一種識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(gsc)的核酸適體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)的核酸適體及其制備方法。涉及一種核酸，提供具有高特異性和高親和力的GSC的核酸適體及其制備方法與應(yīng)用。所述GSC的核酸適體具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，制備方法包括：設(shè)計并合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，篩選目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體分子量小，滲透性好，無毒性，經(jīng)濟(jì)，易于合成與標(biāo)記，能特異性識別GSC，而對其他細(xì)胞系不具有識別功能。
【專利說明】
一種識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)的核酸適體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸，特別涉及GSC的核酸適體制備方法及其在腫瘤靶向治療中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見而又最難治療的惡性腫瘤，即使運(yùn)用現(xiàn)代顯 微神經(jīng)外科技術(shù)、放療、化療等綜合治療措施后，高度惡性的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者3年 以上的生存率僅為2.2%，無疑給社會、家庭和患者帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1997年， Bonnet和Dick(l.Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.[J].Nat Med, 1997,3:730-737)從白血病腫瘤細(xì)胞中分離出少量細(xì)胞，它們是眾多腫瘤細(xì)胞中惟一具有 致瘤性的細(xì)胞，且能分化為其他腫瘤細(xì)胞，具有干細(xì)胞特征，從而證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存 在。2004年Singh等（2?Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,et al.Identification of human brain tumour initiating cells. [J]Nature,2004,432:396-401).從膠質(zhì)瘤中分離出具 有干細(xì)胞樣特征的細(xì)胞，證明了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(G1 ioma Stem Ce 11 s，GSC)的存在。現(xiàn)有的膠 質(zhì)瘤治療方法，包括顯微神經(jīng)外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療以及免疫和基因治療，這些方 法往往只針對腫瘤實(shí)體中的已分化細(xì)胞，而忽視了腫瘤祖細(xì)胞和GSC，而這些占少量的GSC 很可能負(fù)責(zé)腫瘤的起源和生長、侵襲和復(fù)發(fā)。最新研究表明，GSC的存在是當(dāng)前膠質(zhì)瘤治療 療效不高、復(fù)發(fā)性高的一大可能原因之一（3.Cho WC.Updates in cancer research: insights from the AACRIOOth Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn,2009,9: 411-416.)〇
[0003] TSC是腫瘤中具有自我更新能力并能多向分化的腫瘤細(xì)胞(3.Cho WC.Updates in cancer research:insights from the AACR 100th Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn, 2009,9:411-416.)。許多研究證實(shí)了TSC在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、復(fù)發(fā)等過程中 起著關(guān)鍵作用。根據(jù)TSC理論，腫瘤起源于腫瘤組織中的一小部分具有增殖和轉(zhuǎn)移浸潤能力 的TSC，而腫瘤組織中其余大部分的腫瘤細(xì)胞并無轉(zhuǎn)移能力。TSC不僅具有干細(xì)胞的自我更 新和分化潛能的特性，這些細(xì)胞的另一特點(diǎn)就是耐藥性。TSC細(xì)胞膜上多數(shù)表達(dá)ABC transporter家族膜蛋白，這類蛋白大多可運(yùn)輸并外排包括代謝產(chǎn)物、藥物、毒性物質(zhì)、內(nèi)源 性脂類物質(zhì)、多肽、核苷酸及固醇類等多種物質(zhì)，使許多對腫瘤非干細(xì)胞具有抑制或殺傷作 用的化療藥物卻對TSC殺傷作用明顯減弱。TSC的耐藥性直接影響了腫瘤化療的成敗。目前 腫瘤的常規(guī)治療，如放療、化療，可以殺死大部分腫瘤細(xì)胞，但是對存在于腫瘤中的數(shù)量稀 少的干細(xì)胞樣細(xì)胞群卻作用甚微。治療后殘存TSC的增殖，足以促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此 在治療時，應(yīng)該針對TSC，從源頭上根治腫瘤的發(fā)生。
[0004] 當(dāng)前GSC研究的一個技術(shù)難題是如何獲得特異性標(biāo)記物以用于GSC的分離純化。目 前人們主要是利用GSC特異性抗體來識別GSC，并通過細(xì)胞分選技術(shù)來分離GSC?，F(xiàn)階段GSC 的標(biāo)志物主要借助廣譜的干細(xì)胞標(biāo)志物(如⑶133 )、黏附分子(如⑶15、CD34、神經(jīng)細(xì)胞黏附 分子11)、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(如0)15、42135、11681：；[11、]\11183811；[1)、胚胎干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(如 SOX家族蛋白、Nanog)等。CD133在人造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì) 胞、大腸癌、前列腺癌、肝癌中均有表達(dá)，它是一種廣譜的干細(xì)胞標(biāo)志物(4.Prestegarden L,Svendsen A,ffang J，et al.Glioma cell populations grouped by different cell type markers drive brain tumor growth. [J]Cancer Res，2010,70:4274_4279) D因此， CD133作為GSC標(biāo)志物的特異性受到了質(zhì)疑。CD15抗原也稱階段特異性胚胎表面抗原-1，是 一種細(xì)胞黏附分子;CD34屬于鈣黏蛋白家族，在多種干(祖)細(xì)胞中表達(dá)。2010年P(guān)atru等 (5.Patru C,Romao L,Varlet P,et al.CD133,CD15/SSEA-1,CD34or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.[J].BMC Cancer,2010,10:66.)M 47例長期傳代的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，各細(xì)胞系中存在不同亞 群，其中部分細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特征，表達(dá)⑶133、⑶15、CD34等，但是⑶133、⑶15、⑶34的表 達(dá)情況以及Hoechst著色能力與致瘤性、化療抵抗均無明顯相關(guān)，且CD34與CD133幾乎不同 時表達(dá)，可見上述標(biāo)志物并非特異性的GSC標(biāo)志物。A2B5是膠質(zhì)前體細(xì)胞膜表面的一種神經(jīng) 節(jié)苷脂，多用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞譜系研究。2008年Ogden檢測了 25例WHO分級II~IV級膠質(zhì)瘤，均 表達(dá)A2B5;而且⑶133僅表達(dá)于A2B5+細(xì)胞，在A2B5-細(xì)胞則無表達(dá)。但該研究未能說明A2B5+ 細(xì)胞的分化特性，未能進(jìn)一步闡述〇)133+和4285+細(xì)胞之間的關(guān)系（6.(^(1611八1'，1 &2化1 AE,Lochhead RA,et al.Identification of A2B5+CD133-tumor-initiating cells in adult human gliomas ? [J] .Neurosurgery,2008,62:505-515)。因此，A2B5作為GSC標(biāo)志物 有待進(jìn)一步探討。Nestin在未分化的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSC)和未成熟的星 形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中消失，它是NSC的主要標(biāo)志之一。雖然Nestin作 為GSC的一個重要指標(biāo)被廣泛應(yīng)用，Nestin高表達(dá)的高級別膠質(zhì)瘤預(yù)后差(7. Arai H, Ikota H,Sugawara K,et al.Nestin expression in brain tumors:its utility for pathological diagnosis and correlation with the prognosis of high-grade gliomas ? [J]Brain Tumor Pathol ? 2012,29(3): 160-167 ?)，但能否作為GSC的特異性標(biāo)志 物還有待商榷。此外，國內(nèi)有學(xué)者用化療藥物長春新堿作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞來篩選TSC，但由 于化療抵抗機(jī)制復(fù)雜，該方法得到的細(xì)胞目前只能稱為"富含TSC" (8. Zhou ZH，Ping YF，Yu SC,et al.A novel approach to the identification and enrichment of cancer stem cells from a cultured human glioma cell line.Cancer Lett,2009,281:92-99) 〇因此 尋找和發(fā)現(xiàn)GSC特異性的標(biāo)記物成為解決問題的關(guān)鍵所在，并將會對膠質(zhì)瘤的早期診斷、治 療和預(yù)后起著極其重要的意義。
[0005]核酸適配體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠與靶標(biāo)高特異 性和高親和力結(jié)合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作 用力形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質(zhì)甚至影 響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有諸多優(yōu)勢，如 靶分子范圍廣、親和力與特異性強(qiáng)、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼容性、無 毒、體外穩(wěn)定性好等。核酸適體可以通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選獲得，其基本原理是在 體外人工化學(xué)合成一個寡核苷酸文庫，包括RNA、ssDNA或修飾的RNA和ssDNA，通過寡核苷酸 文庫與目標(biāo)分子的相互作用，結(jié)合PCR技術(shù)指數(shù)級放大與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過 幾輪或數(shù)十輪篩選富集過程，獲得高親和力和高特異性的核酸適體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的在于提供具有高特異性和高親和力的GSC的核酸適體。
[0007] 其序列如下：
[0008] TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇
[0009] 該序列可以被切短或部分堿基替換，所述的切短為兩端堿基分別或同時截短1-20 個堿基。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，其兩端堿基同時截短7個堿基，其也同樣具有和GSC的高 特異性和高親和力。
[0010] 本發(fā)明的第二目的在于提供GSC的核酸適體的制備方法。
[0011] 所述GSC的核酸適體的制備方法包括以下步驟：
[0012] 1)合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87為反篩細(xì)胞，去除DNA 隨機(jī)寡核苷酸庫中的非特異性結(jié)合部分，以GSC為正篩細(xì)胞篩選得到與GSC特異結(jié)合的核酸 序列；
[0013] 2)將步驟1)所得與GSC特異結(jié)合的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈酶親 和素微珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文 庫；
[0014] 3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過20輪篩選后獲得目的寡核 苷酸序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并鑒定其與GSC結(jié)合的特異性和親和力，獲得 GSC的核酸適體。
[0015]在步驟1)中，所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的 隨機(jī)序列，即為5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為1015以上。
[0016] 在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的引物為：
[0017] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；
[0018] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'；
[0019] 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為3 '端帶有生物素標(biāo)記、5 '端帶有FAM標(biāo)記的雙鏈DNA文庫。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:CELL-SELEX技術(shù)與流式細(xì)胞分析法相結(jié)合的篩選方法使篩選 獲得的核酸適體無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標(biāo)記。通過SELEX方法篩選獲得的 核酸適體只特異性識別GSC，對其他細(xì)胞系不具有識別功能。上述優(yōu)點(diǎn)使得所述核酸適體成 為GSC檢測的有力工具，識別GSC的核酸適配體在膠質(zhì)瘤的診斷和靶向治療中具有重要的意 義。
【附圖說明】
[0021] 圖1為流式細(xì)胞儀檢測篩選進(jìn)程中DNA隨機(jī)寡核苷酸庫對GSC的富集圖。在圖1中， 橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，曲線A為初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線B為第8輪DNA 隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線C為第14輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線D為第20輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫。
[0022]圖2為流式細(xì)胞儀檢測篩選進(jìn)程中DNA隨機(jī)寡核苷酸庫對于U87細(xì)胞的富集圖。在 圖2中，橫坐標(biāo)為焚光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，曲線A為初始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線B為第8 輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線C為第14輪DNA隨機(jī)寡核苷酸庫，曲線D為第20輪DNA隨機(jī)寡核苷 酸庫。
[0023]圖3為流式細(xì)胞儀測定所得核酸適體W5對GSC的解離常數(shù)。在圖3中，橫坐標(biāo)為DNA 濃度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為平均熒光強(qiáng)度。
[0024] 圖4為流式細(xì)胞儀測定所得核酸適體W5對GSC的熒光偏移。在圖4中，橫坐標(biāo)為熒光 強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。
[0025] 圖5為流式細(xì)胞儀測定所得核酸適體W5對多種其他腫瘤細(xì)胞系的熒光偏移。在圖5 中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1體外篩選與GSC特異結(jié)合的核酸適體
[0027] 1)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸庫溶于結(jié)合緩沖液（lxPBS，4.5g/L葡萄糖， 0.5mmol/L MgCl2,0.1g/L tRNA，lg/L BSA)中，進(jìn)行熱處理：95°C加熱5min，在冰上放置 lOmin;所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機(jī)序列，即為 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為 1015 以上。
[0028] 2)將處理好的單鏈DNA核酸庫與用roS洗滌后的U87細(xì)胞進(jìn)行孵育，收集未與U87細(xì) 胞結(jié)合的液體；
[0029] 3)將未與U87細(xì)胞結(jié)合的液體加入GSC中于冰上孵育40min;
[0030] 4)使用洗滌緩沖液洗滌孵育后的GSC，95°C加熱10min，13000g離心5min，獲取結(jié)合 了 GSC的寡核苷酸，然后做PCR反應(yīng)；
[0031] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性 3min，94°C30s，60°C30s，72°C30s，擴(kuò)增 16 個循環(huán)，最 后72°C終延伸5min，
[0032] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3,；
[0033] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3,；
[0034] 5 )PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物為3 '端帶有生物素標(biāo)記，5 '端帶有FAM標(biāo)記的雙鏈DNA，加 入鏈酶親和素微珠，反應(yīng)30min，然后用0.2mol/L NaOH進(jìn)行單鏈化，經(jīng)脫鹽柱純化即得到用 于下一輪篩選的單鏈DNA文庫；
[0035] 6)之后每輪使用200pmol的單鏈DNA文庫，并且逐步增加洗滌次數(shù)以增強(qiáng)篩選強(qiáng) 度。共進(jìn)行20輪篩選，而后通過流式細(xì)胞儀檢測單鏈DNA文庫的富集情況，結(jié)果顯示第20輪 庫與GSC有比較明顯的結(jié)合(參見圖1)，而與U87細(xì)胞沒有結(jié)合(參見圖2)，最后把第20輪庫 進(jìn)行克隆測序。所得的序列為
[0036] 5'-TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC-3'。
[0037] 該序列命名為W-5。
[0038]實(shí)施例2以流式分析法檢測所得單鏈DNA與GSC的結(jié)合能力
[0039] 首先PCR擴(kuò)增帶熒光標(biāo)記的單鏈DNA，使用引物2:5'-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；引物3:5'-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，PCR產(chǎn)物為5'端帶有FAM 并且3 '端帶有生物素的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應(yīng)30min，然后用0.2mol/L NaOH 進(jìn)行單鏈化，經(jīng)脫鹽柱純化即得到用于流式分析的帶FAM標(biāo)記的單鏈DNA。
[0040]使用 lnmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L， 200nmol/L濃度梯度的單鏈DNA與GSC來測定解離常數(shù)(Kd)。用200yl結(jié)合緩沖液配置上述各 濃度的DNA溶液，95°C加熱5min，冰上放置lOmin。加入到50xl0 4個GSCs，冰上孵育40min。使 用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次，而后把細(xì)胞重懸在250yL結(jié)合緩沖液中。設(shè)置未經(jīng)過篩選的初 始DNA隨機(jī)寡核苷酸庫作對照。
[0041 ] 使用BD公司的FACSAria流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行焚光測定，而后用sigma plot軟件 作圖，計算出所得核酸適體的解離常數(shù)(結(jié)果參見圖3)。
[0042]實(shí)施例3篩選得到核酸適配體與其他各種細(xì)胞系結(jié)合情況
[0043] 1)將合成好的5nmol單鏈DNA溶于結(jié)合緩沖液中，進(jìn)行熱處理:95°C加熱5min，冰上 放置l〇min。
[0044] 2)將處理好的單鏈DNA與500000個細(xì)胞種于24孔板24小時進(jìn)行孵育，冰上孵育 40min〇
[0045] 3)孵育好后，洗滌緩沖液溶液洗3次，再將細(xì)胞刮下來溶于200iiL結(jié)合緩沖液中，使 用BD公司的FACSAria流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行熒光測定(結(jié)果參見圖5)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體，其特征在于，其序列如下： TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇2. 基于權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的切短或部分堿基替換的GSC的核 酸適體，所述的切短為兩端堿基分別或同時截短1-20個堿基。3. 如權(quán)利要求1所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的制備方法，其特征在于包括以 下步驟： 1) 合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫；以人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87為反篩細(xì)胞，篩選除去 DNA隨機(jī)寡核苷酸庫中的非特異性結(jié)合部分，以GSC為正篩細(xì)胞篩選得到與GSC特異結(jié)合的 核酸序列； 2) 將步驟1)所得與GSC特異結(jié)合的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鏈酶親和素 微珠為基質(zhì)進(jìn)行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫，形 成次一級核酸庫； 3) 將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過20輪篩選后獲得目的寡核苷酸 序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性 和親和力。4. 如權(quán)利要求3所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機(jī)序列，即為 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC 40nt GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為 1015 以上。5. 如權(quán)利要求3所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)的核酸適體的制備方法，其特征在于在 步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的引物為： 引物1:TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC; 引物2: GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC。6. 如權(quán)利要求1所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的用途，在制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞識 別試劑的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求1所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的用途，在制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞診 斷試劑的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1所述的識別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適體的用途，在制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治 療藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK105821043SQ201610048666
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月25日
【發(fā)明人】康德智, 吳巧藝, 吳亮, 王煜喆, 楊朝勇, 朱志
【申請人】福建醫(yī)科大學(xué)附屬第醫(yī)院, 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院