一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種酪蛋白?百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法及用途。本發(fā)明通過將百里香精油包裹在酪蛋白脂質(zhì)體中，以實(shí)現(xiàn)減少百里香精油在施用過程中的揮發(fā)，從而減少百里香精油的浪費(fèi)，提高其利用率，達(dá)到長(zhǎng)效抗菌與高效利用的目的。
【專利說明】
一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種酪蛋白-百里香 精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 百里香，屬于常綠灌木草本植物，是唇形科植物，花期7-8月，小堅(jiān)果近圓形或卵圓 形。主要有以百里酚為主的百里香酚百里香、含最多沉香醇的沉香醇百里香、以側(cè)柏醇為主 的側(cè)柏醇百里香這三種。百里香精油具有治感冒、祛風(fēng)、健脾消食、止咳化痰、溫中散寒等作 用。在海鮮、肉類、魚類等食品中應(yīng)用廣泛，是天然的調(diào)味香料，可去除腥味，增加菜肴的風(fēng) 味;百里香中含有大量的單萜等揮發(fā)性成分，對(duì)人體具有極高的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0003]國(guó)內(nèi)已有很多關(guān)于百里香在食品、化妝品、醫(yī)藥技術(shù)等領(lǐng)域的專利申請(qǐng)。 CN103333509A公開了一種含有百里香精油的可食性魚皮膠原蛋白抗菌膜及其制備方法。制 備的膠原蛋白抗菌膜具有良好的抗菌性能，能被生物降解，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，能抑制食 品表面微生物的生長(zhǎng)，從而達(dá)到食品保鮮及延長(zhǎng)貨架期的效果。CN104739952A公開了一種 具有促進(jìn)傷口愈合作用的復(fù)方茶樹精油，能促進(jìn)皮膚新陳代謝，促進(jìn)傷口愈合，且可防留 疤。CN1618294公開了一種從天然芳香植物百里香中提取的精油作為活性成分的驅(qū)螨組合 物，24h驅(qū)避率均達(dá)到100%<XN102178251A公開了一種百里香羊肉除膻調(diào)味劑，除膻效果良 好，色澤優(yōu)美，百里香香氣適宜，口感和諧自然，具有很高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。 CN104379156A公開了一種鋪地百里香提取物，用于治療腸炎性疾病。CN104478607A公開了 一種百里香酚殺菌劑及其該殺菌劑幾種劑型的制備方法。該殺菌劑低毒、環(huán)保、安全、無害， 是一種非常具有市場(chǎng)應(yīng)用前景的殺菌劑。CN104381334A公開了一種微囊懸乳劑，特別是含 有阿維菌素、百里香酚、茚楝油、生半夏活性成分的微囊懸乳劑的配方及其制備方法。阿維 菌素和百里香酚具有協(xié)同增效作用，復(fù)配作用明顯，大大降低農(nóng)藥的用藥量，還可擴(kuò)大殺蟲 譜，提尚殺蟲效率。
[0004] 雖然百里香精油在醫(yī)學(xué)，食品和化妝品行業(yè)被廣泛應(yīng)用，具有較好的殺菌、增香等 特點(diǎn)，但是百里香精油易揮發(fā)，暴露在空氣中不穩(wěn)定，所以要尋找有效的方法降低百里香精 油在使用過程中的揮發(fā)程度，延長(zhǎng)其貯存期。
[0005] 納米脂質(zhì)體能將精油包裹在內(nèi)，并且納米脂質(zhì)體不會(huì)對(duì)百里香精油的主要活性成 分造成破壞。納米脂質(zhì)體使百里香精油中的活性成分與外界環(huán)境隔絕開來，可以降低百里 香精油的揮發(fā)性，延長(zhǎng)保存期。但由于脂質(zhì)體的緩釋作用，包裹精油的脂質(zhì)體保質(zhì)期有限。 因此，選用酪蛋白制成穩(wěn)定性更高的酪蛋白脂質(zhì)體。此外，納米脂質(zhì)體由于它們的亞細(xì)胞尺 寸，能加強(qiáng)脂質(zhì)體的被動(dòng)吸收機(jī)制，減少物質(zhì)運(yùn)輸阻力，從而增強(qiáng)精油的抗菌效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是公開一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的制備方法及其用途，通過 將百里香精油包裹在酪蛋白脂質(zhì)體中，以實(shí)現(xiàn)減少百里香精油在施用過程中的揮發(fā)，從而 減少百里香精油的浪費(fèi)，提高其利用率，達(dá)到長(zhǎng)效抗菌與高效利用的目的。本發(fā)明由百里香 精油，大豆卵磷脂，膽固醇和表面活性劑，酪蛋白制成酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體。
[0007] 本發(fā)明的制備方法是將百里香精油，大豆卵磷脂，膽固醇混合于有機(jī)溶劑，減壓蒸 發(fā)形成光滑的薄膜，加入水相介質(zhì)溶解膜狀物并超聲成乳液，通過離心和微孔濾膜過濾，得 到粒徑為納米級(jí)的百里香精油脂質(zhì)體，其特征在于:將納米級(jí)的百里香精油脂質(zhì)體與酪蛋 白和表面活性劑的溶液混合，攪拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融化的方法使酪蛋白鑲嵌在脂 質(zhì)體上，通過溫和超聲使脂質(zhì)體閉合，最終形成包裹百里香精油的酪蛋白脂質(zhì)體。
[0008] 本發(fā)明的大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為5:1;用于制備精油脂質(zhì)體的乳液含有 百里香精油的濃度為5.0mg/mL;表面活性劑為十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹百 里香精油的酷蛋白脂質(zhì)體后其最終濃度為1. 〇mg/mL。
[0009] 本發(fā)明中所述的有機(jī)溶劑為氯仿。
[0010] 本發(fā)明中所用的水相介質(zhì)是根據(jù)中國(guó)藥典2000版標(biāo)準(zhǔn)配制的磷酸鹽緩沖溶液，pH 值6.5~7.4,優(yōu)選7.2。
[0011] 所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在Brij-35的磷酸鹽緩沖液中 得到的，Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0012] 本發(fā)明中脂質(zhì)體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，百里香精油脂質(zhì)體與酪蛋白和表面活性 劑的溶液以體積比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為〇. lmg/mL，Brij-35濃度為1 .Omg/ mL〇
[0013] 本發(fā)明中低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在-18°c下冷凍2h，隨后在0°C下緩慢融 化2h。
[0014] 本發(fā)明中溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲2h，溫度范圍0-10°C。
【附圖說明】
[0015] 圖1酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的包封率。
[0016] 圖2酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)。
[0017] 圖3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體對(duì)大腸桿菌的抗菌效果。
[0018] 圖4酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果。
[0019] 表1酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電位。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 通過下面實(shí)例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容，不僅局限于此
[0021] 實(shí)施例1酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的包封率
[0022] 1實(shí)驗(yàn)材料 大豆卵磷脂 BR 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 膽固醇 AR 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 三氯甲烷 AR 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0023] - 百里香精油AR 法國(guó)Florihana精油 Brij-35 GR 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 酪蛋白 CP國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0024] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0025] 1)百里香精油脂質(zhì)體的制備
[0026]①稱取lg大豆卵磷脂，0.2g膽固醇和250mg的百里香精油，加入50mL氯仿使其溶 解。
[0027] ②在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至溶劑蒸干，蒸發(fā)溫度為10~30°C，圓底燒瓶?jī)?nèi)壁會(huì)形成 光滑的薄膜;然后將所得產(chǎn)品放入真空干燥箱中，30°C，真空狀態(tài)下干燥24h。
[0028] ③加入50mL的磷酸鹽緩沖液到圓底燒瓶中進(jìn)行水化，水化超聲波功率為100W，超 聲時(shí)間為5h。
[0029] ④將所得混合液于細(xì)胞超微粉碎儀中以功率360W，工作10s，間隙5s，粉碎30min。
[0030] ⑤將所得產(chǎn)品進(jìn)行離心，4000rpm，15min，取上層液體。
[0031 ]⑥將所得液體用0.22μπι濾膜進(jìn)行過濾，得濾液。
[0032] 2)酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的制備
[0033]①按照上述百里香精油脂質(zhì)體的制備方法，制備百里香精油濃度為5.Omg/mL的百 里香精油脂質(zhì)體。
[0034]②將酪蛋白超聲分散在含10mg/mL Brij-35的磷酸鹽緩沖液中，形成酪蛋白一 Br i j-35溶液，其中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0035]③在50mL百里香精油脂質(zhì)體中添加5mL酪蛋白一 Brij-35溶液，混合均勻。④將所 得混合液于超聲條件下擴(kuò)散lOmin。
[0036] ⑤將所得混合液在-18 °C下冷凍2h。
[0037]⑥將所得混合液在0 °C下緩慢融化2h。
[0038] ⑦通過溫和超聲（功率50W，2h，KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司）使脂質(zhì)體閉 合，所得溶液即為酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體。
[0039] 3)包封率的測(cè)定
[0040]用無水乙醇稀釋百里香精油，逐級(jí)稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，分別吸取lyL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析，對(duì)其主要成分的譜峰面積進(jìn)行自 動(dòng)積分，繪制主成分峰面積-百里香精油濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取lmL酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體樣 品，13500rpm，離心3h，倒掉上清液。接著加入lmL乙醇破乳齊丨」，超聲3h。最后以lOOOOrpm的轉(zhuǎn) 速離心15min，取上清液，用于GC-MS分析。制備好的脂質(zhì)體樣品，對(duì)精油主成分的峰面進(jìn)行 自動(dòng)積分，再根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出脂質(zhì)體中百里香精油的含量。則：
[0041]
[0042] 3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的包封率
[0043] 包封率是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制劑質(zhì)量好壞的最重要的指標(biāo)，也是脂質(zhì)體能否發(fā)揮較普通 制劑高效、低毒等特點(diǎn)的關(guān)鍵。由圖1可看出，百里香精油脂質(zhì)體的包封率為38.42%，酪蛋 白-百里香精油脂質(zhì)體的包封率為75.89%。因此制備酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體可以明顯 提尚脂質(zhì)體的包封率。
[0044] 實(shí)施例2酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)
[0045] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0046] ①空白脂質(zhì)體 [0047]②百里香精油脂質(zhì)體 [0048]③酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體
[0049] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0050] 用美國(guó)布魯克海文儀器公司產(chǎn)的，型號(hào)為BI-9000的高濃度激光粒度儀測(cè)定酪蛋 白-百里香精油脂質(zhì)體的粒徑和多分散系數(shù)(PDI)值，所測(cè)樣品放入樣品池直接測(cè)量即可。
[0051] 3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)
[0052]多分散系數(shù)(PDI)直接反映酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，因此是主要參考 指標(biāo)，脂質(zhì)體的PDI在0~0.3范圍內(nèi)屬于最好，在0.3~0.7范圍內(nèi)較差，但可以接受，當(dāng)Η)Ι> 0.8時(shí)，不予考慮。如圖2所不，空白脂質(zhì)體的粒徑為86.4nm、PDI為0.353,百里香精油脂質(zhì)體 的粒徑為146 · 6nm、PDI為0 · 254，酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的粒徑為628 · 0nm、PDI為0 · 028〇 酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的多分散系數(shù)(PDI)最小，因此制備酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體 可以明顯提尚脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
[0053] 實(shí)施例3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電位
[0054] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0055] ①空白脂質(zhì)體
[0056] ②百里香精油脂質(zhì)體
[0057]③酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體 [0058] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0059] 用英國(guó)馬爾文儀器有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為ZetasirernanoZSZeta的電位儀測(cè)量， 直接將待測(cè)脂質(zhì)體樣品放入電位儀中測(cè)量即可。
[0060] 3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電位
[0061] 表1酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電位
[0062]
[0063]
[0064] Zeta電位也可以直接反映酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，因此也是主要參 考指標(biāo)，脂質(zhì)體的Ze ta電位的絕對(duì)值越大說明脂質(zhì)體越穩(wěn)定性，Ze ta電位的絕對(duì)值在0~30 范圍內(nèi)屬于不穩(wěn)定，在大于30時(shí)脂質(zhì)體較穩(wěn)定性。如表1所示，三種脂質(zhì)體均帶負(fù)電，空白脂 質(zhì)體的Zeta電位為-22.8mV，其絕對(duì)值小于30，脂質(zhì)體不穩(wěn)定；百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電 位為-36. lmV，其絕對(duì)值大于30，脂質(zhì)體較穩(wěn)定;酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的Zeta電位為-41.5mV，其絕對(duì)值最大，脂質(zhì)體最穩(wěn)定。
[0065] 實(shí)施例4酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的抗菌性能
[0066] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0067]①百里香精油脂質(zhì)體(保存7天、30天、60天、90天）
[0068]②酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體(保存7天、30天、60天、90天）
[0069] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0070] 采用平板菌落計(jì)數(shù)法，以大腸桿菌（Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)為模式菌種測(cè)定酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的殘存菌數(shù)。將大腸 桿菌和金黃色葡萄球菌接種到液體培養(yǎng)基中，分別置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件 下震蕩培養(yǎng)24~48h，獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液。取適量處于對(duì)數(shù)期的大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌分別加入含有一定量無菌磷酸鹽緩沖液的試管中（細(xì)菌濃度約為1〇 5~106CFU/mL)， 然后再向試管中加入濃度為20% (v/v)的百里香精油脂質(zhì)體及酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體。 同時(shí)另取兩個(gè)分別含有以上兩種菌的試管并向其中加入等量無菌水(不加脂質(zhì)體)作為對(duì) 照。將各試管均置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件下震蕩反應(yīng)24h。分別于不同時(shí)間點(diǎn) 的取適量培養(yǎng)液進(jìn)行十倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取l〇〇yL稀釋液滴到無菌固體平 板培養(yǎng)基上，涂布均勻之后放入37°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。24~48h后進(jìn)行平板菌落 計(jì)數(shù)，從而對(duì)百里香精油脂質(zhì)體和酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)重 復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0071] 3酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的抗菌性能
[0072] 不同保存期的酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的抗菌活性的變化也可以間接反映脂質(zhì) 體的穩(wěn)定性。因此對(duì)保存7天、30天、60天、90天的百里香精油脂質(zhì)體及酪蛋白-百里香精油 脂質(zhì)體進(jìn)行了抗菌性能評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖3、圖4所示。保存時(shí)間為7天時(shí)，百里香精油脂質(zhì)體與 酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體的抗菌活性相近，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均顯示了良好 的抗菌效果。保存時(shí)間為30天時(shí)，百里香精油脂質(zhì)體的抗菌效果明顯降低，而酪蛋白-百里 香精油脂質(zhì)體仍然顯示出良好的抗菌效果。保存時(shí)間為60天和90天時(shí)，百里香精油脂質(zhì)體 幾乎沒有顯示抗菌效果，而酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體仍然保持良好的抗菌效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，將百里香精油，大豆卵磷脂，膽 固醇混合于有機(jī)溶劑，減壓蒸發(fā)形成光滑的薄膜，加入水相介質(zhì)溶解膜狀物并超聲成乳液， 通過離心和微孔濾膜過濾，得到粒徑為納米級(jí)的百里香精油脂質(zhì)體，其特征在于:將納米級(jí) 的百里香精油脂質(zhì)體與酪蛋白和表面活性劑的溶液混合，攪拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融 化的方法使酪蛋白鑲嵌在脂質(zhì)體上，通過溫和超聲使脂質(zhì)體閉合，最終形成包裹百里香精 油的酷蛋白脂質(zhì)體。2. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為5:1;用于制備精油脂質(zhì)體的乳液含有百里香精油的濃 度為5.0mg/mL;表面活性劑為十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹百里香精油的酪蛋 白脂質(zhì)體后其最終濃度為1 .Omg/mL。3. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所述的有機(jī)溶劑為氯仿。4. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所用的水相介質(zhì)是根據(jù)中國(guó)藥典2000版標(biāo)準(zhǔn)配制的磷酸鹽緩沖溶液，pH值6.5~7.4,優(yōu) 選 7.2。5. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在Brij-35的磷酸鹽緩沖液中得到 的，Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。6. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:脂質(zhì)體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，百里香精油脂質(zhì)體與酪蛋白和表面活性劑的溶液以體 積比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為0. lmg/mL，Bri j-35濃度為1 .Omg/mL。7. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在-18 °C下冷凍2h，隨后在0°C下緩慢融化2h。8. 如權(quán)利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質(zhì)體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲2h，溫度范圍0-10°C。
【文檔編號(hào)】A61Q19/00GK105997561SQ201610521996
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】林琳, 馬翠霞, 崔海英
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)