專利名稱：活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，用于對污水生物處理系統(tǒng)活性污泥中氨氧化菌的定量檢測。
背景技術(shù)：
污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的微生物學(xué)研究是污水生物處理中最基本、最重要的內(nèi)容， 是污水生物處理系統(tǒng)高效穩(wěn)定運行的保障。傳統(tǒng)的微生物學(xué)研究方法過于依賴純培養(yǎng)技術(shù)進行菌種分離，該方法對于研究污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的微生物有一定的局限性。首先，污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的微生物菌群是由多種微生物構(gòu)成、具有一定空間分布的聚集體。這些微生物相互依存、相互競爭，具有復(fù)雜的種群關(guān)系。當(dāng)進行菌種分離培養(yǎng)后，將無法獲取自然條件下微生物菌群結(jié)構(gòu)與空間分布的信息。其次，由于微生物的基因表達和代謝活性受外界環(huán)境因素的影響較大，菌種的分離培養(yǎng)將會改變微生物的生理生化特性，從而降低對實際工程實踐的指導(dǎo)意義。此外，純培養(yǎng)需要較長的時間，而且有些菌種(如硝化菌中的 Nitrospira)目前還無法通過純培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)純種分離。水體富營養(yǎng)化的日趨嚴(yán)重迫使國家嚴(yán)格控制排放到天然水體的氮、磷濃度，從而使污水生物脫氮除磷新技術(shù)和微生物研究成為熱點。污水生物脫氮涉及硝化和反硝化兩個過程，其中硝化過程的主要功能微生物是硝化菌，包括氨氧化菌(ammonia oxidizing bacteria, A0B)和亞硝酸鹽氧化菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)。AOB 作為污水生物脫氮的主要功能微生物之一，在污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的生物活性和菌群分布的穩(wěn)定性， 是保證污水生物脫氮系統(tǒng)穩(wěn)定運行的關(guān)鍵因素。近年來，分子生物技術(shù)的快速發(fā)展為污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)微生物研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技術(shù)對不同工藝、水質(zhì)條件下的AOB菌群結(jié)構(gòu)、活性等進行研究分析，能夠為污水生物脫氮系統(tǒng)的長期穩(wěn)定運行提供有力保障。目前，以PCR為代表的分子生物技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的分子生物技術(shù)。PCR技術(shù)解決了從環(huán)境樣品中提取的DNA 或RNA含量過低而不能進行相關(guān)分析的難題。實時熒光定量PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上誕生的一項新技術(shù)，它是通過熒光信號實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法，至今已經(jīng)成為基因定量和表達解析的必要手段。實時熒光定量PCR秉承和發(fā)展了普通PCR快速、高靈敏度檢出等全部優(yōu)點，同時克服了普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等的不足，可以說實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，擴展了 PCR技術(shù)的應(yīng)用范疇，是一種具有劃時代意義的技術(shù)。本發(fā)明采用實時熒光定量PCR技術(shù)對污水生物處理系統(tǒng)活性污泥中的AOB進行定量檢測。本發(fā)明在技術(shù)上不同于現(xiàn)有技術(shù)，主要體現(xiàn)在以下三方面(1)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的來源。應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)首先要建立標(biāo)準(zhǔn)品DNA含量與達到熒光域值時的循環(huán)數(shù)Ct值(Threshold Cycle)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這就涉及標(biāo)準(zhǔn)品 DNA的來源?，F(xiàn)有技術(shù)主要是從純培養(yǎng)的目標(biāo)菌中提取基因組DNA或是化學(xué)合成DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。目標(biāo)菌的純培養(yǎng)需要較長的時間、費用較高，而且有些活性污泥微生物(如硝化菌中的Nitrospira)目前還無法實現(xiàn)純培養(yǎng)?；瘜W(xué)合成DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品首先要通過基因測序知道目標(biāo)基因序列，否則無法合成。而本發(fā)明采用的是來自污水處理廠的活性污泥，對活性污泥中的目標(biāo)菌AOB進行富集培養(yǎng)，然后提取基因組DNA，無需純培養(yǎng)和目標(biāo)基因序列。(2)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的制備方法?，F(xiàn)有技術(shù)主要是采用含有目標(biāo)DNA片段的質(zhì)?？寺?。 利用質(zhì)?？寺〗⒌臉?biāo)準(zhǔn)曲線的重現(xiàn)性好，但其操作較為繁瑣，費用較高，對操作者的技術(shù)水平要求較高。對于生命科學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠達到這樣的要求，但對于污水處理廠的技術(shù)人員實施起來難度較大，不便于對污水處理廠的日常運行進行監(jiān)控，從而限制了在污水處理領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明采用基因組DNA兩次常規(guī)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳切膠純化回收產(chǎn)物的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品DNA，即能滿足檢測靈敏度和準(zhǔn)確度的要求，又能減化操作，費用相對低廉，具有更強的適用性。(3)定量檢測的環(huán)境樣品。目前，實時熒光定量PCR主要應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)Σ《?、致病菌的檢測分析。如果將其應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)主要功能微生物AOB的檢測，待測樣品為污水處理系統(tǒng)中的活性污泥，樣品本身具有極強的特殊性。由于活性污泥受廢水污染，其中含有大量未知的有機、無機污染物、顆粒物、雜質(zhì)等，還有其它與AOB共存于活性污泥中的菌膠團，對DNA的提取純化干擾較大，并進而影響后續(xù)的PCR擴增。因此，活性污泥微生物基因組DNA的提取方法、PCR擴增體系及反應(yīng)條件需要特殊確定，難度較大。故本發(fā)明從富集培養(yǎng)氨氧化菌的活性污泥中提取基因組DNA，采用基因組DNA PCR 擴增片段切膠純化回收產(chǎn)物法建立檢測AOB的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水全程生物脫氮和短程生物脫氮活性污泥中氨氧化菌進行定量檢測，國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。本發(fā)明為污水生物脫氮系統(tǒng)中主要功能微生物氨氧化菌的定量檢測提供了一種經(jīng)濟、簡便、可靠的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟、簡便、可靠的活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR檢測方法，縮短標(biāo)準(zhǔn)品制備時間，簡化操作步驟，并且可同時進行大批量的樣本分析。與傳統(tǒng)的利用質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法相比，檢測時間明顯縮短，可用于污水生物處理系統(tǒng)中氨氧化菌菌群數(shù)量的監(jiān)控和鑒定，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的技術(shù)方案一種活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于提取富集程度在80%以上的氨氧化菌的基因組DNA，經(jīng)第一次常規(guī)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后，將含有116個堿基對的凝膠條帶切下并提取其中的DNA擴增片段。提取的DNA片段再進行第二次常規(guī)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，將第二次瓊脂糖凝膠電泳中含116個堿基對的凝膠條帶切下，提取其中的DNA擴增片段作為實時熒光定量PCR檢測氨氧化菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品，在實時熒光定量PCR儀上進行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。并利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對活性污泥中氨氧化菌進行定量檢測。上述兩次常規(guī)PCR擴增體系及反應(yīng)條件如下
權(quán)利要求
1. 一種活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于提取富集程度在80%以上的氨氧化菌的基因組DNA，經(jīng)第一次常規(guī)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后，將含有堿基對的凝膠條帶切下并提取其中的DNA擴增片段；提取的DNA片段再進行第二次常規(guī) PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，將第二次瓊脂糖凝膠電泳中含堿基對的凝膠條帶切下，提取其中的DNA擴增片段作為實時熒光定量PCR檢測氨氧化菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品，在實時熒光定量PCR 儀上進行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；并利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對活性污泥中氨氧化菌進行定量檢測；上述兩次常規(guī)PCR擴增體系及反應(yīng)條件如下組分體積無菌雙蒸水37.75含Mg2+的10倍PCR反應(yīng)緩沖液5脫氧核糖核苷酸dNTP (2.5 mM)4正向引物 CT0189fA/B 和 CT0189fC1(10umol/L)1反向引物 RTlr (10umol/L)1Taq 酶(5υ/μ1 )0.25DNA模板1總體積50上述常規(guī)PCR擴增條件如下94°C下預(yù)處理3min ；30個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95°C 45s,58°C 30s,72°C 45s ；最后 72°C 4min ；上述瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖質(zhì)量百分比濃度為3%，電泳電壓為75V，電泳時間為 90min ；上述實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為組分體積無菌雙蒸水8.5正向引物 CT0189fA/B 和 CT0189fC (10umol/L) 0.75反向引物 RTlr (10umol/L)0.75探針 TMPl (3.125umol/L)1日本寶生物公司合成的Rox reference II0.52 倍 Taq 酶12.5DNA模板1總體積25擴增條件為95°C 30s ；40個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95°C 5s, 60°C 20s ； 上述正向引物CT0189fA/B和CT0189fC按摩爾比2 1混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，用于對污水處理廠活性污泥中的氨氧化菌的定量檢測。目前，研究者多是采用等梯度稀釋含有目標(biāo)DNA片段的質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)品，進而建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，但操作較為繁瑣且成本較高。本發(fā)明采用基因組PCR擴增片段切膠純化回收產(chǎn)物法建立檢測氨氧化菌的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，初始模板數(shù)的對數(shù)與熒光域值的循環(huán)數(shù)Ct值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對活性污泥中氨氧化菌進行定量檢測。本發(fā)明為污水生物脫氮系統(tǒng)中主要功能微生物氨氧化菌的定量檢測提供了一種經(jīng)濟、簡便、可靠的分析方法。
文檔編號C12R1/01GK102329874SQ201110305190
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者彭永臻, 曾薇, 李博曉, 李磊, 王向東 申請人:北京工業(yè)大學(xué)