簡便可行 一般實(shí)驗(yàn)室均可搡作，且耗時短。
2. 應(yīng)用面廣該模型可應(yīng)用于不同土壤樣品，研究不同土壤的真菌拮 抗功能及發(fā)現(xiàn)土壤特異的抑真菌微生物；不僅可以研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)， 還可以研究真菌以及放線菌等其它微生物的群落結(jié)構(gòu)組成與真菌拮抗功能 的關(guān)系。
3. 本方法可以不考慮以上幾種因素的影響，只釆取一個清潔土壤樣品 (即無真菌病害發(fā)生)，用不同的溫度處理可使得其真菌拮抗功能逐漸下
降。研究這些處理后的樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的變化就可以找出土 壤真菌拮抗功能的關(guān)鍵菌群。


圖1為本發(fā)明各處理土壤樣品真菌拮抗功能圖。
圖2不同真菌拮抗能力土壤的細(xì)菌組成UPGMA聚類圖。圖標(biāo)為土壤樣 品間遺傳距離。對照為自然土壤，樣品1、 2、 3分別為10(TC、 ll(TC、 121 。C處理4 min土壤樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建
土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法將采集的土樣高壓高溫，建立土壤抑 真菌能力逐漸降低的土壤真菌拮抗模型，通過如下步驟進(jìn)行構(gòu)建
1) 釆集土壤樣品；
2) 高壓高溫處理土壤樣品；
3) 檢測真菌拮抗功能；
所述步驟l)中的土壤樣品為無植物病害的土壤；所述步驟2)將土壤 樣品分4份，l份為未處理的空白對照，另外3份分別在高壓滅菌鍋內(nèi)100 。C、 ll(TC和12rC處理4min;所述步驟3 )將高溫高壓處理后的土樣分別接入禾谷鐮刀菌Fusar!'iM graffl!'加ar咖的瓊脂糖菌絲塊，在25-28。C培養(yǎng) 3-5天后檢測菌絲直徑，通過檢測菌絲直徑即得到土壤抑真菌能力逐漸降低 的土壤真菌拮抗模型。
釆取叉花式釆樣法從中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實(shí)驗(yàn)站釆集近十年未受農(nóng)藥 和肥料影響的自然荒地土壤，分別釆集0-20cm表層土壤，充分混勻，過 2mm篩子后分成四份，其中一份為空白對照，另外3份每份設(shè)3個重復(fù)，每 個重復(fù)稱取40g土壤于培養(yǎng)皿中，分別于高壓滅菌鍋內(nèi)IO(TC、 ll(TC以及 12rC處理4min。從已培養(yǎng)好禾谷鐮刀菌Fusari咖gra/n&ear咖PDA平板 邊緣取直徑為0.8cm菌絲體生長旺盛的圓形瓊脂糖塊置于已處理土壤的中 央，然后于2Sr避光培養(yǎng)三天，測量菌絲體擴(kuò)散生長圈直徑大小，并根據(jù) 真菌菌絲生長相對抑制率建立具有高、中、低和極低真菌拮抗功能的土壤 模型(參見圖1)。將高拮抗能力土壤對真菌生長的抑制率設(shè)為1,而極低 拮抗能力土壤的真菌生長抑制率設(shè)為0,用以下公式來計算其它兩種土壤的 真菌生長相對抑制率
真菌生長相對抑制率-l- (Dn-DO) / (Dl _D0) x簡
式中Dn代表土壤中真菌生長圈直徑，D0和D1分別為極低拮抗能力和 高拮抗能力土壤中真菌生長圈直徑。
高、中、低和極低拮抗能力土壤的真菌生長抑制率分別為1， 74%， 49%,0。
驗(yàn)證土壤真菌拮抗模型的拮抗能力
1) 土壤微生物基因組總DM的提取釆用FastPr印DNA提取儀及試 劑盒(Bio-101, Thermo)對處理后具不同真菌拮抗能力的土壤進(jìn)行總MA
提取，按說明書進(jìn)行具體操作。
2) 細(xì)菌16S rDNA片段的擴(kuò)增與克隆文庫的構(gòu)建用細(xì)菌16S rDNA通 用引物 27F 5 ，—AGAGTTTGATCATGGCTCAG—3 ) 和 1492R ( 5 ，
-GGTTACCTTGTTACGACTT -3，)對土壤微生物基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得全長約為1.5Kb的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后，利用 DNA膠純化試劑盒(DV805A , TaKaRa,大連)回收。純化后的PCR產(chǎn)物與 pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E. coh' JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含有IPTG和X-gal 的LB (含lOOmg/L Amp)平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆子，建立 16S rDNA克隆文庫。
3) 16S rDNA的RFLP分析用載體引物M13-47重新擴(kuò)增陽性克隆子中 插入的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物先后用限制性內(nèi)切酶r叫I (65°C， 12hr ) 和/7i/2fl (37°C, 12hr)消化。取8 p 1酶切產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳
(BIO-RAD),釆用10%的膠濃度，1 x TAE ( 40mMTris, 20mM冰乙酸，1 mM Na廣EDTA), 120V條件下電泳lhr。電泳后凝膠用GeneFinder核酸染料染 色并在凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)成像保存。比較酶切帶型及分布情況，并 用POPGENE軟件對其進(jìn)行分析。結(jié)果表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與自然土壤的相差越遠(yuǎn)，則真菌拮抗功能越弱(圖2)。 12rc處理的土壤樣品3與自然
對照土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性最低，其土壤真菌拮抗能力最差。
4)測序和同源性比較選擇特異性O(shè)TU用載體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純 化，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將所得序列用BLAST軟件在 GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較，獲取同源性較高的相關(guān)菌株16S rRNA 基因序列，并提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫。結(jié)果表明，與Pseudofflonas, v4cidoba"e"'a , Alphaproteobacter ia, Betaproteobacter ia 和 Fk;dbac"r相似性最高的克隆所代表的細(xì)菌在土壤真菌拮抗功能中起著 決定性的作用。
實(shí)施例2
與實(shí)施例1不同之處在于
釆用的土樣為黑龍江海倫生態(tài)實(shí)驗(yàn)站采取的黑土，而后按照實(shí)施例1 的操作步驟進(jìn)行構(gòu)建模型。
經(jīng)過驗(yàn)證可知其黑龍江海倫生態(tài)實(shí)驗(yàn)站釆取的黑土中，發(fā)現(xiàn) Alphaproteobacter ia, Betaproteobacter ia， 5uri:i3o7c eWa，尸seuc/oM^as， 5aciUus， XaiUi30fflo朋s相似性最高的克隆所代表的細(xì)菌在土壤真菌拮抗 功能中起著決定性作用。
權(quán)利要求
1. 一種土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法，其特征在于將采集的土樣高壓高溫，建立土壤抑真菌能力逐漸降低的土壤真菌拮抗模型，通過如下步驟進(jìn)行構(gòu)建1)采集土壤樣品；2)高壓高溫處理土壤樣品；3)檢測真菌拮抗功能；所述步驟1)中的土壤樣品為無植物病害的土壤；所述步驟2)將土壤樣品分4份，1份為未處理的空白對照，另外3份分別在高壓滅菌鍋內(nèi)100℃、110℃和121℃處理4min；所述步驟3)將高溫高壓處理后的土樣分別接入禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum的瓊脂糖菌絲塊，在25-28℃培養(yǎng)3-5天后檢測菌絲直徑，通過檢測菌絲直徑即得到土壤抑真菌能力逐漸降低的土壤真菌拮抗模型。
2. 按照權(quán)利要求1所述的土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟1 )中土壤樣品通過叉花式釆樣法進(jìn)行樣品釆集。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種土壤真菌拮抗模型的構(gòu)建方法。具體為將采集的土樣高壓高溫，建立土壤抑真菌能力逐漸降低的土壤真菌拮抗模型，通過如下步驟進(jìn)行構(gòu)建1)采集土壤樣品；2)高壓高溫處理土壤樣品；3)檢測真菌拮抗功能。本發(fā)明模型構(gòu)建方法簡便可行，一般實(shí)驗(yàn)室均可操作，且耗時短。并且該模型可應(yīng)用于不同土壤樣品，研究不同土壤的真菌拮抗功能，發(fā)現(xiàn)土壤特異的抑真菌微生物；不僅可以研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，還可以研究真菌以及放線菌等其它微生物的群落結(jié)構(gòu)組成與真菌拮抗功能的關(guān)系。
文檔編號G01N33/00GK101413934SQ20071015756
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者吳敏娜, 張惠文, 張成剛, 旭 李, 李新宇, 蘇振成 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所