專(zhuān)利名稱(chēng)：：核酸的多重分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及對(duì)樣品中的靶標(biāo)核酸的檢測(cè)、鑒定和定量的方法。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及使用多個(gè)等級(jí)寡核苷酸引物(hierarchicaloligonucleotideprimer)來(lái)檢測(cè)、鑒定和定量樣品如環(huán)境樣品或生物樣品中的靶標(biāo)核酸的方法。
背景技術(shù)：
：己開(kāi)發(fā)出多種分子方法來(lái)分析含有多個(gè)靶標(biāo)的樣品。這些方法在從微生物群落分析、微生物監(jiān)測(cè)和微生物鑒定到基于疾病相關(guān)生物標(biāo)志的患者疾病鑒定的應(yīng)用中得到了使用。但是，這些方法在檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)閾、定量能力、易使用性和費(fèi)用方面各有不同。例如，雖然基于16SrRNA基因的克隆文庫(kù)方法能夠鑒定給定生態(tài)系統(tǒng)中的數(shù)量上優(yōu)勢(shì)微生物群體至種或菌株的水平，但它是費(fèi)時(shí)和費(fèi)用大的方法。類(lèi)似地，雖然群落指紋技術(shù)如變性梯度凝膠電泳(DGGE)和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)能夠快速剖析優(yōu)勢(shì)微生物群體至微生物群落結(jié)構(gòu)的總PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大約0.1%,使得可以對(duì)從不同環(huán)境獲得或者在同一環(huán)境的不同時(shí)間和地點(diǎn)獲得的不同微生物群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，但若對(duì)所存在的微牛物種沒(méi)有事先的了解，則這種指紋方法不能夠鑒定出給定微生物群落中的各個(gè)種，且結(jié)果往往受到DNA提取和PCR擴(kuò)增所伴隨出現(xiàn)的不一致性的影響。還開(kāi)發(fā)出其他的方法來(lái)鑒定微生物群落屮特定類(lèi)型的微生物群體，例如全細(xì)胞熒光原位雜交(FISH)、膜雜交和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)及序列特異性酶切方法。但是，F(xiàn)ISH需要冗長(zhǎng)的固定和雜交程序，且會(huì)受到以下因素的影響探針對(duì)細(xì)胞膜的穿透性差、非活性細(xì)胞內(nèi)的rRNA拷貝數(shù)低和生態(tài)系統(tǒng)種存在著非均一的非生物材料(heterogeneousabioticmaterials)。對(duì)于膜雜交和qPCR，首先必須用參照菌株建立和優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此它們不僅費(fèi)力費(fèi)時(shí)，而且不能夠進(jìn)行高通量應(yīng)用。對(duì)于高通量應(yīng)用，例如在微生物的檢測(cè)和微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)中，冃前有微陣列技術(shù)能提供最準(zhǔn)確的測(cè)量。但是，它目前難以在微陣列上進(jìn)行多重分析以大規(guī)模分析微生物豐度。另一種最近開(kāi)發(fā)的方法利用序列特異性酶切來(lái)定量目的16SrRNA靶標(biāo)。16SrRNA耙標(biāo)的豐度是通過(guò)比較電泳圖中被切割16SrRNA的峰面積(強(qiáng)度)與總16SrRNA的峰面積(強(qiáng)度)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。雖然這個(gè)技術(shù)不需要先制作外標(biāo)曲線(xiàn)或不需要使用內(nèi)標(biāo)，但它在每次實(shí)驗(yàn)只能分析一個(gè)16SrRNA靶標(biāo)。有需要提供快速、高通量、靈敏且準(zhǔn)確的高再現(xiàn)性方法，來(lái)測(cè)定樣品中的靶標(biāo)核酸的存在、身份(identity)和/或數(shù)量，且這種方法能克服或者至少改進(jìn)上述的一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)方面提供鑒定靶標(biāo)核酸的方法，所述方法包括以下歩驟(a)使含有多個(gè)靶標(biāo)核酸的樣品與至少一個(gè)系列的核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物可以與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(b)測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的所述可檢測(cè)信號(hào)，以確定所述靶標(biāo)核酸的身份。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包含經(jīng)擴(kuò)增的靶標(biāo)核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)核酸包含16S核糖體RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)方面的方法還包括在步驟(b)之前對(duì)標(biāo)記引物進(jìn)行純化的步驟。純化步驟可包括色譜分離、基于酶的消化、離心純化管柱純化(spincolumnpurification)、化學(xué)沉淀或電泳分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)系列包含3-20個(gè)核苷酸引物。一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)核苷酸引物其K度可與該系列的其他成員不同。或者，一個(gè)系列當(dāng)中的每一個(gè)核苷酸引物其長(zhǎng)度可與該系列的其他引物不同。不同的長(zhǎng)度可包括約2至約70個(gè)核苷酸的差異，可用不同長(zhǎng)度的核酸尾(nucleicacidtail)來(lái)獲得。示例性的核酸尾包括polydA尾和poiydT尾。一個(gè)系列的各個(gè)成員的核酸尾可在約2至約50個(gè)核苷酸之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在核苷酸引物與靶標(biāo)核酸結(jié)合后，所述方法包括用標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸延伸該引物的步驟。示例性的單核苷酸包括雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP禾nddGTP?？蓹z測(cè)信號(hào)可以是熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)、放射性信號(hào)或生物素?；盘?hào)。示例性的熒光信號(hào)包括熒光素、羅丹明、香豆素、花青、熒光納米顆粒和熒光量子染料。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記引物的可檢測(cè)信號(hào)是通過(guò)應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)核酸的校準(zhǔn)系數(shù)(calibrationfactor)來(lái)定量。校準(zhǔn)系數(shù)可通過(guò)確定特異性水平較高的結(jié)合引物的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與特異性水平較低的結(jié)合引物的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度之比來(lái)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)方面的方法包括在歩驟(b)之前對(duì)標(biāo)記引物進(jìn)行分離以使得能夠確定靶標(biāo)核酸的身份的步驟。分離可用電泳、色譜或質(zhì)譜來(lái)進(jìn)fi""。在一個(gè)實(shí)施方案中，能使得引物可以與至少一個(gè)靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合并使得結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記的條件，包括使引物與靶標(biāo)核酸發(fā)生退火和使引物用至少一個(gè)標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸進(jìn)行延伸的條件，及這種條件的多個(gè)循環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)方面的方法的步驟(a)包括使樣品的第一等分試樣與第一系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸和另外地使該樣品的第二等分試樣與第二系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸，其中第v系列和第二系列包括至少一個(gè)共同的核苷酸引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法是測(cè)定異質(zhì)樣品(heterogenoussample)中的組成生物(constituentorganism)的方法。組成生物可以是原核生物如細(xì)菌和古細(xì)臠或者真核生物如真菌和酵母。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸引物的系列包括多個(gè)特異性水平等級(jí)的核苷酸引物。該系列可包括一個(gè)等級(jí)水平較高的引物和多個(gè)等級(jí)水平較低的引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸引物的系列包括多個(gè)種特異性引物和一個(gè)非種特異性引物。該系列可包括某個(gè)域特異性引物(domain-specificprimer)和選自門(mén)特異性引物(phylum-specificprimer)、綱特異性引物(class-specificprimer)、目特異性弓I物(order-specificprimer)、科特異性弓I物(family-spedficprimer)、屬特異性引物(genus-specificpnmer)和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包含一個(gè)門(mén)特異性引物和選自綱特異性引物、目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者BJ包括一個(gè)綱特異性引物和選自目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)目特異性引物和選自科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)科特異性引物和選自屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)屬特異性引物和多個(gè)種特異性引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列除了特異性水T較低的那一個(gè)成員外每個(gè)成員都對(duì)一個(gè)靶標(biāo)核酸有特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)核苷酸引物能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供在鑒定靶標(biāo)核酸的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含(i)至少一個(gè)系列的能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸的核苷酸引物，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(ii)說(shuō)明書(shū)，說(shuō)明使含有多個(gè)核酸的樣品與核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得引物可以與至少一個(gè)靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，和使得結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，以使得可以測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的可檢測(cè)信號(hào)，從而確定出靶標(biāo)核酸的身份。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含一套能夠結(jié)合核苷酸引物的具有可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記(label)。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)核苷酸引物其長(zhǎng)度可與該系列的其他成員不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列當(dāng)中的每一個(gè)核苷酸引物其長(zhǎng)度與該系列的其他成員不同。述疾病與腸道菌群的異常分布有關(guān)，所述方法包括鑒定來(lái)自該受治療者的樣品中的靶標(biāo)核酸，該鑒定包括以下步驟(a)使含有靶標(biāo)核酸的樣品與至少一個(gè)系列的核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物可以與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(b)測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的可檢測(cè)信號(hào)以鑒定耙標(biāo)核酸的身份，其中該鑒定能確定出腸道菌群分布。定義本文所用的以下詞語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有以下所示的含義術(shù)語(yǔ)"多重"指在單個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行的多個(gè)反應(yīng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"指至少兩個(gè)。術(shù)語(yǔ)"核酸"及同意義術(shù)語(yǔ)如"多核苷酸"指任何長(zhǎng)度的核苷酸多聚形式，如核糖核苷酸(RNA)、脫氧核糖核苷酸(DNA)或肽核酸(PNAs)，它們包含嘌呤堿基和嘧啶堿基，或者其他天然的、經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基。核酸可以是雙鏈的或單鏈的。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基團(tuán)，如在RNA或DNA中通常所見(jiàn)，或者包含經(jīng)修飾或取代的糖或磷酸基團(tuán)。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類(lèi)似物。核苷酸的序列可被非核苷酸成分所間斷。術(shù)語(yǔ)核苷、核苷酸、脫氧核苷和脫氧核苷酸通常包括核苷、核苷酸、脫氧核苷和脫氧核苷酸的互補(bǔ)物、片段和變體，或者它們的類(lèi)似物。多核苷酸包括通常包含2至約500個(gè)核苷酸的"寡核苷酸"。本文所用的術(shù)語(yǔ)"引物"指能夠與耙標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合的單鏈寡核苷酸。通常，結(jié)合是選擇性結(jié)合。引物的精確長(zhǎng)度會(huì)隨特定的應(yīng)用而異，但通常為約15至約120個(gè)核苷酸。引物不需要反映靶標(biāo)核酸模板的確切序列，但必須有足夠的互補(bǔ)性以與模板發(fā)生結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"核苷酸引物"包括"寡核苷酸引物"。術(shù)語(yǔ)"系列"指在多重反應(yīng)的中.一反應(yīng)容器中使用的一套核苷酸引物。在每一個(gè)系列當(dāng)中，各核苷酸引物其長(zhǎng)度可相同或不相同，可與發(fā)射相同或不同的可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記進(jìn)行偶聯(lián)，可具有不同的特異性水平，其中一些引物能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸，而一些引物則僅能夠結(jié)合一個(gè)特定的靶標(biāo)核酸。術(shù)語(yǔ)"種特異性核酸"指衍自生物的一個(gè)特定種的核酸。在一些實(shí)施方案中，衍自第一生物的種特異性核酸可存在于包含衍自第二生物的種特異性核酸的混合樣品中。術(shù)語(yǔ)"域特異性核酸"、"門(mén)特異性核酸"、"綱特異性核酸"、"目特異性核酸"、"科特異性核酸"和"屬特異性核酸"應(yīng)作相應(yīng)的解釋。術(shù)語(yǔ)"選擇性結(jié)合"指核苷酸引物優(yōu)先結(jié)合靶標(biāo)核酸的能力。在表示某核苷酸引物能"選擇性結(jié)合"這個(gè)意義上，該術(shù)語(yǔ)包括這樣一層意思，即該核苷酸引物在嚴(yán)格結(jié)合條件下與靶標(biāo)核酸的結(jié)合程度可檢測(cè)地大于其與非靶標(biāo)核酸的結(jié)合程度。術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)標(biāo)記"指能夠產(chǎn)生可檢測(cè)和可測(cè)量的信號(hào)，且可與核苷酸引物共價(jià)或非共價(jià)連接的報(bào)道分子或酶。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記(的)"當(dāng)與核苷酸引物一起使用時(shí)，意指涵蓋通過(guò)將可檢測(cè)物質(zhì)(例如熒光標(biāo)記)共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)(例如物理連接)到該引物來(lái)對(duì)該引物進(jìn)行的直接標(biāo)記，以及通過(guò)與被直接標(biāo)記的另一試劑的反應(yīng)性來(lái)對(duì)該引物進(jìn)行的間接標(biāo)記。直接標(biāo)記可用單核苷酸鏈延伸來(lái)實(shí)現(xiàn)，這包括用標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)如熒光標(biāo)記的單核苷酸對(duì)核苷酸引物進(jìn)行的延伸。間接標(biāo)記的實(shí)例包括用熒光標(biāo)記的第二抗體對(duì)第一抗體迸行的檢測(cè)，和為了使DNA引物能用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)而用生物素對(duì)DNA引物進(jìn)行的末端標(biāo)記。詞語(yǔ)"基本上"并不排除"完全"，例如"基木上不含"Y的組合物可完全不含Y。在必要的情況下，詞語(yǔ)"基本上"可從本發(fā)明的定義中略去。除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)"包含"及其語(yǔ)法變體意指代表"開(kāi)放的(open)"或"包括在內(nèi)的(inclusive)"語(yǔ)意，使得它們包括所述及的要素，但還允許包括另外的未述及的要素。本文所用的術(shù)語(yǔ)"約"在成分濃度的情形中，通常指所述值的+/-5%，更通常指所述值的+/-4%，更通常指所述值的+/-3%，更通常指所述值的+/-2%，還更通常指所述值的+/-1%，甚至更通常指所述值的+/-0.5%。在本公開(kāi)說(shuō)明書(shū)通篇中，某些實(shí)施方案會(huì)以范圍形式(rangeformat)進(jìn)行公開(kāi)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，以范圍形式(rangeformat)進(jìn)行的描述僅僅是出于方便和簡(jiǎn)明起見(jiàn)，不應(yīng)被解釋為對(duì)所公開(kāi)區(qū)間的范圍的硬性限制。因此，對(duì)某范圍的描述應(yīng)被認(rèn)為是具體公開(kāi)了所有可能的亞范圍(sub-range)以及該范圍當(dāng)中的各個(gè)數(shù)值。例如，對(duì)諸如1-6的范圍的描述應(yīng)被認(rèn)為是具體公開(kāi)了諸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的亞范圍，以及該范圍當(dāng)中的各個(gè)數(shù)值，例如l、2、3、4、5和6。這不管范圍的寬度有多大都是適用的。附圖旨在說(shuō)明所公開(kāi)的實(shí)施方案，幫助解釋所公開(kāi)的實(shí)施方案的原理。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，附圖僅出于說(shuō)明的目的來(lái)給出，并不代表對(duì)本發(fā)明的限制。圖1這個(gè)原理圖說(shuō)明進(jìn)行多重鑒定和定量分析的等級(jí)寡核苷酸引物延伸('HOPE)方法的基本原理。圖2顯示DNA測(cè)序儀進(jìn)行寡核苷酸分離和熒光測(cè)量的靈敏度。(a)在5'末端帶有Cy5修飾的合成寡核苷酸的序列。(b)毛細(xì)管電泳所分離的四個(gè)不同濃度的Cy5標(biāo)記寡核苷酸的基于大小的電泳圖。(c)Cy5標(biāo)記寡核苷酸的濃度(94-1857pM)與峰面積表示的熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系。(d)Cy5標(biāo)記寡核苷酸的濃度(2.4-46.4pM)與峰面積表示的熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系。圖3顯示polydA尾長(zhǎng)度對(duì)用染料終止物進(jìn)行的引物延伸的效率的影響。(a)大腸桿菌(五.co巧16SrRNA基因的選定區(qū)域的序列和用不同長(zhǎng)度的polydA尾修飾的寡核苷酸引物(EUB338)的序列。與不帶polydA尾的EUB338引物中存在的核苷酸相同的核苷酸以連字號(hào)表示。(b)受加到EUB338引物的5'末端的polydA尾的長(zhǎng)度影響造成的引物延伸效率的下降。以百分?jǐn)?shù)表示的延伸效率是基于ddCTP偶聯(lián)的每條引物的濃度與每條不帶polydA尾的ddCTP偶聯(lián)引物EUB338的濃度之比計(jì)算的。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表得自?xún)蓚€(gè)反應(yīng)和重復(fù)毛細(xì)管電泳分析的平均值。誤差條代表平均數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4是擬桿菌屬菌種(^^m^fevspp.)的系統(tǒng)樹(shù)和用于多重HOPE的引物的特異性。該系統(tǒng)樹(shù)圖是用ARB以鄰位相連法構(gòu)建，以大腸桿菌co")為根。線(xiàn)標(biāo)尺對(duì)應(yīng)于每100個(gè)核苷酸位置10個(gè)核苷酸置換。用于4重反應(yīng)(空心圓圈)、6重反應(yīng)(實(shí)心圓圈)和7重反應(yīng)(實(shí)心方框)的引物在樹(shù)圖的右邊顯示。引物特異性由引物的位置和括號(hào)表示。所延伸的核苷酸的類(lèi)型在引物名稱(chēng)后面的括號(hào)內(nèi)表示。擬桿菌屬菌種的末端限制性片段(tRF)長(zhǎng)度在種名后面的括號(hào)內(nèi)表示，這些長(zhǎng)度是用ARB中的tRF切割插入程序(tRFcutadd-inprogram)用引物Bac32F和Bac708R及限制性?xún)?nèi)切核酸酶進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析得到的。圖5顯示退火溫度對(duì)多重HOPE的效率的影響。各反應(yīng)是用多形擬桿菌(及Aeto/otowmcra")16SrRNA基因擴(kuò)增子和含有(a)EUB338Ia、(b)BAC303-5a、(c)BTH274-15a禾口(d)BTH584-16a的引物混合物進(jìn)行。應(yīng)用了25個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)(96。C變性10sec，高溫退火30sec，72°C延伸15sec)。對(duì)于每個(gè)高溫，相應(yīng)的效率以占該引物所遇到的最大值的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算。每個(gè)引物的解鏈溫度(Tm)不計(jì)dA按以下公式計(jì)算2(A+T)+4(G+C)。圖6顯示循環(huán)數(shù)對(duì)用染料終止物進(jìn)行的多重HOPE的影響。各反應(yīng)是用以下熱循環(huán)條件進(jìn)行96°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec。實(shí)驗(yàn)是用6.Aetowtoow/c7W216SrRNA基因擴(kuò)增子和含有EUB338Ia、BAC303-5a、BTH274-15a和BTH584-16a的引物混合物進(jìn)行。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表得自?xún)蓚€(gè)反應(yīng)和重復(fù)毛細(xì)管電泳分析的平均值。誤差條代表平均數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7顯示引物BAC303-5a()、BTH274-15a(o)和BTH584-16a(T)對(duì)通用引物EUB338Ia的換算系數(shù)的分布。引物-.粑標(biāo)比(以摩爾濃度計(jì))在250-16000之間。實(shí)驗(yàn)是用固定的引物濃度，通過(guò)改變靶標(biāo)濃度來(lái)進(jìn)行，如下文實(shí)施例l所示。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表得自三個(gè)反應(yīng)的平均值。誤差條代表平均數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖8顯示多重HOPE的特異性。擬桿菌屬菌種模板在4重HOPE反應(yīng)中使用，該反應(yīng)巾包括有引物EUB338、BAC303-5a、BTH274-15a和BTH584-16a。(a)引物的序列和選定的參照靶標(biāo)的結(jié)合區(qū)域的序列。對(duì)于每個(gè)引物，顯示了第一個(gè)細(xì)菌種的互補(bǔ)序列。在后隨的菌種中若遇到相同的序列組成，則用雙虛線(xiàn)表示。對(duì)于引物EUB338;下劃線(xiàn)的各核苷酸表示引物EUB338Ia的序列。(b)用染料終止物進(jìn)行的多重HOPE的特異性。擬桿菌屬菌種模板在每個(gè)基于大小的電泳圖的右上方表示。虛峰和實(shí)心峰分別代表D4-ddUTP偶聯(lián)引物和D2-ddCTP偶聯(lián)引物。圖9顯示用染料終止物進(jìn)行的HOPE的靈敏度。兩個(gè)引物(a)BTH274-15A禾口(b)BTH584-16A與1pg至5000pg的系列濃度的6.16SrRNA基因擴(kuò)增子一起使用。各反應(yīng)是用單獨(dú)6.Aeto/:otoo附/craw擴(kuò)增子在20(空心圓圈)，10pl(空心方框)和5^1(空心倒三角)的總體積中進(jìn)行。還進(jìn)行了及Aeto/otoo/mc/W7力卩100ng丄.acwfo;/n7w,s'擴(kuò)增子的5^0)反應(yīng)。應(yīng)用了40個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)條件(96°C變性10sec，60°C退火30sec，72°C延伸15sec)。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表得自重復(fù)毛細(xì)管電泳分析的一個(gè)反應(yīng)的平均值。誤差條代表平均數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10顯示各種形式的可用多重HOPE方法進(jìn)行分析的核酸，包括基因組DNA(a)和天然RNA(b)。圖11的電泳圖分別是從Sfifc&ra/t/e.v/ec/ZM'、8ofc/e廠(chǎng)o/c/w/rag,7/'s'禾口決eto'otoo附/cra"的混合16SrRNA基因擴(kuò)增子產(chǎn)生的6重反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖(a);從SaCeraWes、及/rag〃w、5fl"eraWesacz^y^c/e/M、^3cferaZ(ie'swm/f/7m、禾口/^rc&ra/(iex/;/ogewes的、混合16SrRNA基因擴(kuò)增子產(chǎn)生的7重反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖(b);和從廢水流入物的16SrRNA基因擴(kuò)增子產(chǎn)生的7重反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖(c)。虛線(xiàn)峰、實(shí)線(xiàn)峰和實(shí)心峰分別代表用D4-ddUTP、D3-ddGTP和D2-ddCTP延伸的引物。受檢的引物和內(nèi)標(biāo)(GT40-D4和GT46-D2)在(c)小圖中的對(duì)應(yīng)峰的旁邊標(biāo)出。圖12顯示HOPE反應(yīng)的另一個(gè)實(shí)施方案。將PCR擴(kuò)增子、熒光標(biāo)記ddNTPs、DNA聚合酶和各寡核苷酸引物混合在一起，形成多重HOPE反應(yīng)混合物。該混合物進(jìn)行20-25個(gè)循環(huán)的變性(96。C)、退火(60-640C)和單堿基延伸(72。C)。然后將適當(dāng)量的產(chǎn)物混合物與合成的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。圖13顯示擬桿菌屬的系統(tǒng)樹(shù)和用于多重HOPE的引物的特異性。多重HOPE反應(yīng)1-5含有種特異性引物和一個(gè)對(duì)及/rag,7w簇(cluster)特異的更高級(jí)別引物(Bfrg602J9dA或Bth274[T]—15dA)。多重HOPE反應(yīng)6含有以亞簇水平(Bth274—15dA)、簇水平(Bfrg602J9dA)、目水平(Bac303—5dA)和域水平(Ol390—17dA)進(jìn)行耙向的引物。圖14顯示多重HOPE反應(yīng)1-6的毛細(xì)管電泳圖。對(duì)于每個(gè)樣品，將30ngPCR擴(kuò)增子和2.5plSNP預(yù)混合物(premix)加到多重HOPE反應(yīng)1-6中。如毛細(xì)管電泳圖所示，人糞便H3在域水平、目水平和種水平上檢測(cè)到擬桿菌屬細(xì)菌。黑色峰、紅色峰和綠色峰分別代表用dTAMRA-ddCTP、dROX-ddTTP,dR6G-ddATP延伸的引物。內(nèi)標(biāo)在相應(yīng)的峰的旁邊標(biāo)示。圖15顯示以不同的循環(huán)數(shù)進(jìn)行的微牛物耙標(biāo)PCR擴(kuò)增，以確定最佳的循環(huán)數(shù)。具體實(shí)施方式現(xiàn)將公開(kāi)用以檢測(cè)、鑒定和/或定量多個(gè)耙標(biāo)核酸的新方法的示例性非限制性實(shí)施方案。本發(fā)明提供了多重方法即等級(jí)寡核苷酸引物延伸(hierarchicaloligonucleotideprimerextension,HOPE),用以快速檢測(cè)、鑒定和/或定量含有不同核酸的混合物的樣品中的多個(gè)不同耙標(biāo)核酸。多個(gè)在這個(gè)情形中指至少兩個(gè)。樣品可以是任何樣品，其至少有一些組分要進(jìn)行測(cè)定。例如，樣品可以是環(huán)境樣品、生物樣品或食品樣品。環(huán)境樣品包括但不限于獲自或衍自土壤、水、廢水、泥漿、植物提取物、木材、生物材料、海洋或河口沉積物、工業(yè)排放物、氣體、礦物提取物、砂子、自然排泄物、隕星等的樣品。該樣品可從不同的地區(qū)或條件收集，如熱帶地區(qū)、沙漠、火山地區(qū)、森林、農(nóng)場(chǎng)、工業(yè)區(qū)、家庭等。生物樣品指獲自生物或獲自生物的組成成分(如細(xì)胞)的樣品。該樣品可以屬任何生物組織或流體。通常，生物樣品是衍自患者的"臨床樣品"。這種樣品包括但不限于糞便(feces)、排泄物、大便(stool)、痰、腦脊髓液、血液、血液級(jí)份(例如血清、血漿)、血細(xì)胞(例如白細(xì)胞)、組織或細(xì)針穿刺活檢樣品、尿液、腹膜液和胸液或來(lái)自它們的細(xì)胞、以及組織切片如為組織學(xué)目的獲取的冷凍切片。食品樣品指可被動(dòng)物如人攝取的物質(zhì)，包括包裝食品制品、乳制品、動(dòng)物制品、植物制品、生食品材料、未經(jīng)巴氏殺菌或經(jīng)過(guò)巴氏殺菌的食品材料以及水。樣品可以是未經(jīng)處理的、經(jīng)處理的、經(jīng)稀釋的或經(jīng)濃縮的。樣品可直接進(jìn)行分析，或者可在用于本發(fā)明公開(kāi)的方法前先進(jìn)行一定的制備。這種制各包括但不限于將該樣品懸浮/稀釋于水或適當(dāng)緩沖液中，或者例如通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片或艽他不需要的成分，或者在分析前先選出該樣品的特定級(jí)份。靶標(biāo)核酸可以是任何要從含有核酸混合物的樣品中的其他核酸中挑出來(lái)的核酸。靶標(biāo)核酸可以是RNA、DNA、cDNA或PNA。靶標(biāo)核酸可以是同一核酸分子的不同區(qū)域。例如，靶標(biāo)核酸可包含f爭(zhēng)定的基因簇如16SrRNA或者其他功能基因。在需要的情況下，可用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將靶標(biāo)核酸從樣品中提取出來(lái)，所述技術(shù)例如超聲處理、去污劑處理、酶消化、鹽析、醇沉淀和苯酚-氯仿萃取。靶標(biāo)核酸例如基因組DNA和X然RNA可直接用于本發(fā)明公開(kāi)的方法中。在一些實(shí)施方案中，可將靶標(biāo)核酸進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生出額外拷貝的一些或所有靶標(biāo)核酸，再用于本發(fā)明公開(kāi)的方法中。例如，可用PCR技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor，NewYork,1989禾QAusubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc,andWiley誦Intersciehces,1992)，或者本領(lǐng)士或公知的其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見(jiàn)WuandWallace,Genomics4:560(1989)和Landegren等人，Science241:1077(1988))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見(jiàn)Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173(1989))、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(參見(jiàn)Guatelli等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:1874(1990))和基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)(J.Compton,Nucleic-AcidBasedSequenceAmplification,Nature350(6313):91,Mar.7,1991)，來(lái)擴(kuò)增耙標(biāo)核酸。在一些實(shí)施方案中，可將樣品中的大多數(shù)或所有的靶標(biāo)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案巾，可將所需的靶標(biāo)核酸亞群(subpopulation)進(jìn)行擴(kuò)增。例如，在懷疑或已知包含細(xì)菌、分枝桿菌和真菌的廢水樣品中，可能需要優(yōu)先地?cái)U(kuò)增細(xì)菌靶標(biāo)核酸后再用于本發(fā)明公開(kāi)的方法中。在一些實(shí)施方案中，可將靶標(biāo)核酸的選定區(qū)域例如rRNA(如16SrRNA)進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)不同的靶標(biāo)核酸可在一個(gè)樣品中得到檢測(cè)、鑒定和/或定量。本文所用的多個(gè)指至少兩個(gè)。在諸如土壤、水、廢水、泥槳、植物提取物、木材、生物材料、海洋或河口沉積物、工業(yè)排放物、氣體、礦物提取物、砂子、自然排泄物、隕星等的環(huán)境樣品的情形中，樣品口J能含有不同生物的混合物，可在該樣品中檢測(cè)、鑒定和/或定量出多個(gè)不同的靶標(biāo)核酸，例如可檢測(cè)、鑒定和/或定量出約2個(gè)、約3個(gè)、約4個(gè)、約5個(gè)、約10個(gè)、約15個(gè)或約20個(gè)靶標(biāo)核酸。靶標(biāo)核酸可用一個(gè)或多個(gè)系列的這種核苷酸引物中的多個(gè)核苷酸引物進(jìn)行檢測(cè)、鑒定和/或定量。用于本發(fā)明公開(kāi)的方法和試劑盒的引物通常是長(zhǎng)度一般為15-120個(gè)堿基的寡核苷酸。這種引物可通過(guò)任何合適的方法制備，包括例如直接化學(xué)合成或者適當(dāng)序列的克隆和限制酶切(restnction)。并不需要引物中的所有堿基都反映其將要結(jié)合的模板分子的序列；引物僅需要含有足以使它能夠結(jié)合靶標(biāo)核酸模板的足夠互補(bǔ)堿基。如本文所述，引物可在5'末端包括例如polydA或polydT尾形式的額外堿基，以改變一系列引物當(dāng)中的各引物的長(zhǎng)度。制備和使用引物的方法在例如以下文獻(xiàn)中有描述Sambrook,J.andD.W.Russell(2001;MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdea.,vol.1-3,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarborNY)，Ausubel,F.M.等人(1999;ShortProtocolsinMolecularBiology,4dea.,JohnWiley&Sons,NewYorkNY)和Innis,M.等人(1990;PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress,SanDiegoCA)。引物可從已知的序列衍生，例如通過(guò)使用預(yù)定用于這個(gè)用途的計(jì)算機(jī)程序如Primer(Version0.5,1991,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,CambridgeMA沐衍生。供用作引物的寡核苷酸可用木領(lǐng)域己知用于該用途的軟件來(lái)選擇。例如，OLIGO4.06引物分析軟件(可獲自NationalBiosciences,Plymouth,MN)可用于選擇各自最長(zhǎng)達(dá)30-100個(gè)核苷酸的引物，和用于從最長(zhǎng)達(dá)32千堿基的輸入多核苷酸序列中分析最長(zhǎng)達(dá)5,000個(gè)核苷酸的更大多核苷酸。類(lèi)似的引物選擇程序已并入了額外的特征以擴(kuò)展性能。例如，PmnOU引物選擇程序(公眾可從UniversityofTexasSouthWestMedicalCenter(位于DallasTX)的GenomeCenter獲得)能夠從兆堿基序列中選擇特異的引物，因此可用于在基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)引物。Primer3引物選擇程序(公眾可從WhiteheadInstitute/MITCenterforGenome5Research,CambridgeMA獲得)能讓使用者輸入"m邵nminglibrary"，其中要避免作為引物結(jié)合位點(diǎn)的序列是使用者指定的。Prmier3對(duì)于選擇微陣列用核苷酸特別有用。(后兩個(gè)引物選擇程序的源代碼也可從它們各自的來(lái)源獲得，并作修改以符合使用者的具體需要)。PrimeGen程序(公眾可從UKHumanGenomeMappingProjectResourceCentre,CambridgeUK獲得)基于多個(gè)序列比對(duì)來(lái)設(shè)計(jì)引物，從而使得可以選擇出能與所比對(duì)的核酸序列的最保守區(qū)域或最不保守區(qū)域結(jié)合或雜交的引物。因此，這個(gè)程序可用于鑒定獨(dú)特和保守核苷酸以及多核苷酸片段。多個(gè)引物可構(gòu)成一系列的引物。至少有一個(gè)系列的引物用于本發(fā)明公開(kāi)的方法中。每個(gè)系列的引物包含約3個(gè)至約20個(gè)引物。例如，一個(gè)系列可包含約3至約5個(gè)引物，約5至約10個(gè)引物，約8至約12個(gè)引物，約10至約15個(gè)引物，約13至約18個(gè)引物，或者約15至約20個(gè)引物。例如，一個(gè)系列可包含約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)引物。每個(gè)引物可在一個(gè)系列當(dāng)中以一個(gè)或多個(gè)拷貝數(shù)存在。某系列當(dāng)中的不同引物可在分析或測(cè)量過(guò)程中，通過(guò)不同的引物長(zhǎng)度或不同的標(biāo)記或這兩方面進(jìn)行區(qū)分。在一個(gè)系列當(dāng)中的各引物基于其長(zhǎng)度進(jìn)行區(qū)分的情況中，該系列當(dāng)中有至少一個(gè)引物其長(zhǎng)度與該系列的其他成員不同?；蛘?，一個(gè)系列當(dāng)中的每個(gè)引物其長(zhǎng)度可與該系列的每個(gè)其他成員不同。在一個(gè)系列中的各引物長(zhǎng)度的差異旨在用丁區(qū)分這些引物的情況中，所述差異必須足以使得能夠區(qū)分不同引物中的每一個(gè)。本發(fā)明技術(shù)人員(skilledaddressee)會(huì)認(rèn)識(shí)至ij，引物的分析方法會(huì)影響各引物之間所需的差異程度，其中一些分析方法能夠區(qū)分約1、2、3、4或5個(gè)堿基的差異(例如毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳)，而其他的分析方法能夠區(qū)分大于約5、6、7或8個(gè)堿基的差異(例如瓊脂糖凝膠電泳)。一般地，差異可在約2至約70個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。通常，差異可為約5至約10個(gè)核苷酸、約ll至約15個(gè)核苷酸、約16至約20個(gè)核苷酸、約21至約30個(gè)核苷酸、約31至約40個(gè)核苷酸、約41至約50個(gè)核苷酸、約51至約60個(gè)核苷酸或者約61至約70個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，不同的長(zhǎng)度可通過(guò)將不同長(zhǎng)度的核酸尾整合到一個(gè)系列當(dāng)中的各引物中的一個(gè)或多個(gè)或者每一個(gè)中來(lái)獲得。可使用的核酸尾的是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于polydA尾和polydT尾。用于一系列的引物中的各個(gè)成員的核酸尾的長(zhǎng)度可在約2至約50個(gè)核苷酸之間。通常，核酸尾的長(zhǎng)度可為約5至約10個(gè)核苷酸、約11至約15個(gè)核苷酸、約15至約20個(gè)核苷酸、約21至約25個(gè)核苷酸、約25至約30個(gè)核苷酸、約31至約35個(gè)核苷酸、約35至約40個(gè)核苷酸、約41至約45個(gè)核苷酸或者約45至約50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核酸尾的長(zhǎng)度為約4、約8、約12、約18、約24或約30個(gè)核苷酸。在一個(gè)系列當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)引物基于其不同標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分的情況中，該系列當(dāng)中有至少一個(gè)引物其標(biāo)記與該系列的其他成員不同?；蛘?，一個(gè)系列當(dāng)中的每個(gè)引物其標(biāo)記可與該系列的每個(gè)其他成員不同。每個(gè)標(biāo)記能夠發(fā)射出能區(qū)分該系列當(dāng)中的不同引物的可檢測(cè)信號(hào)?？捎糜诒景l(fā)明公開(kāi)的方法的標(biāo)記是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于發(fā)射熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)、放射性信號(hào)或生物素?；盘?hào)的標(biāo)記。發(fā)射熒光信號(hào)的標(biāo)記的實(shí)例包括熒光素、羅丹明、香豆素、花青、熒光納米顆粒和熒光量子染料。熒光染料的具體實(shí)例包括3-(s-羧基戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧雜羰花青(CYA)、6-羧基熒光素(FAM)、5和6-羧基羅丹明-110(R110)、6-羧基羅丹明-6g(r6g)、N',N',N',N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、2',4',5',7'-四氯-4-7-二氯熒光素(TET)和2',7'-二甲氧基-4',5',6羧基羅丹明(:JOE)。發(fā)射化學(xué)發(fā)光信號(hào)的標(biāo)記的實(shí)例包括1,2-二氧雜環(huán)丁烷、cyalume、草酰氯、四(二甲氨基)乙烯、連苯三酚、光澤精和魯米諾，而發(fā)射放射性信號(hào)的標(biāo)記的實(shí)例包括碘的y-放射性同位素。標(biāo)記可如上所述直接或間接地與引物偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在引物與其靶標(biāo)核酸結(jié)合后，通過(guò)單鏈引物延伸反應(yīng)將標(biāo)記與引物偶聯(lián)，該反應(yīng)包括用標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸對(duì)結(jié)合引物進(jìn)行延伸?？捎糜谶@個(gè)用途的單核苷酸是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)ddATP、ddTTP、ddCTP禾BddGTP。通常，引物成功地與耙標(biāo)核酸退火后，將熒光標(biāo)記的二脫氧核苷三磷酸(ddNTP)或染料終止物(dye-terminator)加到引物的3'末端。由于所加入的ddNTP上缺乏3'-OH基團(tuán)來(lái)形成磷酸—酯鍵，鏈延伸反應(yīng)被終止。ddNTP上的標(biāo)記因此與核苷酸引物偶聯(lián)。每個(gè)系列的核苷酸引物當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列除了特異性水平較低的那一個(gè)成員外每個(gè)成員都對(duì)某一不同的耙標(biāo)核酸有特異性。在其他實(shí)施方案中，一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)核苷酸引物能夠結(jié)合多個(gè)耙標(biāo)核酸。在其他實(shí)施方案中，一個(gè)系列的第一多個(gè)成員各自能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸，而該系列的第二多個(gè)成員各自對(duì)某一靶標(biāo)有特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列當(dāng)中的各核苷酸引物其特異性水平是分等級(jí)的。例如，一個(gè)系列可包括一個(gè)等級(jí)水平較高的引物和多個(gè)等級(jí)水平較低的引物。等級(jí)水平較高的引物其特異性水平較低，原因在于該引物能夠比等級(jí)水平較低、特異性水平較高的引物結(jié)合更多的靶標(biāo)核酸。一個(gè)系列當(dāng)中的等級(jí)水平為最高級(jí)別的引物可例如結(jié)合樣品中的所有靶標(biāo)核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)系列可包含多個(gè)種特異性引物和一個(gè)非種特異性引物。例如，一個(gè)系列可包含一個(gè)域特異性引物和選自門(mén)特異性引物、綱特異性引物、目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包含一個(gè)門(mén)特異性引物和選自綱特異性引物、目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)綱特異性引物和選自目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)目特異性引物和選自科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)科特異性引物和選自屬特異性引物和種特異性引物的多個(gè)引物，或者可包括一個(gè)屬特異性引物和多個(gè)種特異性引物。預(yù)期具有域水平特異性的引物能夠比具有較低等級(jí)特異性的引物結(jié)合更多的靶標(biāo)核酸。在這個(gè)情形中所用的域(domam)指生物在分類(lèi)學(xué)等級(jí)中的最高級(jí)別。通常，分類(lèi)學(xué)等級(jí)排序?yàn)橛?，接下?lái)為界(kingdom)、門(mén)(phylum)、纟岡(class)、冃(order)、科(family)、屬(genus)和種(species)。每個(gè)等級(jí)級(jí)別(hierarchicalrank)可進(jìn)一步包括前綴，例如前綴"亞"(sub-)表示較下的級(jí)別，前綴"超"(super-)表示較上的級(jí)別，前綴"次"(infra-)表示低于"亞"的級(jí)別。例如，超域的級(jí)別較高于域，域的級(jí)別較高于亞域，亞域的級(jí)別較高于次域。界、門(mén)、綱、目、科、屬和種的甜綴應(yīng)作相應(yīng)解釋。如上所述，可將多個(gè)系列的核苷酸引物用于本發(fā)明公開(kāi)的方法中。例如，可用兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)或十五個(gè)系列來(lái)分析樣品。在進(jìn)行超過(guò)一個(gè)多重反應(yīng)的情況中，可使用幾個(gè)系列的核苷酸引物。例如，系列'A'可用于4重反應(yīng)，系列'B'可用于6重反應(yīng)，系列'C'可用于7重反應(yīng)。各個(gè)多重反應(yīng)還可以以不同的排列(permutation)進(jìn)行組合，以進(jìn)一步增加多種反應(yīng)的重?cái)?shù)(multiplicity)。例如，6重反應(yīng)中的系列'B'可與7重反應(yīng)屮的系列進(jìn)行組合，以將重?cái)?shù)增加到IO重反應(yīng)。在使用兩個(gè)系列的情況中，將樣品的第一等分試樣與第一系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸和另外地使該樣品的第二等分試樣與第二系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸，其中第一系列和第二系列具有至少一個(gè)共同的核苷酸引物。類(lèi)似地，在使用三個(gè)系列的情況中，將樣品的第一等分試樣與第一系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸，另外地使該樣品的第二等分試樣與第二系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸，和另外地使該樣品的第三等分試樣與第三系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸。第一系列和第二系列可具有至少一個(gè)共同的核苷酸引物，第二系列和第三系列可具有至少一個(gè)共同的核苷酸引物，第一系列和第三系列可具有至少一個(gè)共同的核苷酸引物。為避免混淆，第一系列、第二系列和第三系列可都具有至少一個(gè)共同的核苷酸引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法是測(cè)定異質(zhì)樣品中的組成生物的方法。組成生物可以是原核生物如細(xì)菌(例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、綠色絲狀細(xì)菌(greenfilamentousbacteria)、螺旋菌、變形細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、浮游菌屬(planctomyces)、擬桿萌屬(bacteroides)、噬纖維菌屬(cyt叩haga)、熱袍臠屬(thermotoga)、產(chǎn)液菌屬(aquifex))和古細(xì)菌(例如嗜鹽菌(halophiles)、甲烷八疊球菌(methanosarcina)、甲'烷桿菌(methanobacterium)、甲'烷球菌(methanococcus)、熱變幵》菌屬(thermoproteus)、熱網(wǎng)菌屬(pyrodicticum)，或者真核生物如真菌(例如藻菌綱(phycomycetes)、子囊菌綱(ascomycetes)和擔(dān)子菌綱(bas油'omycetes))、酵母(例如酵母菌屬(saccharomyces)、克魯維酵母屬(kluyveromyces))和植物(例如藻類(lèi)、苔蘚等)。能使得引物可以結(jié)合靶標(biāo)核酸的條件是本領(lǐng)域公知的，或者可容易地用普通的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行確定。在每種情況中，合適的方案和試劑在很大程度上要取決于具體的境況(circumstance)。可從多個(gè)來(lái)源獲得指導(dǎo)，例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpring-Harbor,NewYork,1989禾卩Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc,andWiley陽(yáng)Intersciences,1992。本令頁(yè)域技術(shù)人員會(huì)容易認(rèn)識(shí)到，可在不造成不能夠?qū)崿F(xiàn)所需的結(jié)果的條件下，對(duì)這些程序的各個(gè)不同參數(shù)加以變動(dòng)。例如，所用的靶標(biāo)核酸的量，可根據(jù)可利用所得的材料或樣品(如RNA或DNA)的量或者為進(jìn)行有效結(jié)合所需的靶標(biāo)核酸的最佳量，來(lái)進(jìn)行變動(dòng)。通常，適合于引物與耙標(biāo)核酸的結(jié)合的條件包括低于約1M的鹽濃度，更通常低于約500mM和低于約200mM。合適的溫度可低至5°C，但通常高于22。C，更通常高亍約30。C，優(yōu)選超過(guò)約37。C。引物與靶標(biāo)核酸的結(jié)合優(yōu)選在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。嚴(yán)格條件是取決于序列而定的，在不同的境況下不同。較長(zhǎng)的引物可能要求較高的溫度來(lái)進(jìn)行特異性結(jié)合。由于其他因素會(huì)影響結(jié)合的嚴(yán)格性(stringency)，包括互補(bǔ)鏈的堿基組成和長(zhǎng)度、有機(jī)溶劑的存在和堿基錯(cuò)配的程度，參數(shù)的組合比任何單個(gè)參數(shù)的絕對(duì)度量(absolutemeasure)更為重要。一般地，將嚴(yán)格條件選擇為比具體序列在確定離子強(qiáng)度和pH下的熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。Tm是在平衡時(shí)與靶標(biāo)核酸互補(bǔ)的引物中有50%與靶標(biāo)核酸結(jié)合的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸組成下)。通常，嚴(yán)格條件包括在pH7.0-8.3和至少25。C溫度下鹽濃度為至少0.01M到不超過(guò)1MNa離子濃度(或者其他鹽)。雖然引物與核酸靶標(biāo)的結(jié)合優(yōu)選在如上所述的高嚴(yán)格性條件下進(jìn)行，但結(jié)合也可在中嚴(yán)格性和低嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。低嚴(yán)格性條件可對(duì)應(yīng)于在2xSSC中50°C下進(jìn)行的結(jié)合。有多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件和因素可用來(lái)改變這種結(jié)合的嚴(yán)格性。例如，要與靶標(biāo)核酸結(jié)合的引物的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)；鹽和其他成分的濃度，如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇；和改變結(jié)合和/或洗滌步驟的溫度。如本文所討論，已結(jié)合的引物可通過(guò)用經(jīng)標(biāo)記的單核苷酸對(duì)其進(jìn)行延伸來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。單核苷酸鏈延伸通常要求單鏈DNA模板(即靶標(biāo)核酸)、核苷酸引物、酶(即DNA聚合酶)、經(jīng)標(biāo)記的核苷酸和能終止DNA鏈延伸的經(jīng)修飾的核苷酸(例如雙脫氧核苷酸或ddNTPs)。這些雙脫氧核苷酸是鏈終止核苷酸，缺乏在DNA鏈延伸過(guò)程中兩個(gè)核苷酸之間為形成磷酸二酯鍵所需的3'-OH基團(tuán)。因此，將雙脫氧核苷酸摻入到新生的(延伸中的)DNA鏈中能終止DNA鏈延伸。經(jīng)標(biāo)記的引物可進(jìn)行熱變性，且可通過(guò)大小(分辨率達(dá)一個(gè)核苷酸)進(jìn)行分離，下文有討論。用經(jīng)標(biāo)記的單核苷酸來(lái)延伸引物的合適條件，與PCR的延伸/延長(zhǎng)歩驟屮所應(yīng)用的條件基本相同。DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)在通常取決于所用的DNA聚合酶的溫度下將ddNTP加到引物。在使用Taq聚合酶的情況中，例如可使用70-74°C的最佳溫度。通常使用約72°C的溫度。本發(fā)明技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可使用任何合適的延伸引物的酶，另外的實(shí)例包括DNA聚合酶I、DNA聚合酶n、DNA聚合酶III全酶、DNA聚合酶IV(DinB)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。用使引物與靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合并將該引物用至少一個(gè)標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸進(jìn)行延伸的條件，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)。例如，可進(jìn)行15-50個(gè)循環(huán)。通常，進(jìn)行約20、約25、約30或約35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物(即已延伸的標(biāo)記引物)可在分析前進(jìn)行純化，例如以除去剩余在反應(yīng)混合物中的未摻入的標(biāo)記單核苷酸。純化方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于各種形式的色譜分離(例如高效液相色譜)、基于酶的消化(例如使用堿性磷酸酶)、離心純化管柱純化或電泳分離。反應(yīng)產(chǎn)物可按照它們的不同大小和/或不同標(biāo)記，在對(duì)與引物偶聯(lián)的標(biāo)記所發(fā)射的可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量之前或同時(shí)進(jìn)行分離?？墒褂玫姆蛛x技術(shù)包括電泳(例如凝膠微通道(gelmicro-channel)電泳和毛細(xì)管電泳、色譜(例如高效液相色譜)和質(zhì)譜(例如MALDI-TOF)。反應(yīng)產(chǎn)物可用裝備有檢測(cè)器(如熒光檢測(cè)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、發(fā)光檢測(cè)器或放射性檢測(cè)器)的DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行分析。經(jīng)延伸的引物的長(zhǎng)度和濃度可根據(jù)內(nèi)標(biāo)來(lái)計(jì)算，例如由長(zhǎng)度在bp之間和濃度在100-1000pM之間的不同熒光標(biāo)記寡核苷酸組成的內(nèi)標(biāo)。知道了各個(gè)引物的延伸效率，就可以確定特異性較高的標(biāo)記引物相對(duì)于特異性較低的標(biāo)記引物的強(qiáng)度，且如果期望的話(huà)，可將該相對(duì)強(qiáng)度用來(lái)計(jì)算樣品中的不同靶標(biāo)核酸的相對(duì)數(shù)量。經(jīng)標(biāo)記的引物的nj檢測(cè)信號(hào)可應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)核酸的校準(zhǔn)系數(shù)來(lái)進(jìn)行定量。校準(zhǔn)系數(shù)可通過(guò)確定特異性水平較高的經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)延伸引物的可檢測(cè)信號(hào)相對(duì)于特異性水平較低的經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)延伸引物的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度之比獲得。以下各方程可用于確定靶標(biāo)核酸的相對(duì)豐度。某特定的經(jīng)延伸引物的濃度可用以下方程進(jìn)行定量經(jīng)延伸引物的峰面積=相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的峰面積(Cp)(注射樣品的體積)(Cstd)(標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的體積)其中Cp代表該樣品的HOPE反應(yīng)中所延伸的某特定引物的摩爾濃度；Cstd代表相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的摩爾濃度。每個(gè)引物的校準(zhǔn)系數(shù)可用相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸作為模板來(lái)獲得，用以下方程進(jìn)行確定CFA-B=經(jīng)延伸的引物A的濃度,Ca經(jīng)延伸的引物B的濃度，Cb其中引物B的特異性水平比引物A低。然后可如下計(jì)算出引物A所靶向的核酸相比丁引物B所靶向的核酸的相對(duì)豐度靶標(biāo)的相對(duì)豐度(％:)=Cax100%CbxCFA-B本文所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案如圖1所示。本發(fā)明公開(kāi)的方法的這個(gè)實(shí)施方案的初始步驟，涉及到引物一旦成功地與經(jīng)純化、經(jīng)PCR擴(kuò)增的rRNA基因的被靶向區(qū)域發(fā)生退火，就進(jìn)行用于"微測(cè)序(minisequencing)"的鏈延伸反應(yīng)，來(lái)在該引物的3'末端延伸經(jīng)熒光標(biāo)記的二脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP)或染料終止物。在這個(gè)步驟中，加入了多個(gè)寡核苷酸引物，這些引物被設(shè)計(jì)來(lái)以不同的特異性水平(即域、門(mén)、......、種)靶向序列，并在各自的5'末端用不同長(zhǎng)度的polydA進(jìn)行修飾。在單堿基延伸后，將HOPE產(chǎn)物進(jìn)行純化并用裝備冇四顏色檢測(cè)器的DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行分析。由于長(zhǎng)度和所加入的染料終止物類(lèi)型/顏色的差異，這些經(jīng)延伸的等級(jí)引物能得到分離和鑒定，它們的長(zhǎng)度和濃度按照由不同的熒光標(biāo)記寡核苷酸組成的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。由于具有域水平特異性的引物能比群特異性引物(group-specificprimer)在更多的DNA模板上弓I導(dǎo)延伸，知道了各個(gè)引物的延伸效率，就可以獲得某特異性的經(jīng)標(biāo)記引物與某寬特異性的引物的相對(duì)強(qiáng)度，這一比例將代表著PCR混合物中的被靶向rRNA片段的相對(duì)豐度。HOPE程序可在90分鐘內(nèi)完成，因此使得可以快速鑒定環(huán)境樣品中的多個(gè)微生物靶標(biāo)。還提供了用于本發(fā)明公開(kāi)的方法的試劑盒。試劑盒包含至少一個(gè)系列的能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸的核苷酸引物，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和依照本發(fā)明公開(kāi)的方法的使用說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包括多個(gè)系列的引物，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)或十五個(gè)系列。如本文所述，一系列的引物可包含約3至約20個(gè)核苷酸引物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可包含套能夠結(jié)合核苷酸引物的具有可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。如本文所述，示例性的標(biāo)記包括發(fā)射熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)、放射性信號(hào)或生物素?；盘?hào)的標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包括包含有約2至約70個(gè)核苷酸的核酸尾。如本文所述，示例性的可包括在試劑盒中的核酸尾是polydA尾和polydT尾。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包括額外的試劑，如用于樣品制備、樣品擴(kuò)增、引物的單核苷酸鏈延伸和反應(yīng)產(chǎn)物的純化的試劑。樣品制備用的試劑包括但不限于懸浮或稀釋樣品用的緩沖液，用于核酸提取的醇(如苯酚、氯仿、異丙醇和乙醇)和鹽溶液(如乙酸鈉或乙酸銨)。樣品擴(kuò)增用的試劑包括但不限于適合于延伸引物的酶(如Taq聚合酶或任何其他本文所述的酶)、脫氧核苷酸三磷酸(如dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、緩沖溶液(如氯化鉀和Tns-HCl)和二價(jià)陽(yáng)離子(如氯化鎂)。引物的單核苷酸鏈延伸用的試劑包括但不限于適合于延伸引物的酶(如Taq聚合酶或任何其他本文所述的酶)、雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)(如本文所述的ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP)、合適的緩沖溶液(如氯化鉀和Tris-HCl)和二價(jià)陽(yáng)離子(如氯化鎂)。如本文所述，ddNTPs可仟選與標(biāo)記進(jìn)行偶聯(lián)。反應(yīng)產(chǎn)物純化用的試劑包括但不限于色譜分離用試劑(如洗脫緩沖液如TE緩沖液和Tris-HCl緩沖液)、基于酶的消化用試劑(如堿性磷酸酶)、離心純化管柱純化用試劑(如洗脫劑咪唑、氯化銨、組氨酸等)、化學(xué)沉淀用試劑(如苯酚、異丙醇、乙酸鈉、Tris-EDTA等)和電泳分離用試劑(如瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、十二烷基磷酸鈉等)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包括內(nèi)標(biāo)如熒光標(biāo)記的寡核苷酸，以有助于靶標(biāo)核酸的定量。實(shí)施例現(xiàn)將通過(guò)以下具體的實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)一歩描述本發(fā)明的非限制性實(shí)例，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為以任何方式限制木發(fā)明的范圍。實(shí)施例l環(huán)境樣品中的微生物耙標(biāo)的分析(a)材料和方法收集了本地廢水處理系統(tǒng)的流入物樣品和流出物樣品，并離心濃縮得到包含微生物細(xì)胞的總懸浮固形物。提取了各個(gè)參照菌株和本地廢水處理工廠(chǎng)的各樣品的總DNA，用作16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增的DNA模板。PCR反應(yīng)(IOOml)含有IX緩沖溶液(Promega)、2.0mMMgCl2、各200nM的引物[lIF,GTTTGATCCTGGCTCAG和1492R,GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT]、各200mM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、0.5UTaqDNA聚合酶(Promega)和50-100ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增是用Bio-RadiCycler(Hercules,CA)按以下熱循環(huán)程序進(jìn)行初始變性(95。C,3mm);95°C(30s),55°C(30s)和72。C(30s)，30個(gè)循環(huán)；最終延伸(72°C,5min)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增后，用QIAqmckPCR純化試劑盒(Qiagen)按生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)純化PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物的濃度用DU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter,Fullerton,CA)通常紫外吸收測(cè)量進(jìn)行定量。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于HOPE反應(yīng)中。在5-20^的總體積中進(jìn)行的HOPE反應(yīng)，含有5-10皮摩爾(pmole)的各個(gè)寡核苷酸引物、10-20ng的純化模板和CEQtmSNP-PrimerExtensionKit(BeckmanCoulter,Fullerton,CA)的IX預(yù)混合溶液。含有試劑盒中所提供的DNA聚合酶(9%,v/v)、反應(yīng)緩沖液(18.2%，v/v)和熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸(ddUTP、ddGTP、ddATP和ddCTP，18.2。/。(v/v))的預(yù)混合等分試液(2X)，是按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行制備。ddNTPs或染料終止物標(biāo)記有四種不同的WellRed熒光染料(Dl、D2、D3和D4)(BeckmanCoulter)。所用的寡核苷酸引物是合成的，并用HPLC純化。引物延伸反應(yīng)是用Bio-RadiCycler按以下熱循環(huán)程序進(jìn)行96°C(10s),600C(30s)和72°C(15s)，20個(gè)循環(huán)。引物延伸反應(yīng)后，向反應(yīng)混合物加入1U的蝦堿性磷酸酶(RocheAppliedScience,Penzberg,德國(guó))，以水解未慘入的染料終止物的5'磷酸基團(tuán)。將混合物在37°C下溫育60min，通過(guò)在85°C下熱變性10min終止反應(yīng)?；蛘?，為縮短反應(yīng)時(shí)間，可用Microcon-YM3spincolumn(Millipore)純化HOPE反應(yīng)產(chǎn)物。表lb列出了所有用到的引物。HOPE反應(yīng)產(chǎn)物用具有四顏色檢測(cè)能力的CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)(BeckmanCoulter)進(jìn)行分析。在進(jìn)行毛細(xì)管電泳前，將1卩iL的經(jīng)稀釋HOPE反應(yīng)產(chǎn)物與1的濃度和大小內(nèi)標(biāo)(見(jiàn)下，500-1000pM)、0.2的GenomeLabTM(DNA大小標(biāo)準(zhǔn)80試劑盒)DNAsizestandard80kit(BeckmanCoulter)和39.8的樣品加樣緩沖液(BeckmanCoulter)迸行混合。將所得混合物轉(zhuǎn)移到96孔板中，覆蓋上一滴礦物汕。然后將該板連同充滿(mǎn)著分離緩沖液(BeckmanCoulter)的緩沖液板裝入CEQ8000系統(tǒng)中。電泳程序包括變性步驟(90。C,120s)、在2.1kV電壓下15s(或者6kV下5s)的注射歩驟和在6.0kV電壓下的分離步驟(58。C,16mm)。為了檢測(cè)出以低濃度存在的標(biāo)記寡核苷酸，將注射樣品體積和注射時(shí)間分別增加到2pL和40s。熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)被自動(dòng)收集，隨后通過(guò)提供給CEQtm8000系統(tǒng)的軟件進(jìn)行分析。各個(gè)寡核苷酸的電泳大小(electrophoreticsize)是用裝入該軟件中的默認(rèn)線(xiàn)性模型和染料校準(zhǔn)參數(shù)(SNPverl)進(jìn)行測(cè)定并用大小內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)。所用的濃度和大小內(nèi)標(biāo)含有四個(gè)不同長(zhǎng)度的四個(gè)不同Cy5標(biāo)記寡核苷酸(即50-Cy5-[GT]x-30，x=8、13、18和23)、一個(gè)D2標(biāo)記寡核苷酸(50-D2-[GT]23-30)和一個(gè)D4標(biāo)記寡核苷酸(即50-D4-[GT]20-30)的混合物(表lb)。它們是由OperonBiotechnologies(德國(guó)科隆)或Sigma-ProligoFranceSAS(法閨巴黎)合成和HPLC純化的。這些寡核苷酸的濃度和純度是按照各寡核苷酸和染料在最大吸光度下測(cè)得的光密度和染料的消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。GenomeLabDNA大小標(biāo)準(zhǔn)80試劑盒含有長(zhǎng)度13和88bp的WellRedDl標(biāo)記的片段。染料終止物標(biāo)記的寡核苷酸引物的濃度按以下方程(l)進(jìn)行定量Cp二G蟲(chóng)^A^L^j(1)Ad,xVp其中Cp表示某摻入了特定染料終止物的寡核苷酸引物的摩爾濃度；Qh表示與標(biāo)記的寡核苷酸引物相同的用染料標(biāo)記的寡核苷酸內(nèi)標(biāo)的摩爾濃度；Ap表示該寡核苷酸引物的峰面積；A^表示寡核苷酸內(nèi)標(biāo)的峰面積；Vp表示裝載到樣品裝載溶液的HOPE反應(yīng)產(chǎn)物的體積；Vd,表示裝載到樣品裝載溶液的內(nèi)標(biāo)的體積。某特定引物所定量的某特定靶標(biāo)核酸序列與通用引物所定量的總靶標(biāo)的相對(duì)數(shù)量，可按照以下方程(2)進(jìn)行計(jì)算靶標(biāo)的相對(duì)豐度(％)=Cdx100%(2)C338laXGFp—338ia其中Cp代表在HOPE反應(yīng)中延伸的某特定引物的摩爾濃度；(:33813代表在HOPE反應(yīng)中延伸的通用引物EUB338Ia的摩爾濃度；0。.33813是用參照菌株獲得的該特定引物相對(duì)于EUB338Ia的引物延伸效率校準(zhǔn)系數(shù)。(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2顯示DNA測(cè)序儀進(jìn)行寡核苷酸分離和熒光測(cè)量的靈敏度。評(píng)估了在2.4-46.4pM和94-1857pM這兩個(gè)不同最終濃度范圍的四個(gè)不同Cy5標(biāo)記合成寡核苷酸(即cy5-GT16、cy5-GT26、cy5-GT36和cy5-GT46)的混合物(圖2a)。在這四個(gè)Cy5標(biāo)記寡核苷酸當(dāng)中獲得了明顯和準(zhǔn)確的長(zhǎng)度分離(圖2b)。所觀(guān)測(cè)到的熒光強(qiáng)度或峰面積與這些Cy5標(biāo)記寡核苷酸的濃度高度相關(guān)(R2〉0.9998)(圖2c和2d)，動(dòng)態(tài)范圍至少3階。圖3顯示polydA長(zhǎng)度對(duì)單堿基引物延伸效率的影響。在引物延伸反應(yīng)中使用了七個(gè)用0-30核苷酸(nt)的不同長(zhǎng)度polydA尾修飾的EUB338引物(圖3a和表lb)。它們分別用D2標(biāo)記ddCTP進(jìn)行延伸。用DNA自動(dòng)測(cè)序儀分析后，以所觀(guān)測(cè)到的熒光強(qiáng)度用方程(l)定量各個(gè)被延伸引物的濃度。那些poly-dA連接的EUB引物的相對(duì)引物延伸效率，通過(guò)設(shè)定EUB338的延伸效率為100%來(lái)計(jì)算。圖3b顯示，單堿基引物延伸的效率隨polydA尾長(zhǎng)度的增加而線(xiàn)性下降(3.6G/。每dA)，直到該長(zhǎng)度達(dá)18nt(R2=0.982)。當(dāng)polydA尾的長(zhǎng)度超過(guò)18nt時(shí)，引物延伸效率在24-34%之間波動(dòng)。以后使用最多18nt的polydA尾長(zhǎng)度。最初，在HOPE反應(yīng)中使用四個(gè)不同的等級(jí)寡核苷酸引物。這四個(gè)引物即EUB338Ia、BAC303-5a、BTH274誦15a和BTH584-16a在5'末端分別用0、5、15和16個(gè)dA修飾。這些引物的特異性在表lb和圖4中顯示。這四個(gè)引物的預(yù)測(cè)的延伸核苷酸類(lèi)型，是用含有28,289個(gè)幾乎完全16SrRNA序列(41450nt)白勺ssu」an04.arb數(shù)據(jù)庫(kù)(www.arb-home.de)，通過(guò)ARB中提供的MatchProbes功能進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。所延伸的核苷酸的預(yù)測(cè)類(lèi)型，對(duì)于EUB338Ia來(lái)說(shuō)大部分是ddTTP(91.6%)，對(duì)于BAC303-5a和BTH584-16a來(lái)說(shuō)是ddCTP。對(duì)于BTH274-15a，所延伸的核苷酸類(lèi)型，對(duì)5a"ero/cfey^etoz》tocw/craw或5a"era/tifes./"rag7/z^16SrRNA基因分另U為ddTTP或ddCTP。其他HOPE引物的特異性及其延伸核苷酸類(lèi)型在圖4中顯示。圖5顯示退火溫度對(duì)引物延伸效率的影響。退火溫度在45-70°C之29間以5°C的增幅變化。鏈延伸反應(yīng)后，按方程(l)對(duì)這些標(biāo)記引物進(jìn)行定量。將各個(gè)相對(duì)引物延伸效率對(duì)各個(gè)引物所觀(guān)測(cè)到的最高濃度進(jìn)行歸一化。BAC303-5A、BTH274-15A禾QBTH584-16A的最高延伸效率出現(xiàn)在45°C的退火溫度，而EUB338Ia出現(xiàn)在60。C。在45-60°C之間，所有的引物顯示出80%-100%之間的延伸效率。在高于65°C的溫度下，EUB338Ia、BAC303-5A和BTH274-15A的引物延伸效率快速下降到12.2%以下。對(duì)于BTH584-16A，當(dāng)退火溫度高于70°C時(shí)，引物延伸效率降低到8.2%。為達(dá)到引物延伸的嚴(yán)格條件，將60。C的退火溫度用于本研究的后續(xù)各實(shí)驗(yàn)。研究了變性所用的持續(xù)時(shí)間(10s、30s和60s)、退火所用的持續(xù)時(shí)間(5s、30s和60s)和延伸所用的持續(xù)時(shí)間(15s、30s和60s)對(duì)引物延伸效率的影響。所獲得的最佳持續(xù)時(shí)間為，96。C變性10s，60。C退火30s和72°C延伸15s。圖6顯示引物延伸的一致結(jié)果(consistentresult)。結(jié)果表明，被延伸引物的量隨循環(huán)數(shù)的增加而線(xiàn)性增加，直到循環(huán)數(shù)為25，在30個(gè)循環(huán)后逐漸達(dá)到穩(wěn)定。引物延伸的效率在循環(huán)數(shù)為25個(gè)循環(huán)以?xún)?nèi)保持恒定。達(dá)25個(gè)循環(huán)后，D2-ddCTP標(biāo)記的BTH584-16A和BAC303-5A的增加速率相似冃.高于D4-ddUTP標(biāo)記的BTH274隱15A和EUB338Ia。BTH584-16A、BAC303-5A、BTH274-15A和EUB338Ia的引物延伸的斜率經(jīng)計(jì)算分別為5.77、5.23、2.48和1.26飛摩爾(femto-mole)每循環(huán)(R2〉0.99)。換言之，已與模板退火且被成功延伸的BTH584-16A、BAC303-5A和BTH274-15A的量，比被延伸的EUB338Ia的量高4.19、4.15和1.92倍。圖7顯示引物-模板比的影響。對(duì)于這個(gè)研究，將各引物固定濃度，EUB338Ia為5pmol，BAC303-5A、BTH584-16A和BTH274-15A為10pmol。使用了在250-16000范圍的引物-模板比(基于EUB338Ia)，這個(gè)比例是通過(guò)將模板數(shù)量(即6.PCR擴(kuò)增子)在20fmol-0.3125fmol之間變動(dòng)得到的。設(shè)定被延伸的EUB338Ia的量為1，對(duì)以各個(gè)引物-模板比從這四個(gè)引物延伸得到的引物的量進(jìn)行歸一化。EUB338Ia和D2-ddCTP延伸引物(BAC303-5A禾BBTH584隱16A)之間的歸一化比普遍高于EUB338Ia和D4-ddUTP延伸引物(BTH274-15A)之間的歸一化比。在1000-16000范圍的引物-模板比，對(duì)于BTH274-15a和BAC303-5a來(lái)說(shuō)，歸一化比大體上分別保持在1.73和4.0的恒定數(shù)值。對(duì)于BTH584-16a，歸一化比從3.49稍降到2.69。基于這些觀(guān)測(cè)結(jié)果，當(dāng)寡核苷酸引物的初始濃度超過(guò)模板濃度時(shí)(>1000倍)，可用歸一化比來(lái)進(jìn)一步計(jì)算HOPE反應(yīng)內(nèi)的這些被延伸引物的濃度，以確保一致的引物延伸效率。圖8顯示HOPE方法的特異性。HOPE的特異性首先是在單一反應(yīng)中，用四個(gè)不同的擬桿菌屬菌種(即及//2eZaz》too/wtr朋、及/^g〃"'、B.vw/ga〖仏s'和及afctoww;s')和四種不同的引物EUB338、BAC303-5A、BTH584-16A和BTH274-15A進(jìn)行驗(yàn)證。圖8a表明，使用EUB338或BAC303-5A，所有四個(gè)擬桿菌屬菌種用D4-ddUTP或D2-ddCTP都分別被正確地延伸。使用BTH274-15A，S.,/zetowtoow/cra"和及/hg,7"'用D4-ddUTP和D2隱ddCTP分別被延伸。D4-ddUTP延伸引物和D2-ddCTP延伸引物雖然顯示類(lèi)似的電泳大小，但根據(jù)染料的顏色可容易地被DNA測(cè)序儀所區(qū)分。對(duì)引物BTH274-15A來(lái)說(shuō)，5.vWg"ft^和A.^fo似ww/5不產(chǎn)生熒光信號(hào)，因?yàn)樗鼈兎謩e在接近引物3'末端處含有一個(gè)錯(cuò)配核苷酸"T"和兩個(gè)錯(cuò)配核苷酸"AG"。用BTH584-16A只有RZ/j"a/o/ao/mcro〃得到D2-ddCTP的成功延伸。其他三個(gè)擬桿菌屬菌種沒(méi)有觀(guān)測(cè)到信號(hào)，因?yàn)樗鼈儗?duì)于BTH584-16A的序列含有至少兩個(gè)核苷酸錯(cuò)配。這些觀(guān)測(cè)結(jié)果與圖8b所示的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)相匹配。結(jié)果總體上提示，HOPE技術(shù)對(duì)錯(cuò)配靶標(biāo)有較高的區(qū)分能力。用16個(gè)其他的常見(jiàn)于糞便樣品的參照菌種，進(jìn)一歩確證4重HOPE的特異性(表la)。該HOPE反應(yīng)顯示在從這些參照菌株延伸正確類(lèi)型的核苷酸方面準(zhǔn)確率達(dá)100%，結(jié)果與計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)相匹配。圖9顯示HOPE方法的靈敏度。HOPE反應(yīng)是用不同數(shù)量(l-5ng)的DNA模板(即&Aeto/otoo/wcra"16SrRNA基因)在三個(gè)不同反應(yīng)體積(即5pL、10禾卩20pL)下進(jìn)行。使用了兩個(gè)特異性引物BTH274-15A和BTH584-16A。圖9(a)表明D4-ddUTP延伸的BTH274-15A的量隨著模板濃度的下降而線(xiàn)性下降。使用20pL、10^L和5的反應(yīng)體積，發(fā)現(xiàn)模板的最低可檢測(cè)量分別為250pg、31.3pg和7.8pg(R2分別等于0.999、0.993和0.988)。這些可檢測(cè)量分別對(duì)應(yīng)于227amol、28.4amol和7.1amol。引物BTH584-16a獲得了類(lèi)似的結(jié)果(圖9b)。對(duì)于20pL、10pL和5的反應(yīng)體積，所檢測(cè)到的最低模板量也分別為250pg、31.3pg和7.8pg(W分31別等于0.999、0.99]和0.994)。顯然，5pL的小反應(yīng)體積會(huì)提高檢測(cè)靈敏度和減少試劑用量。通過(guò)將耙標(biāo)模板(即S.齡towto/mcra")與以高濃度存在的其他靶標(biāo)進(jìn)行混合，對(duì)HOPE的檢測(cè)靈敏度作進(jìn)一步的研究。在5pL反應(yīng)體積中，將100ng的丄.ac,卻她s16SrRNA基因擴(kuò)增子與不同數(shù)量(l-250pg)的"Ae/"/》/flow/craw16SrRNA基因進(jìn)行混合。最低檢到量對(duì)于BTH274-15a為]5.6pg，對(duì)于BTH584-16a為31.3pg(圖9)，這與前面的DNA模板中不存在L.acWop///z擴(kuò)增子情況下獲得的數(shù)據(jù)相當(dāng)。最小可檢測(cè)靶標(biāo)DNA占100ng數(shù)量的總DNA模板的人約0.016-0.031%。如表2所示，分別制備了五個(gè)不同的模型群落力:通過(guò)HOPE反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。它們包含不同數(shù)量的從三個(gè)不同擬桿菌屬菌種、L."a^^/7,/w、,/^c,MW、尸./ra^crtw、co/,禾卩A^/wrybn擴(kuò)增得到的16SrRNA基因。A.//^tootoo/wzcra"在HOPE反應(yīng)中可同時(shí)被所有四個(gè)引物(BTH274-15A、BTH584-16A、BAC303-5A和EUB338Ia)檢測(cè)至lJ。及和及vw/ga&s'僅可被BAC303-5a和EUB338Ia檢測(cè)到。其余四個(gè)細(xì)菌種可被EUB338Ia檢測(cè)到，A/.力"/bw不被任何引物檢測(cè)到。某特定靶標(biāo)的豐度按方程(2)進(jìn)行計(jì)算。在MC1、MC2和MC3中，由BAC303-5A觀(guān)測(cè)到的擬桿菌屬比例分別為占總擴(kuò)增DNA的77.0±3.9%、49.2±3.6%和14.8±1.0%(以摩爾濃度計(jì))，分別與制備的比例72.7%、46.2%和21.5%非常接近(表2)。由BTH274-15A和BTH584-16A檢測(cè)到的8.Aeto,otoowzcraw的比例，在MC1和MC2中分別為17.6-18.5%，這也與制備的比例(21.5-22.1%)接近。但是，在MC3中觀(guān)測(cè)到較低的比例(14.4-14.9%)。在MC4中，觀(guān)測(cè)到擬桿菌屬菌種的豐度為占總細(xì)菌16SrRNA基因的9.7%,這也與11.1%的理論值非常接近。引物BTH2840-15A和BTH584-16A所檢測(cè)到的5.Aeto,》towmcrow的豐度為占總細(xì)菌16SrRNA基因的2.8-3.4%，接近理論比例。在MC5中，用M16SrRNA基因替代E16SrRNA基岡，所有擬桿菌屬菌種的觀(guān)測(cè)比例從占總細(xì)菌16SrRNA基因的9.7。/。增加到53.1。/。。因此，S.^eto,otoom/craw的豐度也從占總細(xì)菌16SrRNA基因的2.8-3.4%增加到15.3-17.4%。這些結(jié)果顯示，HOPE反應(yīng)能夠準(zhǔn)確地和可再現(xiàn)性地剖析混合的16SrRNA基因樣品中的選定革E標(biāo)的相對(duì)豐度。在圖10中顯示了可在HOPE反應(yīng)中分析的靶標(biāo)核酸的類(lèi)型。除了經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物外，基因組DNA和天然RNA也可用于分析。對(duì)用基因組DNA作為靶標(biāo)，使用較長(zhǎng)的引物(例如2550nt)來(lái)提高引物延伸效率，如圖10a所示。對(duì)于天然RNA耙標(biāo)，使用了RNA依賴(lài)性DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶，如圖10b所示。證實(shí)使用HOPE反應(yīng)來(lái)分析RNA靶標(biāo)能夠直接定量出樣品中的耙標(biāo)的絕對(duì)拷貝數(shù)。為實(shí)現(xiàn)多重能力大于4重，設(shè)計(jì)并試驗(yàn)了6重反應(yīng)和7重反應(yīng)。圖4顯示含有一個(gè)域細(xì)菌特異性引物和四個(gè)群特異性引物(BTT1250、BAC303-5a、BTH274-15a、EUB338Ia-23a和BFRG602-19a)的6重HOPE反應(yīng)中的引物組合。取決于靶標(biāo)而定，BTH274-15a可用ddCTP或ddTTP延伸。7重反應(yīng)包括兩個(gè)群特異性引物(BFRG602-19a和BTH274-15a)和四個(gè)種特異性引物(BUFM1018-18a、BADF1037-9a、BFG1024和BITTi41)。圖lla和11b分別顯示用不同參照菌株進(jìn)行的6重反應(yīng)和7重反應(yīng)的電泳圖。各個(gè)引物基于長(zhǎng)度和所延伸的染料終止物類(lèi)型得到明顯的分離和鑒定。給定引物和參照引物之間獲得的校準(zhǔn)系數(shù)與從圖6和7獲得的相當(dāng)。還將6重和7重HOPE反應(yīng)一起使用(總共10重)，以同時(shí)測(cè)定生活廢水處理廠(chǎng)的流入物和流出物中的擬桿菌屬不同種的相對(duì)豐度，在該流入物和流出物中經(jīng)T-RFLP測(cè)定觀(guān)測(cè)到超過(guò)25-34個(gè)可檢測(cè)細(xì)菌群(數(shù)據(jù)未顯示)。圖11c圖解了用7重HOPE反應(yīng)獲得的流入物樣品的電泳圖。那些明顯的可檢測(cè)峰正確地對(duì)應(yīng)于群特異性引物(BFRG602—19a和BTH274-15a)、兩個(gè)種特異性引物(BUFM1018-18a和BFG1024)及兩個(gè)大小和濃度標(biāo)準(zhǔn)品。表3表明，擬桿菌群和BFRG602相關(guān)群的相對(duì)豐度分別占流入物樣品中的經(jīng)擴(kuò)增16SrRNA基因的10-11.1%和3.6-4.5%。在流出物樣品中這些百分?jǐn)?shù)降低到1.1-1.6%和50.1%,即相對(duì)豐度卜降7-45倍。BTH274相關(guān)群占流入物樣品中的總擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的大約0.3-1.1%，在流出物中沒(méi)有檢測(cè)到。在BTH274相關(guān)群當(dāng)中，萬(wàn)./rag/fo和6"rfera,fifey朋z/o潔w分別占BFRG602相關(guān)群的4.9-5.1%和19.7-21.6%，或者分別占EUB338Ia檢測(cè)的細(xì)菌的0.2%和0.8-0.9%，這提示流入物中存在著其他不被所用的種特異性引物靶向的擬桿菌屬菌種。實(shí)施例2用等級(jí)寡核苷酸引物延伸(HOPE)反應(yīng)定量分析糞便和廢水中的人特有擬桿菌屬菌種本實(shí)施例證明HOPE作為執(zhí)行對(duì)糞便和廢水中存在的17個(gè)不同的人特有擬桿菌屬菌種的定量分析的新方法的用途。通過(guò)將23個(gè)不同長(zhǎng)度和/或用不同ddNTPs延伸的引物安排到七個(gè)HOPE反應(yīng)管中，在90分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高通量和快速分析。(a)材料和方法細(xì)菌菌株和環(huán)境樣品使用了從"日本微生物保藏中心"(JapanCollectionofMicroorganisms)(日本和光)或"生物資源保存及研究中心"(BioresourcesCollectionandResearchCentre)(臺(tái)灣新竹)獲得的19個(gè)參照細(xì)菌菌株。它們包括^fo'tow""'(JCM5825)、及w"《/br附^(JCM5828)、/7少0w"e,s'(JCM6294)、S./^/c.o取脫,v(JCM6297)、及Wero;n;v(JCM9496)、5.(JCM9497)、5.c"ccae(JCM9498)、及^c^y(JCM10003)、S.ac/^/ac/em'(JCM10556)、S./rag,7w(BCRC10619)、及Aeto/(tocw,craw(BCRC10624)、5.w/ga/w(BCRC12903)、6.co/raco/a(JCM12979)、Awtw,"fe朋".(JCM12892)、8.eg取rt/〃:(JCM12986)、及woni〃(JCM12987)、j5.'s'a/yeraae(JCM12988)、及(JCM13266)和及go/Afe/w(JCM13446)。糞便樣品收集自(i)三個(gè)年齡26-32歲的健康供體，(i)三頭健康豬和(iii)三頭健康牛。環(huán)境樣品收集自位于新加坡的城市處理廠(chǎng)和位于臺(tái)灣臺(tái)南的豬廢水處理廠(chǎng)的流入物。樣品收集保藏于-20°C以備進(jìn)行DNA提取。DNA提取純培養(yǎng)物和流入物樣品的總DNA按之前描述的方案稍作改動(dòng)來(lái)進(jìn)行提取(Schmidt,T.M.,E.F.DeLong,andN.R.Pace.1991.Analysisofamarinepicoplanktoncommunityby16SrRNAgenecloningandsequencing(通過(guò)16SrRNA基因克隆和測(cè)序分析海洋超微型浮游生物群落).JBacterid173:4371-8)。糞便樣品的總DNA用QIAampDNAstoolminikit(Qiagen)來(lái)提取，因?yàn)檫@個(gè)市售試劑盒據(jù)報(bào)道最適合于糞便樣品的DNA提取。16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增每個(gè)PCR反應(yīng)含有50-100ng的基因組DNA(于IXTakaraEx-Taq緩沖液中)、200nM的正向引物[11F,5'-GTTTGATCCTGGCTCAG-3']和反向引物[1492R,GGYTACCTTGTTACGACTT-3']、200mM的dNTP和0.5U的Ex-TaqDNA聚合酶(Takara)。為獲得成比例擴(kuò)增微生物群落所需的最佳熱循環(huán)數(shù)，通過(guò)將熱程序(變性，95。C30s;退火，55°C45s;延伸，72°C60s)以5個(gè)循環(huán)的增幅從10個(gè)循環(huán)變動(dòng)到35個(gè)循環(huán)來(lái)進(jìn)行研究確定。每個(gè)循環(huán)獲得的擴(kuò)增子用QIAquickPCR純化試劑盒(Qmgen)進(jìn)行濃縮純化，濃度用DU730分光光度計(jì)(BeckmanCoulterO通過(guò)紫外吸收測(cè)量進(jìn)行定量?？寺『蜏y(cè)序?yàn)楸ＷC培養(yǎng)物純度，用TA克隆試劑盒(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)將那些參照菌株的16SrRNA基因單獨(dú)地克隆到pCRII載體中。對(duì)于每個(gè)克隆文庫(kù)，選出20個(gè)克隆，用M13R引物和M13F引物進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增，來(lái)確證DNA插入物的存在。然后用ABIPRISM3.130遺傳分析儀(AppliedBiosystems)禾口Bigdye測(cè)序試齊J盒(AppliedBiosystems)對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。用BLAST軟件將這些序列與16SrRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。種特異性引物設(shè)計(jì)用ARB軟件的探針設(shè)計(jì)功能，共設(shè)計(jì)了17個(gè)特異性靶向不同的人特有擬桿菌屬菌種的引物。將最新版的ssujati04.arb數(shù)據(jù)庫(kù)(www.arb-home.de，含有28,289個(gè)幾乎完全的16SrRNA序列(長(zhǎng)度>1450nt))與培養(yǎng)的擬桿菌屬菌種的189個(gè)比對(duì)序列(獲自RibosomalDatabaseProjectII(RDP))和19個(gè)參照細(xì)菌菌株的幾乎完全16SrRNA序列一起使用。為提高HOPE引物的特異性，每個(gè)引物設(shè)計(jì)成非靶標(biāo)的錯(cuò)配位置位于3'末端。首先將所設(shè)計(jì)的引物的特異性對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)驗(yàn)證，隨后在HOPE反應(yīng)中驗(yàn)證，以確保當(dāng)非靶標(biāo)細(xì)菌菌株用作DNA模板時(shí)引物不會(huì)發(fā)生延伸。內(nèi)標(biāo)寡核苷酸混合物混合物含有四種不同K度的寡核苷酸[5'-(GT)x-3';其中x-18、20、22禾n24]，它們是合成的，并用四種不同的熒光團(tuán)(即dR110、dR6G、dTAMRA和dROX)(AppliedBiosystems)在5'末端進(jìn)行末端標(biāo)記。在260nm處測(cè)量各個(gè)寡核苷酸的濃度，隨后進(jìn)行稀釋?zhuān)?'-dR110-(GT)20-3'稀釋至3nM，5'-dTAMRA-(GT)22-3'稀釋至15nM，5'畫(huà)dROX-(GT)24-3'稀釋至18nM，5'-dR6G-(GT)18-3'稀釋至3nM。HOPE反應(yīng)除非另有規(guī)定，否則每個(gè)HOPE反應(yīng)(共5nl)含有2.5的SnaPshot預(yù)混合物、5-30fmol的DNA模板、10pmole的寡核苷酸引物(新加坡Sigma-Proligo和臺(tái)灣MissionBiotech)和不同數(shù)量的去離子水。SnaPshot預(yù)混合物由DNA聚合酶、離子緩沖液和熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(dROXTM-ddTTP、dTAMRATM-ddCTP、dR110-ddGTP和dRpG-ddATP)組成。HOPE熱程序由20個(gè)循環(huán)的變性(96。C,10s)、退火(64。C,30s)和延伸(72。C,15s)所組成。引物延伸反應(yīng)后，加入1U的蝦堿性磷酸酶(RocheAppliedScience,Penzberg,德國(guó))以除去未摻入的染料終止物，在37°C下溫育60min。然后在75°C下將酶滅活10min。毛細(xì)管電泳將0.5-1pl的HOPE產(chǎn)物與0.125的GeneScanLiz120標(biāo)準(zhǔn)品(AppliedBiosystems)、0.25^的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸混合物和12pi的Hi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)混合。電泳程序包括變性步驟(60。C)、施加1.0-2.1kV進(jìn)行12-40s的注射步驟、分離步驟。隨后通過(guò)片段分析軟件GeneMapper分析熒光數(shù)據(jù)，在該軟件中記錄著經(jīng)延伸引物和內(nèi)標(biāo)寡核苷酸的片段大小和峰面積。HOPE產(chǎn)物的相對(duì)豐度的計(jì)算經(jīng)延伸引物的濃度如下進(jìn)行定量經(jīng)延伸引物的峰面積=相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的峰面積(Cp)(注射樣品的體積)(Cstd)(標(biāo)準(zhǔn)的體積)(i)其中Cp代表樣品的HOPE反應(yīng)中所延伸的某特定引物的摩爾濃度；C姻代表相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的摩爾濃度。36每個(gè)特定引物相對(duì)于更高級(jí)別引物的校準(zhǔn)系數(shù)可用相關(guān)的參照菌株作為模板來(lái)獲得，計(jì)算如下-CFA-B=經(jīng)延伸的引物A的濃度，Ca經(jīng)延伸的引物B的濃度，Cb(ii)其中引物B以高于引物A的等級(jí)水T進(jìn)行靶向。然后可如下計(jì)算出引物A所靶向的16SrRNA基因擴(kuò)增子相比于引物B所靶向的擴(kuò)增子的相對(duì)豐度靶標(biāo)的相對(duì)豐度(％)=Cax100%CbxCFA-B(iii)(b)結(jié)果PCR擴(kuò)增在進(jìn)行15-20循環(huán)的PCR時(shí)，實(shí)現(xiàn)了微生物靶標(biāo)的成比例擴(kuò)增。在20個(gè)循環(huán)后出現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增，在35個(gè)循環(huán)后達(dá)到穩(wěn)定(圖15)。因此，對(duì)于糞便樣品和廢水樣品中的微生物靶標(biāo)的所有PCR擴(kuò)增，選擇20個(gè)循環(huán)的PCR來(lái)產(chǎn)生DNA模板供隨后的HOPE分析。這可使當(dāng)進(jìn)行種豐度(speciesrichness)的定量分析時(shí)由PCR引入的偏差減至最低。等級(jí)引物的設(shè)計(jì)表4列出了以種水平、群水平或域水平涉及擬桿菌屬的23個(gè)不同引物的序列和特異性?；谶@些細(xì)菌菌株的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系(phylogeneticaffiliation),將引物分配到七個(gè)不同的多重HOPE反應(yīng)中(圖13)。反應(yīng)1-6含有三個(gè)較高級(jí)別的引物(Bth274、Bdts—gp980或Bfrg602)以及17個(gè)種特異性引物。因此，可定量出每個(gè)種特異性引物所靶向的各個(gè)微生物靶標(biāo)相對(duì)于較高級(jí)別引物所靶向的那些革巴標(biāo)的豐度。在反應(yīng)7中，可計(jì)算出Bth274、Bdts—gp980、Bfrg602和Bac303所代表的微生物靶標(biāo)相比于總細(xì)菌(U1390相關(guān))的相對(duì)豐度。為清楚地區(qū)分同一HOPE反應(yīng)中的各個(gè)經(jīng)延伸引物，將以相同ddNTP延伸的引物在5'末端用從5-24個(gè)核苷酸的不同長(zhǎng)度poly-A尾進(jìn)行修飾(表4)。引物延伸的特異性引物延伸的特異性是針對(duì)參照菌株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，所有的種特異性引物當(dāng)其被靶向的細(xì)菌種在反應(yīng)中用作DNA模板時(shí)，都如計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)那樣正確地被相同核苷酸延伸。同樣，所有的種特異性引物當(dāng)在非靶標(biāo)存在時(shí)都不延伸。群特異性引物Bth274在6.wm/譜w^//76./ragz/w的存在下被核苷酸"C，，延伸，或者在及fe"M^、漢pj;ogewes、及wonfo、S..wera/ae和及的存在下被核苷酸"T"延伸。Bfrg602被設(shè)計(jì)成靶向S./ragz7w簇中的擬桿菌屬菌種并被"C"延伸。被設(shè)計(jì)成分別在目水平和域水平上靶向所有19個(gè)參照細(xì)菌菌株的Bac303和U1390，分別被"C"和"A"延伸了(表4)。HOPE反應(yīng)的電泳圖的闡釋圖14顯示代表人糞便屮不同的人特有擬桿菌屬菌種的經(jīng)延伸引物的電泳圖。由于較高級(jí)別的引物具有更多的靶標(biāo)可引發(fā)，它們的峰高和峰面積比代表種特異性引物的那些峰高和峰面積要大的多。因此，在用種特異性引物進(jìn)行的HOPE反應(yīng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，相關(guān)的更高級(jí)別引物可能在科水平以外不靶向。這有助于峰高較低的經(jīng)延伸種特異性引物的檢測(cè)。另外，由于經(jīng)延伸的引物會(huì)以一致的片段大小出現(xiàn)，所有其他與經(jīng)延伸的引物不相符的峰都可認(rèn)為是背景噪音而從后面的分析中除去。經(jīng)延伸引物和內(nèi)標(biāo)寡核苷酸的峰面積得到了記錄并用于計(jì)算相對(duì)豐度。糞便樣品中的人特有擬桿菌屬菌種的相對(duì)豐度表5描述了人特有擬桿菌屬菌種在不同分類(lèi)學(xué)水平的相對(duì)豐度。在所有的人糞便樣品中，觀(guān)測(cè)到5.vm/伊加為Bfrg602相關(guān)群當(dāng)中的優(yōu)勢(shì)種(14.5-51.2%)，但擬桿菌屬多樣性的個(gè)體間差異明顯。&/rag&v、S.eggeW/w'、及/"&幼'rt"fo禾卩wo^,7/em',》在志愿者H2禾卩H3中檢測(cè)到在0.6-6.8%之間，但在志愿者Hl中低得沒(méi)有檢測(cè)至l」。及Mcc"e和S.ww/bram'也以不同的相對(duì)豐度(1.3-9.1%)存在。在較高的分類(lèi)學(xué)水平上，Bth274[C]38相關(guān)群(包括8.Mm》mn's'和S./rag!fe)占糞便菌群中存在的細(xì)菌的0.4-0.8%。同樣，Bth274[T]相關(guān)群(包括B.^^a,otoow,cra"、3.erfw5、及及/;/6^e""、5.wW〃禾口及s"/，/^/"e)占細(xì)菌的0.1-0.6%，其中及/eto,otocw,c/W7為這個(gè)群的優(yōu)勢(shì)種(44.8-96.4%)。Bfrg602相關(guān)簇C8./rag,to簇)隨宿主而異，占細(xì)菌的3.0-6.6%。還觀(guān)測(cè)到，在三個(gè)人志愿者中Bac303引物所靶向的擬桿菌(Bacteroidales)群的相對(duì)豐度為14.3-21.8%之間，這提示人糞便菌群具有相對(duì)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)微生物譜型。但是，種豐度隨個(gè)體明顯不同，推測(cè)是因?yàn)樯盍?xí)慣、年齡和飲食的差異所致。相比之下，豬和牛糞便藺群中的人特有擬桿菌屬菌種的比例明顯較低。在HOPE反應(yīng)7中沒(méi)有檢測(cè)到代表經(jīng)延伸的Bth274—15dA和Bfrg602一19dA的片段。Bac303—5dA所靶向的擬桿菌，在豬糞便菌群中占總細(xì)菌的2.4-5.1%，在牛糞便中占總細(xì)菌的1.8-2.9%。這一擬桿菌相對(duì)豐度比人糞便菌群低五倍以上。廢水中人特有擬桿菌屬菌種的相對(duì)豐度將HOPE進(jìn)一步應(yīng)用來(lái)研究豬和城市廢水處理廠(chǎng)流入物中的擬桿菌屬菌種的相對(duì)豐度(表5)。之前在人糞便中檢測(cè)到的擬桿菌屬菌種在城市廢水中也存在,其中及/ragZ/w、及caccae、及ww(/br附z^、vi//gah"禾卩5.was5'/7,饑ws分別占Bfrg602相關(guān)群的11.8%、3.1%、21.5%、32.5%和6.1%。及,/zetowtoo冊(cè)cww仍是Bth274[T]相關(guān)群中的優(yōu)勢(shì)種，占了大約93.6%。雖然城市廢水中存在的Bth274相關(guān)群和Bfrg602相關(guān)群相對(duì)豐度與人糞便菌群中所見(jiàn)的接近，但擬桿菌目的經(jīng)擴(kuò)增16SrRNA基因的相對(duì)豐度似乎已降低了超過(guò)兩倍。這可提示擬桿菌屬菌種在環(huán)境中的持久力低。在豬廢水處理廠(chǎng)的流入物中，在種水平上耙向擬桿臠屬菌種的引物沒(méi)有一個(gè)可被檢測(cè)到。擬桿菌目的靶標(biāo)的相對(duì)豐度比城市廢水低大約三倍。這再次證實(shí)了前面的觀(guān)測(cè)結(jié)果，即人特有擬桿菌屬菌種在動(dòng)物排泄物中以較低的豐度存在。(c)討論為研究擬桿藺在腸道中的功能重要性，諸如FISH和16SrRNA克隆文庫(kù)構(gòu)建之類(lèi)的基于分子的方法已得到使用，盡管它們?cè)谶M(jìn)行定量方面有局限?；?6SrRNA克隆文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)占總細(xì)菌的27.7-48Q/。。在它們當(dāng)中，及/rag,fo和及tfoto^"w亞群占總細(xì)菌最多達(dá)13.3%，這表明了它們?cè)谌四c道的良好機(jī)能中的優(yōu)勢(shì)和重要性。在禾中水平上，Suau等人(Directanalysisofgenesencoding16SrRNAfromcomplexcommunitiesrevealsmanynovelmolecularspecieswithinthehumangut(對(duì)來(lái)自復(fù)雜群落的編碼16SrRNA的基因的直接分析發(fā)現(xiàn)了人腸道中的許多新分子種).ApplEnvironMicrobiol65:4799-807v)已測(cè)定到Af/eto/o^76>/m'crow、S.vw/gtrfws、5.朋i/b/7m's禾口6.c"ccae分另寸山—細(xì)菌的2.1%、1.4%、4.9%和1.1%。但是，這個(gè)報(bào)道的豐度比Eckburg及其同事(2005;Diversityofthehumanintestinalmicrobialflora(人腸道微生物菌群的多樣性).Science308:1635-8)報(bào)道的低三倍以上，Eckburg及其同事發(fā)現(xiàn)Ara/ga/m'和5.//^to/》/aow/c/w2分別占細(xì)菌的15%和6.2%(表6)。這兩個(gè)研究中所報(bào)道的擬桿菌屬菌種豐度的差異，可能是由克隆前的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)以及挑選進(jìn)行分析的克隆總數(shù)的差異所致。同樣，F(xiàn)ISH也顯示出擬桿臠屬在亞群水平和目水平上的相似豐度。但是，沒(méi)有進(jìn)行過(guò)對(duì)擬桿菌屬中每個(gè)種進(jìn)行定量的詳細(xì)研究(表6)。這可能是因?yàn)閿M桿菌屬16SrRNA基因在糞便中的缺乏活性，而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低。與上述方法相比，HOPE的檢測(cè)靈敏度達(dá)總PCR擴(kuò)增微生物靶標(biāo)的0.05-0.1%,因此能夠在種水平上檢測(cè)微生物靶標(biāo)。使用HOPE，發(fā)現(xiàn)擬桿菌的相對(duì)豐度占總細(xì)菌的14.3-21.8%，與16SrRNA克隆文庫(kù)所報(bào)道的相似。但是，每個(gè)擬桿菌屬菌種的豐度低三倍以上(表6)。這一相對(duì)豐度差異很可能是由于兩種方法的差異所致。與檢測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增微生物群落的HOPE不同的是，通過(guò)克隆文庫(kù)進(jìn)行的定量分析取決于所挑選的克隆的最終數(shù)量。肉此，HOPE分析能比克隆文庫(kù)更準(zhǔn)確地反映實(shí)際種豐度。另外，整個(gè)HOPE程序可在不到90分鐘內(nèi)完成，從而提供了快速且靈敏的對(duì)任何樣品類(lèi)型進(jìn)行定量分析的方法。由于HOPE能快速定量糞便和受污染水中的擬桿菌屬菌種，它可用于不同的環(huán)境微生物研究中。由于Kreader等人(1995;DesignandevaluationofBacteroidesDNAprobesforthespecificdetectionofhumanfecalpollution(用于人糞便污染的特異性檢測(cè)的擬桿菌屬DNA探針的設(shè)計(jì)和評(píng)估).ApplEnvironMicrobiol61:117U9)發(fā)現(xiàn)，人特有擬桿菌屬菌種的豐度可區(qū)分人糞便與非人糞便，因此HOPE可用來(lái)定量這些微生物靶標(biāo)，從而可作為糞便源跟蹤(fecalsourcetracking,FST)的方法。這個(gè)研究顯示的是HOPE在定量具有很高比例的擬桿菌屬菌種的樣品中這些菌種的相對(duì)比例方面的應(yīng)用，可能不能準(zhǔn)確反映它在這樣的大片水體中執(zhí)行FST的能力，在該大片水體中擬桿菌屬16SrRNA基因的量Bj能占總細(xì)菌的0.1%以下。在這種情況下，為提高HOPE的檢測(cè)靈敏度，可擴(kuò)增擬桿菌屬-普氏菌屬(尸rcw^/to)而不是細(xì)菌來(lái)充當(dāng)HOPE反應(yīng)的DNA模板。通過(guò)將該替代的基于HOPE的FST策略補(bǔ)充以常規(guī)的糞便指示劑試驗(yàn)，可更好地理解糞便污染。HOPE除了用于FST外，這個(gè)方法還能應(yīng)用來(lái)鑒定腸道或糞便中存在的疾病相關(guān)生物標(biāo)記。這可這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)，首先將這些生物標(biāo)記在健康人和病人中的相對(duì)豐度進(jìn)行比較。結(jié)合對(duì)這些生物標(biāo)記所起到的功能作用的認(rèn)識(shí)，由此可制定出另選的治療策略，該策略涉及到對(duì)微生物多樣性進(jìn)行操控。到目前為止，只有基于培養(yǎng)物的和常規(guī)的分子方法如變性梯度凝膠電泳(DGGE)被應(yīng)用亍這個(gè)領(lǐng)域。HOPE相對(duì)于這些常規(guī)方法具有比較優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗芴峁┒糠治觯瑥亩茉谒b定的生物標(biāo)記和人疾病之間建立更好統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。總之，這個(gè)研究證明了HOPE作為能夠在各種分類(lèi)學(xué)水平上定量微生物靶標(biāo)的快速高通量檢測(cè)方法的用途。這個(gè)方法的通用性還會(huì)意味著，一旦有適當(dāng)?shù)牡燃?jí)引物設(shè)計(jì)可供利用，可將它擴(kuò)展到PCR擴(kuò)增群落中的任何微生物靶標(biāo)，從而促進(jìn)對(duì)不同生態(tài)環(huán)境中的微生物多樣性的進(jìn)一歩認(rèn)識(shí)。應(yīng)用有利的是，本發(fā)明公開(kāi)的方法使得能夠在單個(gè)分析中快速、高通量、靈敏和準(zhǔn)確地檢測(cè)、鑒定和/或定量樣品巾的多個(gè)靶標(biāo)核酸。本發(fā)明方法在開(kāi)發(fā)商品化的或定制的環(huán)境和臨床用途的診斷試劑盒方面具有潛在的應(yīng)用，所述用途包括監(jiān)測(cè)以下場(chǎng)合中的指示微生物飲用水(例如病原菌、糞便細(xì)菌和產(chǎn)毒素微生物)、水和廢水生物處理工藝(生物膜、絲狀細(xì)菌和發(fā)泡細(xì)菌(foam-formingbacteria))、受污染土壤和地下水的生物除污(指示細(xì)菌)及人和動(dòng)物腸道(與健康和疾病相關(guān)的細(xì)菌)，在這些場(chǎng)合中特定群體的豐度或者多個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)和/或定量是重要的或者必需的。顯而易見(jiàn)，本發(fā)明技術(shù)人員在閱讀了前述公開(kāi)內(nèi)容后，可不偏離本發(fā)明精祌和范圍對(duì)本發(fā)明作出各種其他的修改方案和改編方案，且認(rèn)為所有這些修改方案和改編方案都落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。表la.20個(gè)細(xì)菌菌株的等級(jí)寡核苷酸引物延伸分析Eub338(18nt>BAC303-5a(22nt)B冊(cè)74-15a(32nt)BTH5S4-16a(36nt-)#菌種來(lái)源3固。等位基因ddNTP1i^！^ddNTP^d藩^雄TP_—11_基因___^§__I"a"e，VesBCRC106243^"ar。/c/e5JCM58254Ke_ro/rfesBCKC1，35^W/"Ocut;(;uird/i;wDSMZ204556。7"/seWaJCM10I887""。6牆7;usDSMZ200798cfo6acfei/wmBCRC146069￡os"-印fococct/sDSM295010(T化sf"'力'〃;w/印f柳B(niǎo)CRC14522IIATCC2725512j^'/yd^acfw/wmBCRC1184713fecBCRC1006714d/W力-柳B(niǎo)(:R(，l4545CJ。S"'07//。2"膨15S/'/Yrfo6arfe_r/wmDSMZ2008818f謂Ag"er細(xì)ATCC2776819ATCC27760a各細(xì)菌菌株獲自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)、生物資源保存及研究中心(BioresourceCollectionandResearchCeater，BCRC)、日本微生物保存中心(JapanCollectionofMicroorganisms,JCM)、德國(guó)國(guó)家生物材料資源中心(GermanNationalResourceCentreforBiologicalMaterial,DSMZ)禾卩英國(guó)食品工業(yè)與海洋細(xì)菌菌種保藏中心(NationalCollectionofIndustrialMarineandFoodBacteria,NCIMB)。b錯(cuò)配堿基配對(duì)(MM)的數(shù)目。e指鄰近所形成的引物-模板雙鏈體的模板核苷酸。d指所觀(guān)測(cè)到的染料終止物。ND，未檢測(cè)到。OAU0GCOAU0GCOAU0GCOAU0GC0GC6-ND0GC6-NDOAU5-ND0GC6-ND0GC6-ND0GC6-ND0GC6-0GC6-OAU5-NDOAU6-ND0GC6-ND0GC6-NDOATJ6-0GC5-ND0GC5-ND0GC6-ND0AU0GC0GC2-ND2-ND6-ND7-ND4-ND7-NDS-ND7-ND10-ND7-ND7-ND5-ND9-ND8-ND9-ND7-ND10-ND7-ND8-ND5-ND9-ND6-ND7_ND6-NDS-ND5-ND9-ND7-ND6-ND5-"ND9-ND6-ND6-ND8-ND7-冊(cè)8-ND5-ND42表lb.本研究中所用寡核苷酸的序列和特異性名稱(chēng)序列(5'-3')特異性寡核苷酸引物EUB338EUB338-4aEUB338-8aEUB338-12aEUB338-18aE腦38陽(yáng)24aEUB338國(guó)30aEUB338IaE腦381a-23aBAC303-5aBTH274陽(yáng)15aBTH584-16aBFRG602-19aBTT1250BFRG1024BITT141BADF1037陽(yáng)9aBUFM1018-18aGCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)4GCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)8GCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)12GCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)18GCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)24GCTGCCTCCCGTAGGAGT(A)30GCTGCCTCCCGTAGGAGTGCTGCCTCCCGTAGGAG(A)23GCTGCCTCCCGTAGGAG(A)—,CCAATGTGGGGGACCTT(A)15CCCCTATCCATCGAAGG(A)16CAACTGACTTAACTGTCCAC(A)19GAGCCGCAAACTTTCACAACGCCGTGTAGCAACCTGCTCACAGCGGTGATTGCTCACGAAAGGCTATCCCGGAA(A)9TGCAGCACCTTCACACCT(A)1SAACTGCCTTGCGGCTGACA細(xì)菌細(xì)菌細(xì)歯細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌擬樸菌群及勸e/fl/o/ao""c/'tw、5./rag/fo和其他擬桿菌屬菌種aBttl250群a8ac/e朋i/"'熒光標(biāo)記的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)GT16-Cy5Cy5-(GT)8GT26-Cy5Cy5-(GT)13GT36-Cy5Cy5-(GT)1SGT46-Cy5Cy5(GT)23GT46-D2D2-(GT)23GT40-D4D4-(GT)20a參考圖4。43<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表3.用多重HOPE方法定量污水處理廠(chǎng)流入物和流出物中特定靶標(biāo)的相對(duì)豐度<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>a由BTH274-15a的ddCTP延伸引物檢測(cè)的群。b山BTH274-15a的ddTTP延伸引物檢測(cè)的群。6重反應(yīng)所獲得的校準(zhǔn)系數(shù)EUB338Ia-23a:BAC303-5a:BFRG602-19a:BTH274-15a(C):BTH274-15a(T):BTT1250=1:6.1:11.2:14.4:3.1:2.4，7重反應(yīng)所獲得的校準(zhǔn)系數(shù)BFRG602-19a:BUFM1018-18a:BTH274-15a(C):BTH274-15a(T):BFG1024:BITT141=1:0.8:1.2:0.4:1.7:0.1。所用的細(xì)菌菌株包括A^Kto/otoo柳/cra"、A/rag,7k、及ac/t^/"ac/e,"'(JCM10556)、及/〃/w/''"a/7'5-(JCM13266)、及Mm/wTO^(JCM5828)、Bactow.tfes,ec加s(JCM10003)和Bactera/tfes/j^界'"t's(JCM6294)。ND，未檢測(cè)到。表4.本研究所包括的引物足設(shè)計(jì)來(lái)在不同的等級(jí)水平(種、屬、目和域水平)靶向人特有擬桿菌屬菌種引物耙標(biāo),'、一—/Poly-A尾(nt)EK+n入ddNTP類(lèi)型象去夕J文獻(xiàn)Pg—dtc732GTTCCGGCCCGGTGAGCT20G本研究Bhcg171TTTCAGTGCCATCGGGCAT8T本研究Bcc1(366CCTATGGGTTTCCCCATAA15T本研究Badf1009CGGCTAACATGTTTCCAC0A本研究Bvg1016ATGCCTTGCGGCTTACGGC0T本研究Bcpc1015漢cw.oco/"CGCCTTGCGGCTTACAAGT24T本研究Bmsl1000GCGTTTCCGCCATATTCGG19T本研究Begt999及eggeW/w7GTTTCCACTACATTCCGC0T本研究Bnd136AOCCTATCCCCGAGTAAAA0G本研究Bsls1016GCCTTGCGGCTATGCCG10T本研究Bmde657TCCGCCTACCTCAAACAC0A本研究Bgld277GAACCCCTATCCATCGTG8G本研究Bdtsl278AGACGTGGTTTGGGGATT0C本研究Bufm1018及Mw'ybnw/sCTGCCTTGCGGCTGACA20T(32)Bfrg1026TCACAGCGGTGATTGCTC20A(32)Bth584CAACTGACTTAACTGTCCAC16C(32)Bitt141CGAAAGGCTATCCCGGAA0T(32)Bdts—gp980f界CGTTCAAACCCGGGTAA12G本研究Bth274亞群CCCCTATCCATCGAAGO15C/T(32)Bfrg602群GAGCCGCAAACTTTCACAA19C(14)Bac303擬桿菌CCAATGTGGGGGACCTTc(26)U1390細(xì)菌YGACGGGCGCTGTGT17A(38)(14)Harmsen,etal.2002.Extensivesetof16SrRNA-basedprobesfordetectionofbacteriainhumanfeces(用于檢測(cè)人糞便細(xì)菌的一大套基于16SrRNA的探針).ApplEnvironMicrobiol68:2982-90.(26)Manz,etal.1996.Applicationofasuiteof16SrRNA-specificoligonucleotideprobesdesignedtoinvestigatebacteriaofthephylumcytophaga-flavobacter-bacteroidesinthenaturalenvironment(—套設(shè)計(jì)來(lái)研究自然環(huán)境中的phylumcytophaga-flavobacter-bacteroides細(xì)菌的16SrRNA特異性寡核苷酸探針的應(yīng)用).Microbiology142(Pt5).1097-106.(32)Wang,etal.1996.PCRdetectionandquantitationofpredominantanaerobicbacteriainhumanandanimalfecalsamples(人和動(dòng)物糞便樣品中的優(yōu)勢(shì)厭氧細(xì)菌的PCR檢測(cè)和定暈).ApplEnvironMicrobiol62:1242-7.(38)Zheng,etal.1996.Characterizationofuniversals脂ll-subunitrRNAhybridizationprobesforquantitativemolecularmicrobialecologys加dies(用于定量分子微生物生態(tài)學(xué)研究的通用小亞申.位rRNA雜交探針的表征).ApplEnvironMicrobiol62:4504-13.46表5.用多重HOPE方法分別定量人、豬和牛糞便樣品及城市和豬廢水處理廠(chǎng)流入物中的微生物耙標(biāo)的相對(duì)豐度<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>引物Bth274一15dA當(dāng)與這個(gè)群的微生物靶標(biāo)退火時(shí)由ddCTP延伸。:引物Bth274—15dA當(dāng)與這個(gè)群的微生物靶標(biāo)退火時(shí)由ddTTP延伸。'ND表示未檢測(cè)到。多重管1-4中的引物所獲得的校準(zhǔn)系數(shù)(CF):Bfrg602—19dA:Bfrgl026—20dA:Bccl066—15dA:Badfl009:Bittl41:Bufml018—20dA:Begt999:Bhcgl71—8dA:Bvgl016:Bmsl1000_19dA:Bcpcl015_24dA=1:0.17:2.96:0.36:16.51:4.61:8.17:13.86:8.37:3.13:3.06。CF是用細(xì)菌菌株的克隆獲得的，所述細(xì)菌菌株包括5./rag/fo(BCRC10619)、及caccae(JCM9498)、Aaczfi^/"ac/my(JCM10556)、Aw附/ora,'5(JCM5828)、丑egger,/2,z(JCM12986)、5.fe/cogew^(JCM6297)、5.vw/g油"(BCRC12903)、5.ma柳7,e,w,s(JCM12982)和Accpraa)/"(JCM12979)。多重管5中的引物所獲得的校準(zhǔn)系數(shù)(CF):Bth274[T]—15dA:Bndl36:Bslsl016—10dA:Pg_dtc732—20dA:Bth584—16dA=1:2.05:0.39:0.36:0.19。CF是用細(xì)菌菌株的克隆獲得的，所述細(xì)菌菌株包括A朋W/7(JCMI2987)、Aw/"raae(JCM12988)、A"og(m.s'(JCM6294)和及^to/otoo/m.cra"(BCRC10624)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>權(quán)利要求1.一種鑒定靶標(biāo)核酸的方法，所述方法包括以下步驟(a)使含有多個(gè)靶標(biāo)核酸的樣品與至少一個(gè)系列的核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物可以與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(b)測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的所述可檢測(cè)信號(hào)，以確定所述靶標(biāo)核酸的身份。2.權(quán)利要求1的方法，其屮所述樣品包含經(jīng)擴(kuò)增的所述多個(gè)靶標(biāo)核酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述多個(gè)靶標(biāo)核酸包含16S核糖體RNA。4.權(quán)利耍求1的方法，所述方法還包括在步驟(b)之前對(duì)所述標(biāo)記引物進(jìn)行純化的步驟。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述純化步驟選fi由色譜分離、基于酶的消化、離心純化管柱純化、化學(xué)沉淀或電泳分離構(gòu)成的組。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)系列的每一個(gè)包含3-20個(gè)核苷酸引物。7.權(quán)利要求1的方法，其屮一個(gè)系列當(dāng)屮至少一個(gè)所述核苷酸引物其長(zhǎng)度與所述系列的其他成員不同。8.權(quán)利要求l的方法，其中個(gè)系列當(dāng)中的每個(gè)所述核苷酸引物其長(zhǎng)度與所述系列的其他成員不同。9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述不同的長(zhǎng)度包括2-70個(gè)核苷酸的差異.10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述不同的長(zhǎng)度是用不同長(zhǎng)度的核酸尾來(lái)獲得。11.權(quán)利要求10的方法，其屮所述核酸尾選自polydA尾和polydT尾。12.權(quán)利要求10的方法，其中一個(gè)系列的各個(gè)成員的所述核酸尾在2-50個(gè)核苷酸之間。13.權(quán)利要求1的方法，其中在所述核苷酸引物與所述靶標(biāo)核酸結(jié)合后，所述方法包括用標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸延伸所述引物的步驟。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述單核苷酸選自雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP禾口ddGTP。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)信號(hào)選自熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)、放射性信號(hào)或生物素?；盘?hào)。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述熒光信號(hào)選自熒光素、羅丹明、香豆素、花青、熒光納米顆粒和熒光量子染料。17.權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記引物的所述可檢測(cè)信號(hào)是通過(guò)應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)核酸的校準(zhǔn)系數(shù)來(lái)定量。18.權(quán)利要求17的方法，其屮所述校準(zhǔn)系數(shù)是通過(guò)確定特異性水平較高的結(jié)合引物的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與特異性水平較低的結(jié)合引物的可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度之比來(lái)獲得。19.權(quán)利要求l的方法，所述方法包括在步驟(b)之前對(duì)所述標(biāo)記引物進(jìn)行分離以使得能夠確定所述靶標(biāo)核酸的身份的步驟。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述分離步驟選自電泳、色譜或質(zhì)譜。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述能使得所述引物與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合并使得所述結(jié)合引物用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記的條件，包括使所述引物與所述靶標(biāo)核酸發(fā)生退火和使所述引物用至少一個(gè)標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)的單核苷酸進(jìn)行延伸的條件，及這種條件的多個(gè)循環(huán)。22.權(quán)利要求1的方法，其中歩驟(a)包括使所述樣品的第一等分試樣與第系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸和另外地使所述樣品的第二等分試樣與第二系列的核苷酸引物進(jìn)行接觸，其中所述第一系列和第二系列包括至少一個(gè)共同的核苷酸引物。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是測(cè)定異質(zhì)樣品中的組成生物的方法。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述組成生物選自原核生物和真核生物。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述原核生物選自細(xì)菌和古細(xì)菌。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述真核生物選自真菌和酵母。27.權(quán)利要求1的方法，其中所述系列的核苷酸引物包括多個(gè)特異性水平等級(jí)的核苷酸引物。28.權(quán)利要求1或27的方法，其中所述系列包括一個(gè)等級(jí)水平較高的引物和多個(gè)等級(jí)水平較低的引物。29.權(quán)利要求1或27的方法，其中所述系列的核苷酸引物包括多個(gè)種特異性引物和一個(gè)非種特異性引物。30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括一個(gè)域特異性引物和多個(gè)選自門(mén)特異性引物、綱特異性引物、目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的引物。31.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括一個(gè)門(mén)特異性引物和多個(gè)選自綱特異性引物、目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的引物。32.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括一個(gè)綱特異性引物和多個(gè)選自目特異性引物、科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的引1物。33.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括一個(gè)目特異性引物和多個(gè)選自科特異性引物、屬特異性引物和種特異性引物的引物。34.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括一個(gè)科特異性引物和多個(gè)選自屬特異性引物和種特異性引物的引物。35.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述系列包括屬特異性引物和多個(gè)種特異性引物。36.權(quán)利要求1的方法，其中一個(gè)系列除了所述特異性水平較低的一個(gè)成員外每個(gè)成員都對(duì)一個(gè)耙標(biāo)核酸有特異性。37.權(quán)利要求1的方法，其中一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)核苷酸引物能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸。38.—種在鑒定靶標(biāo)核酸的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含(i)至少一個(gè)系列的能夠結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)核酸的核苷酸引物，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(ii)說(shuō)明書(shū)，說(shuō)明使含有多個(gè)核酸的樣品與所述核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物與至少一個(gè)所述耙標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，以使得可以測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的所述可檢測(cè)信號(hào)，從而確定出所述靶標(biāo)核酸的身份。39.權(quán)利要求38的試劑盒，所述試劑盒還包含一套能夠結(jié)合所述核苷酸引物的具有可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。40.權(quán)利要求38的試劑盒，其中一個(gè)系列當(dāng)中有至少一個(gè)所述核苷酸引物其長(zhǎng)度與所述系列的其他成員不同。41.權(quán)利要求38的試劑盒，其中一個(gè)系列當(dāng)中的每一個(gè)所述核苷酸引物其長(zhǎng)度與所述系列的其他成員不同。42.—種診斷受治療者中的腸道疾病的方法，其中所述疾病與腸道臠群的異常分布有關(guān)，所述方法包括鑒定來(lái)自所述受治療者的樣品中的靶標(biāo)核酸，該鑒定包括以下步驟(a)使含有靶標(biāo)核酸的所述樣品與至少一個(gè)系列的核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，其中每個(gè)系列當(dāng)中一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和(b)測(cè)量每個(gè)標(biāo)記弓1物的所述可檢測(cè)信號(hào)以鑒定所述靶標(biāo)核酸的身份，其中所述鑒定確定出腸道菌群分布。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定靶標(biāo)核酸的方法，所述方法包括以下步驟使含有多個(gè)靶標(biāo)核酸的樣品與至少一個(gè)系列的核苷酸引物在這樣的條件下進(jìn)行接觸，該條件能使得所述引物可以與至少一個(gè)所述靶標(biāo)核酸發(fā)生結(jié)合，并使得所述結(jié)合引物可以用可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，其中每個(gè)系列當(dāng)中有一個(gè)成員其特異性水平低于該系列的其他成員；和測(cè)量每個(gè)標(biāo)記引物的所述可檢測(cè)信號(hào)，以確定所述靶標(biāo)核酸的身份。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101535504SQ200780037134公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年8月3日優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日發(fā)明者劉文佐,吳哲宏申請(qǐng)人:新加坡國(guó)立大學(xué)