專(zhuān)利名稱(chēng)：用于基因療法的核酸構(gòu)建體的制作方法
本申請(qǐng)涉及一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)p27，從而可解除由p27引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，本申請(qǐng)還涉及該蛋白質(zhì)的突變體，一些所述的突變體具有顯性干涉性狀，本申請(qǐng)還涉及編碼這些蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸，以及所述蛋白質(zhì)和核酸用于預(yù)防和治療疾病的用途。另外，本申請(qǐng)公開(kāi)了用于疾病的基因療法的核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有上述核酸。
真核細(xì)胞的細(xì)胞周期受依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶(cdks)的控制；所述激酶需要調(diào)節(jié)性亞單位(“細(xì)胞周期蛋白”)才能保持活性。細(xì)胞周期的不同過(guò)程(如復(fù)制和進(jìn)入有絲分裂)受不同cdks控制(Morgan，自然，374，131(1995))。與之相關(guān)的是依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶的活性受到高水平的調(diào)節(jié)。在這種情況下存在的內(nèi)部控制機(jī)制可以例如防止進(jìn)入有絲分裂直至DNA已完成其復(fù)制。如生長(zhǎng)因子的外部因子的控制僅在DNA復(fù)制開(kāi)始前發(fā)生；復(fù)制由有活性的細(xì)胞周期蛋白E/cdks2復(fù)合物起始。
除了激酶亞單位中細(xì)胞周期蛋白的量以外，依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶的活性也受小的抑制蛋白調(diào)節(jié)(Sherr和Roberts，Gene Dev.，9，1149(1995))。例如，根據(jù)其大小被稱(chēng)為p21和p27的兩個(gè)抑制劑對(duì)于細(xì)胞周期蛋白E/cdk2而言是至關(guān)重要的。通常，在表達(dá)大量p27的細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白E/cdk2激酶不具活性，DNA復(fù)制的進(jìn)入因而被阻斷。
盡管細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)物在很多人腫瘤中過(guò)量表達(dá)或至少組成型表達(dá)(Sherr，科學(xué)，274，1672(1996))，而負(fù)調(diào)節(jié)物經(jīng)常突變或僅少量表達(dá)(Fero等，細(xì)胞，85，733(1996))。這兩者存在特殊的關(guān)聯(lián)例如，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1基因在很多頸腫瘤中過(guò)量表達(dá)。因此我們希望依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶及其功能是尋求新的，選擇性的，具有抗增殖效應(yīng)的物質(zhì)過(guò)程中的靶結(jié)構(gòu)。
幾年前已知p27蛋白的基因(K.Polyak等，細(xì)胞，78，59-66(1994))，該基因可得自GenBank[鼠p27；登記號(hào)為K09968；人p27K10906]。盡管已對(duì)p27基因進(jìn)行了深入的研究，但迄今為止仍未在人腫瘤中發(fā)現(xiàn)p27基因的突變。這種現(xiàn)象非常令人驚奇，因?yàn)閜27基因失活的小鼠表現(xiàn)出多發(fā)性發(fā)育異常的表型和腫瘤發(fā)生率增加(Fero等，細(xì)胞，85，733(1996)，Kiyokawa等，細(xì)胞，85，721(1996))。取而代之的是p27的功能明顯地受轉(zhuǎn)錄后主調(diào)節(jié)。
因此，p27由蛋白酶解降解；在正常細(xì)胞中這也在DNA復(fù)制開(kāi)始時(shí)發(fā)生。與正常組織相比，很多腫瘤中蛋白酶解降解p27的能力顯著增加，這似乎與不利的預(yù)后直接相關(guān)(Loda等，天然藥物，3，231(1997))。
然而，也必定有能導(dǎo)致p27失活的其它機(jī)制。例如，用Myc癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞之后，p27首先在功能上失活(即不再與細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物結(jié)合)，并僅在較晚的階段被降解。迄今為止仍無(wú)法理解例如為什么很多乳腺腫瘤可表達(dá)大量p27蛋白，而這些腫瘤仍能非?？焖俚厣L(zhǎng)。目前仍不知道在這些腫瘤中使p27失活的機(jī)制(Fredersdorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，6380(1997))。
因此，有關(guān)專(zhuān)家很有興趣發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)使腫瘤中p27失活的機(jī)制或物質(zhì)。本發(fā)明已解決了這一難題。本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)p163能結(jié)合p27，可抑制p27的功能并可導(dǎo)致p27在胞質(zhì)中被蛋白酶解。1)蛋白質(zhì)p163及其核酸序列本發(fā)明涉及一種新的，被稱(chēng)為p163的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能結(jié)合p27，從而可抑制p27的功能并可導(dǎo)致p27在胞質(zhì)中被蛋白酶解。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列已被測(cè)定。
蛋白質(zhì)p163特異性地與p27結(jié)合，而不與如Myc，Max，Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明還涉及編碼蛋白質(zhì)p163的核苷酸序列。已測(cè)定小鼠p163蛋白的核苷酸序列，通過(guò)序列比較，也測(cè)定了人p163蛋白的核苷酸序列。2)顯性失活的p163類(lèi)似物本發(fā)明還涉及編碼p163組成肽的核苷酸序列和/或編碼身為p163的類(lèi)似物并可發(fā)揮顯性失活作用的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述顯性失活作用即為抑制天然p163蛋白與蛋白質(zhì)p27結(jié)合，而基本上不會(huì)削弱p27蛋白與細(xì)胞周期蛋白E/cdk2的結(jié)合和由此引發(fā)的細(xì)胞周期蛋白E/cdk2的抑制作用。
本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白顯性失活突變體的核酸序列或其組成序列的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將這些核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，抑制靶細(xì)胞-特異性p163蛋白和靶細(xì)胞-特異性p27蛋白之間的結(jié)合，以使靶細(xì)胞的增殖被由此釋放的靶細(xì)胞-特異性p27蛋白抑制。3)抑制p163的肽然而，本發(fā)明也涉及編碼抑制p163功能的蛋白質(zhì)或肽的核苷酸序列。所述蛋白質(zhì)或肽包括與p163蛋白上用于結(jié)合p27蛋白的位點(diǎn)結(jié)合或與p163蛋白上用于結(jié)合Ran(Loeb等，分子細(xì)胞生物學(xué)，4，209-222(1993))的位點(diǎn)結(jié)合，從而可抑制對(duì)細(xì)胞而言為內(nèi)源性的p163蛋白的蛋白質(zhì)或肽。
這些蛋白質(zhì)包括對(duì)應(yīng)于p27蛋白或Ran蛋白上用于結(jié)合p163蛋白的位點(diǎn)的肽。這些蛋白質(zhì)另外還包括對(duì)蛋白質(zhì)p163，尤其是對(duì)其結(jié)合p27蛋白的位點(diǎn)具有特異性的抗體或抗體裂解產(chǎn)物，如F(ab)2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v和scFv。
本發(fā)明還涉及編碼這類(lèi)抑制蛋白或肽的核酸序列的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將這些核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，抑制靶細(xì)胞-特異性p163蛋白和靶細(xì)胞-特異性p27蛋白或靶細(xì)胞-特異性Ran蛋白之間的結(jié)合，以使靶細(xì)胞的增殖被由此釋放的靶細(xì)胞-特異性p27蛋白抑制。4)p163刺激細(xì)胞分裂的用途本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白的核苷酸序列或p163蛋白自身用于抑制對(duì)細(xì)胞而言為內(nèi)源性的p27蛋白，從而刺激靶細(xì)胞的細(xì)胞分裂的用途。5)抑制p163的轉(zhuǎn)錄和翻譯然而，本發(fā)明也涉及抑制編碼p163蛋白的靶細(xì)胞-特異性核酸序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而導(dǎo)致p27蛋白被釋放，進(jìn)而抑制靶細(xì)胞增殖的核酸序列。本發(fā)明的這類(lèi)核酸序列可以是例如反義(三鏈體)DNA，反義RNA和/或核酶。6)篩查p163抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白的核酸序列，或p163蛋白，或其組成序列用于篩查p163蛋白和p27蛋白或Ran蛋白之間結(jié)合的抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)的用途，和這些檢測(cè)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的p163蛋白抑制劑用于抑制靶細(xì)胞增殖的用途。7)檢測(cè)p163以診斷疾病本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白或編碼p163蛋白之組成序列的核酸構(gòu)建體，或與p163蛋白的這些核酸序列結(jié)合的核酸序列或蛋白質(zhì)序列，或與p163蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)用于檢測(cè)細(xì)胞或組織或體液中編碼p163的核酸或檢測(cè)其中的p163蛋白以確定細(xì)胞或組織的增殖狀況或診斷疾病狀況的用途。8)含有結(jié)合p27或p163/p27蛋白復(fù)合物的序列的表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及一種表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)所含核酸序列的表達(dá)受p27蛋白的控制，所述表達(dá)系統(tǒng)至少含有下列組分組分a)—至少一種激活序列(啟動(dòng)子No.I)組分b)—至少一種轉(zhuǎn)錄因子的基因，所述轉(zhuǎn)錄因子由融合蛋白組成，組分b)含有·組分b1)轉(zhuǎn)錄因子的至少一種激活域·組分b2)1)與p27蛋白結(jié)合的p163蛋白的至少一種序列或至少一種組成序列，或2)與p27蛋白中用于結(jié)合p163蛋白的位點(diǎn)結(jié)合的至少一種抗體或至少一種抗體片段，如Fab，F(xiàn)v或scFv，或3)與p163蛋白中用于結(jié)合p27蛋白的位點(diǎn)結(jié)合的至少一種抗體或至少一種抗體片段，如Fab，F(xiàn)v或scFv，或4)與由p163和p27組成的復(fù)合物結(jié)合的至少一種抗體或至少一種抗體片段，如Fab，F(xiàn)v或scFv。
·組分b3)轉(zhuǎn)錄因子的至少一種DNA結(jié)合域組分c)—通過(guò)結(jié)合由組分b)編碼的轉(zhuǎn)錄因子而被激活的至少一種激活序列(啟動(dòng)子No.11)組分d)—至少一種效應(yīng)基因。
各個(gè)組分排列的示例見(jiàn)

圖1。所述表達(dá)系統(tǒng)能發(fā)揮本發(fā)明所述功能的前提條件是組分b21)，b22)或b23)被置于組分b1)和b3)之間或加入組分b1)和b3)中以使p27蛋白或p163蛋白與組分b2)的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合可抑制激活域[組分b1)]和/或DNA結(jié)合域[組分b3)]的功能。在有游離p27或游離p163的細(xì)胞中，這種抑制導(dǎo)致效應(yīng)基因的表達(dá)受抑制。在p27蛋白和/或p163蛋白處于復(fù)合狀態(tài)以使之不再能與組分b2)相互作用，或使之不再存在或僅少量存在的細(xì)胞中，這種抑制不復(fù)存在，這意味著轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]能以無(wú)礙的方式激活激活序列[組分c)]，從而起始效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。
組分b24)構(gòu)成了與眾不同的特征。在處于分裂的細(xì)胞中，p163/p27復(fù)合物與組分b24)的結(jié)合抑制了轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]；與之形成對(duì)照的是，轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]在靜息細(xì)胞(即其時(shí)p27以游離狀態(tài)存在)中是游離的和功能完全的。
通過(guò)激活激活序列[組分a)]可起始效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，這會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子組分b)的基因被表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]反過(guò)來(lái)與激活序列[組分c)]結(jié)合，這會(huì)誘導(dǎo)效應(yīng)基因[組分d)]的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，組分a)與組分c)相同。在這個(gè)具體的實(shí)施方案中，輕度激活激活序列[啟動(dòng)子I，組分a)]可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)既可激活激活序列[啟動(dòng)子I，組分a)]，也可激活激活序列[啟動(dòng)子II，組分c)]，從而既可以誘導(dǎo)效應(yīng)基因[組分d)]的基因表達(dá)，也可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]的表達(dá)，反過(guò)來(lái)又可增強(qiáng)效應(yīng)基因[組分d)]的表達(dá)。
通過(guò)下列方法可伸展表達(dá)系統(tǒng)—將效應(yīng)基因[組分d)，d’)，d”)]的幾個(gè)相同或不同的序列連在一起，每種情況下都通過(guò)相同或不同的IRES序列或通過(guò)激活序列[組分c’)和c”)]相互連接。
—將轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]的幾個(gè)相同或不同的基因連在一起，每種情況下都通過(guò)相同或不同的IRES序列或通過(guò)激活序列[組分a)或組分c)]相互連接。
當(dāng)不同轉(zhuǎn)錄因子的基因連在一起時(shí)，選擇激活序列以使它們含有能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]的核苷酸序列。
根據(jù)所選擇的激活序列[組分a)或c)]，可使用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體來(lái)非特異性地，細(xì)胞特異性地或病毒特異性地，或在特殊的代謝條件下，或者細(xì)胞周期特異性地表達(dá)效應(yīng)基因[組分d)]。效應(yīng)基因是這樣一種基因，它的一部分可編碼藥理活性化合物或者編碼能將無(wú)活性的藥物前體裂解成活性藥物的酶。
例如，所選擇的效應(yīng)基因應(yīng)使所述活性化合物或所述酶能與配體一起被表達(dá)成融合蛋白的形式，所述配體能與細(xì)胞表面結(jié)合，所述細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞或白細(xì)胞。
優(yōu)選上文述及的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體由DNA組成。術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”可被理解為能在靶細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄的人工核酸結(jié)構(gòu)。優(yōu)選將所述核酸構(gòu)建體插入載體，尤其優(yōu)選插入質(zhì)粒載體或病毒載體。
可給病人施用適當(dāng)插入載體中的核酸構(gòu)建體以預(yù)防或治療疾病。給藥的方式有經(jīng)口，局部給藥或通過(guò)注射或灌注給藥。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后該細(xì)胞系可用作本發(fā)明表達(dá)效應(yīng)基因的表達(dá)系統(tǒng)的載體。可使用這種細(xì)胞給病人提供藥物?；蛘?，可將其中導(dǎo)入了本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞或細(xì)胞系，如腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞局部施用于病人或非腸道(例如靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi))注射給病人或注射入體腔、器官內(nèi)或皮下施用。
因此，本發(fā)明核酸構(gòu)建體的優(yōu)選用途在于預(yù)防或治療疾病，對(duì)于本發(fā)明而言包括體外導(dǎo)入核酸構(gòu)建體至靶細(xì)胞中，在靶細(xì)胞中非特異性地，病毒特異性地或靶細(xì)胞特異性地，代謝特異性地和/或細(xì)胞周期特異性地表達(dá)藥物，以及給病人局部或非腸道施用靶細(xì)胞，或者給病人局部或非腸道施用核酸構(gòu)建體以將核酸構(gòu)建體體內(nèi)導(dǎo)入至靶細(xì)胞中。
自然界中不會(huì)出現(xiàn)本發(fā)明這種形式的核酸構(gòu)建體，即活性化合物或酶或配體-活性化合物或配體-酶融合蛋白的效應(yīng)基因不會(huì)天然地與本發(fā)明核酸構(gòu)建體中所含的核酸序列連接。
優(yōu)選摻入本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)中的效應(yīng)基因[組分d)]編碼藥理活性化合物。這種藥理活性化合物是蛋白質(zhì)和糖蛋白，它們選自細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的受體，抗體或抗體片段，具有抗增殖或細(xì)胞靜止效應(yīng)的蛋白質(zhì)，具有細(xì)胞程序死亡或抗細(xì)胞程序死亡效應(yīng)的蛋白質(zhì)，腫瘤抗原，血管生成抑制劑，誘導(dǎo)血栓形成的蛋白質(zhì)，凝固抑制劑，具有溶纖效應(yīng)的蛋白質(zhì)，血漿蛋白質(zhì)，激活補(bǔ)體的蛋白質(zhì)，病毒和細(xì)菌的包膜物質(zhì)，激素，對(duì)循環(huán)起作用的肽，神經(jīng)肽，酶，介體，天然產(chǎn)生的、未經(jīng)改變的調(diào)節(jié)蛋白和核酶，或?qū)虮磉_(dá)具有抑制作用的(反義)核苷酸序列。
優(yōu)選轉(zhuǎn)基因是編碼核酶的效應(yīng)基因，所述核酶可滅活編碼蛋白質(zhì)的mRNA，所述蛋白質(zhì)選自細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，尤其是細(xì)胞周期蛋白A，細(xì)胞周期蛋白B，細(xì)胞周期蛋白D1，細(xì)胞周期蛋白E，E2F1-5，cdc2，cdc25C，p163或DP1，或病毒蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子或它們的受體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)基因編碼配體-活性化合物融合蛋白，所述配體可以是抗體，抗體片段，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，粘附分子或肽激素，活性化合物可以是上文所述的藥理活性化合物或酶。例如，效應(yīng)基因可編碼配體-酶融合蛋白，酶可將藥物前體裂解成藥物，配體可與細(xì)胞表面結(jié)合，優(yōu)選與內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的表面結(jié)合。
圖1表示本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。1)鑒定p163蛋白和編碼p163蛋白的核酸序列使用“雙雜合體(two-hybrid)技術(shù)”(Fields和Song，自然，340，245(1989))發(fā)現(xiàn)p163蛋白是一種新的p27配偶體蛋白，為此，使用PCR將鼠p27蛋白的完整編碼序列和轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域符合讀框地克隆至酵母載體pGBT10(Clontech)中。用此載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Hf7c(Clontech Heidelberg，Matchmaker Two Hybrid，K1605-1)，然后分離色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落，在使用針對(duì)GAL4和p27的特異性抗體的Western印跡中檢測(cè)正確融合蛋白的表達(dá)。
在第二次轉(zhuǎn)化中，使用得自小鼠胚的經(jīng)VP16標(biāo)記的cDNA文庫(kù)(Vojtek等，細(xì)胞，74，205(1993))轉(zhuǎn)化此菌株。對(duì)在15nM氨基三唑存在下表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的400個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步的分析，對(duì)這些克隆中的70個(gè)測(cè)序；它們都編碼不同的D-型細(xì)胞周期蛋白；已知它們是與p27相互作用的配偶體。使用Southern印跡顯示出400個(gè)抗性克隆中有390個(gè)編碼D細(xì)胞周期蛋白。其余克隆中有兩個(gè)(第163號(hào))編碼相同的蛋白質(zhì)對(duì)它們進(jìn)行完整地測(cè)序。
由Balb/c-3T3細(xì)胞制備λZAP cDNA文庫(kù)，得自該文庫(kù)的幾個(gè)克隆被鑒定為與p163同源。序列分析顯示出開(kāi)放閱讀框；該閱讀框也被用于得自cDNA文庫(kù)的VP16嵌合體。兩個(gè)原始克隆都編碼此閱讀框的氨基酸121-252。在使用β-半乳糖苷酶作為報(bào)道基因的酵母中更詳細(xì)地鑒定了克隆p163如表1所示，酵母中編碼的蛋白質(zhì)特異性地與p27相互作用，而不與如Myc，Max，Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白質(zhì)相互作用。表1也顯示了p27中與p163發(fā)生相互作用的區(qū)域的第一處定界。這些數(shù)據(jù)表明p163和依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶(Russo等，自然，382，325(1996))一樣與p27的相同區(qū)域結(jié)合。這暗示了p163和依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶競(jìng)爭(zhēng)同p27的結(jié)合。其次，可將p163中與p27相互作用的區(qū)域劃定為氨基酸121-252。
為了證實(shí)得自所述酵母檢測(cè)系統(tǒng)的這些結(jié)果，將重組表達(dá)的p163[與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)一起表達(dá)成融合蛋白]結(jié)合到柱上，然后通過(guò)在此柱上進(jìn)行親和層析試著純化35S-標(biāo)記的p27蛋白。含有p163以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的應(yīng)用使得在這些實(shí)驗(yàn)中利用均一的基質(zhì)成為可能(所謂的GST pulldowns；Hateboer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，8489(1993))。
為了進(jìn)行這些研究，將得自酵母克隆的閱讀框轉(zhuǎn)移至pGEX載體(Pharmacia，F(xiàn)reiburg pGEX-2T；Cat.No.27-4801-01)中，所述載體編碼與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的嵌合蛋白，該嵌合蛋白受大腸桿菌的IPTG-誘導(dǎo)的TAC啟動(dòng)子控制(Smith和Johnson，基因，6731，1988)。通過(guò)在谷胱甘肽-瓊脂糖上進(jìn)行親和層析(Smith和Johnson，1988)從經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化嵌合蛋白，然后對(duì)100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，20mM EDTA，10％甘油，0.1mM PMSF透析嵌合蛋白。根據(jù)相同方案純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，然后進(jìn)行透析以作為對(duì)照；將純化的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存于-80℃。
然后于4℃下將10μg兩種蛋白質(zhì)各與10μg BSA和20mg膨脹的GST-瓊脂糖一起保溫2小時(shí)；之后離心分離出瓊脂糖，用透析緩沖液將瓊脂糖洗滌兩次。將瓊脂糖的等分試樣直接煮沸于樣品緩沖液中以作為蛋白質(zhì)結(jié)合的對(duì)照，SDS凝膠電泳后檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)體外翻譯制備35S-甲硫氨酸-標(biāo)記的p27(根據(jù)廠(chǎng)商的說(shuō)明Promega，Mannheim；TNT coupled retc.lys.systems；L4610)，于4℃下將所述經(jīng)標(biāo)記的p27與上樣的瓊脂糖一起在總體積為200μl的含有0.1％NP-40的透析緩沖液中保溫2小時(shí)。用透析緩沖液/0.1％NP-40將瓊脂糖洗滌4次，然后在SDS樣品緩沖液中煮沸。通過(guò)SDS凝膠電泳和熒光顯影檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表2。表2表明重組的、體外合成的35S-標(biāo)記的p27選擇性地與用嵌合的GST-p163融合蛋白上樣的柱結(jié)合，而不與用相同量的GST上樣的柱結(jié)合。表2也表明得自細(xì)胞提取物的p27不能有效地與GST-p163結(jié)合；在此提取物中，p27與依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶的復(fù)合物結(jié)合。稍作加熱處理可從這些復(fù)合物中釋放出p27，從而使之與p163結(jié)合。這表明p163和依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白的激酶競(jìng)爭(zhēng)與p27的結(jié)合。
本發(fā)明的編碼鼠p163蛋白的核酸序列示于表3。數(shù)據(jù)庫(kù)中有此序列的同系物；該同系物是酵母核蛋白(Nup)2基因。Nup2是核膜蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)參與核蛋白的形成和蛋白質(zhì)進(jìn)出核的轉(zhuǎn)運(yùn)。在酵母中，Nup2可能特別地參與輸出。
盡管從整體上看同源性并不高，但幾個(gè)功能域是保守的(表4)。例如，Ran-結(jié)合蛋白(RBP-1)，NuP-2和p163之間與調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)蛋白(Ran，一種GTP-結(jié)合蛋白)結(jié)合的位點(diǎn)是保守的(表5)，結(jié)構(gòu)功能已定的短五肽序列也是保守的(表6)。
為了毫無(wú)疑問(wèn)地闡明p163就是核孔蛋白，產(chǎn)生了針對(duì)蛋白質(zhì)[組氨酸-p163(氨基酸121-252)]的多克隆抗血清，然后進(jìn)行親和純化；從免疫熒光下典型的核孔染色(核表面和外周的點(diǎn)被染色)結(jié)果看，此抗血清毫無(wú)疑問(wèn)地識(shí)別了核孔蛋白。
為了闡明p163或Nup2和p27在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，使用CMV表達(dá)載體在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)兩種蛋白質(zhì)；48小時(shí)后，裂解細(xì)胞并通過(guò)免疫沉淀/Western印跡檢查可能存在的兩種蛋白質(zhì)的相互作用(Peukert等，EMBO J，16，5672(1997))。在每種情況下使用針對(duì)Nup2的多克隆抗體和針對(duì)鼠p27的多克隆抗體可闡明p27和Nup2之間的結(jié)合。僅當(dāng)p163被表達(dá)時(shí)p27蛋白才能沉淀良好(見(jiàn)表7)。這證明在HeLa細(xì)胞中Nup2和p27能在體內(nèi)互相結(jié)合。
通過(guò)使用人EST進(jìn)行序列比較和序列檢索鑒定出人p163蛋白的核酸序列。其中Ran-結(jié)合域位于序列AA161285中的第173≥575位，p27-結(jié)合域位于序列R62312的第318≥486位，p163的其它組成區(qū)段位于序列THC199124的第348≥489位。
為了更精確地限定與Nup2-p163相互作用的p27氨基酸，在酵母中尋找不再與p163相互作用的突變體。為此，對(duì)編碼p27的cDNA進(jìn)行誘導(dǎo)錯(cuò)誤的PCR反應(yīng)(PCR的條件描述于“PCR-技術(shù)，DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用”；H.A.Erlich，Stockton出版社，紐約1989)，檢測(cè)含有隨機(jī)錯(cuò)誤的所得克隆與Nup2的相互作用，檢測(cè)所述克隆與細(xì)胞周期蛋白D1的相互作用以作為對(duì)照。該P(yáng)CR的條件(不同于標(biāo)準(zhǔn)條件)是在1U GIBCO Taq聚合酶和0.1mM MnCl2存在下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
將所得cDNA片斷與已被BamHI和EcoRI線(xiàn)性化然后經(jīng)純化的pGBT10載體一起共轉(zhuǎn)化至酵母菌株HF7c-p163/Nup2中。通過(guò)從缺少-Leu-Trp的培養(yǎng)基中選擇篩選出經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落。分離出960個(gè)獨(dú)立的克隆，將它們平鋪在選擇培養(yǎng)基上(-Leu-His-Trp)。對(duì)在此選擇培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行第二個(gè)相互作用試驗(yàn)，即β-半乳糖苷試驗(yàn)。
鑒定陰性克隆，從中分離出pGBT10-p27質(zhì)粒。首先，所得質(zhì)粒與將p163/Nup2表達(dá)成含有反式激活域的嵌合體的酵母表達(dá)質(zhì)粒一起被重新轉(zhuǎn)化，然后所得質(zhì)粒與將細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)成含有反式激活域的嵌合體的質(zhì)粒一起被重新轉(zhuǎn)化以作為對(duì)照。如此產(chǎn)生了3個(gè)克隆，所述克隆不再選擇性地與Nup2相互作用，但與細(xì)胞周期蛋白D1相互作用。與幾個(gè)對(duì)照一起測(cè)定這些質(zhì)粒的序列。
所得表型的范圍簡(jiǎn)述于表13。在這些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在缺乏組氨酸(-Trp-Leu-His，“選擇性的”)的條件下生長(zhǎng)時(shí)，相互作用證實(shí)了其自身，而對(duì)照(-Trp-Leu；“非選擇性的”)顯示出兩種蛋白質(zhì)都可在酵母中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)1000個(gè)克隆中有3個(gè)不再特異性地與p163-Nup2相互作用，但與細(xì)胞周期蛋白D1相互作用。這些序列示于表14。所有3個(gè)克隆，而不是一系列對(duì)照克隆在氨基酸的精氨酸90處攜帶相同的突變(突變成甘氨酸)。序列也表明克隆是獨(dú)立形成的，因?yàn)樗鼈償y有額外的，不同的突變。這清楚地將精氨酸90鑒定為p27與Nup2相互作用的主要氨基酸?？捎么送蛔凅w證實(shí)這種相互作用的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。2)p163蛋白的顯性失活類(lèi)似物的核苷酸序列上述功能分析揭示了p163蛋白的兩個(gè)區(qū)域?qū)τ谄涔δ苁侵陵P(guān)重要的。
其中一個(gè)區(qū)域是結(jié)合p27的區(qū)域(氨基酸121-252)，另一個(gè)是結(jié)合Ran的區(qū)域(氨基酸307-467)，Ran是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的GTP-結(jié)合蛋白。
因此，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)p163的核酸序列或此蛋白質(zhì)的一部分的核酸序列，這些核酸序列在p27結(jié)合域和/或Ran結(jié)合域表現(xiàn)出突變，以使所表達(dá)的突變蛋白質(zhì)與p27或Ran的結(jié)合大幅度地減少。當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，p163的這些類(lèi)似物抑制功能細(xì)胞-特異性的p163。這會(huì)產(chǎn)生游離的p27，導(dǎo)致細(xì)胞分裂被抑制。p163的這種顯性失活突變體的例子示于表8和9。表8顯示出其中缺失了p27-結(jié)合域的p163，而表9顯示出缺乏Ran-結(jié)合域的p163。
因此，本發(fā)明涉及將編碼顯性失活的p163類(lèi)似物的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，目的是抑制此細(xì)胞的增殖。導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程可在體外進(jìn)行，也可在體內(nèi)進(jìn)行。
為了確保本發(fā)明核酸構(gòu)建體的表達(dá)是最可能的，和/或確保所述表達(dá)受到控制，優(yōu)選使所述構(gòu)建體與激活序列連接。這種激活序列的例子列于8.3節(jié)。為了確保編碼p163的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信號(hào)(NLS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種NLS。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒載體，或借助于并插入病毒載體將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。3)與p163結(jié)合域結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽的核苷酸序列已描述的研究成果將p163蛋白的p27-結(jié)合域確定為氨基酸121-252，將Ran-結(jié)合域確定為氨基酸307-467。
因此，本發(fā)明涉及編碼肽的核酸構(gòu)建體，所述肽或與p163中的p27結(jié)合域結(jié)合從而抑制p163與p27的結(jié)合，或與p163中的Ran結(jié)合域結(jié)合從而抑制p163與Ran的結(jié)合。這種抑制導(dǎo)致游離的p27的形成，p27通過(guò)例如與細(xì)胞周期蛋白E/cdk2結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞增殖。這種抑制性肽的例子是對(duì)應(yīng)于p27蛋白(氨基酸69-178)或Ran的p163-結(jié)合域的氨基酸序列。
另一類(lèi)例子是與p163結(jié)合，特別是與p163的p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體或抗體片段，如F(ab)2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v或s.c.Fv。通過(guò)例如用p163或p163的p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合域免疫動(dòng)物可產(chǎn)生這種抗體。所述結(jié)合域示于表5(Ran-結(jié)合域)和表10(p27-結(jié)合域)。
因此，本發(fā)明涉及將編碼與p163結(jié)合的蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，目的是抑制所述細(xì)胞的增殖。導(dǎo)入細(xì)胞可在體外或體內(nèi)發(fā)生。
為了確保本發(fā)明核酸構(gòu)建體的表達(dá)是最可能的，和/或確保所述表達(dá)受到控制，優(yōu)選使所述構(gòu)建體與激活序列連接。這種激活序列的例子列于8.3節(jié)。為了確保編碼本發(fā)明核酸構(gòu)建體的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信號(hào)(NLS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種NLS。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒載體，或借助于并插入病毒載體將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。4)刺激細(xì)胞分裂的p163的核苷酸序列將p163的核苷酸序列或p163蛋白導(dǎo)入細(xì)胞可抑制細(xì)胞內(nèi)的p27。這可釋放細(xì)胞周期蛋白E/cdk2復(fù)合物(受p27抑制)，所述復(fù)合物可啟動(dòng)細(xì)胞分裂。
因此，本發(fā)明涉及將編碼p163的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，目的是促進(jìn)細(xì)胞的增殖。導(dǎo)入細(xì)胞可在體外或體內(nèi)發(fā)生。
為了確保本發(fā)明核酸構(gòu)建體的表達(dá)是最可能的，和/或確保所述表達(dá)受到控制，優(yōu)選使所述構(gòu)建體與激活序列連接。這種激活序列的例子列于8.3節(jié)。為了確保編碼p163的核酸序列位于核中，不得不在其中加入核定位信號(hào)(NLS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種NLS。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒載體，或借助于并插入病毒載體將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。
例如，當(dāng)細(xì)胞增殖有缺陷時(shí)，導(dǎo)入編碼p163的核酸構(gòu)建體可刺激細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞增殖。5)抑制p163蛋白轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸序列有關(guān)p163蛋白核酸序列的知識(shí)提供了制備可用于特異性抑制p163轉(zhuǎn)錄或翻譯的寡核苷酸的可能性。這些反義核酸包括寡核苷酸，反義(三鏈體)DNA，核酶和反義RNA。制備三鏈體DNA寡核苷酸的方法詳細(xì)描述于Frank-Kamenetskii和Mirkin，Ann.Rev.Biochem，64，65(1995)，制備反義RNA寡核苷酸的方法詳細(xì)描述于Neckers等，Crit.Rev.Oncogen，3，175(1992)；Carter和Lemoine，Br.J.Cancer，67，869(1993)；Mukhdopadhyay和Roth，Crit.Rev.Oncogen，7，151(1996)和Mercola和Cohen，癌癥基因療法，2，47(1995)。
本發(fā)明中優(yōu)選使用能與p163核苷酸序列雜交的三鏈體DNA或反義RNA寡核苷酸，所述核苷酸序列編碼p27蛋白-結(jié)合域(總區(qū)域，氨基酸121-252)的組成區(qū)域或Ran蛋白-結(jié)合域(總區(qū)域，氨基酸307-467)組成區(qū)域。
抑制p163轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸序列還包括特異于p163蛋白核苷酸序列區(qū)域的核酶。
制備核酶的方法詳細(xì)描述于Burke，核酸分子生物學(xué)，8，105(1994)，Christoffersen和Marr，藥物化學(xué)雜志，38，2023(1995)和Scott等，科學(xué)，274，2065(1996)。本發(fā)明優(yōu)選與p163核苷酸序列雜交的核酶，所述核苷酸序列位于p27蛋白-結(jié)合域(氨基酸121-252)或Ran蛋白-結(jié)合域(氨基酸307-467)的核苷酸序列的區(qū)域。
能被核酶裂解的p163蛋白核苷酸序列的例子列于表11。
將寡核苷酸形式的三鏈體DNA，反義RNA或核酶[使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(見(jiàn)上述文獻(xiàn))制備并保護(hù)以防DNA酶或RNA酶降解]或者在體外加入靶細(xì)胞，或者通過(guò)注射或局部應(yīng)用而進(jìn)行體內(nèi)施用。
然而，本發(fā)明也涉及將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，目的是通過(guò)轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞中形成對(duì)應(yīng)于本發(fā)明寡核苷酸的反義RNA或核酶，從而抑制所述細(xì)胞的增殖。導(dǎo)入細(xì)胞可在體外或體內(nèi)發(fā)生。
為了確保本發(fā)明核酸構(gòu)建體的表達(dá)是最可能的，和/或確保所述表達(dá)受到控制，優(yōu)選使所述構(gòu)建體與激活序列連接。這種激活序列的例子列于8.3節(jié)。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒載體，或借助于并插入病毒載體將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。6)篩查p163功能抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)有關(guān)p163蛋白及其與p27蛋白的相互作用的發(fā)現(xiàn)使篩查所述相互作用的抑制劑成為可能。這需要檢測(cè)系統(tǒng)，該檢測(cè)系統(tǒng)中p27蛋白和p163蛋白之間的結(jié)合被抑制，這種抑制的出現(xiàn)由指示劑顯示。
大量方法是已知的，一個(gè)所述方法的例子是雙雜合體篩選試驗(yàn)(有關(guān)內(nèi)容見(jiàn)C.1節(jié)和表1)。
然而也可以使用例如親和系統(tǒng)來(lái)篩選，在該系統(tǒng)中，p163[優(yōu)選為p27-結(jié)合域(氨基酸121-252)]與固相結(jié)合并與檢測(cè)物質(zhì)一起保溫，通過(guò)對(duì)p163蛋白中p27-結(jié)合域的經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合配偶體的結(jié)合的抑制作用可確定檢測(cè)物質(zhì)的結(jié)合。所述經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合配偶體可以是p27或特異性地結(jié)合p163蛋白的p27-結(jié)合域的抗體。
可以按照與組建檢測(cè)p163和p27之間結(jié)合的抑制劑的系統(tǒng)相同的方式，組建檢測(cè)p163和Ran之間結(jié)合的抑制劑的系統(tǒng)，并將該檢測(cè)系統(tǒng)用于篩選。因此，本發(fā)明涉及編碼p163或p163的組成蛋白的核酸序列用于篩選p163抑制劑的用途，或p163蛋白或其組成蛋白用于篩選p163抑制劑的用途。7)p163的核酸序列或p163的蛋白質(zhì)序列用于診斷細(xì)胞增殖時(shí)期或疾病狀況的用途如導(dǎo)言A)節(jié)中所述，很多腫瘤的特征在于p27的胞內(nèi)濃度增加。由于這些腫瘤在增殖，可假定這種濃度增加的p27的功能受到抑制。根據(jù)本發(fā)明，p163是p27的特異性抑制劑。在細(xì)胞中檢測(cè)這種抑制劑使得對(duì)細(xì)胞的增殖狀況得出結(jié)論成為可能。這種結(jié)論對(duì)于例如評(píng)估腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織的惡性非常重要。通過(guò)細(xì)胞死亡可釋放p163蛋白。因此，在體液中檢測(cè)到p163即可對(duì)體內(nèi)的增殖過(guò)程和/或伴隨細(xì)胞死亡的過(guò)程，如炎癥過(guò)程有一定論。通過(guò)與經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)的特異性結(jié)合可檢測(cè)到p163蛋白。所述特異性結(jié)合的物質(zhì)包括p27蛋白，Ran蛋白和例如通過(guò)用p163蛋白或用p163蛋白的組成序列免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。
然而，通過(guò)使編碼p163蛋白的核酸序列與相應(yīng)的mRNA雜交也可檢測(cè)到細(xì)胞或組織中的p163 mRNA。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，其中使用所謂的引物對(duì)可復(fù)制欲檢測(cè)的幾拷貝核酸序列，從而增加了檢測(cè)的敏感性。
用于擴(kuò)增和檢測(cè)編碼p163的核酸序列的引物對(duì)的例子示于表12a，b和c。
然而，也可以通過(guò)例如使用Gussoni等，Nature Biotechnol，14，1012(1996)所述的熒光原位雜交法來(lái)檢測(cè)編碼p163的RNA。
因此，本發(fā)明涉及檢測(cè)編碼p163的核酸序列或檢測(cè)p163蛋白以確定細(xì)胞或組織的增殖狀況或檢測(cè)活的哺乳動(dòng)物中的增殖變化，或伴隨細(xì)胞死亡的變化。8)由p163，p27或p163/p27復(fù)合物控制的表達(dá)系統(tǒng)的區(qū)別性特征8.1.組分b)8.1.1.p163，p27或p163/p27蛋白復(fù)合物的結(jié)合序列[組分b2)]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的組分b2)含有與p27蛋白結(jié)合的p163蛋白或p163蛋白的一部分的至少一種核酸序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的組分b2)含有抗體或抗體的一部分的至少一種核酸序列，所述抗體或其一部分含有結(jié)合序列(VH和VL)，所述結(jié)合序列針對(duì)的位點(diǎn)是—p27蛋白中與p163蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，或—p163蛋白中與p27蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。
例如，在這些實(shí)施方案中，細(xì)胞中存在的游離的p27蛋白或游離的p163蛋白可結(jié)合組分b2)的表達(dá)產(chǎn)物，從而抑制由組分b)編碼的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果阻斷了表達(dá)系統(tǒng)。但是，如果p27蛋白在細(xì)胞中例如與p163蛋白復(fù)合，那么組分b2)的表達(dá)產(chǎn)物可保持游離狀態(tài)，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄因子[組分b)]也可保持游離狀態(tài)，表達(dá)系統(tǒng)就能發(fā)揮作用。
因此，本發(fā)明的這些表達(dá)系統(tǒng)能夠在處于分裂的細(xì)胞中起作用(存在p163/p27復(fù)合物)，而在靜息細(xì)胞中被抑制(游離的p27)。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，帶有組分b2)的表達(dá)系統(tǒng)含有抗體或抗體的一部分的至少一種核酸序列，所述抗體或其一部分含有由p27和p163組成的復(fù)合物的結(jié)合序列(VH和VL)。在此實(shí)施方案中，p27和p163的復(fù)合物與組分b2)的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，從而阻斷表達(dá)系統(tǒng)，而游離的p27或p163不與組分b2)的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合。
因此，本發(fā)明的該表達(dá)系統(tǒng)在處于分裂的細(xì)胞中被阻斷(存在p163/p27復(fù)合物)，而在靜息細(xì)胞中能發(fā)揮作用(游離的p27)。
當(dāng)選擇組分b2)的抗體時(shí)，優(yōu)選利用抗體的表位結(jié)合部分，即FVL和FVH，如果抗體來(lái)源于鼠，則使之人源化。人源化的方式如Winter等人(自然，349，293(1991)和Hoogenbooms等人(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993))所述。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，如Winter等，自然，349，293(1991)，Hoogenbooms等，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993)，Girol.Mol.Immunol，28，1379(1991)或Huston等，Int.Rev.Immunol，10，195(1993)所述的方法可制備抗體片段?？贵w，抗體片段和重組抗體片段的制備詳細(xì)描述于專(zhuān)利申請(qǐng)DE 9649 645.4中。
可直接由現(xiàn)有的雜交瘤制備重組的抗體片段，也可以借助于噬菌體展示技術(shù)(Winter等，Annu.Rev.Immunol，12，433(1994))，從鼠或人抗體片段文庫(kù)中分離重組的抗體片段。然后在基因水平上直接將這些抗體片段用于與組分b1)和b3)偶聯(lián)。
為了由雜交瘤制備重組的抗體片段，通過(guò)分離mRNA、將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)并使用分別與可變片段的5’和3’末端互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增可分離出編碼抗體的抗原結(jié)合域(VH，VL)的遺傳信息。然后將所得的編碼VH和VL片段的DNA片段克隆至細(xì)菌表達(dá)載體；例如，可用此方法表達(dá)Fv片段，單鏈Fv片段(scFv)或Fab片段。
使用噬菌體展示技術(shù)也可直接從鼠或人源的抗體文庫(kù)(免疫文庫(kù)或首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫(kù))中分離新的抗體片段。在抗體片段的噬菌體展示中，抗原結(jié)合域以scFV片段基因的形式或作為Fab片段基因，作為與絲狀噬菌體的g3P外被蛋白的基因的融合蛋白，被克隆至噬菌體基因組或噬粒載體中。在荷載有抗原的塑料容器中(淘選)，在綴合了抗原的順磁珠上或通過(guò)與細(xì)胞表面結(jié)合來(lái)選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。
通過(guò)PCR擴(kuò)增經(jīng)免疫動(dòng)物或病人的B淋巴細(xì)胞中的可變抗體片段的基因可制備免疫文庫(kù)。為此使用了特異于鼠或人免疫球蛋白或特異于人免疫球蛋白基因家族的寡核苷酸的組合。
通過(guò)使用未經(jīng)免疫的供體作為免疫球蛋白基因的來(lái)源可制備首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫(kù)?；蛘?，可使用免疫球蛋白種系基因來(lái)制備半合成的抗體所有組成成分，通過(guò)使用簡(jiǎn)并引物的PCR擴(kuò)增可變片段的互補(bǔ)決定區(qū)3。與免疫文庫(kù)相比，這些所謂的單箱(single-pot)文庫(kù)的有利之處在于可從單個(gè)文庫(kù)中分離出針對(duì)大量抗原的抗體片段。
通過(guò)噬菌體展示技術(shù)可進(jìn)一步增加抗體片段的親和性，其中利用隨機(jī)的，基于密碼子的或定點(diǎn)的誘變，通過(guò)用得自原初所有組成成分的片段改組各個(gè)區(qū)域的鏈或通過(guò)使用細(xì)菌突變菌株可由現(xiàn)存的抗體片段制備新的文庫(kù)，在嚴(yán)格條件下通過(guò)重新選擇來(lái)分離具有改良特性的抗體片段。另外，通過(guò)用人的所有組成成分逐步取代其中一個(gè)可變區(qū)，隨后使用原始抗原選擇(被引導(dǎo)的選擇)可使鼠抗體片段人源化?；蛘?，通過(guò)有目的地用原始鼠抗體的相應(yīng)區(qū)域取代人抗體的高變區(qū)也可實(shí)現(xiàn)鼠抗體的人源化。8.1.2.激活域[組分b1)]和DNA結(jié)合域[組分b3)]在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄因子激活域和DNA結(jié)合域的所有可利用的基因都可用于組分b)。其描述不會(huì)限制本發(fā)明的這些區(qū)域的例子是—激活域[組分b1)]·HSV1-VP16的酸反式激活域(TAD)(氨基酸406-488；Triezen-berg等，Genes Developm，2718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm，5190(1995)或氨基酸413-490；Regier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，883(1993))的cDNA的至少一種序列，或·Oct-2的激活域(氨基酸438-479；Tanaka等，分子細(xì)胞生物學(xué)，146046(1994)或氨基酸3-154；Das等，自然，374657(1995))的至少一種序列，或·SP1的激活域(氨基酸340-485；Courey和Tijan，細(xì)胞，55，
887(1988))的至少一種序列，或·NFY的激活域(氨基酸1-233；Li等，生物化學(xué)雜志，267，8984(1992)；van Hujisduijnen等，EMBO J，9，3119(1990)；Sinha等，生物化學(xué)雜志，92，1624(1995)；Coustry等，生物化學(xué)雜志，270，468(1995))的至少一種序列，或·ITF2的激活域(氨基酸2-452；Seipel等，EMBO J，13，4961(1992))的至少一種序列，或·c-Myc的激活域(氨基酸1-262；Eilers等)的至少一種序列，或·CTF的激活域(氨基酸399-499；Mermod等，細(xì)胞，58，741(1989)；Das和Herr，自然，374，657(1995))的至少一種序列。
—DNA結(jié)合域[組分b3)]·Gal4蛋白的DNA結(jié)合域(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué)，102916(1990))的cDNA的至少一種序列，或·LexA蛋白(氨基酸1-81；Kim等，科學(xué)，255203(1992))或整個(gè)LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，細(xì)胞，43729(1985))的至少一種序列，或·lac阻抑(lacI)蛋白(Brown等，細(xì)胞，49603(1987)；Fuerst等，PNAS USA 862549(1989))的至少一種序列，或·四環(huán)素阻抑(tetR)蛋白(Gossen等，PNAS USA 895547(1992)；Dingermann等，EMBO J，111487(1992))的至少一種序列，或·ZFHD1蛋白(Pomerantz等，科學(xué)，26793(1995))的至少一種序列。
本發(fā)明中，在DNA結(jié)合域的3’末端加入核定位信號(hào)(NLS)是有利的。8.2.可被組分b)激活的啟動(dòng)子單位II[組分c)]激活序列此激活序列的選擇取決于轉(zhuǎn)錄因子基因[組分b)]中DNA結(jié)合域[組分b3)]的選擇。
例如，針對(duì)8.1.2.中所列的DNA結(jié)合域的例子依次存在下列可能性8.2.1.可能性A)—激活序列含有至少一種與Gal4蛋白(Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué)，10，2916(1990))結(jié)合的序列[核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTGAC CG-3’，SEQ ID NO1]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本啟動(dòng)子(核酸48-5191；Tooze(編輯)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室))或·c-fos的啟動(dòng)子(Das等，自然，374，657(1995))或·U2 sn RNA啟動(dòng)子或·HSV TK的啟動(dòng)子(Papavassiliou等，生物化學(xué)雜志，265，9402(1990)；Park等，Molec.Endocrinol，7，319(1993))。8.2.2.可能性B)—激活序列·含有至少一種與LexA蛋白(LexA操縱基因；Brent等，自然，612，312(1984))結(jié)合的序列[核苷酸序列5’-TACTGTATGTACATACAGTA-3’，SEQ ID NO2]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本啟動(dòng)子(核酸48-5191；Tooze(編輯)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室))或另一種啟動(dòng)子(見(jiàn)可能性A)8.2.3.可能性C)—激活序列
·含有至少一種與lacI阻抑蛋白(Fuerst等，PNAS USA862549(1989)；Simons等，PNAS USA811624(1984))結(jié)合的Lac操縱基因序列[核苷酸序列5’-GAATTGTGAGCGCTCACAAT TC-3’，SEQ ID NO3]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本啟動(dòng)子(核酸48-5191；Tooze(編輯)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室))或另一種啟動(dòng)子(見(jiàn)可能性A)8.2.4.可能性D)—激活序列·含有至少一種與四環(huán)素阻抑(tetR)蛋白結(jié)合的四環(huán)素操縱基因(tetO)序列[核苷酸序列5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’，SEQ ID NO4]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本啟動(dòng)子(核酸48-5191；Tooze(編輯)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室))或另一種啟動(dòng)子(見(jiàn)可能性A)8.2.5.可能性E)—激活序列·含有至少一種與ZFHD-1蛋白(Pomerantz等，科學(xué)，267，93(1995))結(jié)合的序列[核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’，SEQ ID NO5]，并(在其3’末端)加入·SV40的基本啟動(dòng)子(核酸48-5191；Tooze(編輯)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室))或另一種啟動(dòng)子(見(jiàn)可能性A)8.3.激活序列I[組分a)]本發(fā)明中用作激活序列的核苷酸序列在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子之后可激活位于3’末端附近的基因的轉(zhuǎn)錄。激活序列的選擇取決于需治療的疾病和需轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。因此，能以非限制性的方式，靶細(xì)胞特異性地，在特殊的代謝條件下，細(xì)胞周期特異性地或病毒特異性地激活激活序列[組分a)]。這些啟動(dòng)子序列已詳細(xì)描述于專(zhuān)利申請(qǐng)EP95930524.4，EP95931933.6，EP95931204.2，EP95931205.9，EP97101507.8，EP97102547.3，DE196.39103.2和DE196.51443.6。可選擇的啟動(dòng)子序列的例子是8.3.1.能以非限制性的方式被激活的激活序列和啟動(dòng)子如—RNA聚合酶III的啟動(dòng)子—RNA聚合酶II的啟動(dòng)子—CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子—SV40啟動(dòng)子8.3.2.病毒啟動(dòng)子和激活序列如—HBV—HCV—HSV—HPV—EBV—HTLV—HIV當(dāng)使用HIV啟動(dòng)子時(shí)，包括TAR序列[第-453至-80位，Rosen等，細(xì)胞，41，813(1985)]的整個(gè)LTR序列被用作病毒特異性的啟動(dòng)子。8.3.3.可經(jīng)代謝激活的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，如可被缺氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子。8.3.4.可被細(xì)胞周期特異性激活的啟動(dòng)子這些啟動(dòng)子的例子是cdc25C基因，細(xì)胞周期蛋白A基因，cdc2基因，B-myb基因，DHFR基因，E2F-1基因或cdc25B基因的啟動(dòng)子，或者是結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的序列。所述序列在細(xì)胞增殖過(guò)程中似乎或確實(shí)被激活。這些結(jié)合序列包括例如結(jié)合c-myc蛋白的序列。這些結(jié)合序列也包括被稱(chēng)為MycE盒的核苷酸序列[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’，SEQ ID NO6；Blackwood和Eisenmann，科學(xué)，2511211(1991)]的單體或多體。8.3.5.可被四環(huán)素激活的啟動(dòng)子，如與相應(yīng)阻抑蛋白聯(lián)合的四環(huán)素操縱基因8.3.6.嵌合啟動(dòng)子嵌合啟動(dòng)子是可被細(xì)胞特異性地，代謝特異性地或病毒特異性地激活的上游激活序列與含有核苷酸序列CDE-CHR或E2FBS-CHR的下游啟動(dòng)子組件的聯(lián)合，抑制蛋白與之結(jié)合從而可在細(xì)胞周期的G0和G1相抑制上游激活序列的激活(PCT/GB9417366.3；Lucibello等，EMBO J，14，12(1994))。8.3.7.可被細(xì)胞特異性激活的啟動(dòng)子優(yōu)選這些啟動(dòng)子包括這樣的啟動(dòng)子或激活序列，它們由得自編碼優(yōu)先在選定細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)的那些基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子組成。
例如，本發(fā)明中優(yōu)選在下列細(xì)胞中使用下列蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子8.3.7.1.在內(nèi)皮細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列—腦特異性的，內(nèi)皮葡萄糖-1-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—Endoglin—VEGF受體1(flt-1)—VEGF受體2(flk-1，KDR)—tie-1或tie-2—B61受體(Eck受體)—B61—內(nèi)皮肽，尤其是內(nèi)皮肽B或內(nèi)皮肽1—內(nèi)皮肽受體，尤其是內(nèi)皮肽B受體—甘露糖6-磷酸受體—von Willebrand因子—IL-1α和IL-1β—IL-1受體
—血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)—合成的激活序列。
也可使用合成的激活序列作為天然的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的替代物，所述激活序列由用于結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的寡聚化位點(diǎn)組成，所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)先或選擇性地在內(nèi)皮細(xì)胞中具有活性。一個(gè)例子是轉(zhuǎn)錄因子GATA-2，內(nèi)皮肽1基因中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)是5’-TTATCT-3’[Lee等，生物化學(xué)，266，16188(1991)，Dormann等，生物化學(xué)雜志，267，1279(1992)和Wilson等，分子細(xì)胞生物學(xué)，10，4854(1990)]。8.3.7.2.在經(jīng)激活的內(nèi)皮細(xì)胞附近的細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活序列—VEGFVEGF基因的基因-調(diào)節(jié)序列是5’-側(cè)翼區(qū)，3’-側(cè)翼區(qū)，c-Src基因或v-Src基因—類(lèi)固醇激素受體及其啟動(dòng)子元件(Truss和Beato，Endocr.Rev，14，459(1993))，尤其是小鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子8.3.7.3.在肌細(xì)胞，尤其是平滑肌細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活序列—原肌球蛋白—α-肌動(dòng)蛋白—α-肌球蛋白—PDGF的受體—FGF的受體—MRF-4—果糖磷酸激酶A—磷酸甘油酸變位酶—肌鈣蛋白C—肌細(xì)胞生成素—內(nèi)皮肽A的受體—結(jié)蛋白—VEGFVEGF基因的基因-調(diào)節(jié)序列已列于“在經(jīng)激活的內(nèi)皮細(xì)胞附近的細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子”一節(jié)(見(jiàn)上文)—“人工”啟動(dòng)子螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族(MyoD，Myf-5，肌細(xì)胞生成素，MRF4)的因子被描述成肌肉-特異性的轉(zhuǎn)錄因子。肌肉-特異性的轉(zhuǎn)錄因子還包括鋅指蛋白GATA-4。不僅肌肉-特異性基因的啟動(dòng)子可使HLH蛋白和GATA-4表現(xiàn)出肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，在異源前后序列(context)中也能使HLH蛋白和GATA-4表現(xiàn)出肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，人工啟動(dòng)子同樣也能做到這一點(diǎn)。具有此特性的人工啟動(dòng)子的例子是多拷貝的結(jié)合肌肉特異性HLH蛋白，如E盒(MyoD)的(DNA)位點(diǎn)(如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC，SEQ IDNO7)或多拷貝的結(jié)合α-肌球蛋白重鏈基因的GATA-4的DNA位點(diǎn)(如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’，SEQ ID NO8)。8.3.7.4.在膠質(zhì)細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列這些啟動(dòng)子和激活序列尤其包括例如編碼下列蛋白質(zhì)的基因的基因-調(diào)節(jié)序列或元件—Schwann細(xì)胞-特異性蛋白質(zhì)periaxin—谷氨酰胺合成酶—膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)＝GFAP)—膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)S100b—IL-6(CNTF)—5-HT受體—TNFα—IL-10—胰島素樣生長(zhǎng)因子受體I和II—VEGF上文已列出VEGF基因的基因-調(diào)節(jié)序列。8.3.7.5在造血細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列具有這種特性的基因-調(diào)節(jié)序列包括在造血細(xì)胞或其鄰近細(xì)胞，如基質(zhì)中表達(dá)的細(xì)胞因子或其受體的基因的啟動(dòng)子序列。
它們包括下列細(xì)胞因子及其受體的啟動(dòng)子序列，例如—干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體—干細(xì)胞生長(zhǎng)因子—IL-1α—IL-1受體—IL-3—IL-3受體(α-亞單位)—IL-3受體(β-亞單位)—IL-6—IL-6受體—GM-CSF—GM-CSF受體(α-鏈)—干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)IL-6和IFNγ或IFNβ可等效地激活I(lǐng)RF-1的啟動(dòng)子。
—促紅細(xì)胞生成素—促紅細(xì)胞生成素受體。8.3.7.6.在淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列所述啟動(dòng)子和激活序列包括例如細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體和粘附分子和抗體Fc片斷的受體的基因的啟動(dòng)子和激活序列。
例如—IL-1受體—IL-1α—IL-1β—IL-2—IL-2受體—IL-3—IL-3受體(α-亞單位)—IL-3受體(β-亞單位)
—IL-4—IL-4受體—IL-5—IL-6—IL-6受體—干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)(IL-6和IFNγ或IFNβ可等效地激活I(lǐng)RF-1啟動(dòng)子)。
—IFNγ-反應(yīng)性啟動(dòng)子—IL-7—IL-8—IL-10—IL-11—IFNγ—GM-CSF—GM-CSF受體(α-鏈)—IL-13—LIF—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體—I和II型巨噬細(xì)胞清除劑受體—MAC-1(白細(xì)胞功能抗原)—LFA-1α(白細(xì)胞功能抗原)—p150，95(白細(xì)胞功能抗原)8.3.7.7.在滑膜細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列所述啟動(dòng)子和激活序列包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的啟動(dòng)子序列，例如下列MMP的啟動(dòng)子序列—MMP-1(間質(zhì)膠原酶)—MMP-3(溶基質(zhì)素/transin)另外還包括金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的啟動(dòng)子序列，例如—TIMP-1
—TIMP-2—TIMP-38.3.7.8.在白血病細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活序列所述啟動(dòng)子和激活序列包括例如下列蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子—c-myc—HSP-70—bcl-1/細(xì)胞周期蛋白D-1—bcl-2—IL-6—IL-10—TNFα，TNFβ—HOX-11—BCR-Abl—E2A-PBX-1—PML-RARA(前髓細(xì)胞白血病-視黃酸受體)—c-myc—c-myc蛋白結(jié)合并激活被稱(chēng)為MycE盒的核苷酸序列多體(5’-GGAAGCAGA CCACGTGGTCTGCTTCC-3’，SEQ ID NO6)。8.3.7.9在腫瘤細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活序列與在腫瘤細(xì)胞中形成或在腫瘤細(xì)胞中具有活性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的基因-調(diào)節(jié)核苷酸序列被設(shè)想為啟動(dòng)子或激活序列。
本發(fā)明中優(yōu)選的啟動(dòng)子或激活序列包括編碼特別地在癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)的基因的基因-調(diào)節(jié)序列或元件。因此，對(duì)于小-細(xì)胞支氣管癌優(yōu)選使用N-CAM蛋白的啟動(dòng)子，對(duì)于卵巢癌優(yōu)選使用“肝炎生長(zhǎng)因子”受體的啟動(dòng)子或L-絲束蛋白的啟動(dòng)子，對(duì)于胰腺癌優(yōu)選使用L-絲束蛋白的啟動(dòng)子或多形上皮粘蛋白(PEM)的啟動(dòng)子。8.4.效應(yīng)基因[組分d)]本發(fā)明中的效應(yīng)基因[組分d)]編碼可用于預(yù)防和/或治療疾病的活性化合物。效應(yīng)基因和啟動(dòng)子序列的選擇取決于疾病治療的性質(zhì)并要考慮需轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。
例如，對(duì)于下列疾病可選擇下列啟動(dòng)子序列和效應(yīng)基因的聯(lián)合(詳細(xì)描述見(jiàn)列入本文作參考文獻(xiàn)的專(zhuān)利申請(qǐng)EP 95930524.4，EP95931933.6，EP 95931204.2，EP 95931205.9，EP 97101507.8，D196.17851.7，D196.39103.2和D196.51443.6)。8.4.1.腫瘤的療法1.1.靶細(xì)胞—處于增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞或—與內(nèi)皮細(xì)胞相鄰的基質(zhì)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，或—腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞1.2.啟動(dòng)子—內(nèi)皮細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性，或—細(xì)胞-非特異性或肌肉細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性，或—腫瘤細(xì)胞-特異性(實(shí)體腫瘤，白血病)和細(xì)胞周期-特異性1.3.細(xì)胞增殖抑制劑的效應(yīng)基因，例如下列抑制劑的效應(yīng)基因—成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb＝p110)或相關(guān)的p107和p130蛋白通過(guò)磷酸化可使成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb/p110)和相關(guān)的p107和p130蛋白失活。優(yōu)選使用這些細(xì)胞周期抑制劑的基因，所述基因在被表達(dá)的蛋白質(zhì)的滅活位點(diǎn)表現(xiàn)出突變，而后者的功能未受損傷。已描述了p110中這些突變的例子。以類(lèi)似的方式突變p107蛋白或p130蛋白的DNA序列。
—p53蛋白或者通過(guò)與特殊的蛋白質(zhì)，如MDM2結(jié)合，或者通過(guò)利用去磷酸化的C-末端絲氨酸使p53寡聚化能使p53在細(xì)胞中被滅活。因此優(yōu)選使用通過(guò)絲氨酸392使C-末端被截短的p53蛋白的DNA序列。
—p21(WAF-1)—p16蛋白—其它c(diǎn)dk抑制劑—GADD45蛋白
—bak蛋白—結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)(見(jiàn)II.1.)1.4.凝固誘導(dǎo)因子和血管生成抑制劑的效應(yīng)基因，例如—纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)—PAI-2—PAI-3—制管張素—干擾素(IFNα，IFNβ或IFNγ)—血小板因子4—TIMP-1—TIMP-2—TIMP-3—白血病抑制因子(LIF)—組織因子(TF)及其凝結(jié)-活性片斷1.5.細(xì)胞靜止和細(xì)胞毒性蛋白的效應(yīng)基因，例如—穿孔素—粒酶—IL-2—IL-4—IL-12—干擾素，如IFNα，IFNβ或IFNγ—TNF，如TNFα或TNFβ—制癌蛋白M—鞘磷脂酶—爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物1.6.細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性抗體的效應(yīng)基因以及在抗原結(jié)合抗體片段和細(xì)胞靜止，細(xì)胞毒性或炎性蛋白或酶之間形成的融合蛋白的效應(yīng)基因—細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性抗體包括例如Burrows等人(Pharmac.Ther，64，155(1994))，Hughes等人(癌癥研究，49，6214(1989))和Maruyama等人(PNAS USA，87，5744(1990))所述的針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的那些抗體。所述抗體特別地包括針對(duì)VEGF受體的抗體。
—所述抗體還包括針對(duì)腫瘤細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性抗體。這種性質(zhì)的抗體已描述于例如Sedlacek等，Contrib.toOncol，32，Karger Verlag，Munich(1998)和Contrib.to Oncol，43，Karger Verlag，Munich(1992)。其它例子是針對(duì)下列物質(zhì)的抗體路易斯唾液酸；腫瘤上由T細(xì)胞識(shí)別的肽；癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)；神經(jīng)節(jié)苷脂，如GD3，GD2，GM2，9-0-乙酰基GD3，巖藻糖基GM1；血型抗原及其前體；多形上皮細(xì)胞粘蛋白上的抗原；熱激蛋白的抗原。
—所述抗體還包括針對(duì)白血病細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體。已描述了大量這種性質(zhì)的單克隆抗體在診斷和治療方法中的應(yīng)用(例見(jiàn)Kristensen，Danish Medical Bulletin，41，52(1994)；Schranz，TherapiaHungarica，38，3(1990)；Drexler等，Leuk.Res，10，279(1986)；Naeim，Dis.Markers，7，1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol，4，847(1992)；Drexler等，Blut57，327(1988)；Freedman等，Cancer Invest，9，69(1991))。根據(jù)白血病的類(lèi)型，針對(duì)下列膜抗原的單克隆抗體或其結(jié)合抗原的抗體片段適用于，例如作為配體細(xì)胞 膜抗原AML CD13CD15CD33CAMALSialosyl-LeB-CLLCD5CD1cCD23膜免疫球蛋白的獨(dú)特型和同種型T-CLLCD33M38IL-2受體T-細(xì)胞受體ALL CALLACD19非霍奇金淋巴瘤—根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(Winter等，自然，349，293(1991)；Hoogenbooms等，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol，36，19(1993)；Girol.Mol.Immunol，28，1379(1991)或Huston等，Intern.Rev.Immunol，10，195(1993))進(jìn)行鼠抗體的人源化以及Fab和rec.Fv片斷的基因的制備和最優(yōu)化。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)類(lèi)似地進(jìn)行rec.Fv片斷與細(xì)胞靜止蛋白，細(xì)胞毒性蛋白或炎性蛋白或酶的融合。1.7.由結(jié)合靶細(xì)胞的配體和細(xì)胞靜止及細(xì)胞毒性蛋白形成的融合蛋白的效應(yīng)基因。配體包括與內(nèi)皮細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有物質(zhì)。這些配體的例子是
—與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的細(xì)胞因子，如IL-1，或生長(zhǎng)因子，或它們的片斷或其組成序列，如PDGF，bFGF，VEGF和TGF。
—所述配體還包括與經(jīng)激活和/或處于增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的粘附分子。它們包括例如SLex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻連蛋白。
—所述配體還包括與腫瘤或白血病細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的物質(zhì)。這些配體的例子是與白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的受體結(jié)合的激素或生長(zhǎng)因子，或它們的片段或組成序列。有關(guān)這種性質(zhì)的生長(zhǎng)因子已有描述(例見(jiàn)Cross等，細(xì)胞，64，271(1991)，Aulitzky等，藥物，48，667(1994)，Moore，臨床癌癥研究，1，3(1995)，Van Kooten等，Leuk.Lymph，12，27(1993))。
—根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)與靶細(xì)胞結(jié)合的這些配體與細(xì)胞靜止，細(xì)胞毒性或炎性蛋白或酶的基因融合。1.8.炎癥誘導(dǎo)物的效應(yīng)基因，例如下列物質(zhì)的效應(yīng)基因—IL-1—IL-2—RANTES(MCP-2)—單核細(xì)胞趨化及活化因子(MCAF)—IL-8—巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1α，-β)—嗜中性白細(xì)胞活化蛋白-2(NAP-2)—IL-3—IL-5—人白血病抑制因子(LIF)IL-7—IL-11—IL-13—GM-CSF—G-CSF
—M-CSF—眼鏡蛇毒因子(CVF)或CVF的組成序列，它們?cè)诠δ苌舷喈?dāng)于人補(bǔ)體因子C3b，即能與補(bǔ)體因子B結(jié)合，被D因子裂解后構(gòu)成C3轉(zhuǎn)化酶(convertase)—人補(bǔ)體因子C3或其組成序列C3b—在功能和結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于CVF的人補(bǔ)體因子C3的裂解產(chǎn)物—激活補(bǔ)體或引發(fā)炎癥的細(xì)菌蛋白質(zhì)，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌孔蛋白，金黃色葡萄球菌聚集因子，modulin，尤其是得自革蘭氏陰性細(xì)菌的modulin，得自軍團(tuán)菌或B型流感嗜血菌或克雷伯氏菌的主要外膜蛋白，或得自G族鏈球菌的M分子。1.9.激活細(xì)胞靜止因子前體的酶的效應(yīng)基因，如將無(wú)活性的前體物質(zhì)(前藥)轉(zhuǎn)變或裂解成有活性的細(xì)胞靜止因子(藥物)的酶的效應(yīng)基因Deonarain等人(英國(guó)癌癥雜志，70，786(1994))，Mullen，Pharmac.Ther，63，199(1994))和Harris等人(Gene Ther，1，170(1994))已評(píng)述了具有這種性質(zhì)的物質(zhì)，以及總是與之有關(guān)的前藥和藥物。例如，可使用下列酶之一的DNA序列—單純皰疹病毒胸苷激酶—水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶—細(xì)菌硝基還原酶—細(xì)菌β-葡糖苷酸酶—得自黑麥的植物β-葡糖苷酸酶—人β-葡糖苷酸酶—人羧肽酶(CB)，如肥大細(xì)胞CB-A，胰腺CB-B或細(xì)菌羧肽酶—細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶—細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶—人過(guò)氧化氫酶或過(guò)氧化物酶—磷酸酶，尤其是人堿性磷酸酶，人前列腺酸性磷酸酶或5型酸性磷酸酶—氧化酶，尤其是人賴(lài)氨酰氧化酶或人酸性D-氨基氧化酶
—過(guò)氧化物酶，尤其是人谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，人嗜伊紅性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶或人甲狀腺過(guò)氧化物酶—半乳糖苷酶8.4.2.自身免疫病和炎癥的療法2.1.靶細(xì)胞—處于增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞或—巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞—滑膜細(xì)胞2.2.啟動(dòng)子—內(nèi)皮細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的或—巨噬細(xì)胞特異性和/或淋巴細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性的或—滑膜細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性的2.3.治療變態(tài)反應(yīng)的效應(yīng)基因，如下列物質(zhì)的效應(yīng)基因—IFNβ—IFNγ—IL-10—針對(duì)IL-4的抗體或抗體片斷—可溶性的IL-4受體—IL-12—TGFβ2.4.防止移植器官排斥的效應(yīng)基因，如下列物質(zhì)的效應(yīng)基因—IL-10—TGFβ—可溶性的IL-1受體—可溶性的IL-2受體—IL-1受體拮抗劑—可溶性的IL-6受體—免疫抑制抗體或其含有VH和VL的片斷或其通過(guò)接頭鍵合的VH和VL片斷。
免疫抑制抗體是例如，特異于T-細(xì)胞受體或其CD3復(fù)合物的抗體，或針對(duì)CD4或CD8，也針對(duì)IL-2受體，IL-1受體或IL-4受體的抗體，或針對(duì)粘附分子CD2，LFA-1，CD28或CD40的抗體。2.5.治療抗體介導(dǎo)的自身免疫病的效應(yīng)基因，如用于—TGFβ—IFNα—IFNβ—IFNγ—IL-12—可溶性的IL-4受體—可溶性的IL-6受體—免疫抑制抗體或其含有VH和VL的片斷2.6.治療細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的效應(yīng)基因，如用于—IL-6—IL-9—IL-10—IL-13—TNFα或TNFβ—免疫抑制抗體或其含有VH和VL的片斷2.7.細(xì)胞增殖抑制劑，細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性蛋白和激活細(xì)胞靜止因子的前體的酶的效應(yīng)基因編碼這種性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因的例子已列于“用于治療腫瘤的效應(yīng)基因”一節(jié)。
如該段落所述，本發(fā)明中可使用編碼融合蛋白的效應(yīng)基因，所述融合蛋白由抗體或這些抗體的Fab或rec.Fv片斷，或特異于靶細(xì)胞的其它配體與上述細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，受體，細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性蛋白和酶融合而成。2.8.治療關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)基因本發(fā)明中所選擇的效應(yīng)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能直接或間接抑制例如關(guān)節(jié)中的炎癥和/或促進(jìn)關(guān)節(jié)中胞外基質(zhì)(軟骨，結(jié)締組織)的重建。
例子有—IL-1受體拮抗劑(IL-1-RA)；IL-1-RA可抑制IL-1α以及IL-1β的結(jié)合—可溶性IL-1受體；可溶性IL-1受體可結(jié)合并滅活I(lǐng)L-1—IL-6IL-6可使滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中TIMP和超氧化物的分泌增加而IL-1和TNFα的分泌減少—可溶性的TNF受體可溶性的TNF受體可結(jié)合并滅活TNF—IL-4IL-4可抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌—IL-10IL-10可抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌并增加TIMP的分泌—胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)IGF-1可刺激胞外基質(zhì)的合成—TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2TGFβ可刺激胞外基質(zhì)的合成—超氧化物歧化酶—TIMP，尤其是TIMP-1，TIMP-2或TIMP-38.4.3.血細(xì)胞缺損形成的療法3.1.靶細(xì)胞—造血系統(tǒng)的處于增殖中的，不成熟細(xì)胞，或—與造血細(xì)胞相鄰的基質(zhì)細(xì)胞3.2.啟動(dòng)子—造血細(xì)胞特異性和/或細(xì)胞周期特異性—細(xì)胞非特異性和細(xì)胞周期特異性3.3.治療貧血的效應(yīng)基因，例如
—促紅細(xì)胞生成素3.4.治療白細(xì)胞減少癥的效應(yīng)基因，例如—G-CSF—GM-CSF—M-CSF3.5.治療血小板減少癥的效應(yīng)基因，例如—IL-3—白血病抑制因子(LIF)—IL-11—血小板生成素8.4.4神經(jīng)系統(tǒng)損害的療法4.1.靶細(xì)胞—膠質(zhì)細(xì)胞或—處于增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞4.2.啟動(dòng)子—膠質(zhì)細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的或—內(nèi)皮細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的或—非特異性和細(xì)胞周期特異性的4.3.神經(jīng)元生長(zhǎng)因子的效應(yīng)基因，例如—FGF—神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)—神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)—神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT-4)—睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)4.4.酶的效應(yīng)基因，例如—酪氨酸羥化酶—多巴脫羧酶4.5.抑制或中和TNFα神經(jīng)毒效應(yīng)的細(xì)胞因子及其抑制劑的效應(yīng)基因，例如—TGFβ—可溶性TNF受體TNF受體中和TNFα—IL-10IL-10抑制IFNγ，TNFα，IL-2和IL-4的形成—可溶性的IL-1受體—IL-1受體I—IL-1受體II可溶性IL-1受體中和IL-1的活性—IL-1受體拮抗劑—可溶性的IL-6受體8.4.5.血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)障礙的療法5.1.靶細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞或—處于增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞或—內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞附近的體細(xì)胞，或—巨噬細(xì)胞5.2.啟動(dòng)子—細(xì)胞非特異性和細(xì)胞周期特異性的或—內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的5.3.抑制凝固或促進(jìn)纖溶的結(jié)構(gòu)基因，例如—組織纖溶酶原激活物(tPA)—尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)—tPA和uPA的雜合體—C蛋白—水蛭素—絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpine)，如C-1S抑制劑，α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶III
—組織因子途徑抑制劑(TFPI)5.4.促進(jìn)凝固的效應(yīng)基因，例如—F VIII—F IX—von Willebrand因子—F XIII—PAI-1—PAI-2—組織因子及其片斷5.5.血管生成因子的效應(yīng)基因，例如—VEGF—FGF5.6.降低血壓的效應(yīng)基因，例如—激肽釋放酶—內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶5.7.可抑制損害內(nèi)皮細(xì)胞層之后平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)基因，例如—抗增殖的，細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性蛋白或—上文所述的(在腫瘤一節(jié))將細(xì)胞靜止因子的前體裂解成細(xì)胞靜止因子的酶，或—由這些活性化合物之一和配體，例如特異于肌肉細(xì)胞的抗體或抗體片斷組成的融合蛋白5.8.其它血漿蛋白的效應(yīng)基因，例如—白蛋白—C1滅活劑—血清膽堿酯酶—運(yùn)鐵蛋白—1-抗胰蛋白酶8.4.6.接種6.1.靶細(xì)胞
—肌肉細(xì)胞或—巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞6.2.啟動(dòng)子—非特異性和細(xì)胞周期特異性的或—靶細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的6.3.預(yù)防傳染病的效應(yīng)基因常規(guī)生產(chǎn)有效疫苗的可能性是有限的。
結(jié)果開(kāi)發(fā)了DNA疫苗技術(shù)。然而，這些DNA疫苗的有效性值得懷疑(Fynan等，Int.J.Immunopharm，17，79(1995)；Donnelly等，免疫學(xué)，2，20(1994))。
預(yù)期本發(fā)明DNA疫苗的效力較高。
被選定的活性物質(zhì)是由傳染性病原體形成的蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)通過(guò)引發(fā)免疫反應(yīng)，即通過(guò)抗體結(jié)合和/或通過(guò)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致病原體的中和和/或分解。具有這種性質(zhì)的所謂的中和抗原已被用作接種抗原(見(jiàn)Eliis，Adv.Exp.Med.Biol，327，263(1992))。
本發(fā)明中優(yōu)選編碼得自下列病原體的中和抗原的DNA—甲型流感病毒—HIV—狂犬病病毒—HSV(單純皰疹病毒)—RSV(呼吸道合胞病毒)—副流感病毒—輪狀病毒—VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)—CMV(巨細(xì)胞病毒)—麻疹病毒—HPV(人乳頭瘤病毒)—HBV(乙型肝炎病毒)
—HCV(丙型肝炎病毒)—HDV(丁型肝炎病毒)—HEV(戊型肝炎病毒)—HAV(甲型肝炎病毒)—霍亂弧菌抗原—布氏疏螺旋體—幽門(mén)螺桿菌—瘧疾抗原—然而，本發(fā)明中這種性質(zhì)的活性物質(zhì)也包括抗獨(dú)特型抗體或其與抗原結(jié)合的片斷的DNA，所述片斷中結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)(互補(bǔ)決定區(qū))構(gòu)成傳染性病原體的中和抗原的多拷貝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖類(lèi)結(jié)構(gòu)。
對(duì)于細(xì)菌傳染性病原體而言，這種性質(zhì)的抗獨(dú)特型抗體可特別地取代糖類(lèi)抗原。
Hawkins等人(J.Immunother，14，273(1993))以及Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol，15，227(1993))評(píng)述了這種性質(zhì)的抗獨(dú)特型抗體及其裂解產(chǎn)物。6.4.“腫瘤疫苗”的效應(yīng)基因—它們包括腫瘤細(xì)胞上的抗原。有關(guān)這種性質(zhì)的抗原的評(píng)述例如參見(jiàn)Sedlacek等，Contrib.to Oncol，32，Karger Verlag，Munich(1998)和Contrib.to Oncol，43，Karger Verlag，Munich(1992)。
其它例子由下列蛋白質(zhì)抗原的基因或?qū)?yīng)于下列非蛋白質(zhì)抗原的抗獨(dú)特型抗體的可變區(qū)(VL，VH)的基因組成—神經(jīng)節(jié)苷脂—路易斯唾液酸—腫瘤上由T細(xì)胞識(shí)別的肽—癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)—血型抗原及其前體—腫瘤相關(guān)粘蛋白上的抗原—熱激蛋白上的抗原8.4.7.慢性傳染病的療法7.1.靶細(xì)胞—肝臟細(xì)胞—淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞—上皮細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞7.2.啟動(dòng)子—病毒特異性或細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性的7.3.效應(yīng)基因，例如用于—表現(xiàn)出細(xì)胞靜止，細(xì)胞程序死亡或細(xì)胞毒性效應(yīng)的蛋白質(zhì)—將抗病毒或細(xì)胞毒性物質(zhì)的前體裂解成活性物質(zhì)的酶7.4.抗病毒蛋白質(zhì)的效應(yīng)基因—具有抗病毒效應(yīng)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。它們包括例如IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFβ，TNFα，IL-1或TGFβ—特異性地滅活各個(gè)病毒的抗體，或其含有VH和VL的片斷，或其利用接頭鍵合的VH和VL片斷，有關(guān)它們的制備已有描述。
針對(duì)病毒抗原的抗體的例子是抗-HBV，抗-HCV，抗-HSV，抗-HPV，抗-HIV，抗-EBV，抗-HTLV，抗-柯薩奇病毒，抗-漢坦病毒—Rev-結(jié)合蛋白。在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)過(guò)程中，這些蛋白質(zhì)與Rev RNA結(jié)合并抑制依賴(lài)于Rev的轉(zhuǎn)錄后步驟。Rev-結(jié)合蛋白的例子是RBP9-27，
RBP1-8U，RBP1-8D，RBP1-8假基因—消化細(xì)胞周期控制蛋白基因的mRNA或病毒mRNA的核酶。有關(guān)催化HIV的核酶的評(píng)述例見(jiàn)Christoffersen等，藥物化學(xué)雜志，38，2033(1995)。7.5.抗細(xì)菌的蛋白質(zhì)的效應(yīng)基因抗細(xì)菌的蛋白質(zhì)包括例如中和細(xì)菌毒素或調(diào)理細(xì)菌的抗體。這些抗體包括例如抗下列細(xì)菌的抗體腦膜炎球菌C或B，大腸桿菌，疏螺旋體，假單胞菌，幽門(mén)螺桿菌，金黃色葡萄球菌8.5.相同或不同效應(yīng)基因的聯(lián)合本發(fā)明還涉及可自我增強(qiáng)的，并在適當(dāng)時(shí)可被藥理控制的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有兩個(gè)相同或兩個(gè)不同的效應(yīng)基因(組分d)和d’))的DNA序列的聯(lián)合。為了確保這兩個(gè)DNA序列的表達(dá)，在兩個(gè)效應(yīng)基因之間插入另一個(gè)啟動(dòng)子序列，或優(yōu)選插入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的cDNA以作為調(diào)控元件。
IRES使通過(guò)IRES互相連接的兩個(gè)DNA序列的表達(dá)成為可能。
有關(guān)這種性質(zhì)的IRES的描述例見(jiàn)Montford和Smith，(TIG11，179(1995)；Kaufman等，核酸研究，19，4485(1991)；Morgan等，核酸研究，20，1293(1992)；Dirks等，基因，128，247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然，334，320(1988)和Sugitomo等，BioTechn，12，694(1994))。
例如，可使用脊髓灰質(zhì)炎病毒的IRES序列的cDNA(5’UTR的第≤140至≥630位)。
本發(fā)明中優(yōu)選利用其它的啟動(dòng)子序列或IRES序列連接表現(xiàn)出加性效應(yīng)的效應(yīng)基因。
例如，本發(fā)明中優(yōu)選用于下列的效應(yīng)基因的組合8.5.1.腫瘤的療法—相同或不同的，細(xì)胞靜止，細(xì)胞程序死亡，細(xì)胞毒性或炎性蛋白或—相同或不同的裂解細(xì)胞靜止因子的前體的酶8.5.2.自身免疫病的療法—具有抑制細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)的不同細(xì)胞因子或受體或—不同或相同的TIMP8.5.3.血細(xì)胞缺損形成的療法—不同的，梯級(jí)順序的細(xì)胞因子，如IL-1，IL-3，IL-6或GM-CSF和促紅細(xì)胞生成素，G-CSF或血小板生成素8.5.4.神經(jīng)細(xì)胞損害的療法—神經(jīng)元生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子或細(xì)胞因子的抑制劑8.5.5.血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)障礙的療法—抗凝劑和纖溶劑(如tPA或uPA)或—細(xì)胞靜止，細(xì)胞程序死亡或細(xì)胞毒性蛋白和抗凝劑或纖溶劑—幾種不同的，協(xié)同作用的血液凝固因子，如F VIII和vWF或F VIII和F IX8.5.6.接種—抗原和免疫刺激細(xì)胞因子，如IL-1α，IL-1β，IL-2，GM-CSF，IL-3或IL-4受體—一種傳染性病原體或不同傳染性病原體的不同抗原，或—一種腫瘤類(lèi)型或不同腫瘤類(lèi)型的不同抗原8.5.7.病毒傳染性疾病的療法—抗病毒蛋白和細(xì)胞靜止，細(xì)胞程序死亡或細(xì)胞毒性蛋白—針對(duì)一種病毒或幾種病毒的不同表面抗原的抗體8.5.8.細(xì)菌傳染性疾病的療法—針對(duì)生物體不同表面抗原和/或毒素的抗體8.6.插入信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域8.6.1.增強(qiáng)翻譯為了增強(qiáng)翻譯，可在啟動(dòng)子序列的3’末端插入核苷酸序列GCCACC或GCCGCC，并在信號(hào)或跨膜序列的起始信號(hào)(ATG)的5’末端直接插入所述核苷酸序列(Kozak，細(xì)胞生物學(xué)雜志，108，299(1989))。8.6.2.促進(jìn)分泌為了促進(jìn)效應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物的分泌，可用能改善胞外分泌的異源信號(hào)序列取代效應(yīng)基因DNA序列中可能會(huì)含的同源信號(hào)序列。
因此，可插入例如免疫球蛋白的信號(hào)序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等，自然，332，323(1988))或CEA的信號(hào)序列(DNA位置≤33至≥134；Schrewe等，分子細(xì)胞生物學(xué)，10，2738(1990)；Berling等，癌癥研究，50，6534(1990))或人呼吸道合胞病毒糖蛋白的信號(hào)序列(氨基酸的cDNA≤38至≥50或48至65；Lichtenstein等，普通病毒學(xué)雜志，77，109(1996))。8.6.3.錨定活性化合物3.1)為了在形成活性化合物的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中錨定活性化合物，可替代性地，或另外在信號(hào)序列中插入跨膜結(jié)構(gòu)域的序列。
因此，可在啟動(dòng)子序列和效應(yīng)基因序列之間插入例如人巨噬細(xì)胞集落刺激因子的跨膜序列(DNA位置≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt，83，15(1988))或人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的信號(hào)和跨膜區(qū)域(氨基酸1至63或其組成序列，氨基酸38至63；Vijaya等，分子細(xì)胞生物學(xué)，8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒學(xué)雜志，77，109(1996))的DNA序列，或流感病毒神經(jīng)氨酸苷酶的信號(hào)和跨膜區(qū)域(氨基酸7至35或其組成序列氨基酸7至27；Brown等，病毒學(xué)雜志，62，3824(1988))的DNA序列。3.2)然而，為了在形成活性化合物的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中錨定活性化合物，也可插入糖磷脂錨的核苷酸序列。
在效應(yīng)基因核苷酸序列的3’末端插入糖磷脂錨，除了插入糖磷脂錨以外，還可插入信號(hào)序列。
已描述了例如CEA，N-CAM和其它膜蛋白，如Thy-1的糖磷脂錨(例見(jiàn)Ferguson等，Ann.Rev.Biochem，57，285(1988))。3.3)按本發(fā)明，還可以使用配體-活性化合物融合蛋白的DNA序列將活性化合物錨定于細(xì)胞膜上。所述融合蛋白的配體的特異性針對(duì)的是選定靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上的膜結(jié)構(gòu)。
與細(xì)胞表面結(jié)合的配體包括例如針對(duì)下列細(xì)胞的表面上的結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片斷—內(nèi)皮細(xì)胞。它們特別地包括針對(duì)VEGF受體的抗體和針對(duì)細(xì)胞分裂素受體的抗體—或肌肉細(xì)胞，如針對(duì)肌動(dòng)蛋白的抗體或針對(duì)血管緊張肽II受體的抗體或針對(duì)生長(zhǎng)因子受體，如針對(duì)EGF受體或針對(duì)PDGF受體或針對(duì)FGF受體的抗體，或針對(duì)內(nèi)皮肽A受體的抗體—配體也包括針對(duì)腫瘤細(xì)胞膜上腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的抗體或其片斷。這種性質(zhì)的抗體已有描述。
優(yōu)選以人源化的形式使用鼠單克隆抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)制備Fab和rec.Fv片斷及其融合產(chǎn)物。
配體還包括能與所選定的各個(gè)細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有活性化合物，如細(xì)胞因子或粘附因子，生長(zhǎng)因子或其片斷或其組成序列，或介體或肽激素。例子有—內(nèi)皮細(xì)胞的配體，如IL-1，PDGF，bFGF，VEGF，TGGβ或細(xì)胞分裂素以及細(xì)胞分裂素的衍生物或類(lèi)似物—還包括粘附分子。已描述了內(nèi)皮細(xì)胞這種性質(zhì)的粘附分子，如SLex，LFA-1，MAC-1，LeCAM-1，VLA-4或玻連蛋白，或玻連蛋白的衍生物或類(lèi)似物(例見(jiàn)Augustin-Voss等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，119，483(1992)；Pauli等，Cancer Metast.Rev，9，175(1990)；Honn等，Cancer Metast.Rev，11，353(1992)；Varner等，CellAdh.Commun，3，367(1995))。表1
表2柱上樣品與下列物質(zhì)涂覆的親和層析柱的結(jié)合谷胱甘肽 谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶-p163 轉(zhuǎn)移酶融合蛋白重組的+++ +(35S-標(biāo)記的)p27含有p27的細(xì)胞提取物 (+) -(RAT1-Myc ER)含有p27的細(xì)胞提取物 +++ -RAT1-Myc ER)，(95C加熱2分鐘)cdk-2(細(xì)胞提取物) - -cdk-4(細(xì)胞提取物) - -表3[SEQ ID NO.9]TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG 1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA 1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG 1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC 1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG 1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT 1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG 1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG 1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG 1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA1958表4p1631 MAKRVAEKELTDRNWDEEDEVEEM 24 [SEQ ID NO.10]MAKRVA+ +++D + +++YNup2 1 MAKRVADAQIQRETYDSNESDDDV 24 [SEQ ID NO.11]P163 137 NQPPSSGPASSTACPGNAYHKQLAGLNCSN+ +G A P+ +L LNYNup2 71 NRADGTGEAQVDNSPTTESNSRLKALNLQVRDWIVKHVNTNPLCDLTPIFKDYERYLATI 196 [SEQ ID NO.12]++ + V PL DL P+F YE Y+ IFKAKVDDLVLGKPLADLRPLFTRYELYIKNI 130 [SEQ ID NO.13]P163 215 ATAGMEPPSLFGSTKLQQESPFSFHGNKAEDTA + P ST + PF G++YNup2 535 ANSSTSPAPSIPSTGFKFSLPFEQKGSQTTTNSEKVEFTAEKKSDAAQGAT 265 [SEQ ID NO.14]K E T E + +Q ATDSKEESTTEATGNESQDAT 585 [SEQ ID NO.15]P163 239 HGNKAEDTSEKVEFTAEKKSDAAQGATSASFSFG 272 [SEQ ID NO.16]+G++++D+ ++A+ + AT +FSFGYNup2 444 NGSESKDSDKPSLPSAVDGENDKKEATKPAFSFG 477 [SEQ ID NO.17]P163 399 LGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNPPLDEKQPT 438 [SEQ ID NO.18]+GN+LLN + + N ++ PD K TYNup2 655 MGNVLLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAADGKLVT 694 [SEQ ID NO.19]表5RBP1 (小鼠) DSHADHDTST---ENADESTTHP--QFEPIVSVPE----RBP1 (人)5DSHADHDTST---FNADESNHDP--QFEPIVSVPE----NUP2p (酵母) 560 SQTTTNDSKE---ESTTEATGNESQDATKVDATPEESKPp163 (小鼠) 307 QSKAASSLFSAKASESPAGGGSSECRDGEEEENDEPPKVRBP1 (小鼠) QEIKTLEEDEEELTKMRAKLFRFASENDLPEWKEPRHGDVKLLKHK-RBP1 (人)QEIKTLEEDEEELTKMRAKLFRFASENDLPEWKERGTGDVKLLKHK-NUP2p (酵母) INLQNGEEDEVALTSQKAKLMTFNA--ETKSYDSRGVGEMKLLKKKDp163 (小鼠) VVTEVK--EEDAFYSKKCKLFYKKDNEF----KEKGVGTLHL-KPT-RBP1 (小鼠) EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDRBP1 (人)EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDNUP2p (酵母) DSPKVRLLCRSDGMGNV-LLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAAp163 (小鼠) ATQKTQLLVRADTNLGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNP--RBP1 (小鼠) FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI [SEQ ID NO.20]RBP1 (人)FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI [SEQ ID NO.21]NUP2p (酵母) DG-------KLVTYIVFKQKLEGRSFTKAIEDAKKEM [SEQ ID NO.22]p163 (小鼠) PLDEKQPTLPATMLIRVKTSEDADELHKILLEKKDAA [SEQ ID NO.23]表6p163(小鼠)[SEQ ID NO.24]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Gln Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser305 310 315 320Glu Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu325 330 335Glu Glu Asn Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu340 345 350Glu Asp Ala Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp355 360 365Asn Glu Phe Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr370 375 380Ala Thr Gln Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly385 390 395 400Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg405 410 415Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu420 425 430Asp Glu Lys Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys435 440 445Thr Ser Glu Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys450 455 460Asp Ala465NUP2(酵母) [SEQ ID NO.25]Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp1 5 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val Thr Pro Ser Thr Lys Val Ala Ser20 25 30Ser Ala Val Met Asn Arg Arg Lys Ile Ala Met Pro Lys Arg Arg Met35 40 45Ala Phe Lys Pro Phe Gly Ser Ala Lys Ser Asp Glu Thr Lys Gln Ala50 55 60Ser Ser Phe Ser Phe Leu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln65 70 75 80Val Asp Asn Ser Pro Thr Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu85 90 95Asn Leu Gln Phe Lys Ala Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro100 105 110Leu Ala Asp Leu Arg Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys115 120 125Asn Ile Leu Glu Ala Pro Val Lys Phe Ile Glu Asn Pro Thr Gln Thr130 135 140Lys Gly Asn Asp Ala Lys Pro Ala Lys Val Glu Asp Val Gln Lys Ser145 150 155 160Ser Asp Ser Ser Ser Glu Asp Glu Val Lys Val Glu Gly Pro Lys Phe165 170 175Thr Ile Asp Ala Lys Pro Pro Ile Ser Asp Ser Val Phe Ser Phe Gly180 185 190Pro Lys Lys Glu Asn Arg Lys Lys Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asn Asp195 200 205Ile Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Ser Gly Thr Val Ser Ser210 215 220Asp Val Phe Lys Leu Asn Pro Ser Thr Asp Lys Asn Glu Lys Lys Thr225 230 235 240Glu Thr Asn Ala Lys Pro Phe Ser Phe Ser Ser Ala Thr Ser Thr Thr245 250 255Glu Gln Thr Lys Ser Lys Asn Pro Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Lys260 265 270Thr Asn Val Asp Asn Asn Ser Lys Ala Glu Ala Ser Phe Thr Phe Gly275 280 285Thr Lys His Ala Ala Asp Ser Gln Asn Asn Lys Pro Ser Phe Val Phe290 295 300Gly Gln Ala Ala Ala Lys Pro Ser Leu Glu Lys Ser Ser Phe Thr Phe305 310 315 320Gly Ser Thr Thr Ile Glu Lys Lys Asn Asp Glu Asn Ser Thr Ser Asn325 330 335Ser Lys Pro Glu Lys Ser Ser Asp Ser Asn Asp Ser Asn Pro Ser Phe340 345 350Ser Phe Ser Ile Pro Ser Lys Asn Thr Pro Asp Ala Ser Lys Pro Ser355 360 365Phe Asn Phe Gly Val Pro Asn Ser Ser Lys Asn Glu Thr Ser Lys Pro370 375 380Val Phe Ser Phe Gly Ala Ala Thr Pro Ser Ala Lys Glu Ala Ser Gln385 390 395 400Glu Asp Asp Asn Asn Asn Val Glu Lys Pro Ser Ser Lys Pro Ala Phe405 410 415Asn Phe Ile Ser Asn Ala Gly Thr Glu Lys Glu Lys Glu Ser Lys Lys420 425 430Asp Ser Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gly Ile Ser Asn Gly Ser Glu Ser435 440 445Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala Val Asp Gly Glu Asn450 455 460Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Phe Gly Ile Asn Thr Asn465 470 475 480Thr Thr Lys Thr Ala Asp Thr Lys Ala Pro Thr Phe Thr Phe Gly Ser485 490 495Ser Ala Leu Ala Asp Asn Lys Glu Asp Val Lys Lys Pro Phe Ser Phe500 505 510Gly Thr Ser Gln Pro Asn Asn Thr Pro Ser Phe Ser Phe Gly Lys Thr515 520 525Thr Ala Asn Leu Pro Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile530 535 540Pro Ser Thr Gly Phe Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser545 550 555 560Gln Thr Thr Thr Asn Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr565 570 575Gly Asn Glu Ser Gln Asp Ala Thr Lys Val Asp Ala Thr Pro Glu Glu580 585 590Ser Lys Pro Ile Asn Leu Gln Asn Gly Glu Glu Asp Glu Val Ala Leu595 600 605Phe Ser Lys Ala Lys Leu Met Thr Phe Asn Ala Glu Thr Lys Ser Tyr610 615 620Asp Ser Arg Gly Val Gly Glu Met Lys Leu Leu Lys Lys Lys Asp Asp625 630 635 640Pro Ser Lys Val Arg Leu Leu Cys Arg Ser Asp Gly Met Gly Asn Val645 650 655Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr Glu Pro Leu Ala660 665 670Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val Ala Ala Asp Gly675 680 685Lys Thr Tyr Ile Val Lys Phe Lys Gln Lys Glu Glu Gly Arg Ser Phe690 695 700Thr Lys Ala Ile Glu Asp Ala Lys Lys Glu Lys705 710 715表7檢測(cè)HeLa細(xì)胞中p27和p163之間的結(jié)合被下列物質(zhì)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的總蛋白的沉淀與下列物質(zhì)的沉淀 Cmv-p27CMV-p27-+CMV-NapCMV-Nap2-Nap2-特異性抗體 - + + -p27-特異性抗體 + ++ - -表8 [SEQ ID NO.26]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp115 120 125Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly Lys Lys Ile130 135 140Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe145 150 155 160Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp Ala Ala Gln165 170 175Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser Glu Ser Pro180 185 190Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Asn195 200 205Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu Glu Asp Ala210 215 220Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp Asn Glu Phe225 230 235 240Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr Ala Thr Gln245 250 255Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly Asn Ile Leu260 265 270Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg Thr Gly Lys275 280 285Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu Asp Glu Lys290 295 300Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys Thr Ser Glu305 310 315 320Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys Asp Ala325 330 335表9 [SEQ ID NO.27]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120 125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Ile165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Glu Lys Glu Leu305 310表10[SEQ ID NO.28]Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser1 5 10 15Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly20 25 30Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp35 40 45Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro50 55 60Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu65 70 75 80Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr85 90 95Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln100 105 110Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu115 120 125Lys Val Glu Phe130
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道—(C)城市法蘭克福(D)州—(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話(huà)069-305-3005(H)傳真069-35-7175(I)電報(bào)—(ii)發(fā)明題目用于基因療法的核酸構(gòu)建體(iii)序列數(shù)57(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…17(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGACAACTG TTGACCG 17(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…20(xi)序列描述SEQ ID NO2TACTGTATGT ACATACAGTA 20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子
(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO3GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…42(xi)序列描述SEQ ID NO4TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…12(xi)序列描述SEQ ID NO5TAATGATGGG CG 12(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…26(xi)序列描述SEQ ID NO6GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置 1…17(xi)序列描述SEQ ID NO7AGCAGGTGTT GGGAGGC17(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…41(xi)序列描述SEQ ID NO8GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1958個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…1958(xi)序列描述SEQ ID NO9TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA 120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT 180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG 240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG 300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG 360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA 420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT 480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT 540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA 600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT 660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT 720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT 780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC 840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG 900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC 960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG 1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC 1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA 1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA 1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA 1958(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met20(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp1 5 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val20(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…60(xi)序列描述SEQ ID NO12Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly1 5 10 15Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp20 25 30Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro35 40 45Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile50 55 60(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…60(xi)序列描述SEQ ID NO13Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln Val Asp Asn Ser Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu Asn Leu Gln Phe Lys Ala20 25 30Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro Leu Ala Asp Leu Arg Pro35 40 45Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys Asn Ile50 55 60(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…51(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr20 25 30Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln35 40 45Gly Ala Thr50(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…51(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile Pro Ser Thr Gly Phe1 5 10 15Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser Gln Thr Thr Thr Asn20 25 30Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gln35 40 45Asp Ala Thr50(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置 1…34(xi)序列描述SEQ ID NO16His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala1 5 10 15Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…34(xi)序列描述SEQ ID NO17Asn Gly Ser Glu Ser Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala1 5 10 15Val Asp Gly Glu Asn Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…40(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys1 5 10 15Thr Arg Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro20 25 30Pro Leu Asp Glu Lys Gln Pro Thr35 40(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…40(xi)序列描述SEQ ID NO19Met Gly Asn Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr1 5 10 15Glu Pro Leu Ala Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val20 25 30Ala Ala Asp Gly Lys Leu Val Thr35 40(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度157個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…157(xi)序列描述SEQ ID NO20Asp Ser His Ala Asp His Asp Thr Ser Thr Glu Asn Ala Asp Glu Ser1 5 10 15Thr Thr His Pro Gln Phe Glu Pro Ile Val Ser Val Pro Glu Gln Glu20 25 30Ile Lys Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Leu Phe Lys Met Arg Ala35 40 45Lys Leu Phe Arg Phe Ala Ser Glu Asn Asp Leu Pro Glu Trp Lys Glu50 55 60Pro Arg His Gly Asp Val Lys Leu Leu Lys His Lys Glu Lys Gly Thr65 70 75 80Ile Arg Leu Leu Met Arg Arg Asp Lys Thr Leu Lys Ile Cys Ala Asn85 90 95His Tyr Ile Thr Pro Met Met Glu Leu Lys Pro Asn Ala Gly Ser Asp100 105 110Arg Ala Trp Val Trp Asn Thr His Thr Asp Phe Ala Asp Glu Cys Pro115 120 125Lys Pro Glu Leu Leu Ala Ile Arg Phe Leu Asn Ala Glu Asn Ala Gln130 135 140Lys Phe Lys Thr Lys Phe Glu Glu Cys Arg Lys Glu Ile145 150 155(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度157個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…157(xi)序列描述SEQ ID NO21Asp Ser His Ala Asp His Asp Thr Ser Thr Glu Asn Ala Asp Glu Ser1 5 10 15Asn His Asp Pro Gln Phe Glu Pro Ile Val Ser Val Pro Glu Gln Glu20 25 30Ile Lys Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Leu Phe Lys Met Arg Ala35 40 45Lys Leu Phe Arg Phe Ala Ser Glu Asn Asp Leu Pro Glu Trp Lys Glu50 55 60Arg Gly Thr Gly Asp Val Lys Leu Leu Lys His Lys Glu Lys Gly Thr65 70 75 80Ile Arg Leu Leu Met Arg Arg Asp Lys Thr Leu Lys Ile Cys Ala Asn85 90 95His Tyr Ile Thr Pro Met Met Glu Leu Lys Pro Asn Ala Gly Ser Asp100 105 110Arg Ala Trp Val Trp Asn Thr His Thr Asp Phe Ala Asp Glu Cys Pro115 120 125Lys Pro Glu Leu Leu Ala Ile 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NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度466個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…466(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120 125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu 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NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度335個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…335(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp115 120 125Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly Lys Lys Ile130 135 140Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe145 150 155 160Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp Ala Ala Gln165 170 175Ser Lys Ala Ala Ser Ser 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(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO30CAAATCCAGA AAAGCGTCCT C 21(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO31TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG24(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO32AGAAAAGCGT CCTCCTCCAG A 21(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…24(xi)序列描述SEQ ID NO33TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG24(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO34AGCGCCACTA ACCAAATCCA GA 22(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO35AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO36GAAAAGCGTC CTCCTCCAGA AG 22(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO37GAAAGCAAAG CGCAGAAATG TT 22(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO38CTCCAGCGCC ACTACCAAAT C 21(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…20(xi)序列描述SEQ ID NO39CCCGCACGGA GCAGTTCAAG 20(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO40GCAGCGGCAG ATCCCAAGGT AG 22(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…17(xi)序列描述SEQ ID NO41GGCATCGTTT TTCTCCA17(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(xi)序列描述SEQ ID NO42CGTTCTTATC GTCTCTGTGT TC 22(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…19(xi)序列描述SEQ ID NO43GCATCCTTTT TCTCCAGTA19(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…18(xi)序列描述SEQ ID NO44TGTTCCAAAT CCACCAAT 18(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…19(xi)序列描述SEQ ID NO45GTCTGCATCC TCGCTGGTT 19(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO46CGTTCTTATC GTCTGTGTTC C 21(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…18(xi)序列描述SEQ ID NO47TTTTACCCGA ATCAACAT18(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(xi)序列描述SEQ ID NO48GTACGGGAAC AGGGAAGAAT A 21(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度212個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…212(xi)序列描述SEQ ID NO49Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe Met195 200 205Ile Phe Ile Lys210(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度183個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1…183(xi)序列描述SEQ ID NO50Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Cys Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155 160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO51Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Pro Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln His Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Arg50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Pro Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO52Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Gly Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(xi)序列描述SEQ ID NO53Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln Ala1 5 10 15Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val Asn20 25 30His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met Glu35 40 45Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys Pro50 55 60Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu Pro65 70 75 80Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys Val85 90 95Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val Pro100 105 110Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp Gln115 120 125Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys Pro130 135 140Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile Lys145 150 155 160Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn Ala165 170 175Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln Thr180 185 190Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser195(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度220個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…220(xi)序列描述SEQ ID NO54Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala1 5 10 15Arg Gln Ala Asp His Pro Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro20 25 30Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp35 40 45Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His50 55 60Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser65 70 75 80Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys85 90 95Lys Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala100 105 110Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val115 120 125Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln130 135 140Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln145 150 155 160Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro165 170 175Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg180 185 190Gln Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe195 200 205Met Ile Phe Ile Ile Lys Val Ile Lys Lys Ile Ser210 215 220(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度183個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1…183(xi)序列描述SEQ ID NO55Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Gln Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155 160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度138個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…138(xi)序列描述SEQ ID NO56Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Ser Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys130 135(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度197個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…197(xi)序列描述SEQ ID NO57Met Ser Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met1 5 10 15Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu20 25 30Phe Gly Pro Val Asn His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His35 40 45Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe50 55 60Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu65 70 75 80Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys85 90 95Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser100 105 110Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg115 120 125His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu130 135 140Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Gln Asn Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp165 170 175Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly180 185 190Leu Arg Arg Gln Thr19權(quán)利要求
1.含有下列組分的核酸構(gòu)建體組分a)轉(zhuǎn)錄組分b)的激活序列組分b)轉(zhuǎn)錄因子的基因，所述基因含有b1)激活域b2)與抑制劑結(jié)合的序列b3)DNA-結(jié)合域組分c)通過(guò)與組分b)的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合而被激活的激活序列，所述激活序列誘導(dǎo)組分d)的轉(zhuǎn)錄組分d)效應(yīng)基因。
2.權(quán)利要求1所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)與組分c)相同。
3.權(quán)利要求1或2所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)是可被非特異性，細(xì)胞特異性，代謝特異性，病毒特異性和/或細(xì)胞周期特異性地激活的啟動(dòng)子序列。
4.權(quán)利要求3所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)選自—在下列細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子皮膚，肺，胃腸道，腎臟和尿道的內(nèi)皮細(xì)胞，腹膜細(xì)胞，胸膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞，造血細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，白血病細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞—病毒如HBV，HCV，HSV，HPV，EBV，HTLV，CMV或HIV的啟動(dòng)子序列—由缺氧激活的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列或cdc25C，細(xì)胞周期蛋白A，cdc2，E2F-1，B-myb，DHFR基因的細(xì)胞周期特異性激活序列，和—結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的序列，所述序列似乎或確實(shí)以依賴(lài)于細(xì)胞增殖的方式被激活，所述序列如Myc E盒的單體或多體。
5.權(quán)利要求1至4中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中激活域[組分b)的組分b1)]選自包括Oct-2，Sp1，NFY，ITF-2，VP-16，c-Myc和CTF的轉(zhuǎn)錄因子的激活域。
6.權(quán)利要求1至5中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)合抑制劑的序列(b2)選自可抑制p27蛋白，中和p27對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1至5中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)合抑制劑的序列(b2)含有表6所示的p163氨基酸序列[SEQ ID NO24]或其部分。
8.權(quán)利要求7所要求的核酸構(gòu)建體，其中根據(jù)表6的編號(hào)，p163氨基酸序列的部分選自具有下列位置的氨基酸序列的肽1至24[SEQ IDNO10]，137至196[SEQ ID NO12]，215至265[SEQ ID NO14]，239至272[SEQ ID NO16]，399至438[SEQ ID NO18]和307至469[SEQID NO20]。
9.權(quán)利要求1至5中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中通過(guò)從權(quán)利要求7所要求的蛋白質(zhì)中缺失功能域，從表6的[SEQ ID NO24]中缺失p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合域可衍生得到結(jié)合抑制劑的序列(b2)。
10.權(quán)利要求9所要求的核酸構(gòu)建體，其中缺失了p27-結(jié)合域之后可得到具有表8所示氨基酸序列[SEQ ID NO26]的蛋白質(zhì)，缺失了Ran-結(jié)合域時(shí)可得到具有表9所示氨基酸序列[SEQ ID NO27]的蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求1至5中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中通過(guò)從權(quán)利要求2所要求的蛋白質(zhì)中缺失除p27-結(jié)合域區(qū)以外的所有氨基酸序列可衍生得到結(jié)合抑制劑的序列(b2)。
12.權(quán)利要求11所要求的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)合抑制劑的序列含有表10所示的氨基酸序列[SEQ ID NO28]。
13.權(quán)利要求1至5中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)合抑制劑的序列(b2)選自權(quán)利要求6至12中任一個(gè)所要求的抑制劑的同源性蛋白質(zhì)，另一種哺乳動(dòng)物類(lèi)或人的相應(yīng)部分。
14.權(quán)利要求13所要求的核酸構(gòu)建體，其中抑制劑的氨基酸序列是p163的人類(lèi)似物。
15.權(quán)利要求1至14中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分c)含有至少一種結(jié)合組分b)的DNA(結(jié)合)序列，并被這種結(jié)合所激活。
16.權(quán)利要求15所要求的核酸構(gòu)建體，其中DNA結(jié)合序列選自結(jié)合Gal4蛋白的序列(5′-CGGACAACTGTTGACCCG-3′， SEQ ID NO1)；結(jié)合LexA蛋白的序列(5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′，SEQ IDNO2)；結(jié)合LacI阻抑蛋白的序列(5′-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3′，SEQ ID NO3)；結(jié)合四環(huán)素阻 抑 蛋 白 的 序 列 (5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3′，SEQ ID NO4)和結(jié)合ZFHD-1蛋白的序列(5′-TAATGATGGGCG-3′，SEQ ID NO5)。
17.權(quán)利要求1至16中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因(組分d)是編碼活性化合物的基因，所述活性化合物選自細(xì)胞因子，趨化因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的受體，具有抗增殖或細(xì)胞靜止或細(xì)胞程序死亡效應(yīng)的蛋白質(zhì)，抗體，抗體片段，血管生成抑制劑，肽激素，凝結(jié)因子，凝結(jié)抑制劑，纖溶蛋白，對(duì)血液循環(huán)起作用的肽或蛋白質(zhì)，血漿蛋白和傳染性病原體或細(xì)胞或腫瘤的抗原，選定的抗原可導(dǎo)致免疫反應(yīng)。
18.權(quán)利要求1至14中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因是編碼可將藥物前體轉(zhuǎn)變成藥物的酶的基因。
19.權(quán)利要求1至14中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因是編碼配體-活性化合物融合蛋白或配體-酶融合蛋白的基因，所述配體選自細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，抗體，抗體片段，肽激素，介體和細(xì)胞粘附分子。
20.前述權(quán)利要求中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中核酸是DNA。
21.前述權(quán)利要求中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體被插入載體。
22.權(quán)利要求21所要求的核酸構(gòu)建體，其中載體是質(zhì)粒載體。
23.權(quán)利要求21所要求的核酸構(gòu)建體，其中載體是病毒載體。
24.權(quán)利要求1至23中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體，其中通過(guò)下列方式施用所述核酸構(gòu)建體以預(yù)防或治療疾病外部，經(jīng)口，囊內(nèi)，經(jīng)鼻，支氣管內(nèi)，或施用至胃腸道內(nèi)，或注射至器官內(nèi)，體腔內(nèi)，肌肉系統(tǒng)內(nèi)，皮下施用或注射至血液循環(huán)中。
25.含有權(quán)利要求1至24中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體的分離的細(xì)胞。
26.權(quán)利要求1至24中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求25中所要求的細(xì)胞用于生產(chǎn)治療疾病的藥物的用途，所述疾病選自感染，腫瘤，白血病，自身免疫病，變態(tài)反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，炎癥，器官排斥，移植物抗宿主反應(yīng)，血凝固疾病，循環(huán)系統(tǒng)疾病，貧血，激素病和CNS損害。
27.制備權(quán)利要求1至24中任一個(gè)所要求的核酸構(gòu)建體的方法，其中逐步將各個(gè)元件連接在一起。
28.權(quán)利要求25所要求的細(xì)胞用于生產(chǎn)治療權(quán)利要求26所要求的疾病的藥物的用途，其中通過(guò)下列方式施用至少一種細(xì)胞以預(yù)防或治療疾病外部，囊內(nèi)，經(jīng)鼻，支氣管內(nèi)，口服或施用到胃腸道內(nèi)，或注射至器官內(nèi)，體腔內(nèi)，肌肉系統(tǒng)內(nèi)，皮下施用或注射至血液循環(huán)中。
全文摘要
本申請(qǐng)公開(kāi)了用于疾病的基因療法的核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有編碼蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)可抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)p27，因而可解除由p27引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，本申請(qǐng)還涉及所述構(gòu)建體的突變體，其中一些突變體具有顯性干擾性狀，本申請(qǐng)還涉及這些核酸用于預(yù)防和治療疾病的用途。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1227871SQ98125350
公開(kāi)日1999年9月8日 申請(qǐng)日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月20日
發(fā)明者M·艾勒斯, A·布爾吉恩, H－H·塞德拉克 申請(qǐng)人:德國(guó)赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司