專利名稱：利用胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤的制作方法
利用胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤 1.發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供了利用胎盤干細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還 提供了用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的包含胎盤干細(xì)胞的化合物，胎盤干細(xì)胞的腫瘤 抑制群的分離群，以及生產(chǎn)此類群的方法。
2.
背景技術(shù)：
人干細(xì)胞是能夠產(chǎn)生多種成熟的人細(xì)胞系的全能性或多能性前體細(xì)胞。現(xiàn)有證據(jù) 證實(shí)，干細(xì)胞可被用于再增殖多種組織(如果不是所有組織)和被用于恢復(fù)生理學(xué)和組織 學(xué)功能。 已經(jīng)表征過(guò)多種不同類型的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。參見例如C即lan等人，美國(guó)專利 號(hào)5， 486， 359 (人間充質(zhì)干細(xì)胞);Boyse等人，美國(guó)專利號(hào)5， 004， 681 (胎兒和新生兒造 血干細(xì)胞和前體細(xì)胞)；Boyse等人，美國(guó)專利號(hào)5， 192，553(同上)；Beltrami等人，Cell 114(6) :763-766(2003)(心肌干細(xì)胞);Forbes等人，J. Pathol. 197 (4) :510-518(2002)
(肝臟干細(xì)胞)。臍帶血和來(lái)源于臍帶血的全部有核細(xì)胞已被用于移植，從而在已進(jìn)行消融 療法(ablative therapy)的患者中部分或完全恢復(fù)造血功能。 胎盤是特別有吸引力的干細(xì)胞來(lái)源。由于哺乳動(dòng)物胎盤來(lái)源充足并且通常作為醫(yī) 學(xué)廢物丟棄，它們代表了醫(yī)療有用的干細(xì)胞的唯一來(lái)源。 目前已經(jīng)證實(shí)，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)經(jīng)過(guò)遺傳修飾時(shí)，具有遷移和浸潤(rùn) 到某些腫瘤細(xì)胞中的能力。參見例如Hung等人，"Mesenchymal Stem Cell Targeting of Microscopic Tumors and Tumor StromaDevelopment Monitored by Noninvasive In vivo Positron Emission tomography Imaging, ，， CI in. Cancer Res. 11(21): 7749-7756(2005)。某些遺傳改造的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞系已經(jīng)表現(xiàn)出可抑制腫瘤生 長(zhǎng)。參見Studney等人，"Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells as Vehicles for Interferon-P Delivery into Tumors， ，，Cancer Res. 62 :3603-3608 (2002M黑色素瘤細(xì)胞 系)；Nakamura等人，"Antitumor Effect of Genetically Engineered MesenchymalStem Cells in a Rat Glioma Model, "Gene Therapy 11 :1155_1164(2004(表達(dá)重組IL-2的間 充質(zhì)干細(xì)胞)。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)表現(xiàn)出在體內(nèi)可促進(jìn)至少一種腫瘤的生長(zhǎng)。參見 Zhu等人，"Mesenchymal Stem Cells Derivedfrom Bone Marrow Favor Tumor Cell Growth In Vivo，"E鄧.Mol. Pathol.(在公開之前被電子公開，2005)(結(jié)腸腺癌細(xì)胞)。
然而，到目前為止，尚未描述過(guò)胎盤來(lái)源的干細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)，或者抑制腫瘤細(xì) 胞增殖的能力。本發(fā)明提供了胎盤干細(xì)胞的此類用途及其群。
3.發(fā)明概述 本發(fā)明提供了利用胎盤干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞群、以及包含胎盤干細(xì)胞的組合物來(lái) 抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還提供了組合物，包括包含具有腫瘤細(xì)胞增 殖抑制性質(zhì)的胎盤干細(xì)胞的組合物。本發(fā)明還提供了基于其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力而選 擇的胎盤細(xì)胞群，及具有此類性質(zhì)的組合物。 —方面，本發(fā)明提供了抑制大量腫瘤細(xì)胞增殖的方法，包括將所述大量腫瘤細(xì)胞
6與大量胎盤干細(xì)胞接觸一段時(shí)間，與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述時(shí)間 足以使所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖。在特定實(shí)施方案中，所述 腫瘤細(xì)胞是實(shí)體瘤的一部分。在另一特定實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是非實(shí)體瘤細(xì)胞類型。 在另一特定實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急 性T-細(xì)胞白血病、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。在所 述方法的另一特定實(shí)施方案中，所述接觸在體外進(jìn)行。在另一特定實(shí)施方案中，所述接觸 在個(gè)體體內(nèi)進(jìn)行。所述個(gè)體可以是哺乳動(dòng)物，例如人。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干 細(xì)胞與所述個(gè)體是HLA匹配的。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞與所述個(gè)體不是 HLA匹配的。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸包括將所述胎盤細(xì)胞靜脈內(nèi)施用至所 述個(gè)體。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸包括將所述胎盤干細(xì)胞在腫瘤位點(diǎn)或靠近 腫瘤位點(diǎn)處施用至所述個(gè)體。在特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞表達(dá)CD200和HLA-G ; 表達(dá)CD73、CD105和CD200 ;表達(dá)CD200和0CT-4 ;表達(dá)CD73、CD105和HLA-G ;表達(dá)CD73和 CD105，并且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞 群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體，;和/或表達(dá)0CT-4并且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下 培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。
在另一特定實(shí)施方案中，所述大量胎盤干細(xì)胞中的至少一部分被改造為表達(dá)細(xì)胞 因子。在更特定的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是IFN-I3或IL-2。 在另一特定實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腫瘤細(xì)胞與一種或多種抗癌化合 物接觸。在另一特定實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腫瘤細(xì)胞與大量間充質(zhì)干細(xì)胞接 觸，例如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腫瘤 細(xì)胞與大量成纖維細(xì)胞接觸。 在另一特定實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腫瘤細(xì)胞與一種或多種干細(xì)胞化 學(xué)趨化劑(chemoattractant)接觸。在更特定的實(shí)施方案中，所述化學(xué)趨化劑是基質(zhì)來(lái)源 的因子-l(SDF-l)。 所述方法可以采用與例如在個(gè)體中對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生可檢測(cè)地抑 制所需的一樣多的胎盤干細(xì)胞。例如，用于與大量腫瘤細(xì)胞接觸的大量胎盤干細(xì)胞可以包 含約1X105個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X106個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X107個(gè)胎盤干細(xì)胞、或約1X108 個(gè)胎盤干細(xì)胞、或更多。在多個(gè)更特定的的實(shí)施方案中，所述方法包括向所述個(gè)體施用至 少約1X1()5、至少約1X1()6、至少約1X1()7、或至少約1X1()8個(gè)胎盤干細(xì)胞。在多個(gè)更特定 的的實(shí)施方案中，所述方法包括施用個(gè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、 或超過(guò)5倍的胎盤干細(xì)胞數(shù)量。可以使用任何本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定個(gè)體中腫瘤細(xì)胞 的數(shù)量。腫瘤細(xì)胞定量的示例性方法描述于美國(guó)專利號(hào)6， 365， 362和6， 645， 731 ;Mehes 等人，Haematologia 31(2) :97-109(2001);禾口 Hardingham等人，Cancer Research53 : 3455-3458(1993)中，其內(nèi)容在此全文引用作為參考。在多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述 方法包括基于個(gè)體的重量施用大量胎盤干細(xì)胞。例如，所述方法包括向所述個(gè)體施用約 1 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、l X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 104個(gè) 胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞 /kg、5X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、lX 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、或約 lXlQ8個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg。在多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述方法包括向所述個(gè)體施用至少約1 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 104個(gè)胎盤干細(xì) 胞/kg、至少約5X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 105 個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至 少約IX 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、或至少約IX 108個(gè)胎盤 干細(xì)胞/kg。 在多個(gè)其他更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞已在體外增殖不超過(guò)30次群 倍增、不超過(guò)20次群倍增、不超過(guò)10次群倍增、或不超過(guò)5次群倍增。在另一特定實(shí)施方 案中，所述胎盤干細(xì)胞已經(jīng)過(guò)冷凍保藏和在所述接觸前解凍。在所述方法的更特定的實(shí)施 方案中，與在缺少所述胎盤干細(xì)胞的條件下的等量腫瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干細(xì)胞 被證實(shí)在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，例如，至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、90%、或95%。 在另一特定實(shí)施方案中，所述方法還包括在向所述個(gè)體施用所述胎盤干細(xì)胞前， 確定所述胎盤干細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，例如篩選所述胎盤干細(xì)胞對(duì)代表性的 樣本腫瘤細(xì)胞增殖的可檢測(cè)地抑制。在本方法的更特定的實(shí)施方案中，在向所述個(gè)體施用 前，與缺少所述胎盤干細(xì)胞的條件下等量腫瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干細(xì)胞被證實(shí)在 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，例如，至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、 或95%。在某些實(shí)施方案中，在向含有腫瘤細(xì)胞的個(gè)體施用前，胎盤干細(xì)胞被確定通過(guò)直 接接觸、通過(guò)非直接接觸(例如，通過(guò)可溶性因子)、或通過(guò)兩者來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。例 如，在所述方法的特定實(shí)施方案中，在向所述個(gè)體施用前，在直接培養(yǎng)試驗(yàn)中，或在例如 transwell試驗(yàn)中，或更優(yōu)選的，同時(shí)在直接培養(yǎng)試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)中，所述胎盤干細(xì) 胞被證實(shí)在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，例如，至少約20 % 、30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、75 % 、 80% 、90%或95% 。在另一特定實(shí)施方案中，針對(duì)與將按照所述方法被施用所述胎盤干細(xì) 胞的個(gè)體的內(nèi)源性的腫瘤細(xì)胞具有相同細(xì)胞類型(例如上皮、鱗狀上皮)、相同組織起源 (例如乳腺、前列腺等)、或更優(yōu)選的具有相同細(xì)胞類型和組織起源的腫瘤細(xì)胞，在體外 篩選所述胎盤干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)的抑制。在另一更特定的實(shí)施方案中，針 對(duì)從所述個(gè)體的活體切片中獲得的腫瘤細(xì)胞，或者從所述個(gè)體的血樣中純化或分離的腫瘤 細(xì)胞，在體外篩選所述胎盤干細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。在所述方法的多個(gè)更特定的實(shí)施 方案中，所述胎盤干細(xì)胞可以來(lái)源于羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜、臍帶或灌流液，并在向所 述患者施用前，與缺少所述胎盤干細(xì)胞的條件下的等量腫瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干 細(xì)胞被證實(shí)在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，如至少約20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、75%、 80%、90%或95%。 本發(fā)明還提供抑制大量腫瘤細(xì)胞，例如血癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，其包括將所
述大量腫瘤細(xì)胞與包含來(lái)源于大量胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或上清液的組合物接
觸一段時(shí)間，與未接觸所述條件培養(yǎng)基或上清液的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述時(shí)間足以使所
述條件培養(yǎng)基或上清液可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖。在特定實(shí)施方案中，所述
接觸在體外進(jìn)行。在另一特定實(shí)施方案中，所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。在另一特定實(shí)施方案中，
所述條件培養(yǎng)基或上清液來(lái)源于與大量腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的大量胎盤干細(xì)胞。 在多個(gè)特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液來(lái)源于與大量腫瘤細(xì)胞共培
養(yǎng)的大量胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例約i : 1、約2 : 1、約3 : 1、約4 : 1，或約5 : i。所述方法可使用條件培養(yǎng)基或上清液，其來(lái)源于單獨(dú)培養(yǎng)或與大量腫瘤 細(xì)胞共培養(yǎng)的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞與使腫瘤細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)可檢測(cè)的抑 制所需的一樣多。例如，條件培養(yǎng)基或上清液可來(lái)源于培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物含有約1 X 105個(gè) 胎盤干細(xì)胞、約ixio6個(gè)胎盤干細(xì)胞、約ixio7個(gè)胎盤干細(xì)胞、或約ixio8個(gè)胎盤干細(xì)胞 或更多。在另一特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液可來(lái)源于共培養(yǎng)物，所述共培養(yǎng)
物含有約1X1()5至約5X105個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X105個(gè)腫瘤細(xì)胞、約1Xl(f至約5X106 個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X106個(gè)腫瘤細(xì)胞、約1Xl(f至約5X107個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1Xl(f個(gè) 腫瘤細(xì)胞、或約1X1()8至約5X108個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X108個(gè)腫瘤細(xì)胞。
在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法的另一特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上 清液是來(lái)源于包含單獨(dú)的、或與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的大量胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基或上 清液，其中產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)量是基于施用該條件培養(yǎng)基的個(gè)體的重量。例如，條 件培養(yǎng)基或上清液可以是由以下培養(yǎng)物產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基或上清液，所述培養(yǎng)物包含約 1 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg接受者體重、5 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、
5 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 106個(gè)胎 盤干細(xì)胞/kg、5 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/ kg、或1 X 108個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg。在另一特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液是來(lái)源 于共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基或上清液，所述共培養(yǎng)物含有約1 X 103至約5 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg 和約1X103個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1X1。4至約5X104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1X104個(gè)腫瘤 細(xì)胞/kg、約1X1()5至約5X105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1X105個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1X106 至約5 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1 X 106個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1 X 107至約5 X 107個(gè)胎盤 干細(xì)胞/kg和約1Xl(f個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg，或約1X1()8至約5Xl()8個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約 1X108個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，所述群包含基于其抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞 群增殖，或抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力所選擇的胎盤干細(xì)胞。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，其包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b) 表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、 CD105和CD200 ;或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，并且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)， 有助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，并且當(dāng) 所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè) 或多個(gè)胚樣體；和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖，或抑制腫瘤的生長(zhǎng)； 以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)分離的細(xì)胞群的方法，其包括選擇這樣的 胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;和(c)可檢測(cè)地 抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急 性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、或肺癌 細(xì)胞；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一實(shí)施方案中，所述方 法包括選擇這樣的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、 CD105和 CD200 ;和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、 慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)
9膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一實(shí)施 方案中，所述方法包括選擇這樣的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá) CD200和0CT-4 ;和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴 瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì) 胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在 另一實(shí)施方案中，所述方法包括選擇這樣的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)； (b)表達(dá)CD73和CD105 ;(c)當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成胚樣體；和(d)可 檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病 細(xì)胞細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、 或肺癌細(xì)胞；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一實(shí)施方案中， 所述方法包括選擇這樣的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴 瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì) 胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在 另一實(shí)施方案中，所述方法包括選擇這樣的胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)； (b)表達(dá)0CT-4 ;(c)當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成胚樣體；和(d)可檢測(cè)地抑 制腫瘤細(xì)胞增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性 T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞；以
及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在上述方法的更特定的實(shí)施方案中， 所述胎盤干細(xì)胞主要來(lái)源于羊膜、絨毛膜、羊膜和絨毛膜、或臍帶。在另一更特定的實(shí)施方 案中，所述方法中使用的干細(xì)胞是臍帶干細(xì)胞。 在生產(chǎn)分離的胎盤干細(xì)胞群的上述方法中，在一實(shí)施方案中，所述方法可包括選 擇表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的至少一種特異性特征的細(xì)胞。在更特定的實(shí)施方案中，所述間充 質(zhì)干細(xì)胞的特異性特征是表達(dá)CD29、表達(dá)CD44、表達(dá)CD90、或表達(dá)上述的組合。在本方法的 另一特定實(shí)施方案中，所述選擇是利用抗體實(shí)現(xiàn)的。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇是利 用流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)的。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇是利用磁珠實(shí)現(xiàn)的。在另一特定 實(shí)施方案中，所述選擇是利用熒光活化的細(xì)胞分選實(shí)現(xiàn)的。在上述方法的另一特定實(shí)施方 案中，擴(kuò)增所述細(xì)胞群。 本發(fā)明還提供例如，根據(jù)任一上述方法生產(chǎn)或選擇的分離的胎盤干細(xì)胞群。在 一實(shí)施方案中例如，本發(fā)明提供包含胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，其中所述胎盤干細(xì)胞 (a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、 CD105和CD200 ;或表達(dá)CD200和 0CT-4 ;或表達(dá)CD73、CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成 的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表 達(dá)0CT-4，且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤 細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；和(c)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，已 確定可檢測(cè)地抑制大量腫瘤細(xì)胞的增殖。 在特定實(shí)施方案中，所述分離的胎盤細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a) 附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;和(c)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比， 已確定可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、 視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述分離的胎盤細(xì)胞群包含胎盤干細(xì) 胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、CD105和CD200 ;和(c)與未與胎盤干 細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，已確定可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述 腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性 髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所 述分離的胎盤細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和 0CT-4;和(c)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，已確定可檢測(cè)地抑制所述大量 腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性 T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。
在另一特定實(shí)施方案中，所述分離的胎盤細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì) 胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73和CD105 ; (c)當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成 胚樣體；和(d)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，已確定可檢測(cè)地抑制所述大 量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急 性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。 在另一特定實(shí)施方案中，所述分離的胎盤細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附 著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;和(c)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞 相比，已確定可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋 巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌 細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞群包含 胎盤干細(xì)胞，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)0CT-4 ;(c)當(dāng)在允許胚樣體形成的 條件下培養(yǎng)時(shí)，形成胚樣體；和(d)與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，已確定可 檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述腫瘤細(xì)胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性 髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤 細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。 本發(fā)明還提供包含任一上述分離的胎盤干細(xì)胞群的組合物。在特定實(shí)施方案中， 所述組合物還包含大量的非胎盤細(xì)胞，如非胎盤干細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓來(lái)源的間 充質(zhì)干細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，所述組合物還包含大量的成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，所述成纖維細(xì)胞是被施用本發(fā)明中描述的胎盤干細(xì)胞組合物的個(gè)體的自體細(xì)胞。
在上述方法、分離的胎盤干細(xì)胞群和組合物中，可通過(guò)額外的標(biāo)記來(lái)定義或選擇 胎盤干細(xì)胞。例如，所述表達(dá)CD200和HLA-G的胎盤干細(xì)胞還表達(dá)CD73和CD105，即，0073+ 和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、CD38—或CD45—。在更特定的 實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、CD38—、CD45—、CD73+和CD105+。在另一特定實(shí)施方案 中，當(dāng)所述群當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述大量的胎盤干細(xì)胞有助于從含有 胎盤干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。 在另一更特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)CD73、 CD105、 CD200的胎盤干細(xì)胞也是 HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是，CD34—、CD38—或CD45—。在另一特定實(shí) 施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、CD38—和CD45—。在更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì) 胞是CD34—、CD38—、CD45—和HLA-G+ 。在另一特定實(shí)施方案中，當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述大量的胎盤干細(xì)胞有助于從含有胎盤干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群中形 成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。 在另一更特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)CD200和0CT-4的胎盤干細(xì)胞也表達(dá)CD73+ 和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中， 所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、 CD38—或CD45—。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞 是CD34—、CD38—、和CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、 CD105+和HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中，當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培 養(yǎng)時(shí)，所述胎盤干細(xì)胞有助于從含有胎盤干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚 樣體。 在另一更特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G的胎盤干細(xì)胞還是 CD34—、 CD38—或CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、 CD38—和CD45—。 在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是0CT-4+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干 細(xì)胞是CD200+。在更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和 CD200+。在另一特定實(shí)施方案中，當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述干細(xì)胞 有助于從含有胎盤干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。
在另一更特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)CD73和CD105、并且當(dāng)所述群在允許胚 樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)有助于從含有胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣 體的胎盤干細(xì)胞，還是CD34—、 CD38—或CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是 0CT-4+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD200+。在另一特定實(shí)施方案中，所述 胎盤干細(xì)胞是0CT-4+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45一。 在另一更特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)0CT-4、并且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成 的條件下培養(yǎng)時(shí)有助于從含有胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體的胎盤 干細(xì)胞，也是CD73+和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD34—、 CD38—和 CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞是CD200+。在另一特定實(shí)施方案中，所述 胎盤干細(xì)胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—。 本發(fā)明中的方法、分離的群和組合物中使用的胎盤干細(xì)胞可來(lái)源于完整的胎盤，
或胎盤的任何部分。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞主要或僅僅來(lái)源于羊膜、或
羊膜和絨毛膜。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中使用的干細(xì)胞來(lái)源于臍帶。 本發(fā)明還提供了包含胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，所述胎盤干細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明中
描述的選擇腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤細(xì)胞群的任何方法制備。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明
提供了包含分離的胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)
CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、CD105和CD200 ;或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或表達(dá)CD73、CD105
和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在
包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，且當(dāng)所述群在允
許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胚胎干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)
胚樣體；和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖，或腫瘤的生長(zhǎng)。 本發(fā)明還提供了冷凍保藏的干細(xì)胞群，例如本發(fā)明中描述的包含胎盤干細(xì)胞的細(xì)
胞群，其中所述細(xì)胞群是腫瘤細(xì)胞抑制性的。例如，本發(fā)明提供了 CD200+、HLA-G+胎盤干細(xì)
胞群，與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比， 述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述細(xì)胞已被冷凍保藏，并且其中所述群用容器來(lái)容納。本發(fā)明進(jìn) 一步提供了 CD73+、 CD105+、 CD200+胎盤干細(xì)胞群，與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞 相比，所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述干細(xì)胞已被冷凍 保藏，且其中所述群用容器來(lái)容納。本發(fā)明還提供了 CD200+、0CT-4+胎盤干細(xì)胞群，與未與 胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的 增殖，其中所述干細(xì)胞已被冷凍保藏，且其中所述群用容器來(lái)容納。本發(fā)明還提供了 CD73+、 CD105+胎盤干細(xì)胞群，與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述胎盤干細(xì)胞可檢 測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述細(xì)胞已被冷凍保藏，且其中所述群用容器來(lái) 容納，并且其中當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下與胎盤細(xì)胞群培養(yǎng)時(shí)，所述干細(xì)胞有助于一 個(gè)或多個(gè)胚樣體的形成。本發(fā)明還提供了 CD73+、 CD105+、 HLA-G+胎盤干細(xì)胞群，與未與胎 盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制所述大量腫瘤細(xì)胞的增 殖，其中所述細(xì)胞已被冷凍保藏，且其中所述群用容器來(lái)容納。本發(fā)明還提供了 0CT-4+胎 盤干細(xì)胞群，與未與胎盤干細(xì)胞接觸的大量腫瘤細(xì)胞相比，所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制 所述大量腫瘤細(xì)胞的增殖，其中所述細(xì)胞已被冷凍保藏，且其中所述群用容器來(lái)容納，并且 其中當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下與胎盤細(xì)胞群培養(yǎng)時(shí)，所述干細(xì)胞有助于一個(gè)或多個(gè)胚 樣體的形成。 在任何前述冷凍保藏的群的特定實(shí)施方案中，所述容器是袋子。在多個(gè)特定實(shí)施 方案中，所述群包括大約、至少或至多1 X 106個(gè)所述干細(xì)胞、5X 106個(gè)所述干細(xì)胞、1 X 107 個(gè)所述干細(xì)胞、5X 107個(gè)所述干細(xì)胞、1 X 108個(gè)所述干細(xì)胞、5乂 108個(gè)所述干細(xì)胞，1 X 109個(gè) 所述干細(xì)胞、5Xl(f個(gè)所述干細(xì)胞、或1X10"個(gè)所述干細(xì)胞。在任何上述冷凍保藏的群的 其它特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞已經(jīng)傳代大約、至少或不超過(guò)5次、不超過(guò)10次、不超過(guò) 15次、或不超過(guò)20次。在任何上述冷凍保藏的群的另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞在所 述容器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了腫瘤細(xì)胞抑制性組合物，S卩，可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤 細(xì)胞群增殖、或抑制腫瘤生長(zhǎng)的組合物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含上清液的組合 物，所述上清液來(lái)源于本發(fā)明中描述的任何分離的胎盤細(xì)胞群的培養(yǎng)物。在另一實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了包含培養(yǎng)基的組合物，所述培養(yǎng)基來(lái)源于分離的胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)物，其 中所述胎盤細(xì)胞(a)附著于基質(zhì);(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、 CD105和CD200 ; 或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或表達(dá)CD73、CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，且當(dāng)所述群在
允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多 個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胎 盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì) 胞群的增殖、或腫瘤生長(zhǎng)，其中所述胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)物已經(jīng)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 24小 時(shí)或更久。 在另一特定實(shí)施方案中，任何上述組合物包含基質(zhì)。在更特定的實(shí)施方案中，所述 基質(zhì)是三維支架。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括膠原、明膠、層粘連蛋白、纖粘 連蛋白、果膠、鳥氨酸、或玻璃粘連蛋白。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是羊膜或羊 膜來(lái)源的生物材料。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括胞外膜蛋白。在另一更特定 的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括合成的化合物。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括生物活性化合物。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述生物活性化合物是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、 抗體、或小于5000道爾頓的有機(jī)分子。 本發(fā)明還提供了包含胎盤干細(xì)胞的藥物組合物，所述胎盤干細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳改造以 產(chǎn)生與腫瘤抑制相關(guān)的重組或外源性細(xì)胞因子。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含 大量胎盤干細(xì)胞的藥物組合物，其中所述胎盤干細(xì)胞經(jīng)過(guò)改造表達(dá)外源性IFN-P或IL-2。 在特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞以一定量表達(dá)外源性IFN-P或IL-2，與不表達(dá)外源性 IFN-P或IL-2的胎盤干細(xì)胞相比，當(dāng)所述腫瘤細(xì)胞與所述胎盤干細(xì)胞接觸時(shí)，所述量導(dǎo)致 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的可檢測(cè)的更大抑制。在更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞(a)附著 于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、CD105和CD200 ;或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或 表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下 培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，且當(dāng) 所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè) 或多個(gè)胚樣體；和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖、或腫瘤生長(zhǎng)。
3. l定義 如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"約"表示與所述值例如±10%的偏差。 如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"SH2"指與標(biāo)記CD105上的表位結(jié)合的抗體。因此，被稱
為SH2+的細(xì)胞是CD105+的。參見例如美國(guó)專利號(hào)5， 486， 359。 如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"SH3"和"SH4"指與標(biāo)記CD73上的表位結(jié)合的抗體。因 此，被稱為SH3+和/或SH4+的細(xì)胞是CD73+的。參見例如美國(guó)專利號(hào)5， 486， 359。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的干細(xì)胞"是指基本上與干細(xì)胞來(lái)源的組織(如胎 盤)中的其它、非干細(xì)胞分離的干細(xì)胞。如果在例如干細(xì)胞的收集和/或培養(yǎng)中，從干細(xì)胞 中去除了至少50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%，或至少99%的與干細(xì)胞天然相關(guān) 的非干細(xì)胞，則該干細(xì)胞是"分離的"。 如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的細(xì)胞群"是指基本上與細(xì)胞群來(lái)源的組織(如胎 盤)中的其它細(xì)胞分離的細(xì)胞群。如果在例如干細(xì)胞的收集和/或培養(yǎng)中，從干細(xì)胞中去 除了至少50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%，或至少99 %的與細(xì)胞群或者衍生細(xì)胞 群的細(xì)胞天然相關(guān)的細(xì)胞，則該干細(xì)胞是"分離的"。 如本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)"胎盤干細(xì)胞"指不考慮形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記、或原代培 養(yǎng)后的傳代數(shù)，來(lái)源于哺乳動(dòng)物胎盤的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，其附著于組織培養(yǎng)基質(zhì)上(例 如組織培養(yǎng)塑料或纖粘連蛋白包被的組織培養(yǎng)板)。術(shù)語(yǔ)"胎盤干細(xì)胞"涵蓋了來(lái)源于哺 乳動(dòng)物胎盤的任何部分的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，包括羊膜、絨毛膜、羊膜_絨毛膜盤、和/或臍 帶，以及來(lái)源于胎盤灌流液的細(xì)胞。然而，本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"胎盤干細(xì)胞"不表示來(lái)源 于臍帶血的滋養(yǎng)層或細(xì)胞。如果細(xì)胞保留了干細(xì)胞的至少一種屬性，例如分化為至少一種 其它細(xì)胞類型的能力，則認(rèn)為該細(xì)胞是"干細(xì)胞"。 如本發(fā)明中使用的，當(dāng)特定標(biāo)記是可檢測(cè)的時(shí)，則干細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記是"陽(yáng)性"的。例 如，由于CD73在胎盤干細(xì)胞上以可檢測(cè)地大于背景(例如，與同型對(duì)照相比)的量可檢測(cè)， 因此胎盤干細(xì)胞對(duì)CD73為陽(yáng)性的(即，CD73+)。當(dāng)標(biāo)記可用于將所述細(xì)胞與至少一種其它 細(xì)胞類型區(qū)分開時(shí)，或當(dāng)所述標(biāo)記在細(xì)胞中存在或表達(dá)時(shí)可用于選擇或分離所述細(xì)胞，則 該細(xì)胞也是所述標(biāo)記陽(yáng)性的。
在本方法的上下文中，"腫瘤細(xì)胞"是指表現(xiàn)出非正常生長(zhǎng)模式的任何細(xì)胞，包括 良性但增生的細(xì)胞、癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞等。"腫瘤細(xì)胞"可以是例如，實(shí)體瘤中的細(xì)胞、或具有 形成實(shí)體瘤的潛力或能力的細(xì)胞、或非實(shí)體瘤的細(xì)胞，例如血癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， 所述腫瘤細(xì)胞是來(lái)源于上皮、腺體或造血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì) 胞是組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性髓性白 血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。 如本發(fā)明中使用的，"抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞增殖"是指與對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)相 比，降低腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖量。例如，將例如大量胎盤干細(xì)胞存在時(shí)腫瘤細(xì)胞 或大量腫瘤細(xì)胞的增殖與不存在該胎盤干細(xì)胞時(shí)相同類型的腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的 增殖相比。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖的可檢測(cè)的降低、增殖的中止、或 腫瘤細(xì)胞數(shù)量的下降。
4.


圖1 :來(lái)源于灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜_絨毛膜盤(D)、或臍帶干
細(xì)胞(E)的胎盤干細(xì)胞的活力。X-軸上的數(shù)字表示從中獲得干細(xì)胞的胎盤。 圖2 :由FACSCalibur測(cè)定的來(lái)源于灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜_絨
毛膜盤(D)、或臍帶(E)的HLA ABC—/CD45—/CD347CD133+細(xì)胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表
示從中獲得干細(xì)胞的胎盤。 圖3 :由FACSAria.測(cè)定的來(lái)源于灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛 膜盤(D)、或臍帶(E)的HLA ABC—/CD45—/CD347CD133+細(xì)胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表示 從中獲得干細(xì)胞的胎盤。 圖4 :在來(lái)源于胎盤灌流液的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表達(dá)。 圖5 :在來(lái)源于羊膜的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表達(dá)。 圖6 :在來(lái)源于絨毛膜的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表達(dá)。 圖7 :在來(lái)源于羊膜-絨毛膜盤的干細(xì)胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表達(dá)。 圖8 :在來(lái)源于臍帶的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表達(dá)。 圖9 :在來(lái)源于灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜_絨毛膜盤(D)、或臍帶 (E)的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的平均表達(dá)。 圖10 :胎盤干細(xì)胞和臍帶干細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCL)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。LCL 單獨(dú)培養(yǎng)，或與來(lái)源于羊膜-絨毛膜(AC)或羊膜(AM)的胎盤干細(xì)胞，或來(lái)源于臍帶(UC) 的干細(xì)胞共培養(yǎng)17天。胎盤干細(xì)胞與LCL的比例是2 : 1。計(jì)數(shù)大AAD—細(xì)胞(對(duì)于UC，n =3)。 圖11 :胎盤干細(xì)胞與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC) —樣有效地殺死腫瘤細(xì)胞。顯示了 LCL與BM-MSC或臍帶(UC)干細(xì)胞的6天共培養(yǎng)(n = 1)。 圖12 :胎盤干細(xì)胞腫瘤抑制的劑量依賴性。組織細(xì)胞性瘤、慢性髓性白血病
(CML)、乳腺癌、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、和結(jié)腸癌細(xì)胞單獨(dú)孵育，或與胎盤干細(xì)胞以
i : 2、i : i、i.5 : l和2 : i的比例一起孵育。在共培養(yǎng)后，確定活的7-aad—細(xì)胞的數(shù)
量。然后計(jì)算自由生長(zhǎng)培養(yǎng)物的胎盤干細(xì)胞抑制。在圖例中，自由生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞的絕對(duì)
數(shù)在每個(gè)細(xì)胞系說(shuō)明后的括號(hào)內(nèi)給出(數(shù)字表示105個(gè)細(xì)胞)。除LCL n = 4々h，N=2。
附圖13A和13B :胎盤干細(xì)胞腫瘤抑制的抑制和接觸依賴性。A :在transwells (黑 色柱)或開放孔(A，空心柱)中，組織細(xì)胞性瘤、慢性髓性白血病、乳腺導(dǎo)管癌、LCL、視網(wǎng)膜 瘤、肺癌、乳腺癌、和ALL細(xì)胞單獨(dú)孵育，或與胎盤干細(xì)胞以1 : l的比例一起孵育。在6天 后，計(jì)數(shù)活的7-AAD—細(xì)胞，并根據(jù)自由生長(zhǎng)培養(yǎng)物中的細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算抑制(B，計(jì)數(shù)的插 入)。B :根據(jù)抑制數(shù)據(jù)，計(jì)算接觸依賴性。除LCL n = 2夕卜，Tra固ell :n = 1。
圖14 :來(lái)源于于結(jié)果顯示在附圖13A和13B中的實(shí)驗(yàn)中的上清液中高表達(dá)的細(xì)胞 因子。在測(cè)試的25種細(xì)胞因子中，顯示了 LCL和組織細(xì)胞性淋巴瘤的IL-6、IL-8和MCP-1。 比較圖15A和15B。 圖15A和15B :LCL/胎盤干細(xì)胞共培養(yǎng)物的細(xì)胞因子分泌譜。A ;LCL單獨(dú)或與胎 盤干細(xì)胞在開口孔(LCL PDAC)或transwell(LCL PDACTW)中一起培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀計(jì) 數(shù)活的CD23+細(xì)胞。B ;用Luminex測(cè)定來(lái)源于A中實(shí)驗(yàn)中的上清液。N = 2。
圖16A和16B :A :胎盤干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制。 巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系MEG-01、組織細(xì)胞性淋巴瘤、視網(wǎng)膜瘤、和慢性髓性白血病細(xì)胞單獨(dú) 孵育，或與臍帶干細(xì)胞(UC)、羊膜-絨毛膜胎盤干細(xì)胞(AC)、或BM-MSC—起孵育。在共培養(yǎng) 6天后，確定每種共培養(yǎng)物的活的AAD—細(xì)胞的數(shù)量。B :胎盤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞抑制的時(shí)程。 MEG-01細(xì)胞單獨(dú)孵育，或與人臍帶上皮細(xì)胞(HUVEC)、 BM-MSC、或胎盤干細(xì)胞(PDAC)共培 養(yǎng)。在共培養(yǎng)開始后第1、2、3、4和6天，確定每種培養(yǎng)物中的活細(xì)胞(A皿exin V—、7_AAD—) 數(shù)量。 圖17 :MEG-Ol細(xì)胞的胎盤干細(xì)胞腫瘤抑制的接觸依賴性。來(lái)源于MEG-01/臍 帶干細(xì)胞共培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基抑制巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(MEG-01)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 MEG-01細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，或與臍帶干細(xì)胞(MEG/UC)直接共培養(yǎng)，或在條件培養(yǎng)基(1 : 2或 1 : IO比例)中培養(yǎng)，所述條件培養(yǎng)基收獲自抑制性的MEG-01/臍帶干細(xì)胞共培養(yǎng)物(UC)、 MEG-01/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)物(BM)、或MEG-01/HUVEC共培養(yǎng)物(H)。在共培養(yǎng)6天 后，確定活細(xì)胞(Annexin V—、7_AAD—)的數(shù)量。 圖18 :MEG-01/胎盤干細(xì)胞共培養(yǎng)物的細(xì)胞因子分泌譜。MEG-01、胎盤干細(xì)胞 (PDAC) 、 BM-MSC、禾P HUVEC細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，或以下列組合共培養(yǎng)MEG-01/HUVEC、 MEG-01/ BM-MSC、或MEG-01/PDAC。收獲7天培養(yǎng)物的上清液，并用Luminex測(cè)定血小板來(lái)源的生 長(zhǎng)因子-AA(PDGF-AA)、顆粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)、生長(zhǎng)相關(guān)的原癌基 因-a (GROa)，和白血病抑制因子(LIF)的分泌。所述量以pg/ml顯示。
圖19 :對(duì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)產(chǎn)生應(yīng)答的臍帶干細(xì)胞(UC1)的遷移。UC1 胎盤干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(基線)，或含有10% FBS、 SDF-1、或SDF-1加CXCR4抑制劑 AMD3100的培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。在向所述細(xì)胞中添加CYQUANT⑧GR染料后，用熒光 讀板器在480nm/520nm處測(cè)量熒光。
5.發(fā)明詳述 5. 1利用胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞 本發(fā)明提供了利用胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，和抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在一實(shí)
施方案中，本發(fā)明提供了抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞增殖、或腫瘤生長(zhǎng)、或非實(shí)體瘤細(xì)胞
或大量非實(shí)體瘤細(xì)胞增殖的方法，包括將腫瘤細(xì)胞、或腫瘤與大量胎盤干細(xì)胞接觸一段時(shí)
間，所述時(shí)間足以使所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或腫瘤的生長(zhǎng)。 胎盤干細(xì)胞是例如在本發(fā)明中他處描述的胎盤干細(xì)胞(參見5. 2節(jié))。用于腫瘤
細(xì)胞抑制的胎盤干細(xì)胞可來(lái)源于或獲得自單個(gè)胎盤或多個(gè)胎盤。用于腫瘤細(xì)胞抑制的胎盤
干細(xì)胞也可來(lái)源于單個(gè)物種，例如預(yù)期接受者的物種或預(yù)期其腫瘤細(xì)胞功能將被降低或抑
制的物種，或可來(lái)源于多個(gè)物種。胎盤干細(xì)胞可來(lái)源于完整的胎盤或其任何部分，例如羊
膜、絨毛膜、羊膜_絨毛膜盤、或臍帶。來(lái)源于胎盤的任何部分的胎盤干細(xì)胞可在本發(fā)明的
方法中使用。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法從胎盤或其部分收集胎盤干細(xì)胞，
例如灌流或酶促消化。 腫瘤細(xì)胞可以是任何表現(xiàn)出成瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞，不論惡性或良性，并 包括前癌性和癌性細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、母細(xì)胞瘤細(xì) 胞、肉瘤細(xì)胞、和白細(xì)胞細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞更特定的實(shí)例包括乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié) 腸癌細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、胰腺癌 細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸 癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、唾液腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、外陰癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、 肝肉瘤細(xì)胞、和多種類型的頭頸癌細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是巨核母細(xì)胞淋 巴瘤細(xì)胞、急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性T-細(xì)胞白血病、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、骨髓 急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞、或肺癌細(xì)胞。
可以通過(guò)對(duì)懷疑癌化的組織實(shí)施組織切片或根據(jù)體液樣品(例如從血樣分離或 純化的細(xì)胞)來(lái)確定個(gè)體中腫瘤細(xì)胞的存在。然后可利用多種生物學(xué)、分子學(xué)、形態(tài)學(xué)、和 細(xì)胞學(xué)方法來(lái)表征癌細(xì)胞或組織。特別的，生物學(xué)和分子標(biāo)記可用來(lái)評(píng)估特征，如細(xì)胞來(lái)源 的類型(如上皮細(xì)胞)、細(xì)胞的特定類型(例如器官類型，如乳腺或前列腺)、細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì) 胞生長(zhǎng)潛力、細(xì)胞生長(zhǎng)阻斷、和超倍性狀態(tài)。這些細(xì)胞標(biāo)記選自但不限于分子、生物化學(xué)、和 生物學(xué)標(biāo)記和探針，這些標(biāo)記單獨(dú)使用或組合使用。 在本發(fā)明的上下文中，"接觸"涵蓋了在體外，例如在單個(gè)容器(如培養(yǎng)皿、瓶、小 瓶等)中，將胎盤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞放置于一起。"接觸"還涵蓋了在體內(nèi)，例如同一個(gè)體 (例如哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、狗、貓、綿羊、山羊、馬、人等)中將胎盤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞 放置于一起，例如，通過(guò)將胎盤干細(xì)胞靜脈內(nèi)施用至個(gè)體，通過(guò)直接注射到腫瘤位點(diǎn)中，等 等。在體內(nèi)接觸的一些實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞是細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì) 胞。在其它一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是共培養(yǎng)在相同的物理空間中的，例如在同一培養(yǎng)皿 或培養(yǎng)皿的孔中。在另一實(shí)施方案中，所述接觸不要求所述胎盤干細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞間 的直接物理接觸。例如，所述接觸可以包括在獨(dú)立的物理空間例如位于細(xì)胞培養(yǎng)皿的分離 的孔中培養(yǎng)所述胎盤干細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞，其中胎盤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共享所述胎盤干 細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基。在體內(nèi)接觸的某些實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對(duì) 于個(gè)體都是外源性的，即，兩種類型的細(xì)胞都不是來(lái)源于個(gè)體內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是通過(guò)腫瘤發(fā)生在個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞，即，腫瘤細(xì)胞對(duì)個(gè)體是內(nèi)源性的。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接觸(體外或體內(nèi))進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間，并與足夠數(shù)量的胎盤干細(xì) 胞接觸，從而在所述接觸后的一段時(shí)間，足以使腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生可檢測(cè)的抑制。更優(yōu)選 的，在多個(gè)實(shí)施方案中，與缺少胎盤干細(xì)胞的條件下的免疫功能相比，在所述接觸后的一段 時(shí)間，所述接觸足以抑制腫瘤細(xì)胞增殖至少50 % 、60 % 、70 % 、75 % 、80 % 、90 %或95 % 。甚 至更優(yōu)選的，腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞的增殖被完全抑制，從而在所述接觸后的一段時(shí)間， 所述腫瘤細(xì)胞不增殖，或其增殖不足以增加腫瘤細(xì)胞的總數(shù)。在多個(gè)實(shí)施方案中，該時(shí)間段 是1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更長(zhǎng)。 腫瘤細(xì)胞的抑制，例如個(gè)體中的腫瘤細(xì)胞，可以使用對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng) 產(chǎn)生可檢測(cè)的抑制所需要量的胎盤干細(xì)胞。例如，在本方法的多個(gè)實(shí)施方案中，大量胎盤 干細(xì)胞與大量腫瘤細(xì)胞，例如，個(gè)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞接觸，其中所述大量胎盤干細(xì)胞包含約 1乂105個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X106個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X107個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X108個(gè)胎盤 干細(xì)胞、約1X1(^個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X10"個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1X10"個(gè)胎盤干細(xì)胞、約 1X1012個(gè)胎盤干細(xì)胞或更多。 在其它實(shí)施方案中，所述方法包括向所述個(gè)體施用每千克個(gè)體體重至少約 1X1()5、至少約1X1()6、至少約1X1()7、或至少約1X1()8個(gè)胎盤干細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中， 向含有大量腫瘤細(xì)胞的個(gè)體施用每千克個(gè)體體重約1百萬(wàn)個(gè)胎盤干細(xì)胞。
在多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，本方法包括施用約l倍、2倍、3倍、4倍、5倍，或超過(guò) 5倍于個(gè)體中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的胎盤干細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定個(gè)體中的 腫瘤細(xì)胞數(shù)量。腫瘤細(xì)胞定量的示例性方法描述于美國(guó)專利號(hào)6， 365， 362和6， 645， 731中； Mehes等人，Hemtologia31(2) :97-109(2001);禾口 Hardingham等人，Cancer Research 53: 3455-3458(1993)，其全文在此全部引用作為參考。在多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述方法 包括基于個(gè)體的體重施用大量胎盤干細(xì)胞。例如，所述方法包括向所述個(gè)體施用約1X103 個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 104個(gè)胎盤干 細(xì)胞/kg、 1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 5 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、或約1 X 108 個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg。在多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述方法包括向所述個(gè)體施用至少約 1 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/ kg、至少約5X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 105個(gè)胎 盤干細(xì)胞/kg、至少約1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約 1 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、至少約5 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、或至少約1 X 108個(gè)胎盤干細(xì)胞 /kg。 在其它多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞已經(jīng)在體外增殖不超過(guò)30次
群倍增、不超過(guò)20次群倍增、不超過(guò)10次群倍增、或不超過(guò)5次群倍增。在另一特定實(shí)施
方案中，所述胎盤干細(xì)胞已被冷凍保藏并在所述接觸前解凍。在本方法的其它特定實(shí)施方
案中，與缺少所述胎盤干細(xì)胞條件下的等量腫瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干細(xì)胞抑制所
述腫瘤細(xì)胞增殖約20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%。 有利地，在用于例如在個(gè)體中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖前，可篩選胎盤干細(xì)胞，例
如來(lái)源于特定的個(gè)體或個(gè)體庫(kù)、來(lái)源于特定組織等等的胎盤干細(xì)胞的腫瘤抑制活性。因此，在特定實(shí)施方案中，利用胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)的方法包括在向所述個(gè)體 施用所述胎盤干細(xì)胞之前，在體外篩選所述胎盤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性。在本方 法的更特定的實(shí)施方案中，在向所述個(gè)體施用前，與缺少所述胎盤干細(xì)胞條件下的等量腫 瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干細(xì)胞被證實(shí)在體外可抑制腫瘤細(xì)胞增殖例如，至少約20%、 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、或95%，其中所述增殖通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)相 同條件下所產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)來(lái)測(cè)量。所述胎盤干細(xì)胞可以通過(guò)直接接觸、通過(guò)可溶性因子、 或通過(guò)兩者來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞。因此，在本方法的其它更特定的實(shí)施方案中，在向所述個(gè)體 施用前，在體外在直接培養(yǎng)試驗(yàn)、在transwell試驗(yàn)、或更優(yōu)選的同時(shí)在直接培養(yǎng)試驗(yàn)和 transwell試驗(yàn)中驗(yàn)證了所述胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞增殖。 可以利用任何腫瘤細(xì)胞來(lái)篩選胎盤干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)的抑制，但更有 效的篩選是那些在受感染的個(gè)體中的復(fù)現(xiàn)或試圖復(fù)現(xiàn)腫瘤抑制的篩選。例如，在另一特定 實(shí)施方案中，針對(duì)與施用所述胎盤干細(xì)胞的個(gè)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞具有相同細(xì)胞類型(例如 上皮、鱗狀上皮等)、相同組織起源(例如乳腺、前列腺等)、或更優(yōu)選的，相同細(xì)胞類型和 相同組織起源的腫瘤細(xì)胞，在體外篩選所述胎盤干細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。在另一更特 定的實(shí)施方案中，針對(duì)來(lái)源于所述個(gè)體的腫瘤細(xì)胞活體切片的、或從所述個(gè)體的血樣純化 或分離的腫瘤細(xì)胞，在體外篩選所述胎盤干細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。 在本方法的多個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞來(lái)源于羊膜、絨毛膜、羊 膜_絨毛膜、或臍帶、或來(lái)源于胎盤灌流液，并在向所述個(gè)體施用前，與缺少所述干細(xì)胞條 件下的等量腫瘤細(xì)胞的增殖相比，所述胎盤干細(xì)胞被證實(shí)可在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖例 如，至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、或95%。
對(duì)于體內(nèi)接觸胎盤干細(xì)胞和內(nèi)源性腫瘤，例如實(shí)體瘤或血癌，所述胎盤干細(xì)胞可 以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的向個(gè)體有效導(dǎo)入活細(xì)胞的任何方式來(lái)導(dǎo)入個(gè)體中。例如，可 以通過(guò)靜脈內(nèi)灌流，或肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)等方法導(dǎo)入胎盤干細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述胎盤干細(xì)胞在腫瘤或腫瘤細(xì)胞的位點(diǎn)或周邊被注射至個(gè)體體內(nèi)。所述細(xì)胞還可以 通過(guò)移植，例如天然或人造基質(zhì)，如明膠來(lái)導(dǎo)入，其中所述胎盤干細(xì)胞陷入(enmesh)其中， 并且一旦移植后，所述細(xì)胞可從中長(zhǎng)出。此類基質(zhì)的非限制性實(shí)例提供在如下5.6. 1.4節(jié) 中。 通過(guò)任何這類方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法將胎盤干細(xì)胞導(dǎo)入個(gè)體中， 所述的導(dǎo)入足以有助于所述胎盤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的接觸。將胎盤干細(xì)胞導(dǎo)入個(gè)體， 特別是具有內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞的個(gè)體，可以包括單次導(dǎo)入，或在若干小時(shí)、若干天、若干星期、 若干月或若干年內(nèi)的多次導(dǎo)入。胎盤干細(xì)胞的每次導(dǎo)入可以包括一定數(shù)量的干細(xì)胞，所述 量本身或在聚集物中足以可檢測(cè)地抑制大量腫瘤細(xì)胞的增殖。對(duì)于體內(nèi)施用，所述胎盤干 細(xì)胞可配制成如下述5. 6. 1節(jié)中描述的藥物組合物。 在體外實(shí)驗(yàn)中可以確定在體內(nèi)條件下抑制的程度，例如，通過(guò)比較在優(yōu)化生長(zhǎng)條 件下腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞數(shù)量和接觸胎盤干細(xì)胞的等 量腫瘤細(xì)胞在等量時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)的增殖可以通過(guò) 任何本領(lǐng)域已知的方法來(lái)評(píng)估。例如，可以在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞或個(gè)體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行取 樣，并采用血球計(jì)數(shù)器或類似儀器進(jìn)行計(jì)數(shù)。所述腫瘤細(xì)胞可以采用被設(shè)計(jì)分離進(jìn)入子細(xì) 胞的非降解染料來(lái)染色，例如，用溴脫氧嘧啶(BrDU)、二醋酸羧基熒光素(CFSE)、或OregonGreen 488羧酸二乙酸(Invitrogen)來(lái)染色，并采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)確定染色的程度。當(dāng) 所述腫瘤細(xì)胞與胎盤干細(xì)胞接觸，且比不接觸胎盤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出可檢測(cè)的更低 的每細(xì)胞染色量(例如，可檢測(cè)的更低的平均每細(xì)胞染色量)時(shí)，所述胎盤干細(xì)胞抑制腫瘤 細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于特定數(shù)量的胎盤干細(xì)胞和一定量的腫瘤細(xì)胞，從在體外實(shí)驗(yàn)中抑制的程度 可以外推出在個(gè)體內(nèi)腫瘤或腫瘤細(xì)胞的抑制程度。 腫瘤生長(zhǎng)的抑制可采用本領(lǐng)域已知的用于腫瘤成體內(nèi)像或檢測(cè)的任何方法來(lái)評(píng) 估。例如，所述腫瘤細(xì)胞可采用腫瘤特異性抗體來(lái)標(biāo)記，并可采用例如PET掃描或CAT掃描 來(lái)成像，或可以利用x-射線來(lái)成像。腫瘤生長(zhǎng)抑制的測(cè)定可通過(guò)，例如對(duì)腫瘤圖像的視覺(jué) 檢查，通過(guò)確定腫瘤標(biāo)記密度，通過(guò)確定腫瘤圖像中腫瘤的區(qū)域等，來(lái)確認(rèn)。體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng) 抑制的測(cè)定還可通過(guò)，檢測(cè)或關(guān)注腫瘤相關(guān)癥狀的任何消除、改善、或惡化的減緩來(lái)確定。
所述個(gè)體可以是哺乳動(dòng)物，例如人。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸包括靜 脈內(nèi)向所述個(gè)體施用所述胎盤細(xì)胞。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸包括向所述個(gè) 體的腫瘤位點(diǎn)或鄰近位點(diǎn)施用所述胎盤細(xì)胞。 所述胎盤干細(xì)胞還可以與一種或多種第二類型的干細(xì)胞共同施用，例如來(lái)源于骨
髓的間充質(zhì)干細(xì)胞。此類第二干細(xì)胞可以與胎盤干細(xì)胞以例如約i : io至約io : i的比
例向個(gè)體施用。 所述胎盤干細(xì)胞還可以與一種或多種不是干細(xì)胞的細(xì)胞類型共同施用。在特定實(shí)
施方案中，所述胎盤干細(xì)胞與第二種個(gè)體自體的、大量細(xì)胞一起施用。在更特定的實(shí)施方案 中，所述胎盤干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共同施用。在一些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞是自體的
成纖維細(xì)胞。所述成纖維細(xì)胞可以與胎盤干細(xì)胞以例如約i : io至約io : i的比例向個(gè) 體施用。 所述胎盤干細(xì)胞還可以與一種或多種干細(xì)胞化學(xué)趨化劑一起施用。在特定實(shí)施方 案中，所述干細(xì)胞化學(xué)趨化劑是SDF-1。
5. 2胎盤干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞群 本發(fā)明抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法使用胎盤干細(xì)胞，即可從胎盤或其部分獲得的干 細(xì)胞，其(1)附著于組織培養(yǎng)基質(zhì)；(2)具有分化為非胎盤細(xì)胞類型的能力；和(3)在足夠 的數(shù)量下，具有可檢測(cè)地抑制腫瘤細(xì)胞或大量腫瘤細(xì)胞增殖的能力，或可檢測(cè)地抑制腫瘤 生長(zhǎng)的能力。胎盤干細(xì)胞不來(lái)源于血液，例如，胎盤血或臍帶血。在本發(fā)明的方法和組合物 中使用的胎盤干細(xì)胞具有下述能力，并且可根據(jù)其能力進(jìn)行選擇在體外或體內(nèi)抑制癌細(xì) 胞或大量癌細(xì)胞增殖，或在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。 胎盤干細(xì)胞在起源上可以是胎兒或母體的(即，可以具有母親或胎兒的基因型)。 胎盤干細(xì)胞群，或含有胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群，可包含在起源上僅為胎兒或母體的胎盤干細(xì) 胞，或者可以包含胎兒和母體起源的胎盤干細(xì)胞的混合群。所述胎盤干細(xì)胞，和含有胎盤干 細(xì)胞的細(xì)胞群可以通過(guò)如下描述的形態(tài)學(xué)、標(biāo)記和培養(yǎng)特征來(lái)鑒別和選擇。
5. 2. 1物理和形態(tài)學(xué)特征 當(dāng)在原代培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明中使用的胎盤干細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)基質(zhì) 上，例如組織培養(yǎng)容器的表面(如組織培養(yǎng)塑料)。培養(yǎng)中的胎盤干細(xì)胞一般呈現(xiàn)出成纖維 細(xì)胞樣、星狀外觀，從中央細(xì)胞體延伸出大量胞質(zhì)突起。然而，所述胎盤干細(xì)胞與在相同條 件下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上不同，胎盤干細(xì)胞表現(xiàn)出大量多于成纖維細(xì)胞的此類突起。形態(tài)學(xué)上，胎盤干細(xì)胞也與造血干細(xì)胞是可區(qū)分的，其在培養(yǎng)中通常呈現(xiàn)出更圓的，或 鵝卵石狀的形態(tài)。 5. 2. 2細(xì)胞表面、分子和遺傳標(biāo)記 在本發(fā)明的方法和組合物中有用的胎盤干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞群，表達(dá)大量可用于 鑒別和/或分離干細(xì)胞、或包含干細(xì)胞的細(xì)胞群的標(biāo)記。本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞和干細(xì)胞群 (即，兩種或多種胎盤干細(xì)胞)包括從胎盤或其任何部分(例如羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛 膜盤、胎盤小葉、臍帶等)直接獲得的干細(xì)胞和含有干細(xì)胞的細(xì)胞群。胎盤干細(xì)胞群還包括 培養(yǎng)中的胎盤干細(xì)胞群(即，兩種或多種)，和容器例如袋子中的群。然而，胎盤干細(xì)胞不是 滋養(yǎng)層。 胎盤干細(xì)胞一般表達(dá)標(biāo)記CD73、 CD105、 CD200、 HLA-G、和/或0CT-4，并且不表達(dá) CD34、 CD38、或CD45。胎盤干細(xì)胞還可以表達(dá)HLA-ABC (MHC-1)禾P HLA-DR。這些標(biāo)記可用 于鑒別胎盤干細(xì)胞，并將胎盤干細(xì)胞與其它干細(xì)胞類型區(qū)分開。由于胎盤干細(xì)胞可以表達(dá) CD73和CD105，其可具有間充質(zhì)干細(xì)胞-樣特征。然而，由于胎盤干細(xì)胞可以表達(dá)胎兒_特 異性標(biāo)記CD200和HLA-G，其可以與間充質(zhì)干細(xì)胞區(qū)分開，例如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞其 既不表達(dá)CD200也不表達(dá)HLA-G。以相同的方式，缺少CD34、CD38和/或CD45的表達(dá)可鑒 別胎盤干細(xì)胞為非造血干細(xì)胞。 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含大量為CD200+、 HLA-G+的胎盤干細(xì)胞的分離 的細(xì)胞群，其中所述干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在分離群的特定實(shí)施方 案中，所述干細(xì)胞還是CD73+和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34一、 CD38—或CD45—。在更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+和 CD105+。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述分離群產(chǎn)生一個(gè)或 多個(gè)胚樣體。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含大量為CD73+、CD105+、CD200+的胎盤干細(xì)胞 的分離的細(xì)胞群，其中所述干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在所述群的特定 實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、CD38—、或 CD45—。在更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、CD38—、CD45—、和HLA-G+。在另一特定 實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述細(xì)胞群產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)胚樣體。
本發(fā)明還提供了包含大量為CD200+、 0CT-4+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，其中 所述干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是0073+ 和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中，所述干 細(xì)胞是CD34—、CD38—、和CD45—。在更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、CD105+、和HLA-G+。在另一特定實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所 述群產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)胚樣體。 本發(fā)明還提供了包含大量為CD73+、 CD105+、和HLA-G+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞 群，其中所述干細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)中可檢測(cè)地抑制T細(xì)胞增殖。在上述大 量細(xì)胞的特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、CD38—、或CD45—。在另一特定實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、和CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是0CT-4+。 在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD200+。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞 還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和CD200+。
本發(fā)明還提供了包含大量腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，所述干細(xì) 胞是CD73+、CD105+干細(xì)胞，其中所述大量的細(xì)胞當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成 一個(gè)或多個(gè)胚樣體，且其中所述干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施 方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、或CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是 CD34—、CD38—、和CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是0CT-4+。在更特定的實(shí)施 方案中，所述干細(xì)胞還是0CT-4+、 CD34—、 CD38—、和CD45—。 本發(fā)明還提供包含大量胎盤干細(xì)胞的分離細(xì)胞群，所述胎盤干細(xì)胞是0CT-4+干細(xì) 胞，其中所述群當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體，且其中所述 干細(xì)胞被鑒定為可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。 在多個(gè)實(shí)施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % ，或至少95 %的所述分離的胎盤細(xì)胞是0CT-4+干細(xì) 胞。在上述群的特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD73+和CD105+。在另一特定實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞還是CD34—、CD38—或CD45—。在另一特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD200+。在 更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—。在另一 特定實(shí)施方案中，所述群已經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，例如傳代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、 至少15次，或至少20次。 在任何上述實(shí)施方案中，本方法還可以包括選擇表達(dá)ABC-p (胎盤特異性ABC轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白；參見例如Allikmets等人，Cancer Res. 58(23) :5337-9(1998))的胎盤細(xì)胞。本方 法還可以包括選擇表現(xiàn)出至少一種對(duì)例如間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的特征的細(xì)胞，例如表達(dá) CD29、表達(dá)CD44、表達(dá)CD90、或上述組合的表達(dá)。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含大量腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干細(xì)胞的分離細(xì) 胞群，所述干細(xì)胞是CD29+、 CD44+、 CD73+、 CD90+、 CD105+、 CD200+、 CD34—和CD133—。
在上述提到的胎盤干細(xì)胞的特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞組成性分泌IL-6、 IL-8和單核細(xì)胞化學(xué)趨化劑蛋白(MCP-1)。 每種上述大量胎盤干細(xì)胞都可以包含從哺乳動(dòng)物胎盤直接獲得和分離的胎盤干 細(xì)胞，或者已經(jīng)培養(yǎng)和傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代 的胎盤干細(xì)胞，或其組合。 上述腫瘤細(xì)胞抑制性的大量胎盤干細(xì)胞可以包含大約、至少、或不超過(guò)1X105、
5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、
1X1011或更多個(gè)胎盤干細(xì)胞。 5. 2. 3選擇和生產(chǎn)胎盤干細(xì)胞群 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇胎盤細(xì)胞群其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述細(xì)胞是CD200+、 HLA-G+胎盤干細(xì) 胞，并且其中所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇那些還是CD73+和CD105+的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選 擇包括選擇那些還是CD34—、CD38—或CD45—的干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包 括選擇那些還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+和CD105+的干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中， 所述選擇還包括選擇那些當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體的大量胎盤干細(xì)胞。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇大量胎盤細(xì)胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%，或至少95%的所述細(xì)胞是CD73+、 CD105+、 CD200+胎 盤干細(xì)胞，并且其中所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方 案中，所述選擇包括選擇那些還是^^-6+的干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包 括選擇那些還是CD34—、CD38—或CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包 括選擇那些還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包 括選擇那些還是CD34—、 CD38—、 CD45—和HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所 述選擇還包括選擇那些當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體的胎 盤細(xì)胞群。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇大量胎盤細(xì)胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述細(xì)胞是CD200+、 0CT-4+胎盤干細(xì) 胞，并且其中所述胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇那些還是CD73+和CD105+的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選 擇包括選擇那些還是HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那 些還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那 些還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇大量胎盤細(xì)胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述細(xì)胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎 盤干細(xì)胞，并且其中所述胎盤干細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)中可檢測(cè)地抑制T細(xì) 胞增殖。在特定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那些還是CD34—、CD38—或CD45—的胎盤干細(xì) 胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那些還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細(xì) 胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那些還是CD200+的胎盤干細(xì)胞。在另一特 定實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那些還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和CD200+的胎盤干 細(xì)胞。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇大量胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 少60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述細(xì)胞是CD73+、 CD105+胎盤干細(xì) 胞，并且其中所述大量細(xì)胞當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體， 并且其中所述干細(xì)胞可檢測(cè)的抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，所述選擇 包括選擇那些還是CD34—、CD38—或CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇 包括選擇那些還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選擇 包括選擇那些還是0CT-4+的胎盤干細(xì)胞。在更特定的實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那些 還是0CT-4+、 CD34—、 CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了從大量胎盤細(xì)胞中選擇大量胎盤干細(xì)胞的方 法，包括選擇大量胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % ，或至少95 %的所述分離的胎盤干細(xì)胞是0CT-4+ 干細(xì)胞，并且其中所述大量的細(xì)胞當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一個(gè)或多個(gè) 胚樣體，并且其中所述干細(xì)胞可檢測(cè)的抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)。在特定實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇那些還是CD73+和CD105+的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選 擇包括選擇那些還是CD34—、CD38—或CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述選 擇包括選擇那些還是CD200+的胎盤干細(xì)胞。在更特定的實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇那 些還是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。 本發(fā)明還提供生產(chǎn)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖的胎盤干細(xì)胞群的方法。例如，本發(fā)明 提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇任何上述大量胎盤干細(xì)胞，并從其它細(xì)胞，例如，其它 胎盤細(xì)胞中分離大量胎盤干細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法， 包括選擇胎盤細(xì)胞，其中所述胎盤細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá) CD73、 CD105和CD200 ;或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73 和CD105，且當(dāng)所述群培養(yǎng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤 細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，并且當(dāng)所述群培養(yǎng)在允許胚樣體形成的 條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；和(c)可檢 測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)；以及從其它細(xì)胞中分離所述胎盤細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。
在更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞， 其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G;和(c)可檢測(cè)的抑制癌 細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)；并且從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一特定 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞
(a) 附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、CD105和CD200，和(c)可檢測(cè)的抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生 長(zhǎng)；并且從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；
(b) 表達(dá)CD200和0CT-4，和(c)可檢測(cè)的抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)；并且從其它細(xì)胞中 分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的 方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73和CD105，
(c) 當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成胚樣體，和(d)可檢測(cè)的抑制癌細(xì)胞增殖或 腫瘤生長(zhǎng)；并且從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。在另一特定實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于 基質(zhì)；(b)表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G，和(c)在MLR中可檢測(cè)的抑制CD4+或CD8+T細(xì)胞增 殖；并且從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。生產(chǎn)細(xì)胞群的方法包括選擇胎 盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)0CT-4， (c)當(dāng)在允許胚樣體形成 的條件下培養(yǎng)時(shí)形成胚樣體，和(d)可檢測(cè)地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)；并且從其它細(xì) 胞中分離所述胎盤干細(xì)胞來(lái)形成細(xì)胞群。 對(duì)于上述選擇胎盤干細(xì)胞群的方法，所述選擇可以包括確定所述胎盤干細(xì)胞的樣 品是否抑制癌細(xì)胞增殖，或抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且如果所述胎盤干細(xì)胞的樣品可檢測(cè)地抑制 癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)，則選擇胎盤干細(xì)胞群。
5. 2. 4培養(yǎng)生長(zhǎng) 對(duì)于任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，本發(fā)明中描述的胎盤干細(xì)胞的生長(zhǎng)，都部分依賴于選擇用于生長(zhǎng)的特定培養(yǎng)基。在最優(yōu)條件下，胎盤干細(xì)胞一般在3-5天內(nèi)數(shù)量加倍。在培養(yǎng)過(guò) 程中，本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞附著在培養(yǎng)基質(zhì)上，例如組織培養(yǎng)容器的表面(例如組織培養(yǎng)
皿塑料、纖維粘連蛋白包被的塑料等)，并且形成單層細(xì)胞。 分離的胎盤細(xì)胞群包括本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞，當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成胚 樣體，g卩，在附著的干細(xì)胞層上生長(zhǎng)的三維細(xì)胞簇。胚樣體內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)與極早期的干細(xì) 胞，例如0CT-4、 Nanog、 SSE3和SSE4相關(guān)的標(biāo)記。如同本發(fā)明中描述的胎盤干細(xì)胞，胚樣 體內(nèi)的細(xì)胞一般不附著在培養(yǎng)基質(zhì)上，但是在培養(yǎng)過(guò)程中仍然依附于附著的細(xì)胞。胚樣體 細(xì)胞的活力依賴于附著的胎盤干細(xì)胞，在缺少附著的胎盤干細(xì)胞時(shí)不形成胚樣體。因此，附 著的胎盤干細(xì)胞有助于在包含附著的胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中的一個(gè)或多個(gè)胚樣體的 生長(zhǎng)。不希望受制于理論，胚樣體細(xì)胞被認(rèn)為在附著的胎盤干細(xì)胞上的生長(zhǎng)與胚胎干細(xì)胞 在滋養(yǎng)層細(xì)胞上的生長(zhǎng)相似。間充質(zhì)干細(xì)胞，例如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，在培養(yǎng)中不產(chǎn) 生胚樣體。 5. 3獲得胎盤干細(xì)胞的方法
5. 3. l干細(xì)胞收集組合物 本發(fā)明進(jìn)一步提供了收集和分離胎盤干細(xì)胞的方法。 一般利用生理學(xué)可接受的溶 液，例如，干細(xì)胞收集組合物從哺乳動(dòng)物胎盤中獲得干細(xì)胞。干細(xì)胞收集組合物詳細(xì)地在 2005年12月29日提交的名為"用于收集和保藏胎盤干細(xì)胞的改良組合物及利用組合物的 方法(Improved Composition forCollecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using theComposition)"的相關(guān)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/754， 969中進(jìn)行了描 述。 所述干細(xì)胞收集組合物可以包括適合干細(xì)胞收集和/或培養(yǎng)的任何生理學(xué)可接 受的溶液，例如，鹽溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液、Kreb氏液、改良的Kreb氏液、Eagle氏液、 0. 9% NaCl等)、培養(yǎng)基(例如DMEM、 H. DMEM等)等。 干細(xì)胞收集組合物可以包括用于保存胎盤干細(xì)胞的一種或多種組分，S卩，從收集 時(shí)間到培養(yǎng)的時(shí)間內(nèi)，保護(hù)胎盤干細(xì)胞免于死亡，或延緩胎盤干細(xì)胞的死亡，降低細(xì)胞群中 胎盤干細(xì)胞的死亡數(shù)等。此類組分可以是例如，凋亡抑制劑(例如半胱天冬酶抑制劑或 JNK抑制劑)、血管擴(kuò)張劑(例如硫酸鎂、抗高血壓藥物、心鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質(zhì)激 素、皮質(zhì)激素釋放激素、亞硝基鐵氰化鈉、肼苯噠嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、 磷酸二酯酶抑制劑等)、壞死抑制劑(例如2-(lH-吲哚-3-基)-3-戊氨基-馬來(lái)酰亞胺、 吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽、或氯硝西泮)、TNF-a抑制劑、和/或攜氧全氟化碳(例如全氟 辛基溴、全氟癸基溴等)。 干細(xì)胞收集組合物可以包括一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋 白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。此類酶包括但不限于膠原酶(例如膠原酶I、11、
ni或iv，來(lái)源于溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原酶等)、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、
胃蛋白酶、LIBERASE、透明質(zhì)酸酶等。 所述干細(xì)胞收集組合物可以包括殺菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的 實(shí)施方案中，所述抗生素是大環(huán)內(nèi)酯(例如妥布霉素)、頭孢菌素(例如頭孢氨芐、頭孢 拉定、頭孢呋辛、頭孢羅齊、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉仙霉素、紅霉素、青霉 素(例如青霉素V)、或喹諾酮(例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素等。在特定實(shí)施方案中，所述抗生素是抗革蘭氏(+)和/或革蘭氏(_)細(xì)菌活性的，例如綠
月農(nóng)假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黃色酉良月農(nóng)葡萄球菌(staphylococcus aureus)等。 干細(xì)胞收集組合物還可以包括一種或多種下列化合物腺苷(約ImM至約50mM)、 D-葡萄糖(約20mM至約lOOmM)、鎂離子(約ImM至約50mM)、分子量大于20， 000道爾頓的 大分子，在一實(shí)施方案中，以足夠維持內(nèi)皮完整性和細(xì)胞活性的量存在(例如合成的或天 然存在的膠體，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以約25g/l至約100g/l、或約40g/l至約60g/1 存在)、抗氧化劑(例如叔丁對(duì)甲氧酚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，以 約25iiM至約100iiM存在)、還原劑(例如N-乙酰半胱氨酸，以約O. lmM至約5mM存在)、 防止鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的試劑(例如維拉帕米，以約2iiM至約25iiM存在)、硝化甘油(例如 約0. 05g/L至約0. 2g/L)、抗凝劑，在一實(shí)施方案中，以足夠幫助防止殘留血液凝結(jié)的量存 在(例如，濃度為約1000單位/1至約100，000單位/1存在的肝素或水蛭素)、或含有阿米 洛利的化合物(例如以約1. 0 ii M至約5 ii M的量存在的阿米洛利、乙基異丙基阿米洛利、 環(huán)己基阿米洛利、二甲基阿米洛利、或異丁基阿米洛利)。
5. 3. 2胎盤的收集和處理 —般，在出生排出后立即回收人胎盤。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在告知同意并采集患 者與胎盤相關(guān)的完整醫(yī)療史后，從患者處回收胎盤。優(yōu)選的，在分娩后繼續(xù)記錄醫(yī)療史。此 類醫(yī)療史可用于調(diào)整胎盤或從其收獲的干細(xì)胞的收獲后的應(yīng)用。例如，根據(jù)醫(yī)療史，人胎盤 干細(xì)胞可用于與胎盤相關(guān)的嬰兒、或用于所述嬰兒的父母、兄弟姐妹或其他親戚的個(gè)人化 藥物。 在回收胎盤干細(xì)胞之前，去除了臍帶血和胎盤血。在一些實(shí)施方案中，在分娩后 回收胎盤中的臍帶血。所述胎盤可以采用常規(guī)的臍帶血回收方法。 一般使用針頭或插管， 在重力幫助下，將胎盤放血(參見例如Anderson，美國(guó)專利號(hào)5， 372， 581 ;Hessel等人，美 國(guó)專利號(hào)5， 415， 665)。所述針頭或插管通常置于臍靜脈內(nèi)，并且可以輕輕地按摩胎盤幫助 從胎盤中排出臍帶血?？梢陨虡I(yè)方式來(lái)實(shí)施此類臍帶血回收，例如LifeBank公司，Cedar Knolls，N. J. ，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。優(yōu)選的，對(duì)所述月臺(tái)盤通過(guò)重 力來(lái)放血不進(jìn)行其他操作，從而使臍帶血回收過(guò)程中的組織破壞最小化。
典型地，胎盤被從分娩室或初生室轉(zhuǎn)移至另一地點(diǎn)，例如實(shí)驗(yàn)室，用于臍帶血回收 和干細(xì)胞收集，例如，通過(guò)灌流或組織解離。所述胎盤優(yōu)選的在無(wú)菌的、保溫的轉(zhuǎn)移裝置 (維持胎盤溫度在20-28t:)中轉(zhuǎn)移，例如，將臍帶近端夾緊的胎盤放置在無(wú)菌的、夾拉鏈封 閉的塑料袋中，然后將其放置在保溫容器內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，所述胎盤在實(shí)質(zhì)上如2005 年9月19日提交的未決美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/230， 760中描述的臍帶血收集試劑盒中轉(zhuǎn)移。 優(yōu)選的，在分娩后4至24小時(shí)將胎盤遞送至實(shí)驗(yàn)室。在某些實(shí)施方案中，在臍帶血回收前， 夾緊臍帶近端，優(yōu)選的在插入胎盤的4-5cm(厘米)內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，在臍帶血回收 后但是在胎盤的進(jìn)一步處理前夾緊近端臍帶。 在收集干細(xì)胞前，可以將胎盤儲(chǔ)存在無(wú)菌條件下，并儲(chǔ)存在室溫或者5至25t:(攝 氏度)的溫度下。所述胎盤可以儲(chǔ)存超過(guò)48小時(shí)的時(shí)間，并且優(yōu)選的在灌流胎盤以去除任 何殘留的臍帶血前儲(chǔ)存4至24小時(shí)。所述胎盤優(yōu)選的在5至25t:(攝氏度)下儲(chǔ)存在抗凝 劑溶液中。合適的抗凝劑溶液是本領(lǐng)域公知的。例如，可以使用肝素或華法令鈉(warfarinsodium)溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗凝劑溶液含有肝素溶液(例如，在l : IOOO溶
液中1% w/w)。在收集胎盤干細(xì)胞前，放血的胎盤優(yōu)選地儲(chǔ)存不超過(guò)36小時(shí)。 —旦按照上述一般收集和制備，哺乳動(dòng)物胎盤或其部分可以按照本領(lǐng)域已知的任
何方法處理，例如，可以被灌流或解離，如用一種或多種組織解離酶來(lái)解離從而獲得干細(xì)胞。 5. 3. 3胎盤纟目織的物理解離和酶促消化 在一實(shí)施方案中，通過(guò)器官的物理解離，例如酶促消化，從哺乳動(dòng)物胎盤中收集干 細(xì)胞。例如，可以在與本發(fā)明的干細(xì)胞收集組合物接觸的同時(shí)，例如將胎盤或其部分壓碎 (crush)、剪碎(shear)、絞碎(mince)、切塊(dice)、切細(xì)(chop)、浸軟(macerate)等，然 后將組織用一種或多種酶來(lái)消化。胎盤或其部分還可以被物理的解離，并用一種或多種酶 消化，然后將獲得的材料浸入本發(fā)明的干細(xì)胞收集組合物或與本發(fā)明的干細(xì)胞收集組合物 混合。任何物理解離的方法均可以使用，只要通過(guò)如臺(tái)盼藍(lán)不相容可確定，所述解離方法 能使所述器官中多數(shù)的，更優(yōu)選的大量，更優(yōu)選的至少60 % 、 70 % 、80 % 、90 % 、95 % 、98 %或 99%的細(xì)胞存活。 在物理解離和/或酶促消化和干細(xì)胞回收前，所述胎盤可以被分割成部分。例如， 可以從羊膜、絨毛膜、胎盤絨毛葉或其任何組合中獲得胎盤干細(xì)胞。臍帶干細(xì)胞也可用于本 發(fā)明的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞來(lái)源于包含羊膜和絨毛膜的胎盤組織。在另 一特定實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞來(lái)源于臍帶。 一般的，胎盤干細(xì)胞可以通過(guò)將胎盤組織解離 為小塊來(lái)獲得，例如胎盤組織塊的體積是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或約1000立方毫米。 優(yōu)選的干細(xì)胞收集組合物包含一種或多種組織解離酶。酶促消化優(yōu)選地使用酶 的組合，例如基質(zhì)金屬蛋白酶和中性蛋白酶的組合，如膠原酶和分散酶的組合。在一實(shí)施 方案中，胎盤組織的酶促消化使用了基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明質(zhì)酸 的粘多糖酶的組合，例如膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶的組合或者LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp. ， Indian即olis， Ind.)和透明質(zhì)酸酶的組合。可用于裂解胎盤組織的其它 酶包括木瓜蛋白酶、脫氧核糖核酸酶、絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、或彈性蛋白酶。 絲氨酸蛋白酶可被血清中的a2微球蛋白所抑制，因此用于消化的基質(zhì)通常是無(wú)血清的。 在酶促消化過(guò)程中通常使用EDTA和DNA酶來(lái)增加細(xì)胞回收的效率。消化物優(yōu)選的被稀釋 從而避免干細(xì)胞陷入粘稠的消化物中。 任何組織消化酶的組合均可以使用。組織消化酶的典型濃度包括例如50-200U/ ml的I型膠原酶和IV型膠原酶，l-10U/ml的分散酶，和10-100U/ml的彈性蛋白酶?？梢?組合使用蛋白酶，即在同一消化反應(yīng)中使用兩種或多種蛋白酶，或者可以按順序相繼使用 從而釋放胎盤干細(xì)胞。例如，在一實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞或其部分首先用合適量的I型膠 原酶按2mg/ml消化30分鐘，然后用0. 25%的胰蛋白酶在37。C消化10分鐘。絲氨酸蛋白 酶優(yōu)選地在使用其它酶后再連續(xù)使用。 在另一實(shí)施方案中，在從干細(xì)胞收集組合物中分離干細(xì)胞之前，向含有干細(xì)胞的 干細(xì)胞收集組合物，或者向?qū)⒃谄渲薪怆x和/或消化組織的溶液中添加螯合劑來(lái)進(jìn)一步解 離組織，所述螯合劑例如乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N， N，N' N'-四乙酸(EGTA)或乙二胺四 乙酸(EDTA)。
可以理解，當(dāng)完整的胎盤或胎盤的一部分同時(shí)含有胎兒和母體細(xì)胞(例如，胎盤 的一部分包含絨毛膜或絨毛小葉)時(shí)，收集的胎盤干細(xì)胞將同時(shí)包含來(lái)源于胎兒和母體源 的胎盤干細(xì)胞的混合物。當(dāng)胎盤的部分不含有或只含有可忽略量的母體細(xì)胞(例如，羊膜) 時(shí)，收集的胎盤干細(xì)胞將幾乎只含有胎兒的胚胎干細(xì)胞。
5. 3. 4.胎盤灌流 還可以通過(guò)灌流哺乳動(dòng)物胎盤來(lái)獲得胎盤干細(xì)胞。灌流哺乳動(dòng)物胎盤以獲得干 細(xì)胞的方法公開在例如Hariri,美國(guó)專利號(hào)7， 045， 148中，和于2005年12月29日提交 的，名為"用于收集胎盤干細(xì)胞和保存器官的改良基質(zhì)以及使用該組合物的方法(Improved Medium for Collecting PlacentalStem Cells and Preserving Organs and Methods of Using the Composition)"的相關(guān)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/754， 969中。 可以利用例如干細(xì)胞收集組合物作為灌流液，通過(guò)灌流例如通過(guò)胎盤脈管系統(tǒng)來(lái) 收集胎盤干細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，通過(guò)使灌流液流經(jīng)臍動(dòng)脈和/或臍靜脈來(lái)灌流哺乳動(dòng) 物胎盤?？梢岳萌缰亓α魅胩ケP來(lái)實(shí)現(xiàn)灌流液在胎盤中的流動(dòng)。優(yōu)選的，利用泵如，蠕動(dòng) 泵來(lái)迫使灌流液流經(jīng)胎盤。例如，可以用套管，如TEFLON⑧或塑料套管對(duì)臍靜脈進(jìn)行插 管，所述套管與無(wú)菌的連接裝置，如無(wú)菌管道相連。無(wú)菌的連接裝置與灌流歧管相連。
在準(zhǔn)備灌流中，胎盤優(yōu)選的按臍動(dòng)脈和臍靜脈位于胎盤最高點(diǎn)的方式來(lái)定位 (如，懸掛)?？梢酝ㄟ^(guò)灌流液，例如本發(fā)明的干細(xì)胞收集組合物，在胎盤脈管系統(tǒng)或在胎盤 脈管系統(tǒng)和相鄰組織中的流通來(lái)灌流胎盤。在一實(shí)施方案中，臍動(dòng)脈和臍靜脈同時(shí)連接移 液器，所述移液器通過(guò)可變的連接管與灌流液的儲(chǔ)器相連。所述灌流液流入臍靜脈和動(dòng)脈。 所述灌流液滲出和/或流經(jīng)血管壁進(jìn)入胎盤的周圍組織，并從在孕期附著于母親子宮上的 胎盤表面合適的開放脈管中收集。所述灌流液還可以通過(guò)臍帶開口導(dǎo)入，并允許從與母體 子宮壁接觸的胎盤壁中的開口流出或滲出。在另一實(shí)施方案中，所述灌流液流經(jīng)臍靜脈并 從臍動(dòng)脈收集，或者流經(jīng)臍動(dòng)脈并從臍靜脈收集。 在一實(shí)施方案中，在灌流過(guò)程中夾緊臍帶近端，更優(yōu)選的，在臍帶插入胎盤的 4-5cm(厘米)內(nèi)夾緊。 在放血過(guò)程中從哺乳動(dòng)物胎盤首先收集的灌流液一般都被臍帶血和/或胎盤血 殘留的血紅細(xì)胞著色。隨著灌流繼續(xù)和殘留的臍帶血細(xì)胞從胎盤中洗出，灌流液變得越來(lái) 越無(wú)色。 一般30至100ml (毫升)灌流液足以初步將胎盤放血，但根據(jù)觀察的結(jié)果可以使 用或多或少的灌流液。 用于收集胎盤干細(xì)胞的灌流液體積可以根據(jù)收集的干細(xì)胞數(shù)量、胎盤大小、對(duì) 單個(gè)胎盤進(jìn)行的收集次數(shù)等來(lái)變化。在不同的實(shí)施方案中，灌流液的體積可以自50mL 至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至 2000mL、或750mL至2000mL。 一般，在放血后用700-800mL灌流液來(lái)灌流胎盤。
胎盤可以在數(shù)小時(shí)或數(shù)天的過(guò)程中進(jìn)行多次灌流。當(dāng)胎盤進(jìn)行多次灌流時(shí)，可 以在容器或其它合適的器皿中在無(wú)菌條件下維持或培養(yǎng)，并用干細(xì)胞收集組合物或標(biāo)準(zhǔn) 灌流液(例如，普通的鹽溶液如磷酸鹽緩沖液("PBS"))灌流，其中含有或不含抗凝劑 (如，肝素、華法令鈉、香豆素、雙香豆素)，和/或含有或不含抗微生物劑(如，P-巰基乙 醇(0. lmM);抗生素如鏈霉素(如40-100 iig/ml)、青霉素(如40U/ml)、兩性霉素B (如 0. 5ii g/ml))。在一實(shí)施方案中，將分離的胎盤維持或培養(yǎng)一段時(shí)間而沒(méi)有收集灌流液，從而所述胎盤在灌流和收集灌流液前，被維持或培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)小時(shí)，或者2或3或更多天。灌流的胎盤可以被維 持用于再進(jìn)行一次或多次灌流，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24或更多個(gè)小時(shí)，并用如700-800mL灌流液再灌流第二次。所述胎盤可以 灌流1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小時(shí)一次。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胎盤的 灌流和灌流液的收集，如干細(xì)胞收集組合物，被重復(fù)直至回收的有核細(xì)胞數(shù)低于100細(xì)胞/ ml。不同時(shí)間點(diǎn)的灌流液可以分別進(jìn)一步處理用來(lái)回收時(shí)間依賴性的細(xì)胞群，如干細(xì)胞。不 同時(shí)間點(diǎn)的灌流液也可以被混合。 不希望被任何理論約束，在放血并灌流胎盤足夠長(zhǎng)時(shí)間后，胎盤干細(xì)胞被認(rèn)為遷 移到被放血和灌流的胎盤的微循環(huán)中，根據(jù)本發(fā)明的方法，收集干細(xì)胞，優(yōu)選的通過(guò)灌流沖 洗到收集器皿中。灌流分離的胎盤不僅用來(lái)去除殘留的臍帶血，而且為胎盤提供了合適的 營(yíng)養(yǎng)，包括氧氣。所述胎盤可以采用那些用于去除殘留臍帶血細(xì)胞的相似溶液來(lái)培養(yǎng)和灌 流，優(yōu)選的不用添加抗凝劑。 根據(jù)本發(fā)明方法的灌流導(dǎo)致獲得的胎盤干細(xì)胞顯著多于從未用所述溶液灌流，或 者未經(jīng)其它處理(例如，通過(guò)組織解離如酶促消化)來(lái)獲得干細(xì)胞的哺乳動(dòng)物胎盤中可獲 得的數(shù)量。在本文的上下文中，"顯著多于"是指多至少10%。根據(jù)本發(fā)明的方法灌流產(chǎn)生 的胎盤干細(xì)胞顯著多于例如，從被培養(yǎng)的胎盤或其一部分的培養(yǎng)基中可獲得的胎盤干細(xì)胞 數(shù)量。 通過(guò)用包含一種或多種蛋白酶或其他組織解離酶的溶液灌流，可以從胎盤中分離 干細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，將胎盤或其一部分(例如，羊膜、羊膜和絨毛膜、胎盤小葉或絨 毛小葉、臍帶或任何上述的組合)恢復(fù)至25-37°C ，并在200mL培養(yǎng)基中用一種或多種組織 解離酶孵育30分鐘。收集灌流液中的細(xì)胞，降至4°C，并用包含5mM EDTA、2mM 二硫蘇糖醇 和2mMI3 -巰基乙醇的冷卻抑制劑混合物洗滌。數(shù)分鐘后，用本發(fā)明的冷卻的(如4°C )干 細(xì)胞收集組合物來(lái)洗滌干細(xì)胞。 可以理解，利用盤法(pan method)灌流獲得的是胎兒和母體細(xì)胞的混合物，即通 過(guò)該方法，灌流液在其從胎盤的母體側(cè)滲出后被收集。結(jié)果，通過(guò)該方法收集的細(xì)胞包含混 合的胎兒和母體來(lái)源的胎盤干細(xì)胞群。相反，僅通過(guò)胎盤脈管系統(tǒng)灌流，因?yàn)楣嗔饕毫鹘?jīng)一 根或兩根胎盤血管，并僅通過(guò)剩余的血管收集，將導(dǎo)致胎盤干細(xì)胞群的收集物幾乎都是胎 兒來(lái)源的。 5. 3. 5胎盤干細(xì)胞的分離、分選和鑒別 來(lái)源于哺乳動(dòng)物胎盤的干細(xì)胞，不論是否由灌流或酶促消化獲得的，可以通過(guò)聚 蔗糖(Ficoll)梯度離心從其它細(xì)胞中初步純化(即分離)。此類離心可以遵循任何標(biāo)準(zhǔn) 離心方法的速度等。例如，在一實(shí)施方案中，從胎盤收集的細(xì)胞是通過(guò)在5000 X g室溫離心 15分鐘從灌流液中回收的，其將細(xì)胞與例如污染的殘?jiān)脱“宸蛛x開。在另一實(shí)施方案 中，胎盤灌流液被濃縮至約200ml，輕輕地鋪在Fico11上，在22t:以約1100Xg離心20分 鐘，收集低密度的細(xì)胞中間層用于進(jìn)一步處理。 細(xì)胞沉淀可重懸于新鮮的干細(xì)胞收集組合物中，或適合干細(xì)胞維持的培養(yǎng)基中， 例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA的MDM無(wú)血清培養(yǎng)基(GibcoBRL， NY)?？梢岳美?LYMPHOPREP (Nycomed Pharma， Oslo，挪威)，按照生產(chǎn)商的推薦方法來(lái)分離總單核細(xì)胞部分。 如本發(fā)明中使用的，"分離"的胎盤干細(xì)胞是指將一般在完整哺乳動(dòng)物胎盤中與干 細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞去除至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。當(dāng) 其存在于包含少于50%的一般在完整器官內(nèi)與干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞的細(xì)胞群中時(shí)，來(lái)源于器 官的干細(xì)胞就是"分離的"。 通過(guò)灌流或消化獲得的胎盤細(xì)胞，例如，可以采用，如具有0.2% EDTA(Sigma， St. Louis M0)的0. 05%胃蛋白酶溶液通過(guò)差別胰酶消化來(lái)進(jìn)一步或初步地分離。由于胎 盤干細(xì)胞一般在約5分鐘內(nèi)從塑料表面脫離，而其它附著的群一般要求超過(guò)20-30分鐘孵 育，因此差別胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex) 的胰蛋白酶中和反應(yīng)后，可以收獲脫離的胎盤干細(xì)胞。在分離附著細(xì)胞的一實(shí)施方案中，等 份的細(xì)胞，如5-10 X 106個(gè)細(xì)胞被放置在每個(gè)T-75瓶中，優(yōu)選的纖連蛋白包被的T75瓶中。 在此類實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以用商購(gòu)的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM) (Cambrex)， 并且置于組織培養(yǎng)箱(37°C，5% C02)中來(lái)培養(yǎng)。在10-15天后，通過(guò)用PBS洗滌從瓶中去 除非附著細(xì)胞。然后用MSCGM替代PBS。優(yōu)選的每天檢查培養(yǎng)瓶中不同附著細(xì)胞類型的存 在，并且特別的鑒別和擴(kuò)增成纖維樣細(xì)胞簇。 從哺乳動(dòng)物胎盤中收集的細(xì)胞數(shù)量和類型可以被監(jiān)測(cè)例如通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞 檢測(cè)技術(shù)，如流式細(xì)胞儀、細(xì)胞分選、免疫組織化學(xué)(例如，用組織特異性或細(xì)胞標(biāo)志特異 性抗體染色)、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)、磁性活化細(xì)胞分選(MACS)來(lái)測(cè)量細(xì)胞表面標(biāo)記 和形態(tài)學(xué)；通過(guò)利用光學(xué)或共聚焦顯微鏡來(lái)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)；和/或利用本領(lǐng)域公知的技 術(shù)，例如PCR和基因表達(dá)譜來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)的改變。這些技術(shù)也可用于鑒別對(duì)于一種或多 種特定標(biāo)記呈陽(yáng)性的細(xì)胞。例如，利用CD34的抗體，利用上述技術(shù)，可以確定細(xì)胞是否含有 可檢測(cè)量的CD34 ;如果是，則細(xì)胞是CD34+。同時(shí)，如果細(xì)胞產(chǎn)生足夠的能被RT-PCR所檢測(cè) 的0CT-4 RNA，或者顯著多于成體細(xì)胞的0CT-4 RNA，則該細(xì)胞是0CT-4+。細(xì)胞表面標(biāo)記(例 如CD標(biāo)記如CD34)的抗體，和干細(xì)胞特異性基因例如0CT-4的序列，也是本領(lǐng)域公知的。
胎盤細(xì)胞，特別是已經(jīng)經(jīng)過(guò)Ficoll分離、差別附著，或兩者的結(jié)合所分離的細(xì)胞 可以利用熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)來(lái)分選。熒光活化細(xì)胞分選(FACS)是基于顆粒的熒 光性質(zhì)用于分離顆粒(包括細(xì)胞)的普遍已知的方法(Kamarch，1987， Methods Enzymol， 151 :150-165)。單個(gè)顆粒中熒光部分的激光激發(fā)產(chǎn)生微小的電荷，從而允許混合物中正電 和負(fù)電顆粒的電磁分離。在一實(shí)施方案中，用不同的熒光標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)記特異性 抗體或配體。細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞分選儀處理，從而允許基于其與所用抗體的結(jié)合能力來(lái)分離細(xì) 胞。FACS分選的顆粒可以直接注入96-孔或384-孔板的單個(gè)孔中，從而便于分離和克隆。
在一個(gè)分選技術(shù)方案中，來(lái)源于胎盤的干細(xì)胞基于標(biāo)記CD34、 CD38、 CD44、 CD45、 CD73、 CD105、 0CT-4和/或HLA-G的表達(dá)來(lái)分選。它可以通過(guò)結(jié)合基于細(xì)胞在培養(yǎng)中的附 著性質(zhì)來(lái)選擇干細(xì)胞的步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以在基于標(biāo)記表達(dá)的分選之前或之后實(shí)現(xiàn)附 著選擇干細(xì)胞。例如，在一實(shí)施方案中，首先基于CD34的表達(dá)來(lái)分選細(xì)胞；保留CD34—的 細(xì)胞，并將CD200+HLA-G+的細(xì)胞與所有其它CD34—細(xì)胞分離。在另一實(shí)施方案中，基于標(biāo)記 CD200和/或HLA-G的表達(dá)來(lái)分選來(lái)源于胎盤的細(xì)胞；例如，表現(xiàn)出任一這些標(biāo)記的細(xì)胞被 分離以供進(jìn)一步使用。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)例如CD200和/或HLA-G的細(xì)胞可以進(jìn)一 步被分選，所述分選可以基于CD73和/或CD105的表達(dá)，或通過(guò)抗體SH2、 SH3或SH4識(shí)別的表位，或缺少CD34、 CD38或CD45的表達(dá)。例如，在一實(shí)施方案中，胎盤細(xì)胞通過(guò)CD200、 HLA-G、 CD73、 CD105、 CD34、 CD38和CD45的表達(dá)或其缺失來(lái)分選，并且將CD200+、 HLA_G+、 CD73+、 CD105+、 CD34—、 CD38—和CD4—5的細(xì)胞與其它胎盤細(xì)胞分離，供進(jìn)一步使用。
在另一實(shí)施方案中，可以使用磁珠來(lái)分離細(xì)胞。可以利用磁性活化細(xì)胞分選 (MACS)技術(shù)分選細(xì)胞，所述技術(shù)是基于顆粒結(jié)合磁珠(0. 5-100 ym直徑)的能力來(lái)分選顆 粒的方法。對(duì)磁微珠可以進(jìn)行多種有效的修飾，包括共價(jià)添加特異性識(shí)別特定細(xì)胞表面分 子或半抗原的抗體。所述磁珠隨后與細(xì)胞混合，從而允許結(jié)合。然后將細(xì)胞通過(guò)磁場(chǎng)，以分 離出具有特定細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，這些細(xì)胞可隨后分離，并與偶聯(lián)了抗 其它細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體的磁珠再混合。所述細(xì)胞再次通過(guò)磁場(chǎng)，分離結(jié)合兩種抗體的細(xì) 胞。然后可以將此類細(xì)胞稀釋入不同的培養(yǎng)皿中，例如微滴培養(yǎng)皿中用于克隆分離。
胎盤干細(xì)胞還可以基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特征來(lái)表征和/或分選。例如，胎盤干 細(xì)胞可以表征為在培養(yǎng)中具有成纖維細(xì)胞樣表型，和/或基于成纖維細(xì)胞樣表型來(lái)選擇。 胎盤干細(xì)胞還可以表征為具有形成胚樣體的能力，和/或基于其形成胚樣體的能力來(lái)選 擇。在一實(shí)施方案中，例如，將形狀為成纖維細(xì)胞樣，表達(dá)CD73和CD105,并在培養(yǎng)中產(chǎn)生一 個(gè)或多個(gè)胚樣體的胎盤細(xì)胞與其它胎盤細(xì)胞分離。在另一實(shí)施方案中，將培養(yǎng)中產(chǎn)生一個(gè) 或多個(gè)胚樣體的0CT-4+胎盤細(xì)胞與其它胎盤細(xì)胞分離。 在另一實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞可以通過(guò)集落形成單位試驗(yàn)來(lái)鑒別和表征。集落 形成單位試驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的，例如MESEN CULT 培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies, Inc.， Vancouver British Columbia)。 利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如臺(tái)盼藍(lán)不相容試驗(yàn)、醋酸熒光素?cái)z取試驗(yàn)、碘化 丙錠攝取試驗(yàn)(評(píng)估活力)；和胸腺嘧啶核苷攝取試驗(yàn)、MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)(評(píng)估增殖)來(lái) 分析胎盤干細(xì)胞的活力、增殖潛力和壽命。壽命可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法可以確定，例如 通過(guò)延長(zhǎng)培養(yǎng)中群倍增的最大數(shù)來(lái)確定。 利用本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)也可以用來(lái)將胎盤干細(xì)胞和其它胎盤細(xì)胞分離開，例 如期望細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)(陽(yáng)性分選)、不需要細(xì)胞的選擇性破壞(陰性選擇)、基于混合 群與例如大豆凝聚素的差別細(xì)胞可凝集性的分離、凍融步驟、過(guò)濾、常規(guī)離心和區(qū)帶離心、 離心沖洗(逆流離心)、單位重力分離、逆流分布、電泳等等。
5.4胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)
5. 4. 1培養(yǎng)基 分離的胎盤干細(xì)胞、或胎盤干細(xì)胞群、或從其中生長(zhǎng)出胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞或胎盤 組織可被用于起始或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞一般轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的組織培養(yǎng)容器內(nèi)，所述容 器使用或未使用胞外基質(zhì)或配體包被，例如層粘連蛋白、膠原(如天然的或變性的)、明 膠、纖連蛋白、鳥氨酸、玻璃體粘附蛋白、和胞外膜蛋白(例如MATRIGEL(BD Discovery Labware， Bedford, Mass.))。 可以在本領(lǐng)域認(rèn)為適合干細(xì)胞培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基和任何條件下培養(yǎng)胎盤干細(xì)胞。 優(yōu)選的，培養(yǎng)基包含血清。胎盤干細(xì)胞可以培養(yǎng)在例如DMEM-LG(Dulbecco改良的必需培 養(yǎng)基，低糖)/MCDB 201 (雞成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，其含有ITS (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒)、 LA+BSA(亞油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗壞血酸、PDGF、 EGF、 IGF-1，和青霉素/鏈 霉素；含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15% FBS的DMEM-HG ;含有10%FBS、10X馬血清和氫化可的松的MDM(Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基)；含有10% FBS、 EGF和肝素的M199 ;含有10XFBS、GLUTAMAXTM和慶大霉素的a-MEM(最低必需培養(yǎng)基)；含 有10% FBS、GLUTAMAXTM和慶大霉素等的DMEM。優(yōu)選的培養(yǎng)基是含有2% FBS、 ITS、LA+BSA、 右旋糖、L-抗壞血酸、PDGF、 EGF，和青霉素/鏈霉素的DMEM-LG/MCDB-201 。
可用于培養(yǎng)胎盤干細(xì)胞的其它培養(yǎng)基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng) 基、Ham的F10培養(yǎng)基(F10) 、 Ham的F12培養(yǎng)基(F12) 、 Iscove的改良的Dulbecco培養(yǎng) 基、間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM) 、 Liebovitz的L-15培養(yǎng)基、MCDB、 DMIEM/F12、 RPMI 1640、改良的DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201 (Sigma)和CELL-GR0 FREE。 培養(yǎng)基可以添加一種或多種組分，包括例如血清(如胎牛血清(FBS)，優(yōu)選的約 2-15% (v/v);馬血清(ES);人血清(HS)) ;P-巰基乙醇(BME)，優(yōu)選的約0. 001 % (v/v); 一種或多種生長(zhǎng)因子，例如，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、基礎(chǔ)成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素-樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、和促紅細(xì)胞生成素(EPO);氨基酸包括L-纈氨酸；和用于控制微生物 污染的一種或多種抗生素和/或抗真菌劑，例如青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、和制霉 菌素，單獨(dú)或組合使用。
5. 4.2胎盤干細(xì)朐的擴(kuò)增和增獵 —旦分離胎盤干細(xì)胞或分離干細(xì)胞群(例如，與至少50%的胎盤細(xì)胞分離的干細(xì) 胞或干細(xì)胞群，所述胎盤細(xì)胞在體內(nèi)是通常與干細(xì)胞或干細(xì)胞群相關(guān)的)，就可以在體外增 殖或擴(kuò)增干細(xì)胞或干細(xì)胞群。例如，可以在組織培養(yǎng)容器(例如皿、瓶、多孔板等)中培養(yǎng) 胎盤干細(xì)胞群一段時(shí)間，足夠使干細(xì)胞增殖至70_90%匯合度，8卩，直到干細(xì)胞及其后代占 據(jù)組織培養(yǎng)容器的70_90%的培養(yǎng)表面區(qū)域。 胎盤干細(xì)胞可以允許細(xì)胞生長(zhǎng)的密度接種在培養(yǎng)容器內(nèi)。例如，所述細(xì)胞可以低 密度(例如約1， 000至約5， 000細(xì)胞/cm2)至高密度(例如約50， 000或更多細(xì)胞/cm2) 來(lái)接種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在約0至約5%體積0)2的空氣中培養(yǎng)細(xì)胞。在一些優(yōu)選的 實(shí)施方案中，在約2至約25%體積02的空氣中培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選的在約5至約20%體積02的
空氣中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞優(yōu)選的培養(yǎng)在約25t:至約4(rc，優(yōu)選的37t:。細(xì)胞優(yōu)選的在培養(yǎng)箱
中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基可以是靜態(tài)的或攪動(dòng)的，例如，利用生物反應(yīng)器。胎盤干細(xì)胞優(yōu)選的生 長(zhǎng)在低氧化壓力下(例如，添加谷胱甘肽、抗壞血酸、過(guò)氧化氫酶、生育酚、^乙酰半胱氨酸 等)。 —旦獲得70% _90%匯合度，細(xì)胞就可以傳代。例如，所述細(xì)胞可以利用本領(lǐng)域公
知的技術(shù)來(lái)酶促處理，例如胰蛋白酶消化，從而將其與組織培養(yǎng)表面分離。在通過(guò)移液除去
細(xì)胞和計(jì)數(shù)細(xì)胞后，約20， 000-100， 000個(gè)干細(xì)胞，優(yōu)選的約50， 000個(gè)干細(xì)胞被傳代到含有
新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)容器內(nèi)。 一般的，新培養(yǎng)基與從中去除干細(xì)胞的培養(yǎng)基是相同類型的
培養(yǎng)基。發(fā)明涵蓋了已經(jīng)傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次
的胎盤干細(xì)胞群。 5. 4. 3胎盤干細(xì)胞群 本發(fā)明提供了胎盤干細(xì)胞群。胎盤干細(xì)胞群可以直接分離自 一個(gè)或多個(gè)胎盤；即， 所述胎盤干細(xì)胞群可以是包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群，所述胚胎肝細(xì)胞獲自或包含于 灌流液，或者來(lái)源于或包含于消化液(即，通過(guò)酶促消化胎盤或其部分所獲得的細(xì)胞收集物)。還可以培養(yǎng)和擴(kuò)增本發(fā)明的分離的胎盤干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生胎盤干細(xì)胞群。還可以培養(yǎng)和 擴(kuò)增包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群來(lái)產(chǎn)生胎盤干細(xì)胞群。 本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞，例如本發(fā)明中描述的胎盤干細(xì)胞。在多 個(gè)實(shí)施方案中，在分離的胎盤干細(xì)胞群中，至少10% 、20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70%、 80%、90%、95%或99%的細(xì)胞是胎盤干細(xì)胞。即，胎盤干細(xì)胞群可以包含例如多至1%、 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非干細(xì)胞。 在本文的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)可以是能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞(例如胎盤干細(xì)胞)的培養(yǎng)和 /或選擇的任何表面。 一般的，所述基質(zhì)是塑料，例如組織培養(yǎng)皿或多孔板塑料。組織培養(yǎng) 塑料可以用生物分子例如層粘連蛋白或纖連蛋白包被。 可以通過(guò)細(xì)胞選擇領(lǐng)域任何已知的方法來(lái)選擇細(xì)胞(例如胎盤干細(xì)胞)用于胎 盤干細(xì)胞群。例如，可以利用抗一種或多種細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體選擇細(xì)胞，例如，在流式細(xì) 胞儀或FACS。利用與磁珠連接的抗體可以實(shí)現(xiàn)選擇。特異性針對(duì)某些干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的 抗體是本領(lǐng)域已知的。例如，炕0CT-4抗體(Abcam， Cambridge, MA) 、 CD200抗體(Abeam)、 HLA-G抗體(Abcam) 、CD73抗體(BD Biosciences Pharmingen， San Diego， CA) 、CD105抗體 (Abeam ;BioDesign International, Saco，ME)等。其他標(biāo)記的抗體也是可商購(gòu)的，例如可 以從如StemCell Technologies或BioDesign International獲得的CD34、 CD38禾口 CD45 抗體。 分離的胎盤干細(xì)胞群可以包括不是干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞，或者不是胎盤細(xì)胞的細(xì) 胞。 分離的胎盤干細(xì)胞群可以與一個(gè)或多個(gè)非干細(xì)胞或非胎盤細(xì)胞的群結(jié)合。例如， 分離的胎盤干細(xì)胞群可以結(jié)合血液(例如胎盤血或臍帶血)、血液來(lái)源的干細(xì)胞(例如 來(lái)源于胎盤血或臍帶血的干細(xì)胞)、血液來(lái)源的有核細(xì)胞的群、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、 骨來(lái)源的干細(xì)胞群、原始骨髓、成人(成體)干細(xì)胞、包含在組織內(nèi)的干細(xì)胞群、培養(yǎng)的干 細(xì)胞、完全分化的細(xì)胞的群(例如軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、 心肌細(xì)胞等)等。與每個(gè)群中總有核細(xì)胞的數(shù)量相比，分離的胎盤干細(xì)胞群內(nèi)的細(xì)胞可
以與大量另一種類型的細(xì)胞相結(jié)合，結(jié)合比例為約ioo，ooo，ooo : i、50，ooo，ooo : i、 20， ooo， ooo : iuo，ooo，ooo : i、5，ooo，ooo : 1、2，000，000 : iu，ooo，ooo : i、 50o，ooo : i、20o，ooo : iuoo，ooo : 1、50，000 : 1、20，000 : iuo，ooo : i、5，ooo : i、 2，ooo : iu，ooo : i、soo : 1、200 : i、ioo : i、50 : 1、20 : i、io : i、5 : i、2 : i、 i : i;i : 2、i : 5、i : io、i : ioo、i : 200、1 : soo、i : i，ooou : 2，ooo、i : 5，ooo、 i : io， ooo、 i : 20，000、1 : 50，000、1 : ioo，ooou : 500，000、1 : i，ooo，ooo、 i : 2， ooo， ooo、 i : 5，ooo，ooo、i : io，ooo，ooo、i : 20，000，000、1 : 50，(K)0，000，或約 i : ioo，ooo，ooo。在分離的胎盤干細(xì)胞群中的細(xì)胞也可以與多種細(xì)胞類型的大量細(xì)胞相
^口 口 。 在一實(shí)施方案中，分離的胎盤干細(xì)胞群與大量造血干細(xì)胞結(jié)合。此類造血干細(xì)胞 可以是例如，包含在未處理的胎盤、臍帶血或外周血中；在來(lái)源于胎盤血、臍帶血或外周血 的總有核細(xì)胞中；在來(lái)源于胎盤血、臍帶血或外周血的分離的CD34+細(xì)胞群中；在未處理的 骨髓中；在來(lái)源于骨髓的總有核細(xì)胞中；在來(lái)源于骨髓的分離的CD34+細(xì)胞群中；等等。
5.5胎盤干細(xì)胞的保存
33
胎盤干細(xì)胞可以置于允許長(zhǎng)期儲(chǔ)存的條件下，或置于抑制細(xì)胞死亡(如凋亡或壞 死)的條件下保存。 如2005年12月29日提交的名為"用于收集和保藏胎盤干細(xì)胞的改良組合 物及禾U用該組合物的方法(Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)，，的相關(guān)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) 號(hào)60/754， 969中所述，可以利用例如包含凋亡抑制劑、壞死抑制劑和/或攜氧全氟化碳的 組合物保存胎盤干細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了保存干細(xì)胞群的方法，包括將所述 干細(xì)胞群與含有凋亡抑制劑和攜氧全氟化碳的干細(xì)胞收集組合物相接觸，與未接觸凋亡抑 制劑的干細(xì)胞群相比，其中所述凋亡抑制劑存在的量和時(shí)間可足以降低或預(yù)防干細(xì)胞群中 的凋亡。在特定實(shí)施方案中，所述凋亡抑制劑是JNK抑制劑。在更特定的實(shí)施方案中，所述 JNK抑制劑不調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞收集組合物 包含所述凋亡抑制劑和在分離的相中的所述攜氧全氟化碳。在另一實(shí)施方案中，所述干細(xì) 胞收集組合物包含所述凋亡抑制劑和在乳液中的所述攜氧全氟化碳。在另一實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞收集組合物還包含乳化劑，例如卵磷脂。在另一實(shí)施方案中，在接觸干細(xì)胞時(shí)， 所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳處于約ot:和約25t:之間。在另一更特定的實(shí)施方案中， 在接觸干細(xì)胞時(shí)，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳處于約2t:和約i(TC之間，或約2t:和約 5t:之間。在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸是在轉(zhuǎn)移所述干細(xì)胞群的過(guò)程中實(shí)施的。
在另一更特定的實(shí)施方案中，所述接觸是在冷凍和融化所述干細(xì)胞群的過(guò)程中實(shí)施的。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了保存胎盤干細(xì)胞群的方法，包括將所述干細(xì)胞
群與凋亡抑制劑和器官防腐化合物相接觸，與未接觸凋亡抑制劑的干細(xì)胞群相比，其中所 述凋亡抑制劑存在的量和時(shí)間可足以降低或預(yù)防干細(xì)胞群中的凋亡。在特定實(shí)施方案中，
所述器官防腐化合物是UW溶液(描述于美國(guó)專利號(hào)4， 798， 824中；其也被稱為ViaSpan ; 還參見Southard等人，Transplantation 49(2) :251-257(1990))或者在Stern等人的，美 國(guó)專利號(hào)5， 552， 267中描述的溶液。在另一實(shí)施方案中，所述器官防腐化合物是羥乙基淀 粉、乳糖酸、棉子糖，或其組合。在另一實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞收集組合物還包含位于兩相 或位于乳液中的攜氧全氟化碳。 在本方法的另一實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞在灌流過(guò)程中與包含凋亡抑制劑和攜氧 全氟化碳，器官防腐化合物，或其組合的干細(xì)胞收集組合物相接觸。在另一實(shí)施方案中，在 組織破壞(例如，酶促消化)過(guò)程中，所述干細(xì)胞產(chǎn)生接觸。在另一實(shí)施方案中，在灌流收 集后，或在組織破壞(例如，酶促消化)后，胎盤干細(xì)胞與所述干細(xì)胞收集化合物相接觸。
—般的，在胎盤細(xì)胞收集、富集和分離過(guò)程中，優(yōu)選的最小化或消除由于缺氧和機(jī) 械壓力導(dǎo)致的細(xì)胞脅迫。因此，在本方法的另一實(shí)施方案中，在收集、富集或分離過(guò)程中，干 細(xì)胞或干細(xì)胞群在所述保存中暴露在低氧條件下少于6個(gè)小時(shí)，其中所述低氧條件是氧濃 度低于正常的血氧濃度。在更特定的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞群在所述保存中暴露在所述 低氧條件下少于2個(gè)小時(shí)。在另一更特定的實(shí)施方案中，在收集、富集或分離過(guò)程中，所述 干細(xì)胞群暴露在所述低氧條件下少于1個(gè)小時(shí)、或少于30分鐘、或不暴露于低氧條件下。在 另一更特定實(shí)施方案中，在收集、富集或分離過(guò)程中，所述干細(xì)胞群不暴露于剪切力下。
本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞可以冷凍保存，例如置于小容器(如安瓿瓶)中的冷凍保存 培養(yǎng)基中。合適的冷凍保存培養(yǎng)基包括但不限于如下培養(yǎng)基，其包括例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，例如可商購(gòu)的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，例如C2695、 C2639或C6039 (Sigma)。冷 凍保存培養(yǎng)基優(yōu)選的包含匿SO(二甲亞砜)，其濃度為例如約10% (v/v)。冷凍保存培養(yǎng) 基可以包含其它試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。在冷凍保存過(guò)程中，胎盤干細(xì)胞優(yōu)選 的以約1°C /分鐘冷卻。優(yōu)選的冷凍保存溫度是約-S(TC至約-IS(TC，優(yōu)選的約-125°〇至 約-14(TC。在解凍使用前，冷凍保存的細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到液氮中。在一些實(shí)施方案中，例如，
一旦安瓿瓶達(dá)到約-g(rc，就將其轉(zhuǎn)移至液氮儲(chǔ)存區(qū)域。冷凍保存的細(xì)胞優(yōu)選的在溫度約
25°C至約40°C ，優(yōu)選的在溫度約37°C下解凍。 5.6胎盤干細(xì)胞的用途 5. 6. l包含胎盤干細(xì)朐的纟目合物 本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞抑制的方法可以使用包含胎盤干細(xì)胞或其來(lái)源的生物分子的 組合物。以相同的方式，本發(fā)明的大量胎盤干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞群可以與任何生理學(xué)可接 受的，或醫(yī)學(xué)可接受的化合物、組合物相結(jié)合，或與例如在研究或治療中使用的儀器結(jié)合使 用。 5. 6. 1. l冷凍保存的胎盤干細(xì)朐 本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干細(xì)胞群可以保存，例如冷凍保存供后期使用。冷 凍保存細(xì)胞，例如干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。胎盤干細(xì)胞群可以制備成易于向個(gè)體施 用的形式。例如，本發(fā)明提供了包含在適合醫(yī)學(xué)使用的容器內(nèi)的胎盤干細(xì)胞群。此類容器 可以是例如，無(wú)菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便的分配胎盤干細(xì)胞群的容器。例如，所 述容器可以是適合將液體靜脈施用至接受者的血袋或其它塑料的、醫(yī)學(xué)可接受的袋。所述 容器優(yōu)選的是允許冷凍保存組合的干細(xì)胞群的容器。 冷凍保存的腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干細(xì)胞群可以包括來(lái)源于單個(gè)供體，或多個(gè)供 體的胎盤干細(xì)胞。所述胎盤干細(xì)胞群可以與目標(biāo)接受者是完全的HLA匹配，或者部分的 HLA-不匹配、或完全的HLA-不匹配。 因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了位于容器中的包含腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干 細(xì)胞群的組合物。在特定實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞群是冷凍保存的。在另一特定實(shí)施方案 中，所述容器是袋、瓶或罐。在更特定的實(shí)施方案中，所述袋是無(wú)菌塑料袋。在更特定的實(shí) 施方案中，所述袋適合、允許或有助于靜脈施用所述胎盤干細(xì)胞群。所述袋可以包括相互 連接的多個(gè)內(nèi)腔或隔室，其允許在施用前或施用過(guò)程中將胎盤干細(xì)胞與一種或多種其它溶 液，例如藥物進(jìn)行混合。在另一特定實(shí)施方案中，所述組合物包括有助于冷凍保存所述組合 的干細(xì)胞群的一種或多種化合物。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞群包含在生理 可接受的水溶液中。在另一特定實(shí)施方案中，所述生理可接受的水溶液為0. 9% NaCl水溶 液。在更特定的實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞群包含與所述干細(xì)胞群的接受者HLA匹配的 胎盤細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述組合的干細(xì)胞群包括與所述干細(xì)胞群的接受者至 少部分HLA不匹配的胎盤細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞來(lái)源于大量供體。
5. 6. 1. 2藥物組合物 腫瘤細(xì)胞抑制性的胎盤干細(xì)胞群，或包含胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群，可以配制成體內(nèi) 使用的藥物組合物。此類藥物組合物在制藥可接受的載體(例如用于體內(nèi)施用的鹽溶液 或其它生理學(xué)可接受的溶液)中包含胎盤干細(xì)胞群，或包含胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明 的藥物組合物可以包括本發(fā)明其他部分描述的任何胎盤干細(xì)胞群，或胎盤干細(xì)胞類型。所述藥物組合物可以包括胎兒、母體，或同時(shí)包括胎兒和母體的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明的藥物組
合物還可以包括來(lái)源于單個(gè)個(gè)體或胎盤，或來(lái)源于多個(gè)個(gè)體或胎盤的胎盤干細(xì)胞。 本發(fā)明的藥物組合物可以包含任何腫瘤細(xì)胞抑制性數(shù)量的胎盤干細(xì)胞。例如，
在不同的實(shí)施方案中，單個(gè)單位劑量的胎盤干細(xì)胞可以包含大約、至少、或不超過(guò)1X105、
5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、
1X1011或更多個(gè)胎盤干細(xì)胞。 本發(fā)明的藥物組合物包含含有50%或更多活細(xì)胞的細(xì)胞群(即，群中至少50%的 細(xì)胞是功能性的或活的)。優(yōu)選的，群中至少60%的細(xì)胞是活的。更優(yōu)選的，藥物組合物的 群中至少70%、80%、90%、95%或99%的細(xì)胞是活的。
5. 6. 1.3胎盤干細(xì)朐條件培養(yǎng)某 本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞可用于生產(chǎn)腫瘤細(xì)胞抑制性的條件培養(yǎng)基，即含有干細(xì)胞分 泌或排出的一種或多種生物分子，所述生物分子對(duì)大量一種或多種類型的腫瘤細(xì)胞具有可 檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞抑制性效果。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含在其中胎盤干細(xì)胞 已經(jīng)生長(zhǎng)了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培養(yǎng)基。在其它實(shí)施 方案中，所述條件培養(yǎng)基包含在其中胎盤干細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)達(dá)至少30 % 、40 % 、50% 、60 % 、 70%、80%、90%匯合度，或高達(dá)100%匯合度的培養(yǎng)基。此類條件培養(yǎng)基可用于支持胎盤干 細(xì)胞，或另一類干細(xì)胞的分離群的培養(yǎng)。在另一實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含在其中的 胎盤干細(xì)胞已經(jīng)分化為成體細(xì)胞類型的培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的條件培養(yǎng)基 包含在其中已經(jīng)培養(yǎng)了胎盤干細(xì)胞和非胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)基。 因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含來(lái)源于胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的 組合物，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)附著于基質(zhì)；(b)表達(dá)CD200和HLA-G ;或表達(dá)CD73、CD105 和CD200 ;或表達(dá)CD200和0CT-4 ;或表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G ;或表達(dá)CD73和CD105，且 當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形 成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)0CT-4，并且當(dāng)所述群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有 助于在包含胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；和(c)可檢測(cè)地抑制腫瘤 細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞群的生長(zhǎng)或增殖。在特定實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含大量的所述 胎盤干細(xì)胞。在另一特定實(shí)施方案中，所述組合物包含大量的非胎盤細(xì)胞。在更特定的實(shí) 施方案中，所述非胎盤細(xì)胞包括CD34+細(xì)胞，例如造血前體細(xì)胞，如外周血造血祖細(xì)胞，臍帶 血造血祖細(xì)胞，或胎盤血造血祖細(xì)胞。所述非胎盤細(xì)胞還可以包含其它干細(xì)胞，例如間充質(zhì) 干細(xì)胞，例如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。所述非胎盤細(xì)胞還可以是一種或多種類型的成體 細(xì)胞或細(xì)胞系。在另一特定實(shí)施方案中，所述組合物包含抗增殖劑，例如，抗MIP-la抗體 或抗MIP-1P抗體。 在特定實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞條件培養(yǎng)基或上清液來(lái)源于與大量腫瘤細(xì)胞以胎
盤干細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞約i : 1、約2 : 1、約3 : 1、約4 : i或約5 : i的比例共培養(yǎng)的大
量胎盤干細(xì)胞。例如，所述條件培養(yǎng)基或上清液可以來(lái)源于包含約1乂105個(gè)胎盤干細(xì)胞、約 1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞、約1 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞、或約1 X 108個(gè)胎盤干細(xì)胞、或更多。在另一 特定的的實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液來(lái)源于包含約1 X 105至約5 X 105個(gè)胎盤干 細(xì)胞和約1X1()5個(gè)腫瘤細(xì)胞、約1X1()6至約5X106個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X1()6個(gè)腫瘤細(xì)胞、 約1X1Q7至約5X107個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X107個(gè)腫瘤細(xì)胞、或約1X1Q8至約5X108個(gè)胎盤干細(xì)胞和約1X108個(gè)腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)物。 在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法的另一特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液是來(lái)源于培養(yǎng)物的培養(yǎng)基或上清液，所述培養(yǎng)物包含大量的單獨(dú)培養(yǎng)的、或與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的胎盤干細(xì)胞，其中產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的胎盤細(xì)胞數(shù)量是基于要對(duì)其施用所述條件培養(yǎng)基的個(gè)體的重量。例如，所述條件培養(yǎng)基或上清液可以是由以下培養(yǎng)物產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基或上清液，所述培養(yǎng)物包含約1 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg接受者體重、5 X 103個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5 X 106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、 1 X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、5X 107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg、或1 X 108個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg。在另一特定實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基或上清液是來(lái)源于共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基或上清液，所述共培養(yǎng)物含有約lX103至約5Xl()3個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1Xl()3個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1X1()4至約5X104個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1 X 104個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1 X 105至約5 X 105個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1X105個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1X1()6至約5X106個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1X106個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、約1X1()7至約5X107個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1X107個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg、或約1X108至約5 X 108個(gè)胎盤干細(xì)胞/kg和約1 X 108個(gè)腫瘤細(xì)胞/kg。 在特定實(shí)施方案中，適合向70kg的個(gè)體施用的條件培養(yǎng)基包含在約200mL培養(yǎng)基中由70， 000， 000個(gè)胎盤干細(xì)胞條件化的上清液。 條件培養(yǎng)基可被濃縮以制備可施用的藥物級(jí)產(chǎn)品。例如，通過(guò)去除水分，例如蒸發(fā)、凍干等，可以濃縮條件培養(yǎng)基至約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更濃。在特定實(shí)施方案中，例如，來(lái)源于70， 000， 000個(gè)胎盤干細(xì)胞的200mL條件培養(yǎng)基可被濃縮至體積約180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL或更少。所述條件培養(yǎng)基還可以基本干燥為例如粉末。
5. 6. 1. 4包含胎盤干細(xì)胞的基質(zhì) 本發(fā)明還包括包含腫瘤細(xì)胞抑制性胎盤干細(xì)胞群，或腫瘤抑制性量的胎盤干細(xì)胞條件化培養(yǎng)基的基質(zhì)，例如水凝膠、支架等。 本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞可以接種在天然基質(zhì)上，例如胎盤生物材料，如羊膜材料。此類羊膜材料可以是例如直接從哺乳動(dòng)物胎盤切割的羊膜；固定的或熱處理的羊膜、基本干燥(即，< 20% H20)的羊膜、絨毛膜、基本干燥的絨毛膜、基本干燥的羊膜和絨毛膜等。優(yōu)選的可以接種胎盤干細(xì)胞的胎盤生物材料描述在Hariri的，美國(guó)申請(qǐng)
發(fā)明者卡斯帕爾·帕盧丹, 羅伯特·J·哈黎里, 羅斯安·默里, 萊赫爾·哈巴庫(kù)斯奇, 詹姆士·愛丁格 申請(qǐng)人:人類起源公司