專利名稱：酶解半纖維素制備高純度甘露低聚糖的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶技術和生物化工技術，更確切說是一種酶解含甘露聚糖的半纖維素生成純度高達98% (P98)的甘露低聚糖的制備方法及產品，是胃腸道健康、免疫調節(jié)、抗病防病藥物的新型原料和助劑。
背景技術：
半纖維素(Hemicellulose)是指在植物細胞壁中與纖維素共生、可溶于堿溶液， 遇酸后遠較纖維素易于水解的那部分植物多糖。半纖維素主要分為三類，即聚木糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類。本發(fā)明所涉及到的半纖維素是聚葡萄甘露糖類(代表產品是魔芋膠)和聚半乳甘露糖類(代表產品是瓜爾豆膠)，統(tǒng)稱甘露聚糖類。半纖維素中的甘露聚糖經酶水解生成低碳鏈甘露糖雜聚物。已有的文獻表明，低碳鏈甘露糖雜聚物(也稱甘露低聚糖或甘露寡糖)，能顯著增進人體腸道內以雙歧桿菌為代表的有益菌的增殖、減少動物腸道病原菌，還能增強免疫力、提高腸黏膜功能等多種特性。 最近的報道是，黃代勇等(酶法生產高純度P95甘露低聚糖中試研究，食品科技，2007，10)， 李劍芳等(β-甘露聚糖酶制備魔芋葡甘露低聚糖的研究，食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，01)，張敏等(野皂莢多糖膠制備半乳甘露低聚糖的研究，食品工業(yè)斜技，2008，09，)，王玲玲等(酶解法制備低相對分子質量胡蘆巴半乳甘露聚糖及其產物的表征，林產化學與工業(yè)，2009， 四卷(2)，吳長菲等(魔芋葡甘露低聚糖的酶法制備工藝的初步研究，生物技術通報，2010， 01)。迄今為止，有關低碳鏈甘露糖雜聚物的制備方法研究中，或是存在酶活力不高，底物濃度低，成本高，缺乏工業(yè)生產的基礎；或是水解過程中加堿、加酸，給后處理工藝帶來困難，還不利于環(huán)保；或是產品的純度較低，普遍僅為70 80%，雖然黃代勇等(2007)的研究成果中，魔芋甘露低聚糖的純度達到了 95%，但其糖分子聚合度大至3 10糖，由于功能作用的局限性，還只能應用于食品和化工產品中，要應用到醫(yī)藥產品中還有一定的差距。特別是半乳甘露低聚糖研究水平還很低，離工業(yè)化還有很大的差距。因此，甘露低聚糖的原料多樣性及高純度制備方法仍然面臨很多的技術難題。而這也是本發(fā)明創(chuàng)新技術的起點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種以含甘露聚糖的半纖維素為原料，采用保藏號為CCTCC No: M 211147(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址.中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年 08月14日)的枯草芽孢桿菌TQBm (Bacillus subtilis)的枯草芽孢桿菌TQBm發(fā)酵產出的高效能甘露聚糖酶技術、食品生產技術、精細化工技術之系統(tǒng)集成生產純度高達98% (Ρ98)，分子聚合度為4 8糖的甘露低聚糖的方法及產品，該產品可作為胃腸道健康、免疫調節(jié)、抗病防病藥物的新型原料和助劑。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，其工藝過程為
1、酶解轉化。加入保藏號為CCTCC No: M 211147的枯草芽孢桿菌TQ&I1發(fā)酵產出的高效能β-甘露聚糖酶，底物為魔芋膠時，酶解轉化的底物濃度為15 20%，酶料比為酶魔芋膠=Iml :30g ；；底物為瓜爾豆膠時，解轉化的底物濃度為10 15%，酶料比為酶瓜爾豆膠=Iml :15g。；降解溫度48 52°C，攪拌40 60r/min，pH 6. 5 7. 5，降解時間3 4 小時，降解粘度至80 100 mPa s時停止酶解轉化，降解原液半纖維素中甘露聚糖的生物轉化率為85 95%。2、離心分離，將酶解物離心去雜；
3、絮凝、澄清、過濾處理；
4、離子交換處理；
5、超濾和分子篩純化處理；
6、真空濃縮處理；
7、噴霧干燥處理，產出甘露低聚糖成品。8、利用液相色譜和質譜對甘露低聚糖進行檢測總糖^ 99. 5% ；功效成份甘露2 糖 甘露10糖> 98.0 %，其中，甘露4糖 甘露8糖占85%以上。本發(fā)明采用保藏號為CCTCC No: M 211147的枯草芽孢桿菌TQfei發(fā)酵產出的高效能β -甘露聚糖酶技術和食品生產技術、精細化工技術之系統(tǒng)集成制備源于魔芋膠和瓜爾豆膠的Ρ98甘露低聚糖，工藝簡單，能耗低，操作方便，產品純度高，成本可控，無化學污染。本發(fā)明所用甘露聚糖的半纖維素包括魔芋膠、瓜爾豆膠、槐豆膠、田菁膠、皂莢膠、 胡蘆巴膠等。本發(fā)明所生產出的產品純度高，功效成份甘露4糖 甘露8糖占的比重大，具有在同類產品中可唯一應用于醫(yī)藥產品的優(yōu)勢，將大大啟發(fā)人們拓展低聚糖高端應用范圍的新思路，新創(chuàng)造、新前景。
具體實施例方式下面以實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例1 1、酶解；
a)加水在1000L酶解罐中，按有效容量700kg計，魔芋膠水=20 80(w/w)，加水560kg 于降解罐中，水的pH在6. 5 7. 5之間。b)預熱酶解罐夾套通入蒸汽或熱水把罐內的水預熱至50 52°C。c)加酶待降解水溫穩(wěn)定后，按酶與底物之比為1: 20 30加入β-甘露聚糖酶 BM—II，并不斷攪拌，使其混合均勻，保溫5 10 min后投料。d)加料稱取魔芋膠140kg加入酶解罐中，底物濃度15 20%，并充分攪拌。e)酶解罐內溫度保持在50 55°C之間，不斷攪拌，酶解3 4小時。在酶解過程中用NDJ — 1型旋轉粘度計，以12rpm的轉速檢測50°C時酶解液的粘度，當酶解液粘度為80 100 HiPWiPs時，停止降解，該液體稱為“酶解液原液”。2、用離心機過濾除渣得初濾液；
3、采用硅藻土過濾和0.2 μ m微濾膜進行微濾處理得微濾液；
4、用孔徑為截留3萬分子量的聚礬超濾膜作超濾提純，工作條件為溫度25 35°C， 壓力0. 1 0. 12 Mpa，物料流速300 350L/h。
5、用孔徑為截留6千分子量的聚颯超濾膜作進一步超濾提純，工作條件為溫度 25 35°C，壓力 0. 1 0. 12MPa，物料流速 300 350L/h。6、采用D315大孔樹脂一 732陽離子交換樹脂一 717陰離子交換樹脂的樹脂組合對降解液進行脫鹽、脫色、脫味的提純處理，取樣檢測色值和灰分，脫色率為97%，灰分0. 1%，得離子交換提純液；
7、將離子交換提純液經真空濃縮、噴霧干燥后得到P98甘露聚糖58. 3kg，糖粉得率為41.64% (相對于魔芋膠)。利用液相色譜一質譜聯(lián)用檢測P98魔芋甘露低聚糖，總糖 ^ 99. 5%，功效成份(甘露2糖 甘露10糖)^ 98. 0%,其中，甘露4糖 甘露8糖占85%以上。實施例2:
1、酶解；
a)加水在1000L酶解罐中，按有效容量700kg計，瓜爾豆膠水=15:85 (w/w)，加水 595kg于酶解罐中，水的pH在6. 5 7. 5之間。b)預熱酶解罐夾套通入蒸汽或熱水把罐內的水預熱至50 52°C。c)加酶待溫度穩(wěn)定在要求的溫度時，按酶與底物之比為1: 10 15加入β-甘露聚糖酶BM—II。并不斷攪拌，使其混合均勻，保溫5 10分鐘后投料。d)加料稱取瓜爾豆膠105kg加入酶解罐中(底物濃度15%)，充分攪拌。e)酶解罐內溫度保持在50 55°C之間，不斷攪拌，酶解3 4小時。在酶解過程中用NDJ — 1型旋轉粘度計，以12rpm的轉速檢測50°C時酶解液的粘度，當酶解液粘度為80 100 HiPWiPs時，停止酶解，該液體稱為“酶解液原液”。以下離心分離、過濾、微濾、超濾提純、樹脂處理提純、濃縮干燥等工序與實施例1 相同。制備出P98甘露低聚糖成品47.7 ,糖粉得率為45.45% (相對于瓜爾豆膠)。 利用液相色譜一質譜聯(lián)用檢測P98瓜爾豆膠甘露低聚糖，總糖99. 5%，功效成份(甘露2 糖 甘露10糖)> 9896，其中，甘露4糖 甘露8糖占85%以上。實施例3
以槐豆膠，田菁膠，皂莢膠，胡蘆巴膠為原料，應用β-甘露聚糖酶BM— II制備P98甘露低聚糖的方法與實施例2相同。功能試驗結果
Ρ98甘露低聚糖 < 調節(jié)人體腸道菌群的功能試驗>
體檢指標全部正常的30名成年志愿者試食Ρ98甘露低糖后的檢測結果如下
*與食用前比較P <0.05**與食用前比較P < 0. 01
結論受試人群腸道內的菌群數(shù)量發(fā)生有益的變化糞便中雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量明顯增加，差異有極顯著性(Ρ<0.01 )，擬桿菌的數(shù)量明顯增加，差異有顯著性(P<0. 05 )，腸桿菌數(shù)量明顯減少，差異有極顯著性(P < 0. 01 )。 P98甘露低聚糖 < 調節(jié)人體血糖血脂功能試驗>
權利要求
1.一種酶解半纖維素制備高純度甘露低聚糖的生產方法，其特征在于其工藝過程為1)、酶解轉化使用保藏號為CCTCCNo: M 211147芽孢桿菌TQ&I1發(fā)酵產出的β-甘露聚糖酶來酶解含甘露聚糖的半纖維素，底物濃度10 20%，酶底比為1:15 30(v/w)； 降解溫度48 52°C，攪拌40 60r/min，pH 6. 5 7. 5，降解時間3 5小時，降解粘度至80 100 mPa s時停止酶解轉化，降解原液半纖維素中甘露聚糖的生物轉化率為85 95% ；所述含甘露聚糖的半纖維素是指魔芋膠，瓜爾豆膠，槐豆膠，田菁膠，皂莢膠，胡蘆巴膠；2)、離心分離，將酶解物離心去雜；3)、絮凝、澄清、過濾處理；4)、離子交換處理；5)、超濾和分子篩純化處理；6)、真空濃縮處理；7)、噴霧干燥處理，產出甘露低聚糖成品，經檢測總糖99.5%;功效成份甘露2 糖 甘露10糖> 98. 0%，其中，甘露4糖 甘露8糖占85%以上。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶解含甘露聚糖的半纖維素，制備高純度甘露低聚糖的方法，其特征在于酶解反應的最佳條件為底物濃度15 20%，酶底比為1:15 30(v/w)， PH 7. 0，溫度50°C，時間3小時，降解原液中半纖維素酶解成甘露聚糖的生物轉化率為85 95%。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種酶解含甘露聚糖的半纖維素，制備高純度的甘露低聚糖方法及產品，它是利用保藏號為CCTCCNo:M211147枯草芽孢桿菌TQBm發(fā)酵產出的高效能β-甘露聚糖酶BM—Ⅱ，將魔芋膠、瓜爾豆膠、槐豆膠、田菁膠等含甘露聚糖的半纖維素水解成相對小分子物質，然后經離心分離，絮凝澄清，離子交換技術脫鹽、脫色、脫味，再用超濾技術和分子篩層析技術相結合分離糖液中的大分子物質，最后經濃縮、干燥，制備出高純度甘露低聚糖。用本發(fā)明制備出高純度甘露低聚糖，不僅操作簡單，分離效果好，而且成本低，無化學污染，可實現(xiàn)工業(yè)化生產。本發(fā)明的甘露聚糖產品可極顯著增殖人體腸道雙歧桿菌等有益菌，極顯著減少腸桿菌等有害菌，還具有降血糖、血脂及免疫調節(jié)作用，是胃腸道健康、降糖降脂、免疫調節(jié)、抗病防病藥物的新型原料和助劑。
文檔編號C12P19/14GK102373256SQ20111030532
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權日2011年10月10日
發(fā)明者劉仁武, 劉雯, 廖園園, 李小虎, 汪修武, 錢金宏, 黃代勇, 黃偉 申請人:武漢東方天琪生物工程有限公司